Summary
Ce protocole présente un test d’absorption d’acides aminés radiomarqués, utile pour évaluer la consommation d’acides aminés dans les cellules primaires ou dans les os isolés.
Abstract
Le développement osseux et l’homéostasie dépendent de la différenciation et de l’activité des ostéoblastes formant des os. La différenciation des ostéoblastes est caractérisée séquentiellement par une prolifération suivie d’une synthèse protéique et, finalement, d’une sécrétion de matrice osseuse. La prolifération et la synthèse des protéines nécessitent un apport constant en acides aminés. Malgré cela, on sait très peu de choses sur la consommation d’acides aminés dans les ostéoblastes. Nous décrivons ici un protocole très sensible conçu pour mesurer la consommation d’acides aminés à l’aide d’acides aminés radiomarqués. Cette méthode est optimisée pour quantifier les changements dans l’absorption des acides aminés qui sont associés à la prolifération ou à la différenciation des ostéoblastes, aux traitements médicamenteux ou aux facteurs de croissance, ou à diverses manipulations génétiques. Il est important de noter que cette méthode peut être utilisée de manière interchangeable pour quantifier la consommation d’acides aminés dans des lignées cellulaires cultivées ou des cellules primaires in vitro ou dans des puits osseux isolés ex vivo. Enfin, notre méthode peut être facilement adaptée pour mesurer le transport de l’un des acides aminés ainsi que du glucose et d’autres nutriments radiomarqués.
Introduction
Les acides aminés sont des composés organiques qui contiennent un groupe fonctionnel amino (-NH2) et carboxyle (-COOH) avec une chaîne latérale variable spécifique à chaque acide aminé. En général, les acides aminés sont bien connus comme le constituant de base des protéines. Plus récemment, de nouvelles utilisations et fonctions des acides aminés ont été élucidées. Par exemple, les acides aminés individuels peuvent être métabolisés pour générer des métabolites intermédiaires qui contribuent à la bioénergétique, fonctionnent comme cofacteurs enzymatiques, régulent les espèces réactives de l’oxygène ou sont utilisés pour synthétiser d’autres acides aminés 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10 . De nombreuses études démontrent que le métabolisme des acides aminés est essentiel pour la pluripotence, la prolifération et la différenciation cellulaires dans divers contextes 3,6,11,12,13,14,15,16,17.
Les ostéoblastes sont des cellules sécrétoires qui produisent et sécrètent la matrice osseuse extracellulaire riche en collagène de type 1. Pour maintenir des taux élevés de synthèse des protéines pendant la formation osseuse, les ostéoblastes exigent un apport constant en acides aminés. Pour répondre à cette demande, les ostéoblastes doivent acquérir activement des acides aminés. Conformément à cela, des études récentes révèlent l’importance de l’absorption et du métabolisme des acides aminés dans l’activité des ostéoblastes et la formation osseuse 15,16,17,18,19,20.
Les ostéoblastes acquièrent des acides aminés cellulaires à partir de trois sources principales: le milieu extracellulaire, la dégradation des protéines intracellulaires et la biosynthèse de novo des acides aminés. Ce protocole se concentrera sur l’évaluation de l’absorption des acides aminés à partir de l’environnement extracellulaire. Les méthodes les plus courantes pour mesurer l’absorption des acides aminés reposent sur des acides aminés radiomarqués (p. ex., 3H ou 14C) ou des isotopes lourds marqués (p. ex. 13C). Les dosages d’isotopomères lourds peuvent analyser l’absorption et le métabolisme des acides aminés de manière plus approfondie et plus sûre, mais ils prennent plus de temps et prennent plusieurs jours à compléter car il faut une journée pour préparer et dérivatiser les échantillons et plusieurs jours pour analyser sur le spectromètre de masse en fonction du nombre d’échantillons21,22. En comparaison, les tests d’absorption des acides aminés radiomarqués ne sont pas informatifs sur le métabolisme en aval, mais sont peu coûteux et relativement rapides, pouvant être achevés dans les 2-3 heures suivant le début de l’expérience23,24. Ici, nous décrivons un protocole de base facilement modifiable conçu pour évaluer l’absorption d’acides aminés radiomarqués dans des cellules primaires en culture ou des lignées cellulaires in vitro ou des arbres osseux individuels ex vivo. L’application de ces deux protocoles peut être étendue à d’autres acides aminés radiomarqués et à d’autres types de cellules et de tissus associés aux os.
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Protocol
Toutes les procédures de souris décrites ici ont été approuvées par les comités d’études animales du Southwestern Medical Center de l’Université du Texas à Dallas. Le protocole de radioprotection a été approuvé par le Comité consultatif de radioprotection du Southwestern Medical Center de l’Université du Texas à Dallas.
1. Absorption d’acides aminés dans les cellules (Protocole I)
- Plaque 5 x 104 cellules ST2 dans chaque puits d’une plaque de culture tissulaire à 12 puits. Cellules en plaques dans α-MEM contenant 10 % de FBS, 100 U/mL de pénicilline et 0,1 μg/mL de streptomycine (Pen/Strep). Plaquer des puits supplémentaires de cellules pour quantifier le nombre de cellules par condition pour les normalisations de l’étape 1.12. Incuber les cellules dans un incubateur de culture cellulaire humidifié à 37 °C avec 5% de CO2.
- Culture des cellules pendant 2-3 jours jusqu’à confluence.
- Le jour de l’expérience, préparer les solutions suivantes : 1x tampon phosphate salé (PBS), pH 7,4 et tampon Krebs Ringers HEPES (KRH), pH 8,0 : (120 mM NaCl, 5 mM KCl, 2 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, NaHCO3, 5 mM HEPES, 1 mM D-Glucose). Préchauffer à 37 °C.
- Aspirer le milieu et laver les cellules deux fois avec 1 mL de 1x PBS, pH 7,4.
REMARQUE: Ce protocole est également approprié pour diviser rapidement les cellules non confluentes. Dans ce cas, il est important de normaliser la radioactivité en fonction du nombre absolu de cellules ou du contenu de l’ADN. De plus, envisagez d’augmenter la taille de la plaque de culture ou du flacon pour augmenter le nombre global de cellules et les valeurs de cpm. Il est important de le déterminer empiriquement sur une base individuelle. - Aspirer 1x PBS et laver les cellules une fois avec 1 mL KRH.
- Faire 4 μCi/mL de milieu de travail L-[3,4-3 H]-glutamine en diluant 4 μL de [1 μCi μL-1] L-[3,4-3 H]-Glutamine par 1 mL de KRH.
REMARQUE : Avant d’utiliser des matières radioactives, veuillez communiquer avec le Bureau de la radioprotection de votre établissement d’attache pour obtenir des approbations. Toutes les procédures liées au rayonnement doivent être effectuées derrière le blindage en plexiglas. - Incuber des cellules avec 0,5 mL de KRH contenant 4 μCi/mL de milieu de travail L-[3,4-3 H]-glutamine pendant 5 min.
- Recueillir le milieu radioactif et le distribuer dans le conteneur à déchets liquides. Lavez brièvement les cellules trois fois avec du KRH glacé pour mettre fin à la réaction. Recueillir et jeter tous les lavages dans le conteneur à déchets liquides radioactifs.
- Ajouter 1 mL de SDS à 1% à chaque puits et triturer 10x pour lyser et homogénéiser les cellules. Transférer les lysats cellulaires dans des tubes de 1,5 mL. Jeter les plaques de culture cellulaire, les pipettes sérologiques et les pointes de pipettes dans le conteneur de déchets radioactifs solides.
- Centrifuger à 10 000 > x g pendant 10 min. Transférer les surnageants dans des flacons à scintillation contenant 8 mL de la solution de scintillation. Mélanger en agitant vigoureusement les flacons de scintillation. Jeter les tubes et les embouts de pipettes dans un conteneur à déchets radioactifs solides.
- Lire la radioactivité en comptage par minute (cpm) à l’aide d’un compteur à scintillation. Jeter les flacons de scintillation dans le récipient à déchets pour flacons à scintillation.
- Trypsiniser, remettre en suspension et compter les cellules des plaques non radioactives restantes des cellules (voir étape 1.1) pour estimer le nombre de cellules dans les cultures radioactives lysées. À l’aide d’un hémocytomètre, compter le nombre de cellules par puits non radioactif pour chaque condition expérimentale. Normalisez le cpm de l’étape 1.11 au nombre de cellules estimé à partir des plaques non radioactives.
- Une fois l’expérience terminée, décontaminer la hotte de culture cellulaire, le banc et tous les instruments avec un spray décontaminant radioactif. Enfin, effectuez des tests d’essuyage pour vous assurer que la zone de travail est exempte de rayonnement.
2. Absorption d’acides aminés dans les tissus osseux fraîchement isolés (Protocole II)
- Préchauffer KRH à 37 °C.
- Euthanasier une souris de 3 jours et enlever la peau des bras. Désarticulez l’huméru de l’épaule à l’aide de ciseaux et disséquez les deux humérus. Enlevez tous les tissus extemporanés à l’aide d’un scalpel et d’une pince. Retirez les épiphyses de l’os.
NOTE: En plus de l’humerii, ce protocole peut être adapté aux fémurs, tibias et calvariae néonatals ainsi qu’aux humerii, fémurs et tibias isolés de souris âgées de 2 et 4 mois (données non publiées). - Rincer la moelle osseuse et peser les tiges osseuses pour normaliser à l’étape 2.14.
- Faire bouillir un humérus dans 1x PBS à 100 °C pendant 10 min pour décellulariser l’os. L’os bouilli décellularisé est utilisé comme témoin négatif.
REMARQUE: Comme contrôle de la qualité, la paraffine incorpore les os bouillis et non bouillis pour les taches histologiques afin de confirmer visuellement que l’ébullition était efficace pour décellulariser l’os. - Équilibrer les deux humérus dans 1 mL de KRH pendant 30 min dans l’incubateur de culture cellulaire à 37 °C.
- Faire une solution de travail de 4 μCi/mL de L-[2,3,4-3 H]-Arginine dans KRH en diluant 4 μL de 1μCi/μL L-[2,3,4-3 H]- Stock d’arginine par 1 mL de KRH.
REMARQUE : Ce protocole est approprié pour évaluer l’absorption de l’élément nutritif radiomarqué choisi. La L-[2,3,4-3 H]-glutamine, la L-[14CU]-alanine et la L-[2,3-3 H]-proline ont été testées avec des résultats similaires. Les données d’arginine sont montrées pour mettre en évidence l’utilité de ce protocole.
ATTENTION : Toutes les procédures utilisant des radiations doivent être effectuées derrière le blindage en plexiglas tout en utilisant un équipement de protection individuelle (EPI) approprié. - Incuber séparément l’os témoin expérimental et bouilli dans du KRH contenant 4 μCi/mL de L-[2,3,4-3 H]-Arginine pendant 90 minutes à 37 °C.
REMARQUE: Il est important de déterminer empiriquement les temps d’incubation pour différentes conditions, y compris l’âge des souris, les différents éléments squelettiques et les types d’acides aminés radiomarqués en effectuant un cycle de temps. La saturation se produit principalement après environ 3-4 h. L’absorption devrait être évaluée à un moment donné dans la rage linéaire de l’absorption. - Retirer le milieu radioactif et le jeter dans le conteneur de déchets radioactifs liquides. Lavez l’humérium trois fois en utilisant 1 mL de KRH glacé pour mettre fin à la réaction. Jetez tous les lavages dans le conteneur de déchets radioactifs liquides.
- Transférer chaque os dans un tube de 1,5 mL. Ajouter 500 μL de tampon RIPA [150 mM NaCl; 5 mM EDTA; 50 mM Tris (pH 8,0); 0,5% NP40 (v/v); 0,5% DOX (p/v); 0,1% SDS (p/v)]. Jetez les plaques de culture, les pipettes sérologiques et les pointes de pipettes dans un conteneur à déchets solides radioactifs.
- Homogénéiser l’humérium en hachant 100 fois avec des ciseaux dans un tampon RIPA.
- Sonicate (Amplitude: 35%, Pulse 1 s) l’os homogénéisé résultant pendant 10 s.
REMARQUE: La sonication est également connue pour produire des aérosols. Les étapes de sonication peuvent être effectuées dans une armoire de sécurité biologique. Pour réduire la formation d’aérosols, il est important de ne pas trop remplir les tubes. La sonication de petits volumes d’échantillons peut entraîner une sonication incomplète ou une perte d’échantillon due à la formation de mousse. En cas de moussage, centrifuger l’échantillon pendant 5 minutes pour qu’il se dépose. - Clarifier le lysat par centrifugation pendant 10 min à >10 000 x g à température ambiante. Transférer 200 μL du surnageant dans des flacons de scintillation contenant 8 mL de solution de scintillation. Mélanger en agitant vigoureusement les flacons de scintillation. Jeter tous les déchets radioactifs solides (p. ex. tubes usagés, embouts de pipettes, plaques, etc.) dans le contenant de déchets radioactifs solides.
- Lire la radioactivité (cpm) à l’aide du compteur Scintillation. Jeter les flacons de scintillation usagés dans le conteneur de déchets radioactifs désigné pour les flacons de scintillation.
- Soustrayez le cpm de l’os bouilli (valeur basale) du cpm de l’os expérimental. Normaliser la radioactivité avec le poids osseux de l’étape 2.3.
- Vaporiser la cagoule de culture cellulaire, les instruments et le banc avec un décontaminant radioactif. Effectuez des tests d’essuyage pour confirmer que la zone de travail est exempte de rayonnement.
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Representative Results
Le transport des acides aminés est régulé par de nombreux transporteurs d’acides aminés liés à la membrane qui ont été classés en systèmes de transport distincts en fonction de nombreuses caractéristiques, notamment la spécificité du substrat, la cinétique, ainsi que la dépendance aux ions et au pH25. Par exemple, l’absorption de glutamine peut être médiée par les systèmes de transport dépendants de Na+ A, ASC, γ+L et N ou le système L indépendant de Na+. Les systèmes dépendants de Na+ se distinguent par leur capacité à substituer Li+ à Na+ (système N) ou par leur sensibilité à l’analogue de l’acide aminé acide 2-(méthylamino)isobutyrique (MeAIB) (système A). Le but de cette expérience était de définir la quantité de consommation de glutamine attribuable à chaque système de transport. L-[3,4-3 H] glutamine absorption a été mesurée dans des cellules ST2 confluentes dans un KRH normal contenant 120 mM de NaCl, un KRH libre de Na+ contenant 120 mM de chlorure de choline, un KRH normal contenant 5 mM de MeAIB ou un KRH libre de Na+ contenant 120 mM de LiCl. La radioactivité totale (nombre par minute) a été normalisée au nombre de cellules. L’élimination de Na+ a entraîné une réduction de 90% de l’absorption de glutamine. Cela indique que le système L représente 10% de l’absorption de glutamine alors que 90% de l’absorption de glutamine est Na+ dans les cellules ST2 (Figure 2). La présence de Li+ n’a augmenté l’absorption de glutamine que de 2% par rapport à la condition libre de Na+ alors que 5 mM MEAIB n’a pas affecté l’absorption de glutamine. Ces données indiquent que la majorité de l’absorption de glutamine est médiée par les systèmes ASC et γ + L, tandis que le système N et le système A sont responsables d’environ 2% et 0% de l’absorption de glutamine Na+-dépendante, respectivement.
Nous avons modifié le protocole I pour caractériser l’absorption des acides aminés dans les arbres osseux ex vivo. Dans cette expérience, nous avons suivi le protocole II pour caractériser la cinétique d’absorption de l’arginine dans des os longs isolés de souris âgées de 3 jours (p3). Pour ce faire, nous avons d’abord disséqué les deux humérus de souris p3. Les épiphyses ont été enlevées, la moelle a été filée et chaque humérus a été pesé pour la normalisation. L’humérus controlatéral a été désigné comme un témoin négatif et a été bouilli pour tuer l’activité cellulaire. L’humérium expérimental et bouilli a ensuite été incubé avec de la L-[2,3,4-3 H]-Arginine radiomarquée 4μCi/mL pendant 2 h maximum. L’absorption d’arginine a augmenté de manière linéaire au cours de cette expérience (figure 3A). À titre de comparaison, l’huméri bouilli n’a pas montré d’augmentation dynamique de l’absorption d’arginine dans cette expérience, mais avait plutôt une radioactivité basale attribuée à l’adsorption de la sonde dans la matrice osseuse. L’absorption normalisée et corrigée d’arginine est illustrée à la figure 3B.
Figure 1 : Flux de travail des tests d’absorption des acides aminés radiomarqués. Aperçu schématique des tests d’absorption des acides aminés in vitro (Protocole I) et dans les os ex vivo (Protocole II). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Propriétés cinétiques de l’absorption de la L-[3,4-3 H]-glutamine dans ST2 in vitro. (A) Tests d’absorption de la L-[3,4-3 H]-glutamine effectués en présence (+) ou en absence (-) de sodium (Na+), de MeAIB ou de lithium (Li+) dans des cellules ST2. (B) Pourcentage des contributions estimées des systèmes A, N, L ou ASC et γ + L à l’absorption de glutamine. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Absorption ex vivo de L-[2,3,4-3 H]-Arginine dans l’humérium néonatal. ( A) L-[2,3,4-3 H]-Arginine absorbée sur une période de 2 heures chez des humérus vivants et bouillis isolés de souris C57BL/6 âgées de 3jours. (B) Absorption normalisée de L-[2,3,4-3 H]-arginine avec humérus bouilli. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
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Discussion
Le protocole décrit ici fournit une approche rapide et sensible pour évaluer l’absorption des acides aminés en réponse à diverses permutations expérimentales in vitro ou ex vivo. Par rapport aux kits disponibles dans le commerce (par exemple, les kits de détermination de la glutamine et du glutamate), cette méthode est beaucoup plus sensible, plus rapide et moins exigeante en main-d’œuvre16,17,25. Dans notre protocole, nous évaluons l’absorption dans le tampon HEPES de Krebs Ringers. Nous utilisons ce milieu car il s’agit d’une formule basale qui permet des modifications rapides et faciles pour tester un large éventail de conditions afin de caractériser l’absorption des acides aminés. Par exemple, pour tester si le système de transport est dépendant de Na+, nous pouvons simplement remplacer NaCl par du chlorure de choline pour rendre Na+ KRH libre. Cette flexibilité est avantageuse pour interroger les différents systèmes de transport médiant l’absorption d’acides aminés individuels. Les milieux de croissance basaux tels que l’alpha-MEM sont également appropriés pour ce test. Dans ce cas, nous achetons généralement de l’alpha-MEM sans l’acide aminé individuel en question, qui est remplacé par l’acide aminé radiomarqué pour l’expérience. Par exemple, pour évaluer l’absorption de glutamine, nous utilisons de l’alpha-MEM sans glutamine dans les cellules stromales primaires de la moelle osseuse15. KRH a quelques limitations en raison de sa composition simple. KRH n’est pas une option idéale si l’objectif est d’étudier les systèmes de transport actif secondaires tels que les symporteurs et les antiporteurs. Par exemple, l’absorption de la leucine par Slc7a5 / Slc3a2 se produit en échange de glutamine. Dans ce cas, l’absorption de la leucine peut être sous-estimée en raison du manque de glutamine dans KRH; l’utilisation d’un milieu alpha-MEM sans leucine serait préférable dans ce cas. Il est également important de noter que l’utilisation d’un compteur Geiger n’est pas obligatoire lorsque vous travaillez avec l’isotope 3H. Cependant, il est conseillé de garder le compteur Geiger allumé par courtoisie pour alerter les gens que vous travaillez avec des radiations.
Un contrôle critique et obligatoire pour le deuxième protocole est l’ébullition de l’os controlatéral. Ceci est nécessaire car la matrice osseuse peut absorber les acides aminés radioactifs indépendamment du transport facilité par les cellules osseuses. En décellularisant l’os, nous pouvons estimer la quantité de rayonnement piégée par la matrice osseuse et l’utiliser comme radioactivité de base pour normaliser l’absorption. Un autre contrôle important consiste à peser les os après l’ablation des épiphyses et de la moelle. Le poids de l’os est utilisé pour normaliser l’absorption par rapport à la taille de la tige osseuse. Ceci est important car la taille des os peut varier en raison de nombreux facteurs allant de la variabilité lors de l’élimination des épiphyses aux mutations génétiques qui affectent la croissance. Une autre méthode consiste à quantifier la teneur en ADN de la tige osseuse pour la normalisation. D’après notre expérience, la normalisation du contenu de l’ADN est comparable au poids osseux, mais ajoute plus d’étapes traitant des matières radioactives. Ainsi, nous préférons normaliser le poids osseux.
Ces protocoles peuvent être adaptés aux lignées cellulaires, y compris ATDC5, MC3T3, 293, ou d’autres cellules primaires telles que les ostéoblastes calvaires, les chondrocytes, les cellules stromales de la moelle osseuse, les macrophages de la moelle osseuse et les ostéoclastes. De plus, les protocoles sont facilement adaptables pour évaluer d’autres isotopes radioactifs (p. ex. 14C et 35S) ainsi que différents nutriments, y compris les acides aminés, le glucose et les acides gras. En outre, le protocole II peut également être adapté aux cultures d’os et de granulés adultes, en tenant compte de l’ajustement du temps d’incubation. Bien que ce protocole soit hautement adaptable, il est important de caractériser la cinétique des nouvelles molécules marquées aux isotopes ou dans de nouvelles lignées cellulaires avant de mener des expériences. La cinétique de transport peut varier considérablement entre différentes molécules, différents isotopes ou différents types de cellules.
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Disclosures
Les auteurs n’ont aucune divulgation.
Acknowledgments
Le laboratoire Karner est soutenu par des subventions R01 du National Institute of Health (AR076325 et AR071967) à C.M.K.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.25% trypsin | Gibco | 25200 | |
| 12-well plate | Corning | 3513 | |
| 1 mL syringe | BD precision | 309628 | |
| 30G Needle | BD precision | 305106 | |
| Arginine Monohydrochloride L-[2,3,4-3H]-, 1mCi | PerkinElmer | NET1123001MC | |
| Beckman LS6500 scintillation counter | |||
| Calcium chloride | Sigma | C1016 | |
| Choline chloride | Sigma | C7077 | |
| D-(+)-Glucose solution | Sigma | G8769 | |
| Dissection Tool | Forceps, scissors, scapels | ||
| DPBS | Gibco | 14190 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Sigma | E9884 | |
| HEPES(1M) | Gibco | 15630 | |
| L-[3,4-3H(N)]-Glutamine | PerkinElmer | NET551250UC | |
| Liquid scintilation vials | Sigma | Z190535 | |
| Lithium chloride solution, 8M | Sigma | L7026 | |
| Magnesium chloride | Sigma | M8266 | |
| MEMα | Gibco | 12561 | |
| Microcentrifuge tube, 15mL | Biotix | 89511-256 | |
| NP-40 | Sigma | 492016 | |
| Potassium chloride | Sigma | P3911 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma | S6014 | |
| Sodium chloride | Sigma | S9888 | |
| Sodium Deoxycholate | Sigma | D6750 | |
| Sodium dodecyl sulfate | Sigma | 436143 | |
| Sonicator | Sonic&Materials | VCX130 | |
| Tris Base | Sigma | 648311 | |
| Ultima Gold (Scintillation solution) | PerkinElmer | 6013329 | |
| α-(Methylamino)isobutyric acid | Sigma | M2383 |
References
- Xiao, M., et al. Inhibition of α-KG-dependent histone and DNA demethylases by fumarate and succinate that are accumulated in mutations of FH and SDH tumor suppressors. Genes & Development. 26 (12), 1326-1338 (2012).
- Altman, B. J., Stine, Z. E., Dang, C. V. From Krebs to clinic: glutamine metabolism to cancer therapy. Nature Reviews Cancer. 16 (10), 619-634 (2016).
- Karner, C. M., Long, F. Wnt signaling and cellular metabolism in osteoblasts. Cell and Molecular Life Sciences. 74 (9), 1649-1657 (2017).
- Zarse, K., et al. Impaired insulin/IGF1 signaling extends life span by promoting mitochondrial L-proline catabolism to induce a transient ROS signal. Cell Metabolism. 15 (4), 451-465 (2012).
- Nagano, T., et al. Proline dehydrogenase promotes senescence through the generation of reactive oxygen species. Journal of Cell Science. 130 (8), 1413-1420 (2017).
- Comes, S., et al. L-Proline induces a mesenchymal-like invasive program in embryonic stem cells by remodeling H3K9 and H3K36 methylation. Stem Cell Reports. 1 (4), 307-321 (2013).
- Fan, J., et al. Glutamine-driven oxidative phosphorylation is a major ATP source in transformed mammalian cells in both normoxia and hypoxia. Molecular Systems Biology. 9, 712 (2013).
- Hosios, A. M., et al. Amino acids rather than glucose account for the majority of cell mass in proliferating mammalian cells. Developmental Cell. 36 (5), 540-549 (2016).
- Welbourne, T. C. Ammonia production and glutamine incorporation into glutathione in the functioning rat kidney. Canadian Journal of Biochemistry. 57 (3), 233-237 (1979).
- Sullivan, L. B., et al. Supporting aspartate biosynthesis is an essential function of respiration in proliferating cells. Cell. 162 (3), 552-563 (2015).
- Nelsen, C. J., et al. Amino acids regulate hepatocyte proliferation through modulation of cyclin D1 expression. The Journal of Biological Chemistry. 278 (28), 25853-25858 (2003).
- Krall, A. S., Xu, S., Graeber, T. G., Braas, D., Christofk, H. R. Asparagine promotes cancer cell proliferation through use as an amino acid exchange factor. Nature Communications. 7, 11457 (2016).
- Green, C. R., et al. Branched-chain amino acid catabolism fuels adipocyte differentiation and lipogenesis. Nature Chemical Biology. 12 (1), 15-21 (2016).
- Shiraki, N., et al. Methionine metabolism regulates maintenance and differentiation of human pluripotent stem cells. Cell Metabolism. 19 (5), 780-794 (2014).
- Yu, Y., et al. Glutamine metabolism regulates proliferation and lineage allocation in skeletal stem cells. Cell Metabolism. 29 (4), 966-978 (2019).
- Shen, L., Sharma, D., Yu, Y., Long, F., Karner, C. M. Biphasic regulation of glutamine consumption by WNT during osteoblast differentiation. Journal of Cell Science. 134 (1), (2021).
- Karner, C. M., Esen, E., Okunade, A. L., Patterson, B. W., Long, F. Increased glutamine catabolism mediates bone anabolism in response to WNT signaling. Journal of Clinical Investigation. 125 (2), 551-562 (2015).
- Hu, G., et al. The amino acid sensor Eif2ak4/GCN2 is required for proliferation of osteoblast progenitors in mice. Journal of Bone and Mineral Research. 35 (10), 2004-2014 (2020).
- Rached, M. T., et al. FoxO1 is a positive regulator of bone formation by favoring protein synthesis and resistance to oxidative stress in osteoblasts. Cell Metabolism. 11 (2), 147-160 (2010).
- Elefteriou, F., et al. ATF4 mediation of NF1 functions in osteoblast reveals a nutritional basis for congenital skeletal dysplasiae. Cell Metabolism. 4 (6), 441-451 (2006).
- Maleknia, S. D., Johnson, R. Mass spectrometry of amino acids and proteins. Amino Acids, Peptides and Proteins in Organic Chemistry. , 1-50 (2011).
- Rennie, M. J. An introduction to the use of tracers in nutrition and metabolism. The Proceedings of the Nutrition Society. 58 (4), 935-944 (1999).
- Hahn, T. J., Downing, S. J., Phang, J. M. Amino acid transport in adult diaphyseal bone: contrast with amino acid transport mechanisms in fetal membranous bone. Biochimica Biophysica Acta. 183 (1), 194-203 (1969).
- Rosenbusch, J. P., Flanagan, B., Nichols, G. Active transport of amino acids into bone cells. Biochimica Biophysica Acta. 135 (4), 732-740 (1967).
- Kandasamy, P., Gyimesi, G., Kanai, Y., Hediger, M. A. Amino acid transporters revisited: New views in health and disease. Trends in Biochemical Sciences. 43 (10), 752-789 (2018).
