Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Respirometri i høj opløsning til vurdering af bioenergetik i celler og væv ved hjælp af kammer- og pladebaserede åndedrætsværn

Published: October 26, 2021 doi: 10.3791/63000
Automatic Translation
1, 1
1Department of Biochemistry and Developmental Biology, Faculty of Medicine, University of Helsinki

Summary

Vurdering af oxidativ phosphorylering ved hjælp af respirometre med høj opløsning er blevet en integreret del af den funktionelle analyse af mitokondrier og cellulær energimetabolisme. Her præsenterer vi protokoller til analyse af cellulær energimetabolisme ved hjælp af kammer- og mikropladebaserede respirometre med høj opløsning og diskuterer de vigtigste fordele ved hver enhed.

Abstract

Højopløsningsrespirometri (HRR) muliggør overvågning af oxidativ phosphorylering i realtid til analyse af individuelle cellulære energitilstande og vurdering af respiratoriske komplekser ved hjælp af diversificerede substrat-uncoupler-inhibitor titrering (SUIT) protokoller. Her demonstreres brugen af to højopløsningsrespirometriapparater, og en grundlæggende samling af protokoller, der gælder for analyse af dyrkede celler, skelet- og hjertemuskelfibre og blødt væv som hjerne og lever, præsenteres. Protokoller for dyrkede celler og væv leveres til et kammerbaseret åndedrætsværn og dyrkede celler til et mikropladebaseret åndedrætsværn, der begge omfatter standard respirationsprotokoller. Til sammenligningsformål anvendes CRISPR-konstruerede HEK293-celler, der mangler mitokondrietransformation, der forårsager flere luftvejsmangel, med begge enheder til at demonstrere cellulære defekter i respiration. Begge åndedrætsværn giver mulighed for omfattende måling af cellulær respiration med deres respektive tekniske fordele og egnethed afhængigt af forskningsspørgsmålet og modellen under undersøgelse.

Introduction

Mitokondrier opfylder nøgleforsyningen af energi og er en opdelt organel, der bidrager til essentielle cellulære bioenergetiske og metaboliske processer såsom anabolisme af nukleotider, lipider og aminosyrer, jern-svovlklyngebiogenese og er impliceret i signalering såsom kontrolleret celledød 1,2,3 . Mitokondriebioenergetik gennem oxidativ phosphorylering bidrager til næsten alle cellulære processer i cellen, og følgelig er mitokondrie dysfunktioner af primær eller sekundær oprindelse forbundet med et bredt spektrum af sygdomstilstande 4,5. Mitokondrie dysfunktion indebærer ikke kun ændringer i struktur eller mitokondrietæthed, men også i kvaliteten og reguleringen af åndedrætssystemet6. Dette kvalitative element omfatter substratkontrol, koblingsegenskaber, posttranslationelle modifikationer, cristae-dynamik og respiratoriske superkomplekser 7,8. Derfor er nøjagtig analyse af mitokondriebioenergetik til eksperimentelle og diagnostiske tilgange til vurdering af cellens energimetabolisme vigtig i sundhed og sygdom.

Mitokondrie oxidativ phosphorylering (OXPHOS) er en sekvens af reaktioner i åndedrætssystemet eller elektronoverførselssystemet (ETS) til dannelse af cellulær energi gennem adenosintrifosfat (ATP)9. Det multienzymatiske trin til at udnytte energi fra elektronstrøm gennem komplekser I og II til kompleks IV genererer en elektrokemisk protongradient over den indre mitokondriemembran, der efterfølgende anvendes til phosphorylering af adenosindiphosphat (ADP) til ATP via kompleks V (F1FO ATP-syntase) (figur 1A).

For det første genereres to-elektronbærere under tricarboxylcyklussen (TCA), glykolyse og pyruvatoxidation: nicotinamid-adenin-dinukleotid (NADH) og dihydroflavin-adenin-dinukleotid (FADH2). NADH oxideres ved kompleks I (NADH-dehydrogenase), hvor to elektroner overføres til coenzym Q (quinon reduceres til quinol), mens protoner pumpes ind i det intermembrane rum (IMS). For det andet oxiderer kompleks II (Succinatdehydrogenase)FADH2 og føder elektronerne til coenzym Q uden at pumpe protoner. For det tredje overføres elektroner fra coenzym Q ved kompleks III (cytokrom c oxidoreduktase) til cytokrom c, mens protoner pumpes ind i IMS. For det fjerde overfører cytokrom c elektronerne til kompleks IV (Cytochrome c oxidase), det sidste kompleks til pumpning af protoner, og hvor ilt fungerer som en elektronacceptor til at assimilere protoner og i sidste ende danne vand. Det er dette ilt, som mitokondrier forbruger, som kan måles ved en oxygraf. Endelig bruges protonerne genereret fra kompleks I, kompleks III og kompleks IV til at rotere kompleks V og derved generere ATP9.

Det er vigtigt, at elektronoverførsel ikke kun sker lineært, ellers betegnet som elektrontransportkæden. I stedet kan elektroner overføres til coenzym Q-puljen gennem flere respiratoriske veje og lette konvergent elektronstrøm. NADH-substrater og succinat kan for eksempel komme ind via henholdsvis kompleks I og kompleks II. Elektroner fra fedtsyreoxidation kan doneres via det elektronoverførende flavoproteinkompleks. En omfattende analyse af OXPHOS kræver en holistisk tilgang med passende brændselssubstrater (figur 1A).

Figure 1
Figur 1: Mitokondriel oxidativ phosphorylering og specifikke substrat- og inhibitorprotokoller. (A) Mitokondrion og skema af elektronoverførselssystemet (CI-CIV) og mitokondrie F1F0 ATP-syntase (CV). Alle strukturer er fra PDB. Tallene viser kun substrater og hæmmere beskrevet i denne undersøgelse). (B) Prøvespor af iltflux i intakte HEK293-celler ved hjælp af standardprotokol i en mHRR-enhed. (C) Prøvespor af iltflux i intakte HEK293-celler ved hjælp af standardprotokol i en cHRR-enhed. (D) Prøvespor af iltflux i permeabiliserede humane fibroblaster fra en sund donor med respektive SUIT-protokol. Forkortelser: 1 = Rutinemæssig respiration af intakte celler; 2 = Stat 2; 3 = stat 3(I) 4 = Stat 3(I) med cytC; 5 = stat 3 (I+II) 6 = Lækage (OM); 7 = ETS-kapacitet 8 = S(ROT); 9 = ROX; 10 = TMPD; 11 = Az. ROT = Rotenon, AM = Antimycin, ATP = Adenosintrifosfat, Az = Azzid, OM = Oligomycin, FCCP = Carbonylcyanid p-trifluor-methoxyphenyl-hydrazon; Asc = Ascorbat, TMPD = N,N,N′,N′-tetramethyl-p-phenylendiamin, Succ = Succinat, M = Malat, P = Pyruvat, ADP = Adenosindiphosphat, NAD = Nicotinamid-adenin-dinukleotid, IMS = Intermembranrum, FAD = Flavin adenin-dinukleotid. Klik her for at se en større version af denne figur.

Analyse af mitokondrie OXPHOS-kapacitet ved hjælp af HRR er blevet en instrumentel biokemisk metode med diagnostisk værdi ikke kun for primære mitokondriefejl10,11, men strækker sig til alle andre biologiske områder såsom kræft og aldring12. HRR tillader bestemmelse af cellulær respiration ved analyse af mitokondrie OXPHOS-kapacitet, som direkte afspejler individuel eller kombineret mitokondrie respiratorisk kompleksmangel og indirekte er forbundet med cellulær dysfunktion og ændret energimetabolisme9. Metodisk udføres respirationsmålinger ved hjælp af celler, væv eller isolerede mitokondrier 11,13,14, hvor frosset materiale kun er delvist egnet 15,16. Frosset væv har vist sig at have en intakt ETS med opretholdt superkompleks stabilitet15. I modsætning til traditionelle TCA-mellemprodukter tilføres de respektive substrater således direkte til ETS. Koblingen mellem ETS- og ATP-syntesen går imidlertid tabt, da membranintegriteten kompromitteres gennem fryseskader (iskrystaldannelse).

Respirationsforsøg finder normalt sted ved en fysiologisk temperatur på 37 °C for endotermer i enten ikke-permeabiliserede eller permeabiliserede celler eller væv. Mens førstnævnte overvejer den cytosoliske metaboliske kontekst, giver sidstnævnte det energiske bidrag fra individuelle OXPHOS-komplekser og ATPase gennem tilsætning af specifikke substrater (og hæmmere). Sekvensen og variationen af substrater og inhibitorer har ført til udviklingen af en bred vifte af SUIT-protokoller17 og assays18 for at løse forskellige videnskabelige spørgsmål om OXPHOS-funktion (gennemgået under12). Den grundlæggende protokol for cellulær respiration vurderer fire forskellige tilstande: i) rutinemæssig respiration - respirationen i et respektive respirationsmedie uden tilsætning af substrater eller hæmmere, der indtager, men endogene substrater. Denne tilstand kan afsløre generelle OXPHOS eller sekundærinducerede respirationsdefekter forårsaget af for eksempel ændrede metabolitprofiler. Dernæst afslører tilsætningen af ATPase inhibitor oligomycin permeabiliteten af den indre mitokondriemembran til protoner, defineret som ii) lækage respiration. Efterfølgende titrering af en protonofor, såsom uncoupler carbonylcyanid p-trifluor-methoxyphenyl-hydrazon (FCCP), gør det muligt at bestemme den tilstand, hvor ETS-kapaciteten er maksimal i en åben transmembran protonkredsløbstilstand, defineret som iii) ukoblet respiration. Det er vigtigt, at en ukoblet tilstand også kan forekomme ved eksperimentelle indgreb gennem overdreven mekanisk skade på mitokondriemembranerne. Omvendt refererer den ikke-koblede tilstand til respiratorisk afkobling af en iboende mekanisme, der er fysiologisk kontrolleret. Endelig bestemmer fuldstændig hæmning af ETS ved tilsætning af den komplekse III-hæmmer antimycin og kompleks I-hæmmer rotenon resterende iltforbrug (ROX) fra ikke-mitokondrie iltforbrugende processer (figur 1A-C).

Mitokondrie bioenergetik består af fem forskellige respirationstilstande19,20. Tilstand 1 respiration er uden yderligere substrater eller ADP, bortset fra hvad der er endogent tilgængeligt. Efter tilsætning af ADP, men stadig ingen substrater, opnås tilstand 2 respiration. Når substrater tilsættes, hvilket tillader elektronoverførsel og ATP-syntese, nås tilstand 3 respiration. I denne tilstand kan OXPHOS-kapacitet defineres ved mættende koncentrationer af ADP, uorganisk phosphat, oxygen, NADH- og succinatbundne substrater. Tilstand 4 respiration eller LEAK respiration kan defineres som en tilstand uden ADP eller kemisk hæmmede ATP syntaser, mens de har tilstrækkelige substrater. Endelig, når al ilt er udtømt (anoxisk) i en lukket kammerindstilling, observeres tilstand 5 respiration.

Der findes flere metoder til at vurdere cellulære energitilstande14 med to enheder, der dominerer den aktuelle realtidsvurdering af OXPHOS gennem analyse af iltforbrug, målt som funktionen af faldet i ilt over tid i et lukket kammersystem med forskellig anvendelighed afhængig af den eksperimentelle model og forskningsspørgsmål: Oroboros 2k højopløsningsrespirometer og Seahorse XF ekstracellulær fluxanalysator. Begge enheder registrerer iltforbrugshastighederne som et fald i picomomer (pmol) af ilt (O2) pr. Sekund som en absolut værdi i kammeret eller mikropladebrønden. Det specifikke iltforbrug pr. masse opnås ved at normalisere det respektive iltforbrug i en specifik bufferopskrift pr. antal celler (millioner), vævsvægt (mg) eller proteinmængde.

O2k (Oroboros Instruments) er et lukket to-kammersystem udstyret med en polarografisk iltføler (forkortet som kammerbaseret højopløsningsrespirometer: cHRR). Hvert forsøgskammer indeholder 2 ml væske, som holdes homogent af magnetiske omrørere. Den polarografiske iltføler anvender en amperometrisk tilgang til måling af iltet: den indeholder en guldkatode, en sølv / sølvchloridanode og imellem en KCI-opløsning, der skaber en elektrokemisk celle, hvorpå en spænding (0,8 V) påføres. Oxygen fra assaymediet diffunderer gennem en 25 μm fluoreret ethylenpropylenmembran (O 2-permeabel) og gennemgår reduktion ved katoden, der producerer hydrogenperoxid. Ved anoden oxideres sølv af hydrogenperoxid, der genererer en elektrisk strøm. Denne elektriske strøm (ampere) er lineært relateret til det delvise ilttryk. Partialtrykket af ilt og iltopløselighedsfaktoren for assaymediet anvendes til at beregne iltkoncentrationen. Da iltpartialtrykket er afhængigt af forsøgstemperatur, og polarografiske målinger er temperaturfølsomme, kræver temperaturudsving præcis (±0,002 °C) regulering af en Peltier-varmeblok. Temperaturen kan styres inden for et område på 4 °C og 47 °C.

Seahorse XF ekstracellulær fluxanalysator (Agilent) er et pladebaseret system med 24- eller 96-brønds mikropladeformat, hvor tre fluorescenselektroder måler iltforbruget over tid i hver brønd (forkortet mikropladebaseret højopløsningsrespirometer: mHRR). Der er maksimalt fire porte i analysepatronen til rådighed til automatisk injektion under analysen. Et assay indeholder flere cyklusser, hver med tre faser: 1) blanding, 2) venter og 3) måling. I målefasen sænkes sensorsonder ned i mikropladen, hvilket skaber et midlertidigt lukket kammer indeholdende 7-10 μL volumen for at måle udsendt lys. Dette lys udsendes af polymerindlejrede fluorophorer på spidsen af sensorsonderne, som sanserO2 baseret på phosphorescensslukning. Fluorescenssignalets intensitet er proportional medO2 og påvirkes af temperaturen på sensoren og analysemediet. Derfor kræver nøjagtig iltestimering en relativ tilgang med en baggrundsbrønd uden nogen prøve. Gendannelse af iltkoncentration sker i blandingsfasen, når sensoren bevæger sig op og ned for at blande volumenet over det midlertidige kammer. Hver cyklus beregner en iltforbrugshastighed. Temperaturen kan styres inden for et område på 16 °C og 42 °C.

HRR er guldstandarden til vurdering af cellulær bioenergetik i primære og mitokondrier-associerede sygdomme og generel cellulær metabolisme. I denne undersøgelse gives grundlæggende protokoller for HRR til vurdering af OXPHOS-funktion i celler og væv.

Figure 2
Figur 2: Arbejdsgang for celle- og vævspræparater til cHRR og celleforberedelse til mHRR-respirometri. (A) Oversigt over leverede protokoller. (B) Pattedyrceller (trin 1.2): HEK293 pellet svarende til 3 x 106 celler (venstre panel). Ikke-fibrøst væv (trin 1.3): Fremstilling af murin cerebellum lysat i 2 ml teflon keramiker (midterste panel). Saponin-induceret skeletmuskelpermeabilisering (trin 1.4) højre panel) til cHRR-åndedrætsværn. (C) Standard mikropladesåningslayout (trin 2.4) og sammenløbskontrol til analyse af eukaryote celler (HEK293) til mHRR-respirometri. (D, E) Skema for injektionsportbelastning til mHRR-åndedrætsværn (trin 2.4). Klik her for at se en større version af denne figur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle dyreforsøg udføres i overensstemmelse med National Animal Experiment Review Board og Regional State Administrative Agency for Southern Finland. C57BL/6JOlaHsd-hanmus (4-6 måneder gamle) blev anvendt i dette studie. Samtykke til anvendelse af humane cellelinjer blev indhentet fra den institutionelle etiske komité ved Universitetet i Helsinki.

1. Respirometri i høj opløsning: Kammerbaseret åndedrætsværn (cHRR)

BEMÆRK: Eksperimenterne i dette afsnit af protokollen blev udført ved hjælp af Oroboros O2k-Core: Oxygraph-2k (Materialetabel)

  1. Kalibrering af iltfølere
    1. Fordrevne åndedrætsværn ved 37 °C i 2,1 ml mitokondrie respirationsmedium (MiR05, tabel 1, opløselighedsfaktor: 0,92) i >45 min og udfører iltkalibrering som beskrevet21. Fortsæt, hvis baseline variation er inden for ± 4 pmol / s.
      BEMÆRK: Store udsving i baggrundssignalet kan indikere nødvendig vedligeholdelse af sensormembranen eller spor af inhibitorer, der forbliver i kammeret fra tidligere eksperimenter. En instrumentel baggrunds oxygenfluxkorrektion anbefales forud for et parti eksperimenter25.
    2. Registrer iltkalibreringsværdier for at overvåge sensormembranens ydeevne over tid.
      BEMÆRK: Dette afslører sensorfunktion, signal-støj-stabilitet, og hvornår vedligeholdelse af sensormembranen er påkrævet. Afhængig af omgivende tryk opløses mellem 180-200 μmol ilt i MiR05.
    3. Fjern al væske i kammeret inden tilsætning af en prøve i respirationsmediet.
      BEMÆRK: Evaluer mængden af respirationskamre til at være nøjagtigt 2 ml regelmæssigt.
  2. Forberedelse af celler til højopløsningsrespirometri
    1. Kultur HEK293 celler i 10 cm2 diameter fade i Dulbecco's Modified Eagle's medium (DMEM) med høj glucose suppleret med 10% varmeinaktiveret føtalt bovint serum (FBS), GlutaMax, Ikke-essentielle aminosyrer og Na-Pyruvat22 og uridin23 for at understøtte OXPHOS-defekt metabolisme i en inkubator ved 37 ° C ved 5% CO2.
      BEMÆRK: Enhver form for eukaryot celle kan dyrkes. For de fleste celletyper fører dyrkning af en 10 cm2 skål til tilstrækkelige celler (normalt >3 x 106 celler). Kontroller rutinemæssigt for mycoplasmainfektion for at undgå virkninger på cellulær metabolisme og respiration.
    2. Dyrk celler uden at overstige 90% sammenløb (figur 2C).
      BEMÆRK: Celler med >90% sammenløb kan vise vækstafhængige hæmmende virkninger på respiration (hvis ikke synkroniseret eller post-mitotisk).
    3. Vask cellerne med 1x PBS, fjern med 1 ml varm 0,25% trypsin, deaktiver trypsin ved at tilsætte varm DMEM (5 ml / 10 cm2 plade) og tæl cellerne med et hæmocytometer.
    4. Centrifuger forsigtigt celleopløsningen svarende til 2,5 x 106 celler ved 300 x g i 5 minutter, fjern supernatanten fuldstændigt, og resuspend i 2,5 ml varm MiR05 (1 x 106 celler / ml) (figur 2A).
    5. For suspensionsceller tælles og fjernes opløsning svarende til 2,5 x 106 celler, pellet og fortsættes som nævnt i trin 1.2.4.
    6. Suit-protokollen til optimering af permeabilisering (trin 1.6), permeabiliseret celle eller væv (trin 1.5) eller intakte celler (trin 1.7)
      BEMÆRK: For konsistente resultater anbefales det at holde cellekoncentrationen konstant (f.eks. 1 x 106 celler / ml). Selvom respiration er uafhængig af celletætheden i respirometeret24, er substrater og hæmmere i sammenlignelig koncentration gennem forsøg, hvis cellenumre holdes konstante.
  3. Forberedelse af ikke-fibrøst væv (f.eks. Hjerne, lever) til respirometri i høj opløsning
    1. Skær et homogent stykke væv, 30-40 mg i vægt, eller brug hele organet (musecerebellum i dette tilfælde).
      BEMÆRK: Hvis væv ikke anvendes straks, opbevares i 2 ml iskold MiR05, hvilket giver konservering i op til 2 timer for de fleste væv. Individuelle vævsopbevaringstider skal vurderes i tidsserier.
    2. Tør vævet tørt med et Whatman-filterpapir (forsigtigt: blødt vævsmateriale har tendens til at klæbe fast).
    3. Anbring 30-40 mg vævsstykket i en iskølet 2 ml polytetrafluorethylen keramiker Elvehjem homogenisator.
    4. Der tilsættes en passende mængde MiR05 for at opnå 20 mg/ml for at opretholde væv-til-buffer-forholdet. Hold den samlede mængde >1,5 ml og <2 ml for at undgå utilstrækkelig eller overdreven væske til passende mekanisk permeabilisering.
    5. Indsæt pistlen, lys vævet langsomt ved at trække pistlen forsigtigt tilbage, samtidig med at man undgår, at der opstår et vakuum, der forårsager overdreven vævsskade.
    6. Udfør 7 slag i alt (1x defineret som et op- og nedadgående slag), indtil det lyser (tilsyneladende som en uklar væske uden større snavs) (figur 2B).
      BEMÆRK: Antallet af slagtilfælde for passende lysis skal testes for hvert væv ved at vurdere ydre mitokondriemembranintegritet via cytokrom C-respons (trin 1.5.11). Bindevæv eller kardele, der er svære at lyse, kan forblive.
    7. Dekanter det lysede væv i et 15 ml centrifugerør.
    8. Vask indersiden af keramikeren med en lige stor mængde MiR05, der anvendes i lysingstrin (f.eks. 1,5 ml), og tilsæt til 15 ml rør, der nu indeholder 3-4 ml MiR05 ved 10 mg / ml vævslysat.
    9. Tilsæt 2 ml almindelig MiR05 pr. kammer for at varme op til 37 °C.
    10. Hvirvl røret for lige fordeling, før 500 μL (svarende til 5 mg) af hvert lysat pr. kammer pipetteres langsomt for at minimere belastningen fra kulde til 37 °C.
    11. Vent >3 min på, at kammerets indhold er opvarmet til 37 °C, før du lukker kammeret. Fjern overskydende væske oven på proppen (mængde pr. Kammer efter lukning: 4 mg).
    12. Suit-protokollen køres for standardpermeabiliseret (trin 1.5).
  4. Forberedelse af fibrøst væv (skeletmuskulatur, hjertemuskel) til respirometri med høj opløsning
    1. Ekstraher det hårde væv, fjern bindevæv og fedt fra musklerne ved hjælp af skarpe tang i 2 ml iskold BIOPS (tabel 2) under et dissektionsmikroskop.
    2. Adskil fiberbundterne (~ 4 mg) langs længdeaksen med skarpe tang. Drill fibrene tilstrækkeligt til at opnå en maskelignende struktur (figur 2B).
      BEMÆRK: Korrekt mekanisk fiberseparation og permeabilisering er indikeret ved tab af det røde pigment myoglobin og øget gennemskinnelighed.
    3. Fiberbundtet vaskes og permeabiliseres i saponin (50 μg/ml i BIOPS, tilberedt frisk) i 20 minutter ved 4 °C (fibrene bliver gennemskinnelige, hvilket indikerer fuldstændig permeabilisering, figur 2B).
    4. Vask fibrene to gange i MiR05 i 5 min pr. vask ved 4 °C.
    5. Tør med filterpapir og vej, inden der tilsættes kammeret fyldt med 2,1 ml MiR05.
    6. Indfør propper uden at lukke helt, ilt derefter kamrene med 2 ml ren O2 ved hjælp af en 20 ml sprøjte og luk kamrene ved at dreje propperne i en roterende bevægelse. HoldO2-koncentrationen mellem 300-500 μM under eksperimentet for at undgå iltdiffusionsbegrænsning.
  5. Protokol til vurdering af rutinemæssig respiration i celler eller væv
    1. Der tilsættes prøve til kammeret som nævnt i trin 1.5.2-1.5.3.
    2. Der tilsættes 2,3 ml varm MiR05-cellesuspension (standardindgang: 1 x 106 celler/ml som i trin 1.2 eller 2 mg væv/ml som i trin 1.3)
    3. Skelet- og hjertemuskel (trin 1.4): Tilsæt ~ 4 mg saponin-permeabiliserede fibre til forvarmte 2,3 ml varm MiR05 i betragtning af trin 1.4.4-1.4.6
    4. Kamrene køres ved 37 °C og har en omrøringshastighed på 700 o/min. Vent >3 min for at lade mediet afgasse og lukke kamrene ved at dreje proppen i en roterende bevægelse. Peltier blokstabilisering indikerer at nå den indstillede temperatur.
    5. (VALGFRIT) Omrørerhastigheden ændres til 300 o / min for at lade de resterende bobler slippe ud gennem proppens kapillær.
    6. Opsuge overskydende væske oven på proppen. Vent i 10 minutter, indtil der opnås et stabilt iltfluxsignal med en hvilken som helst prøvetype for at registrere rutine/tilstand 1 respiration, figur 1B).
    7. For respirationsmålinger i permeabiliserede celler og væv fortsættes med trin 1.6. For intakte celler med trin 1.8.
  6. Protokol for OXPHOS-analyse i permeabiliserede celler eller væv
    1. Brug lysed (permeabilized) vævsprøve eller permeabilize celler ved at tilsætte 1 μL digitonin (8,1 mM digitonin lager i dimethylsulfoxid (DMSO)) til en endelig koncentration på 5 μg / ml for at permeabilisere celler. Fluxen falder og skal stabilisere sig ved >5 min.
      FORSIGTIG: Digitonin er akut giftigt for luftvejene, i kontakt med huden eller ved indtagelse.
      BEMÆRK: Injektion af alle kemikalier udføres med præcisionsglassprøjter. Brug kun sprøjter til angivne kemikalier for at undgå krydskontaminering og vask grundigt i vand og EtOH efter brug. Blokerede sprøjter kan kræve ultralydbehandling i varm ddH2O eller en rengøringstråd for at løsne eventuelle kemiske træsko. Træk altid et overskud af den respektive stamopløsning ind i sprøjten for at undgå at tilføre luft i kamrene. Undersøg indersiden af kamrene for indføring af luft efter hver injektion. Optag hvert trin indtil fluxplateauer.
    2. Der tilsættes hurtigt efter hinanden: 5 μL 0,4 M malat (M) for en slutkoncentration på 1 mM, 5 μL 2,0 M pyruvat (P; tilberedt frisk), i en slutkoncentration på 5 mM, 4 μL 2,5 M glutamat (G) ved en slutkoncentration på 5 mM.
    3. Efter tidligere flux plateaued tilsættes 5 μL (10 μL for muskelvæv) 0,5 M adenosindiphosphat (ADP, aliquoter opbevaret ved -80 °C) til en slutkoncentration på 1,25 mM.
      BEMÆRK: Væv som muskel kan have brug for en anden koncentration for at nå mætning.
    4. Der tilsættes 5 μL 4 mM cytokrom C (cytC) til en slutkoncentration på 10 μM.
      BEMÆRK: Valgfrit for celler at vurdere kvaliteten af permeabilisering.
    5. Der tilsættes 16 μL 1,25 M succinat (S) til en slutkoncentration på 10 mM. (VALGFRIT) Der tilsættes 3 μL 0,5 M ADP for en slutkoncentration på 2 mM for at kontrollere mætningen af ADP-koncentrationen.
    6. For celler og ikke-fibrøst væv tilsættes 2 μL 1 mg/ml oligomycin (OM) til en slutkoncentration på 1 μg/ml.
      FORSIGTIG: Alle anvendte ETS-hæmmere er meget giftige.
      BEMÆRK: Oligomycin kan kræve titrering for optimal koncentration, da det kan undertrykke ETS-kapacitet og udelades for muskelvæv. Reoxygener her, når muskelvæv analyseres, og hvisO2 er under 300 μM.
    7. Titr FCCP fra en 2 mM-bestand, tilsæt 0,6 μL med efterfølgende 0,2 μL trin, indtil ingen stigning i respiration og respiration maksimalt er afkoblet (teoretisk: ikke-koblet).
    8. Der tilsættes 1 μL 1 mM rotenon (ROT) til en slutkoncentration på 0,5 μM. Der tilsættes 2 μL 1 mg/ml antimycin (AM) lager for en slutkoncentration på 1 μg/ml.
    9. Reoxygenerer kamrene for at opnå et lignende iltniveau (~ 150 μM) i alle kamre ved langsomt at løfte stemplet i vridningsbevægelse.
    10. Der tilsættes 5 μL 0,8 M ascorbat til en slutkoncentration på 2 mM umiddelbart efterfulgt af 5 μL 0,2 M N,N,N′,N′-tetramethyl-p-phenylendiamin (TMPD) til en slutkoncentration på 0,5 mM for at vurdere kompleks IV-aktivitet (valgfrit).
    11. Der tilsættes 5 μL 4 Mazid for en slutkoncentration på 10 mM umiddelbart, når topO2 flux er nået med TMPD. Fortsæt kørslen i >5 minutter for at analysere autooxidation af TMPD til beregning af komplekst IV-basisniveau.
    12. Fortæl cellerne igen for at bekræfte celletællingen før kørsel, og fortsæt med trin 1.9.
      BEMÆRK: Digitonin-permeabilisering (kun for celler) skal titreres i forsøgsforsøg for at opnå maksimal flux og ikke påvirke mitokondriemembranintegriteten (se trin 1.7). Permeabiliserede prøver (især muskelvæv) med >10% stigning i respirationshastighed efter tilsætning af cytokrom c bør udelukkes fra yderligere analyse på grund af ydre mitokondriemembranskade. Der forventes et kortvarigt dyk i flux efter tilsætning af EtOH-opløste kemikalier.
  7. Protokol til bestemmelse af optimale permeabiliseringsbetingelser for celler
    1. Tilføje celler som beskrevet i trin 1.2 og 1.5.2.
    2. Der tages 10 μL 10 mg/ml digitonin-lager, og der tilsættes 10 μL DMSO for at fortynde til 5 mg/ml.
    3. Der tilsættes 1 μL rotenon (1 mM lager). Der tilsættes 10 μL succinat (2 mM lager) og 5 μL ADP (0,5 M lager).
    4. Titrér 1 μL digitonin (2,5 mg pr. trin) gentagne gange, indtil respirationen ikke øges yderligere og er maksimal.
      BEMÆRK: Et fald i respiration indikerer en overdreven koncentration af digitonin.
  8. Protokol for OXPHOS-analyse i intakte celler
    1. Efter rutinemæssig respiration (trin 1.6.1-1.6.6) tilsættes 2 μL 0,01 mM oligomycin til en slutkoncentration på 10 nm.
    2. Titr FCCP fra 2 mM lager, tilsæt 0,6 μL med efterfølgende 0,2 μL trin, indtil der ikke er yderligere stigning i respiration og respiration maksimalt afkoblet (teoretisk: ikke-koblet)
    3. Der tilsættes 1 μL 1 mM rotenon til en slutkoncentration på 0,5 μM. Der tilsættes 2 μL 1 mg/ml antimycinbestand til en slutkoncentration på 1 μg/ml.
    4. Reoxygenerer kammeret til det samme iltniveau (~ 150 μM) ved langsomt at løfte stemplet i vridningsbevægelse.
    5. Der tilsættes 5 μL 0,8 M ascorbat ved slutkoncentration på 2 mM. Der tilsættes straks 5 μL 0,2 M TMPD for en slutkoncentration på 0,5 mM for at vurdere kompleks IV-aktivitet.
      BEMÆRK: Forbered en frisk batch før et større sæt eksperimenter, da TMPD er tilbøjelig til autooxidation. Aktiviteten kan falde over tid, når den opbevares ved -20 °C.
    6. Der tilsættes 5 μL 4 Mazid for en slutkoncentration på 10 mM umiddelbart, når topO2 flux er nået med TMPD. Fortsæt med at køre i >5 minutter for at analysere autooxidation af TMPD til kompleks IV-beregning af basisniveau.
    7. Genoptælle celler for at bekræfte celletællingen før kørsel og fortsætte med trin 1.9.
  9. Indsamling af eksempler efter kørsel
    1. Saml nøjagtigt 1 ml MiR05-suspension fra hvert kammer (med omrørere på) i et 1,5 ml rør 1,5 ml rør.
    2. Centrifuge ved 1000 x g for permeabiliserede celler eller ved 20.000 x g for vævslysat. Supernatanten fjernes, og pelleten fryses ved -80 °C med henblik på videre forarbejdning (punkt 3).
  10. Analyse af SUIT protokoller
    1. Analyser iltflux (pmol / s, normaliseret til input) på hvert plateau efter tilsætning af et substrat eller inhibitor (figur 1C og figur 3A). Eksportér værdierne til et regneark.
    2. Træk værdien for det resterende iltforbrug (ROX, figur 1C og figur 3C) fra alle værdier for hver eksperimentel kørsel. Træk azidrest respiration fra TMPD for at opnå kompleks IV respiration.
    3. Afbild de absolutte værdier normaliseret for celle (figur 3A, B) eller vævsinput (figur 5A,B). Fluxkontrolforholdene (trin 1.11) beregnes, eller de normaliseres til proteintilførsel (figur 3C).
  11. Beregning af fluxkontrolforhold
    1. Få et indeks for åndedrætsfunktion og koblingskontrol ved hjælp af fluxkontrolforhold (FCR)9,26.
      BEMÆRK: Dette gør det muligt at vurdere iboende mitokondriekvalitet, uafhængig af mitokondriekvantitet. Derudover er fluxkontrolforhold (FCR) sammenlignelige inden for de samme cellelinjer, hvilket muliggør reagenskvalitetskontrol (respektive FCR'er opnås gennem de angivne nummererede referenceværdier i figur 1B-D og figur 3C).
    2. Respirationskontrolforholdet for koblingen af OXPHOS til LEAK beregnes ved hjælp af ligning 1.
      Ligning 1: FCRADP = 5/6 = Stat 3 / Stat 4
    3. Beregn FCR for at vurdere NADH-afhængig respiration ved hjælp af ligning 2
      Ligning 2:FCR-tilstand 3 (I) = 3/5 = tilstand 3 (I) / stat 3 (I +II)
    4. Beregn FCR for at vurdere Succinatafhængig respiration ved hjælp af ligning 3.
      Ligning 3:FCR-tilstand 3 (II) = 8/7 = Srot /ETS-kapacitet
    5. Beregn FCR for at vurdere koblet til frakoblet ved hjælp af ligning 4.
      Ligning 4: FCRkoblet/frakoblet = 5/7 = Tilstand 3 (I+II) / ETSkapacitet
    6. For at teste mitokondrie ydre membranintegritet skal du bruge ligning 5.
      Ligning 5: % mitokondrie ydre membranskade = 3/4 = tilstand 3 (I) / tilstand 3 (I) med cyt c

2. Respirometri i høj opløsning: Mikropladebaseret åndedrætsværn (mHRR)

BEMÆRK: Eksperimenterne i dette afsnit af protokollen blev udført ved hjælp af Seahorse XFe96 Extracellular Flux Analyzer (Material Table of Materials)

  1. Cellekultur
    1. Kultur enhver form for celle. Tilhængere (f.eks. Kollagen, laminin) kan bruges til at lette cellebinding. Her dyrkes HEK293-celler som før (trin 1.3).
    2. Dagen før eksperimentet skal du løsne cellerne og overføre dem til en udpeget mHRR 96-brønd mikroplade for at opnå ideel sammenløb på eksperimentets dag (80% -100%) (figur 2C).
      BEMÆRK: For mHRR er mikropladecelletætheder kritiske. Individuelle vækstegenskaber af cellelinjer eller behandlinger, der påvirker væksten, skal redegøres for for at sikre sammenlignelig sammenløb på dagen for eksperimentet.
  2. Forberedelse af celler til højopløsningsrespirometri
    1. Høst og resuspend cellerne tilstrækkeligt inden såning
      BEMÆRK: Det anbefales at frø celler fra samme fortynding til replikater.
    2. Frø cellerne i henhold til vækstrater for individuelle cellelinjer eller vækstegenskaber under behandling.
      BEMÆRK: Optimer på en standard 96-brønd mikroplade og ekstrapoler celletætheden til en 96-brønds assay-specifik mikroplade. I denne opsætning blev 7 x 104 HEK293 WT-celler podet pr. Brønd af en 96-brønd. Den første og sidste kolonne i pladen med 96 brønde anvendes til proteinbestemmelse (figur 2C). De fire hjørnebrønde bør ikke indeholde nogen celler og bruges til eksperimentel baggrundskorrektion. Ideelt set er brønde tæt på kanterne tomme for at minimere kanteffekten (f.eks. Viser celler ændrede vækstrater forårsaget af temperatureffekter) (figur 2C, D).
  3. Fremstilling af sensorplader, belastning af inhibitorer
    1. På dagen for analysen skal du supplere 38,8 ml medium med 0,4 ml 1 M glucose, 0,4 ml 200 ml glutamin og 0,4 ml 100 ml Na-pyruvat.
      BEMÆRK: mHRR-respiration kræver et specialiseret ikke-bufferet DMEM-medium ved pH 7,4. Generelt bør 40 ml være tilstrækkeligt til et forsøg med en 96-brønd mikroplade.
    2. Respirationsassaymediet opvarmes til 37 °C, og cellekulturmediet udskiftes med respirationsassaymediet ved at vaske to gange med 80 μL pr. brønd.
    3. Sæt pladen med cellerne i en 37 °C inkubator uden CO2 i 60 minutter før analysen.
      BEMÆRK: Dette trin er vigtigt for at afgas pladen, da CO2 kan påvirke respirationsresultaterne, og serum i mediet kan producere bobler under analysen.
    4. Præwarm inhibitor aliquots for OM, FCCP, ROT og AM til 37 ° C og tage sensorpladen ud af inkubatoren.
    5. Fortynd OM, FCCP, ROT og AM i 3 ml assaymedium til en endelig brøndkoncentration på henholdsvis 1,5 μM, 1,125 μM og 1 μM. Udfyld separate porte som angivet i figur 2E.
      BEMÆRK: En multikanalpipette anbefales til at fylde sensorpatronen. Da trykluft bruges til at injicere forbindelser, skal alle porte fyldes med en lige stor mængde væskevolumen, når en port er fyldt med en forbindelse. ROT og AM kan kombineres i en port. Inhibitorer kan opløses i EtOH eller DMSO.
    6. Undersøg injektionsportene, og kontroller en jævn lastvolumen for hver port.
      BEMÆRK: Alle porte indeholder et hul i bunden til injektion. Der skal udvises forsigtighed, når du flytter sensorpladen. Luftbobler kan fjernes ved hjælp af en nål.
  4. Protokol til iltvurdering i intakte celler
    1. Dagen før analysen udføres trin 2.4.2-2.4.7.
    2. Aliquot 20 ml af kalibrantopløsningen i et 50 ml konisk rør.
    3. Åbn extracellular Flux Assay Kit, og fjern indholdet.
    4. Placer sensorpatronen omvendt ved siden af brugspladen. Pipetter 200 μL kalibrantopløsning i hver brønd på brugspladen.
    5. Fastgør sensorpatronen på brugspladen og vær opmærksom på, at alle sensorer er nedsænket.
    6. Sæt pladen i en 37 °C inkubator uden CO2 natten over eller mindst 12 timer. Kontroller, at fugtigheden inde i inkubatoren er tilstrækkelig til at forhindre fordampning af kalibranten.
    7. Tænd for det mikropladebaserede system og computeren for at være klar til brug den næste dag (maskinen kræver mindst 3 timer for at afbalancere til 37 ° C, før der udføres et assay).
      BEMÆRK: For signalstabilitet skal du øge målepunkterne til 6 i stedet for 3 målecyklusser pr. respirationstilstand. Hver cyklus består af 3 min blanding og 3 min måling.
    8. På dagen for XF-analysen udføres trin 2.4.9-2.4.20.
    9. Kontroller sammenløbet af cellekulturpladen, cellernes morfologi, og at baggrundsbrønde er tomme.
    10. Cellerne vaskes med det tilberedte respirationsmedium som nævnt i trin 2.4.11-2.4.12.
    11. Fjern alle undtagen 20 μL af kulturmediet fra hver brønd. Fjern 55 μL, hvis dyrkningsmediet var 80 μL på grund af fordampning natten over (ca. 5 μL).
    12. Celler vaskes to gange med 90 μL assaymedium. Til sidst tilsættes 100 μL assaymedium. Slutvolumenet skal være 120 μL.
      BEMÆRK: En multikanalpipette anbefales til dette trin for at sikre, at den samme vaskeprocedure er blevet anvendt på hver eksperimentel tilstand (afhænger af pladeopsætningen). Når du aspirerer, skal du vippe pladen til en vinkel på 45 ° og placere pipettespidserne i hjørnet af brøndene til aspiration og injektion af væsker. Det er bydende nødvendigt at være forsigtig under vask, da visse celler let kan løsne sig fra bunden af cellekulturpladen.
    13. Sæt pladen i en 37 °C inkubator uden CO2 i 60 minutter før analysen.
    14. Hent den hydrerede sensorpatronplade fra den CO2-fri inkubator.
    15. Kassér den gamle kaliberopløsning, og udskift den med frisk kalibrantopløsning, der er forvarmt til 37 °C.
    16. Forbered inhibitorer og assaymedium (3 ml pr. inhibitor for i alt 12 ml assaymedium) og brug et pipettereservoir til inhibitorbelastning i porte.
    17. Åbn softwaren, og kør en foruddesignet eller ny skabelon. Udfyld pladekortet, juster titreringerne og målecyklusserne, og tryk derefter på Start for at starte kalibreringen af de optiske sensorer.
    18. Fjern låget fra den indlæste patron, og placer det i åbningen, der automatisk glider ud af maskinen, og kontroller, at markeringerne i nederste højre hjørne af pladen stemmer overens med trekanten i nederste højre hjørne af spalten.
    19. Klik på Fortsæt for at udføre automatisk kalibrering, der varer ca. 20 min.
    20. Efter kalibrering fjernes brugspladen, der indeholder kalibranten.
    21. Fjern låget fra mikropladen, der indeholder cellerne, og placer pladen i åbningen, når maskinen beder om det. Klik på Fortsæt for at starte kørslen.
  5. Indsamling af eksempler efter kørsel
    1. Tag pladen ud af maskinen, fjern forsigtigt det resterende analysemedie uden at forstyrre cellerne, og frys hele pladen ved -80 °C til videre behandling (punkt 3).

3. Bestemmelse af protein ved hjælp af bicinchoninsyreassay (BCA-assay)

  1. Fortyndet bovint serumalbumin (BSA) fremstilles i buffer, der anvendes til proteinekstraktion, og som er kompatibel med BCA: 2 mg/ml, 1,5 mg/ml, 1 mg/ml, 0,5 mg/ml, 0,25 mg/ml og 0 mg/ml til standardkurve i dubletter.
  2. Proteinerne ekstraheres ved at pumpe dem i en passende lysisbuffer (f.eks. RIPA) med 20 μL pr. brønd for mHRR eller 100 μL pr. pellet indeholdt i et 1,5 ml rør til cHRR.
  3. Inkuber mHRR-pladen eller 1,5 ml rør indeholdende proteinlysater i 30 minutter på is.
  4. 1,5 ml tuben indeholdende proteinlyset centrifugeres ved 4 °C ved 20.000 x g i 20 minutter, og den resulterende supernatant overføres til et nyt rent 1,5 ml rør.
  5. Brug 10 μL pr. prøve i dubletter og standarder i en mikrotiterplade. Der tilsættes 200 μL BCA-arbejdsreagens og inkuberes i >15 min.
  6. Pladen aflæses i et standardspektrofotometer ved en bølgelængde på 562 nm, og proteinkoncentrationerne beregnes ved hjælp af en BSA-standardkurve.
  7. Normaliser respirationsresultaterne til proteinkoncentrationen.
    BEMÆRK: Normalisering til proteinmængde gør det muligt at bekræfte cellesåningstætheder eller vådvægtindgang. De ekstraherede proteiner er egnede til efterfølgende immunblotting mod underenheder af ETS for eksempel, men repræsenterer ikke fuldt ud den oprindelige prøve (f.eks. Tab af phosphoryleringssteder).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Her leverer vi protokoller til bestemmelse af mitokondriebioenergetik i eukaryote celler, ikke-fibrøst væv (f.eks. Cerebellum) og fibrøst væv (f.eks. Skeletmuskulatur). For eukaryote celler blev HEK293 med CRISPR-konstrueret knockout af to forskellige proteiner forbundet med mitokondrietransposition, der resulterede i multiple (CRISPRKO1) og svær/komplet OXPHOS-mangel (CRISPRKO2), målt med enten cHRR (figur 3A-C) eller mHRR (figur 3A-D).

For cHRR blev HEK293-celler digitonin-permeabiliseret, og respirationseksperimenter udført efter standardprotokollen (trin 1.5-1.6) og blev registreret med succes (figur 3A). CRISPRKO1 viser nedsat og CRISPRKO2 ingen respiration sammenlignet med WT, når den normaliseres til celleindgangsmængde (figur 3B). Proteinmængde blev bestemt ud fra indsamlede prøver (afsnit 3), og værdier af rutinemæssig respiration blev normaliseret til proteinmængde for at beregne absolutte værdier og respektive FCR'er (figur 3C, betydningen af hver FCR er detaljeret i diskussion). Optimale prøvemængder producerer fluxer på 80-160 pmol / s pr. Ml. Ideelt set er mængden af celler eller væv tilstrækkelig til at generere en signifikant flux (20 pmol / s for cHRR) for at reducere baggrundsstøj, mens man undgår overdreven reoxygenering under et eksperiment. Ved lav respiring (f.eks. hvidt fedtfedt, hvide blodlegemer) eller prøver, der er svære at få (f.eks. iPS-differentierede neuronale afstamninger), er fluxer på 20 pmol /s pr. Ml tilstrækkelige under ideelle arbejdsforhold.

Figure 3
Figur 3: Repræsentative standardprotokol iltforbrugsspor fra cHRR ved hjælp af HEK293-celler med kombineret OXPHOS-mangel. (A) Rå iltforbrugsspor af WT HEK293-celler og HEK293-celler med CRISPR-medierede mitokondrietranslationsfejl, der forårsager multipel OXPHOS-mangel (CRISPRKO1,2). (B) Overlejrede celleindgangsnormaliserede iltforbrugsspor fra (A). (C) Proteinnormaliseret kvantificering af to uafhængige eksperimenter (middelværdi og SD) og respektive FCR'er. Sammenligninger mellem betingelser blev udført af ANOVA og a posteriori Tukeys test eller en Student's t-test. Betydninger: **** p < 0,0001; p < 0,001; ** p < 0,01; * p < 0,05. Klik her for at se en større version af denne figur.

Dernæst brugte vi mHRR med de samme celler i en standardprotokol (2.1-2.5), der bekræftede OXPHOS-manglerne (figur 4A). Derudover blev ECAR-værdierne øget for alvorlig/komplet OXPHOS-mangel (CRISPRKO2), hvilket tyder på kompensation for mitokondrie oxidativ phosphoryleringsmangel i HEK293-celler med specifik mitokondrietranslationsmangel gennem øget glykolyse, hvilket resulterer i laktatproduktion (figur 4A). Proteinmængden blev bestemt ud fra mikrobrøndpladen (afsnit 3), og de opnåede værdier blev normaliseret til proteinmængde (figur 4B) og kvantificeret (figur 4C). Mikropladebaserede systemer er berygtede for høj variation inden for brønden. Høj variation mellem replikater kan forekomme, når den optimale såtæthed ikke er opnået; celler løsnes under vasketrinnene for at erstatte cellekulturmediet med assaymedium eller forkert pipetteringsteknik såsom introduktion af luftbobler eller aspiration af varierende volumener. Forlængede måletider (6 målecyklusser) anbefales med mHRR for at muliggøre stabilisering af flux i medier (figur 1B og figur 4A). Lave fluxer forårsager høj variation, og afhængigt af celletype kan flux være for tæt på baggrundsstøj (op til 10-15 pmol / s). Lav respirerende (f.eks. Fibroblaster) eller usædvanligt store celler kan producere utilstrækkelig iltstrøm over baggrundsstøjniveauet i 96-brønds mikropladeformatet, selv ved 90% sammenløb. I så fald bør 24-brønd mHRR eller cHRR overvejes. Minimale ændringer i iltflux kan også indikere defekt håndtering af indlæsning af hæmmere, såsom tomme, forkerte eller variabelt fyldte porte. Det anbefales at anvende specifikke pipettespidser, der kommer tilstrækkeligt ind i porte under påfyldning af kemikalierne, så kemikalier kan nå den enkelte port (figur 2E).

Figure 4
Figur 4: Repræsentative standardprotokol iltforbrugsspor fra mHRR ved hjælp af HEK293-celler med kombineret OXPHOS-mangel. (A) Rå iltforbrugsspor af WT HEK293-celler og HEK293-celler med CRISPR-medierede mitokondrietranslationsfejl, der forårsager multipel OXPHOS-mangel (CRISPRKO1,2). (B) Respektive ekstracellulære forsuringshastigheder (ECAR) fra (A). (C) Proteinnormaliserede iltforbrugsspor af WT HEK293-celler og HEK293-celler med CRISPR-medieret mitokondrietranslationsmangel, der forårsager multipel OXPHOS-mangel (CRISPRKO1,2). (D) Proteinnormaliseret kvantificering af brønde (n = 8 pr. genotype; middelværdi og SD). Sammenligninger mellem betingelser blev udført af ANOVA og a posteriori Tukeys test. Betydninger: **** p < 0,0001; p < 0,001; ** p < 0,01; * p < 0,05. Forkortelser: se figur 1. Klik her for at se en større version af denne figur.

Et eksempelforsøg til ikke-fibrøst vævsforberedelse (trin 1.3 og 1.5-1.6) ved anvendelse af musecerebellum (figur 5A) og fibrøst vævspræparat (trin 1.4 og 1.5-1.6) ved hjælp af museskeletmuskulatur (soleus) er vist (figur 5B). Generelt overstiger afkoblet respiration ikke OXPHOS-kapaciteten i museprøver. For mus lillehjerne faldt OXPHOS-kapaciteten, når man sammenlignede med maksimal ETS-kapacitet. LEAK respiration steg under fysiologisk kontrollerede omstændigheder versus kemisk induceret (oligomycin). Dette kan skyldes det faktum, at endogen tilgængelig ADP stadig phosphoryleres til ATP, mens protonlækage ved kemisk induktion er maksimal, hvilket resulterer i en overvurdering af LEAK-respiration. I modsætning til lillehjernen blev soleus testet under hyperoxiske forhold for at undgå iltdiffusionsbegrænsning og viser tre gange højere OXPHOS-kapacitet. NADH-afhængig respiration er anderledes ved analyse af specifikke typer væv, hvor soleus har mere kapacitet til at respirere gennem tilsætning af succinat end cerebellum. Begge typer væv viser minimal ROX.

Figure 5
Figur 5: Repræsentative spor af iltforbrug for ikke-fibrøst (A) og fibrøst (B) væv for cHRR. (A) Vævsnormaliseret iltforbrugsspor af musecerebellum fremstillet som beskrevet (trin 1.3). (B) Vådt vægtvæv-normaliseret iltforbrug spor af mouse soleus muskel som beskrevet (trin 1.4). Blå linje viser respektive iltkoncentration og injektionspunkter. Forkortelser: se figur 1. Klik her for at se en større version af denne figur.

Kemisk Koncentration
BSA, fedtsyrefri 1 g/l
D-saccharose 110 mM
Egta 0,5 mM
HEPES 20 mM
KH2PO4 10 mM
Lactobionsyre 60 mM
MgCl2·6H2O 3 mM
Taurin 20 mM

Tabel 1: Mitokondrie respirationsmedium MiR05 sammensætning justeret til pH 7,127.

Kemisk Koncentration
CaK2EGTA vandfri 2,77 mM
Dithiothreitol (DTT) 0,5 mM
Imidazol 20 mM
K2EGTA, vandfri 7,23 mM
MES hydrat 50 mM
MgCl2-6H 2O 6,56 mM
Na2ATP 5,77 mM
Na2Fosfopotetin 15 mM
Taurin 20 mM

Tabel 2: Sammensætning af opløsningsvæsker (BIOPS) til biopsi og biopsi justeret til pH 7,128.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Traditionelt er mitokondrie bioenergetik blevet undersøgt med Clark-type iltelektroder. Manglende opløsning og gennemstrømning berettigede imidlertid til teknologisk udvikling. Til dato er O2k (kaldet cHRR) og Seahorse XF96 Flux Analyzer (kaldet mHRR) blevet bredt vedtaget inden for cellulær bioenergetik. Her præsenterer vi en forståelig samling af protokoller til analyse af cellulær energimetabolisme via vurdering af mitokondrie respiration ved hjælp af enten cHRR eller mHRR, diskuterer de vigtigste fordele ved hver enhed og giver praktisk vejledning. Protokollerne her omfatter pattedyrceller, fibrøst (hårdt) væv såsom skelet- og hjertemuskel og ikke-fibrøst (blødt) væv såsom hjerne og lever og gælder for lignende typer prøvemateriale.

Mens begge HRR-metoder resulterer i sammenlignelige data for pattedyrceller som eksemplificeret med HEK293 med flere OXPHOS-mangler, gør generelle arbejdsprincipper og teknisk opsætning af enhederne dem egnede til forskellige applikationer. mHRR-opsætningen muliggør automatiseret dataindsamling og har høj kapacitet med en 24- eller 96 multi-well-opsætning, der kræver minimale prøvemængder. Imidlertid kan det lave eksperimentelle volumen og brøndoverfladen ud over brugen af iltgennemtrængelige polymerer (polystyren) forårsage høj variation inden for brønden (især i 96-brøndpladeopsætningen), hvilket fremmer brugen af ≥6 brønde pr. betingelse for reproducerbare resultater. I modsætning til den cHRR-baserede polarografiske iltføler forbruges der ikke ilt af sensorsonderne i mHRR, som anvender slukket phosphorescensO2-sensing . Da mHRR er et halvlukket system, kan omgivendeO2 diffundere ind i respirationsmediet og udsætte prøven og sonden for ilt. Når den stempellignende sensorsonde sænkes, oprettes et midlertidigt forseglet og isoleret kammer for at forstærke ændringer iO2-koncentrationen og måle iltforbruget. Derefter anvendes en matematisk model til nøjagtigt at beregne iltforbrugshastigheder ved at estimere bagdiffusionen afO2. Ulempen er imidlertid, at algoritmen også forstærker støj29. Mikropladeopsætningen bruger ikke-genanvendelige specialiserede porte og plader, der kræver optimal cellesåningstæthed. mHRR-iltfølersonderne måler lateralO2-diffusion i tre forskellige områder pr. brønd svarende til sondens størrelse (~ 1 mm); derfor er et ensartet fordelt cellemonolag afgørende for at bestemme nøjagtige iltforbrugshastigheder. Hvis der er betydelige huller til stede, når man observerer cellefordelingen, beregnes forkerte iltforbrugshastigheder, hvilket resulterer i en høj varians af brøndreplikater. Under hensyntagen til dette er mHRR halvautomatisk og ideelt tilpasningsdygtig til celle- eller småorganismebaserede undersøgelser med høj kapacitet (f.eks . C. elegans) med tilbagevendende screeninger.

CHRR-åndedrætsværnets opsætning er baseret på et to-kammersystem med polarimetrisk måling af ilt. I det lukkede system kan omgivendeO2 ikke diffundere ind i respirationsmediet; Et fald iO2-koncentrationen afspejler således iltforbruget af den biologiske prøve. Da den cHRR polarografiske iltføler forbruger ilt, er diffusion af friO2 afgørende, hvilket gør det vanskeligt at minimere kammervolumen (2 ml, nye cHRR-enheder 0,5 ml) og kræver konstant omrøring for at sikre homogenitet af respirationsmediet. Derfor kræves større prøvevolumener for at generere tilstrækkelig iltflux. På grund af direkte adgang til kamrene og manuel titrering kan enhver respirationsprotokol tilpasses, og baseret på bredt kommercielt tilgængelige kemikalier resulterer det i usædvanligt lave driftsomkostninger. Derudover gør ad hoc-drift det muligt at tilpasse en SUIT-protokol ved titrering under et eksperiment og er vigtig i enkelttidspatientafledte prøver. Delvis automatisering er mulig ved hjælp af en titreringsinjektionsmikropumpe, som muliggør programmerbare SUIT-protokoller. Selvom det er begrænset til to prøver pr. CHRR-enhed, kører erfarne brugere flere enheder parallelt. Fordelen ved alsidigheden i analyseudvikling og softwaremiljø kommer med behovet for mere specifik træning til at betjene disse enheder og brugerafhængig vedligeholdelse (f.eks. Kalibrering af polarografiske iltsensorer) for at erhverve reproducerbare data. Til avancerede applikationer kan yderligere moduler fastgøres til cHRR-enhederne for at registrere pH, fluorescerende modul til analyse af membranpotentiale via safranin30, H2O2 via AMPLEX rød24 og calciumniveauer31.

Begge enheder kræver specialiserede respirationsmedier. mHRR bruger et kommercielt tilgængeligt serumfrit vækstmedium, der undgår brugen af bicarbonat, som afgasser under lave CO2 -betingelser og er afgørende, hvis ekstracellulær forsuringshastighed (ECAR) er af betydning. Under glykolyse omdannes pyruvat til lactat, som dissocieres til mælkesyre og protoner. Denne øgede protonkoncentration får pH til at falde, hvilket registreres som ECAR. En mere detaljeret analyse af ECAR er mulig med glykolyse stresstesten. Dette assay består først i at tilføje mættende glukoseniveauer for at måle den basale glykolytiske hastighed. Efter inhibering af ATP-syntasekomplekset med oligomycin afsløres den maksimale glykolytiske hastighed. Det sidste trin er at måle ikke-glykolytisk forsuring ved at injicere 2-deoxy-glucose, som hæmmer glykolyse via kompetitiv binding til hexokinase og phosphoglucose-isomerase32. Andre kitbaserede protokoller til rådighed omfatter glykolyse, fedtsyreoxidation og glutaminoxidation. Her brugte vi standardprotokollen til at måle basal respiration, ATP-bundet respiration, protonlækage, maksimal respiration, ekstra åndedrætskapacitet og ikke-mitokondrie respiration (figur 4A-C). En tilgang til at udnytte både standard respirationsprotokollen i forbindelse med glykolysestresstesten ville give indsigt i aerobe og anaerobe energiveje, der giver et overblik over cellulær respiration.

Cellulær bioenergetik er normalt tilgængelig i vedhængende celler med mikropladen mHRR opsætning. Afhængigt af celletype kan der kræves specialiseret belægning til adhærens (f.eks. poly-D-lysin, gelatine osv.) (til suspensionsceller) såvel som til løst klæbende celler, da de kan løsne sig fra bunden af brøndmålingscyklusserne33. I modsætning hertil kræver cHRR-målinger konstant omrøring, hvilket muliggør respiratorisk måling for enhver biologisk prøve. For hvert udstyr kræves optimering såsom titrering af inhibitorer (og substrater) for væv og cellelinjer for at vurdere inhibitor-modtagelighed (dosis-responskurver). Inhibitorkoncentrationer bør afprøves i enhver eksperimentel model for at anvende de laveste fuldt hæmmende koncentrationer og for at forhindre uspecifik hæmning samt unødvendig kammerkontaminering. Generelt er 0,25 μM rotenon, 0,5 μg / ml oligomycin, 0,5 μg / ml antimycin tilstrækkelige til de fleste anvendelser og prøvemængder. For at opnå reproducerbarhed skal der fremstilles engangslægemidler i tilstrækkelige mængder til hele de planlagte forsøg (f.eks. musegrupper), og prøveinputtet holdes konstant inden for en bestemt vævs- eller cellelinje. I cHRR vil spor af inhibitorer, der forbliver i kamrene, ændre flux uden nogen indikation til operatøren. Især rotenonspor er vanskelige at undgå og kræver tilstrækkelig vask med en minimumskammer (og prop) rengøring, som omfatter vask 4x med ddH2O, 2x 70% EtOH (96% renhed tilstrækkelig), 1x 100% EtOH, 1x 70% EtOH. Vask kræver, at man drejer omrørere og holder EtOH-trin i > 5 minutter hver. For at forhindre bakteriel forurening opbevares 70% EtOH i alle kamre, når maskiner ikke er i brug. Potentielle resterende forurenere kan slukkes ved tilsætning af ubrugt vævslysat. I et mHRR-eksperiment kan visse kemikalier interagere med det essentielleengangsplastikmateriale 34.

Respiratoriske data opnået via en permeabiliseret protokol giver indsigt i ETS, mens en intakt protokol giver indsigt i mitokondrieegenskaber såsom mitokondriekoblingseffektivitet. Faktisk kan generelle mitokondrie energiegenskaber give det samme resultat, men underliggende elektronoverførsel mellem komplekser kan ændres. Dette ville afspejle ændret mitokondrie energimetabolisme og kræver en permeabiliseringsprotokol for at få adgang til åndedrætskomplekserne. Tilsvarende viser forskellige væv og celler ændret substratafhængighed ved vurdering af respiratoriske egenskaber. For eksempel er glykolytiske muskelfibre kendt for primært at stole på glycerol-3-phosphat til energitilførsel, mens oxidative muskelfibre har en to gange højere elektronoverførselskapacitet fra NADH-oxidation35,36. På samme note kan hjerte mitokondrier, lever, brunt fedtvæv udnytte fedtsyrer til at syntetisere ATP, og til gengæld kan hjernen bruge ketonlegemer, overvejende dannet af fedtsyreoxidation 36,37,38. Derfor kræver bestemmelse af mitokondrieegenskaber en holistisk tilgang i modsætning til den standard glukoseafhængige respiration. mHRR omfatter normalt vurdering af intakte klæbende celler, selvom permeabilisering er opnåelig (f.eks. Mutant rekombinant perfringolysin O, der selektivt permeabiliserer cellemembranen39). Disse metoder kommer imidlertid med øget kompleksitet på grund af begrænsningen af fire injektionsporte. I modsætning hertil er korrekt lysede ikke-fibrøse vævslysater og enhver celletype normalt problemfri for cHRR. Normalt er det ikke muligt at analysere væv med mHRR; imidlertid er tilgange ved hjælp af isolerede mitokondrier fra et væv blevet etableret40,41.

Vigtigt at bemærke er, at normalisering til hele proteinindhold forsømmer absolutte mitokondriemængder. Sammenligning af eksperimentelle grupper under forskellige behandlinger kan variere betydeligt (f.eks. viste 30 dage højprotein diætfodrede rotter en 2,5 gange stigning i mitokondrieindholdet i lever42), især i væv, der er modtageligt for intracellulær lipidakkumulering, såsom brunt fedtvæv, lever og skeletmuskulatur. I disse situationer anbefales det også at vurdere flere mitokondriemarkører som en tilnærmelse for mitokondriemasse, såsom mtDNA kopi nummer43, citratsyntaseaktivitet10 og allestedsnærværende mitokondrieproteiner (f.eks. VDAC1, TOM20). I kombination gør dette det muligt at destillatere, om en ændret åndedrætsfunktion tilskrives mitokondriemængde, kvalitet, integritet eller en kombination heraf. En anden komplementær metode til dette er implementeringen af FCR'er. FCR'er giver indsigt i forskellige respiratoriske tilstande uafhængigt af mitokondrieindhold. FCRADP udleder, om ændret LEAK eller OXPHOS ændrer mitokondriernes effektivitet til phosphorylat ADP. FCR-tilstand 3 (I) afspejler, i hvilken grad prøven er afhængig af kompleks I som sammenligning med kompleks II. FCR-tilstand 3 (II) sammenligner kortfattet respiration med ETS og giver et indeks for mitokondrie respiration afledt af kompleks II. FCRkoblet / frakoblet er et forhold, der giver koblingskontrollen mellem OXPHOS og ETS, med et forhold på 1 uden ledig åndedrætskapacitet tilbage. Mitokondrie ydre membranintegritet kan vurderes ved tilsætning af eksogen cytokrom c. Cytokrom c er lokaliseret i det intermembrane rum, hvor det letter overførslen af elektroner mellem kompleks III og kompleks IV. Hvis den ydre mitokondriemembran er beskadiget, lækker cytokrom c ud af mitokondrierne og bidrager ikke længere til respiration. Gendannelse af denne ubalance kan opnås ved tilsætning af eksogen cytokrom c, hvilket følgelig øger respirationen (figur 1A, D; 5B). Kompleks IV-aktivitet måles individuelt med TMPD efter fuldstændig hæmning af OXPHOS. BaselineO2 flux vil falde, nårO2-koncentrationen falder, fordi TMPD-oxidation erO2-koncentrationsafhængig . Derfor iltes alle kamre efter ROX-vurdering til lige iltniveau (150 μM). Lineær regression af datapunkter fra signal efter tilsætning af azid kan bruges til at interpolere kemisk ogO2-afhængig baggrund for kompleks IV-aktivitetsassay. ROX-værdier skal trækkes fra alle respirationsværdier for at korrigere for ikke-mitokondrie iltforbrug.

Biologisk kan ROX i tilfælde af isolerede mitokondrier være lavere end med permeabiliserede eller intakte celler / væv. Generelt er resterende respiration forårsaget af aktiviteten af oxidaseenzymer, hvor celler og væv har flere autoxiderbare stoffer end isolerede mitokondrier44. Desuden, med intracellulære membranstrukturer stadig intakte, øges vanskeligheden ved ilt til at trænge gennem cellemembraner på grund af dets negative ladning. Følgelig kan diffusion gennem cellulære membraner og intracellulær tilgængelighed af ilt påvirkes, hvilket resulterer i ROX. Imidlertid har isolering af mitokondrier vist sig at forstyrre mitokondriemorfologi, øge mitokondrie hydrogenperoxidproduktion sammen med ændret mitokondrie respiratorisk funktion45. Mens isolering af funktionelle mitokondrier giver mulighed for specifik normalisering og kan være påkrævet under visse forhold, er isoleringsprocessen tidskrævende, kræver normalt mere materiale og bevarer muligvis ikke mitokondrie heterogenitet. Af denne grund har vi afholdt os fra at inkludere mitokondrieisolering i denne undersøgelse. Men for skelet- eller hjertemuskulatur er isolering af mitokondrier eller saponinbehandling af fibre afgørende for respirationsmålinger. Da autolytiske processer forekommer meget hurtigt efter eutanasi, anbefales hurtig vævsekstraktion og overholdelse af sammenlignelig timing for præparater mellem individuelle forsøg.

I vores eksperimenter førte vurdering af mitokondrie respiratorisk funktion af pattedyrceller til sammenlignelige resultater med begge HRR-enheder. Basal respiration var imidlertid højere for cHRR sammenlignet med mHRR. Bortset fra adskillige tekniske aspekter (kammervolumen, omrøring og forskellig signalintegration) kan biologiske årsager såsom ændret respirationsmedium, timing af cellehøst og ikke-vedhæftede celler, der forårsager tab af cellekontakt, forårsage de observerede forskelle. Følgelig er respirationsprotokoller generelt og individuelle substrat- og inhibitorkoncentrationer ikke udskiftelige mellem systemer af de præsenterede årsager, som kan være af teknisk art (f.eks. Titrering) og generelt forskellige assayreagenser (f.eks. Respirationsmedier, kemiske absorbanser af glas eller polymerer). For at sikre den højeste reproducerbarhed omfatter flere tekniske overvejelser og anbefalinger i) anvendelse af alikvoter til engangsbrug for at minimere krydskontaminering eller fryse-optøningscyklusser, ii) passende opbevaring af alle kemikalier (f.eks. ADP ved -80 °C for langvarig stabilitet, pyruvat tilberedt frisk og lysfølsomme kemikalier i mørke), iii) regelmæssig og streng gentestning af kemikalier for effektivitet (f.eks. fordampningspåførte koncentrationsændringer, opbevaringsinduceret TMPD-aktivitetstab) og (iv) omfattende rengøring for at fjerne ethvert sporkemikalie. Overvejelser om reproducerbarheden af longitudinelle undersøgelser (over flere år) vil kræve overvågning af udstyrets ydeevne og sikring af reagensernes stabilitet over tid.

Endelig kan ny teknologi baseret på kombinerede potentiometriske (pH) og amperometriske (O2) målinger gennem rutheniumoxidbaserede elektroder katalysere et paradigmeskift i nuværende værktøjer, hvilket gør det muligt at studere cellulær metabolisme i kultur og in vivo46. Selv om de nuværende metoder overvejende tillader ex vivo - og in vitro-vurdering af cellulær metabolisme, muliggør forsinket fluorescens in vivo-analyse af mitokondrieil oxygen som et mål for mitokondriefunktionen47. Tilsvarende viser mikrofluidikbaseret respirometri løfte i højere følsomhed, der kun kræver et par hundrede celler48. Mens nye metoder er i horisonten, er højopløsningsrespirometri til dato guldstandarden til vurdering af cellulær respirationskapacitet, for hvilken der er tilvejebragt vigtige protokoller her, der gælder for de fleste celler, væv og organismer til at studere mitokondrie respiration.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Ingen interessekonflikt at afsløre.

Acknowledgments

Dette arbejde blev støttet af finansiering fra Finlands Akademi (CBJ), Magnus Ehrnroot Foundation (CBJ) og et ph.d.-stipendium fra Integrated Life Sciences Graduate School (RA).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2 mL Potter-Elvehjem Glass/PTFE Tissue Grinder/Homogenizer Omni International 07-358029
95% O2, 5% CO2 medical gas mixture Potter for tissue grinding
ADP Sigma A 4386
Antimycin A Sigma A 8674 Chemical
Ascorbate Merck PHR1279-1G Chemical, dissolve in ethanol
BSA (fatty accid free) Sigma A 6003 Chemical
CaCO3 Sigma C 4830 Chemical
Cytochrome c Sigma C 7752 Chemical
Digitonin Sigma D 5628 Chemical
Dithiothreitol Sigma D 0632 Chemical, dissolve in DMSO
D-Sucrose Roth 4621.1 Chemical
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (High glucose) Fisher Scientific 41965-039 Chemical
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (No Glucose) Fisher Scientific A14430-01
EGTA Sigma E 4378
Etomoxir Sigma E1905 Chemical
Falcon 15 ml Conical Centrifuge Tubes Fisher Scientific AM12500 Chemical
Falcon 50 ml Conical Centrifuge Tubes Fisher Scientific AM12501
FCCP Sigma C 2920
Glucose Sigma G7021 Chemical, dissolve in ethanol
Glutamate Sigma G 1626 Chemical
GlutaMax (100x) (200 nM L-alanyl-L-glutamine dipeptide) Fisher Scientific 35050061 Chemical
HEK293 cells ATTC CRL-1573
Hemocytometer Fisher Scientific 0267151B Instrument for cell counting
Hepes Sigma H 7523 Chemical
Imidazole Fluka 56750 Chemical
KCl Merck 1.04936 Chemical
L-carnitine Sigma C0283 Chemical
Malate Sigma M 1000 Chemical
MES hydrate Sigma M8250 Chemical
MgCl2 Sigma M 9272 Chemical
Na2ATP Sigma A 2383 Chemical
Na2Phosphocreatine Sigma P 7936 Chemical
Na-pyruvate (100 mM) (100x) Fisher Scientific 11360070
NEAA (Non-essential amino acids) 100x Fisher Scientific 11140035
Normal FBS (10x) Fisher Scientific 10500064
O2k-Core: Oxygraph-2k Oroboros Instruments 10000-02 High-resolution respirometry instrument
O2k-Titration Set Oroboros Instruments 20820-03 Hamilton syringes for chemical injections
Oligomycin Sigma O 4876 Chemical, dissolve in ethanol
Palmitoylcarnitine Sigma P 4509 Chemical
Penicillin-Streptomycin Fisher Scientific 15140122
Pierce BCA Protein Assay Kit Fisher Scientific 23227
Pyruvate Sigma P 2256 Chemical
RIPA-Buffer Fisher Scientific 89900 Chemical
Rotenone Sigma R 8875 Chemical, dissolve in ethanol
Saponin Sigma S7900 Chemical

Seahorse XF DMEM assay medium pack, pH 7.4
Agilent, Santa Clara, CA		 103680-100
Seahorse XFe96 Extracellular Flux Analyzer
Agilent, Santa Clara, CA		 High-throughput respirometry instrument
Seahorse XFe96 FluxPak
Agilent, Santa Clara, CA
Includes assay plates, cartridges, loading guides for transferring compounds to the assay cartridge, and calibrant solution.
Small scissors Fisher Scientific 08-951-20
Sodium azide Sigma S2002 Chemical
Succinate Sigma S 2378 Chemical
Taurine Sigma T 8691 Chemical
TMPD Sigma T 3134 Chemical
Trypan Blue solution Merck 72-57-1 Chemical
Trypsin 0.25% EDTA Fisher Scientific 25200056
Two thin-edged forceps Fisher Scientific 12-000-122
Uridine stock (500x) Sigma U3750 Chemical

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. McBride, H. M., Neuspiel, M., Wasiak, S. Mitochondria: More than just a powerhouse. Current Biology. 16 (14), 551-560 (2006).
  2. Mehta, M. M., Weinberg, S. E., Chandel, N. S. Mitochondrial control of immunity. Beyond ATP. Nature Reviews Immunology. 17 (10), 608-620 (2017).
  3. Spinelli, J. B., Haigis, M. C. The multifaceted contributions of mitochondria to cellular metabolism. Nature Cell Biology. 20 (7), 745-754 (2018).
  4. Gnaiger, E. Capacity of oxidative phosphorylation in human skeletal muscle. New perspectives of mitochondrial physiology. International Journal of Biochemistry and Cell Biology. 41 (10), 1837-1845 (2009).
  5. Gorman, G. S., et al. Mitochondrial diseases. Nature Reviews Disease Primers. 2, 1-23 (2016).
  6. Boushel, R., Gnaiger, E., Schjerling, P., Skovbro, M., Kraunsøe, R., Dela, F. Patients with type 2 diabetes have normal mitochondrial function in skeletal muscle. Diabetologia. 50 (4), 790-796 (2007).
  7. Cogliati, S., et al. Mitochondrial cristae shape determines respiratory chain supercomplexes assembly and respiratory efficiency. Cell. 155 (1), 160-171 (2013).
  8. Kühlbrandt, W. Structure and function of mitochondrial membrane protein complexes. BMC Biology. 13, 1-11 (2015).
  9. Gnaiger, E. Mitochondrial pathways and Respiratory control. An introduction to OXPHOS analysis. Bioenergetics communications. 5th ed. , Steiger Druck GmbH. Axams, Austria. (2020).
  10. Jackson, C. B., et al. Mutations in SDHD lead to autosomal recessive encephalomyopathy and isolated mitochondrial complex II deficiency. Journal of Medical Genetics. 51 (3), 170-175 (2014).
  11. Pesta, D., Gnaiger, E. High-resolution respirometry: OXPHOS protocols for human cells and permeabilized fibers from small biopsies of human muscle. Methods in Molecular Biology. 810, Clifton, N.J. 25-58 (2012).
  12. Horan, M. P., Pichaud, N., Ballard, J. W. O. Review: Quantifying mitochondrial dysfunction in complex diseases of aging. Journals of Gerontology - Series A Biological Sciences and Medical Sciences. 67 (10), 1022-1035 (2012).
  13. Doerrier, C., Garcia-Souza, L. F., Krumschnabel, G., Wohlfarter, Y., Mészáros, A. T., Gnaiger, E. High-resolution fluorespirometry and oxphos protocols for human cells, permeabilized fibers from small biopsies of muscle, and isolated mitochondria. Methods in Molecular Biology. 1782, Clifton, N.J. 31-70 (2018).
  14. Zhang, J., et al. Measuring energy metabolism in cultured cells, including human pluripotent stem cells and differentiated cells. Nature Protocols. 7 (6), 1068-1085 (2012).
  15. García-Roche, M., Casal, A., Carriquiry, M., Radi, R., Quijano, C., Cassina, A. Respiratory analysis of coupled mitochondria in cryopreserved liver biopsies. Redox Biology. 17, 207-212 (2018).
  16. Acin-Perez, R., et al. A novel approach to measure mitochondrial respiration in frozen biological samples. The EMBO Journal. 39 (13), 1-18 (2020).
  17. SUITBrowserWeb. , Available from: http://suitbrowser.oroboros.at/ (2021).
  18. Cell metabolism assay kits. Seahorse assay kits and media. , Available from: https://www.agilent.com/en/product/cell-analysis/real-time-cell-metabolic-analysis/xf-assay-lits-reagents-cell-assay-media (2021).
  19. Chance, B., Williams, G. R. A method for the localization of sites for oxidative phosphorylation. Nature. 176 (4475), 250-254 (1955).
  20. Gnaiger, E., et al. Mitochondrial respiratory states and rates. MitoFit Preprint Arch. , (2019).
  21. Gnaiger, E. O2k-procedures: SOP O2k quality control 1: Polarographic oxygen sensors and accuracy of calibration Section Page. Oroboros. 03 (18), http://wiki.oroboros.at/index.php/MiPNet06.03_POS-Calibration-SOP 1-21 (2020).
  22. Robinson, B. H., Petrova-Benedict, R., Buncic, J. R., Wallace, D. C. Nonviability of cells with oxidative defects in galactose medium: A screening test for affected patient fibroblasts. Biochemical Medicine and Metabolic Biology. 48 (2), 122-126 (1992).
  23. King, M. P., Attardi, G. Human cells lacking mtDNA: Repopulation with exogenous mitochondria by complementation. Science. 246 (4929), 500-503 (1989).
  24. Makrecka-Kuka, M., Krumschnabel, G., Gnaiger, E. High-resolution respirometry for simultaneous measurement of oxygen and hydrogen peroxide fluxes in permeabilized cells, tissue homogenate and isolated mitochondria. Biomolecules. 5 (3), 1319-1338 (2015).
  25. Fasching, M., Gnaiger, E. O2k quality control 2: Instrumental oxygen background correction and accuracy of oxygen flux. Mitochondrial Physiology Network. 14 (06), 1-14 (2016).
  26. Gnaiger, E., Lassnig, B., Kuznetsov, A., Rieger, G., Margreiter, R. Excess capacity of cytochrome c oxidase. Journal of Experimental Biology. 1139, 1129-1139 (1998).
  27. Gnaiger, E., et al. Mitochondria in the Cold. Life in the Cold. , Springer. Berlin, Heidelberg. 431-442 (2000).
  28. Fontana-Ayoub,, Fasching, M., Gnaiger, E. Selected media and chemicals for respirometry with mitochondrial preparations. Mitochondrial Physiology Network. 02 (17), 1-9 (2014).
  29. Gerencser, A. A., et al. Quantitative microplate-based respirometry with correction for oxygen diffusion. Analytical Chemistry. 81 (16), 6868-6878 (2009).
  30. Krumschnabel, G., Eigentler, A., Fasching, M., Gnaiger, E. Use of safranin for the assessment of mitochondrial membrane potential by high-resolution respirometry and fluorometry. Methods in Enzymology. 542, 163-181 (2014).
  31. Nászai, A., Terhes, E., Kaszaki, J., Boros, M., Juhász, L. Ca(2+)N it be measured? Detection of extramitochondrial calcium movement with high-resolution fluorespirometry. Scientific Reports. 9 (1), 1-13 (2019).
  32. Pajak, B., et al. 2-Deoxy-d-Glucose and its analogs: From diagnostic to therapeutic agents. International Journal of Molecular Sciences. 21 (1), 234 (2019).
  33. Mercier-Letondal, P., Marton, C., Godet, Y., Galaine, J. Validation of a method evaluating T cell metabolic potential in compliance with ICH Q2 (R1). Journal of Translational Medicine. 19 (1), 1-15 (2021).
  34. Sauerbeck, A., et al. Analysis of regional brain mitochondrial bioenergetics and susceptibility to mitochondrial inhibition utilizing a microplate based system. Journal of Neuroscience Methods. 198 (1), 36-43 (2011).
  35. Jackman, M. R., Willis, W. T. Characteristics of mitochondria isolated from type I and type IIb skeletal muscle. American Journal of Physiology - Cell Physiology. 270 (2), 673-678 (1996).
  36. Ponsot, E., et al. Mitochondrial tissue specificity of substrates utilization in rat cardiac and skeletal muscles. Journal of Cellular Physiology. 203 (3), 479-486 (2005).
  37. Schönfeld, P., Reiser, G. Why does brain metabolism not favor burning of fatty acids to provide energy-Reflections on disadvantages of the use of free fatty acids as fuel for brain. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 33 (10), 1493-1499 (2013).
  38. Calderon-Dominguez, M., Mir, J. F., Fucho, R., Weber, M., Serra, D., Herrero, L. Fatty acid metabolism and the basis of brown adipose tissue function. Adipocyte. 5 (2), 98-118 (2016).
  39. Divakaruni, A. S., Rogers, G. W., Murphy, A. N. Measuring mitochondrial function in permeabilized cells using the seahorse XF analyzer or a clark-type oxygen electrode. Current Protocols in Toxicology. 2014, 1-16 (2014).
  40. Iuso, A., Repp, B., Biagosch, C., Terrile, C., Prokisch, H. Assessing mitochondrial bioenergetics in isolated mitochondria from various mouse tissues using Seahorse XF96 analyzer. Methods in Molecular Biology. 1567, 217-230 (2017).
  41. Rogers, G. W., et al. High throughput microplate respiratory measurements using minimal quantities of isolated mitochondria. PLoS ONE. 6 (7), 21746 (2011).
  42. Jordá, A., Zaragozá, R., Portolés, M., Báguena-Cervellera, R., Renau-Piqueras, J. Long-term high-protein diet induces biochemical and ultrastructural changes in rat liver mitochondria. Archives of Biochemistry and Biophysics. 265 (2), 241-248 (1988).
  43. Jackson, C. B., Gallati, S., Schaller, A. QPCR-based mitochondrial DNA quantification: Influence of template DNA fragmentation on accuracy. Biochemical and Biophysical Research Communications. 423 (3), 441-447 (2012).
  44. Hirsch, H. M. Tissue autoxidation inhibitors: II. The presence of inhibitor in intact cells; Assay of liver and hepatoma effect on radio-oxidations. Cancer Research. 16 (11), 1076-1082 (1956).
  45. Picard, M., et al. Mitochondrial structure and function are disrupted by standard Isolation methods. PLoS ONE. 6 (3), 18317 (2011).
  46. Tanumihardja, E., Slaats, R. H., Van Der Meer, A. D., Passier, R., Olthuis, W., Van Den Berg, A. Measuring both pH and O2 with a single On-Chip sensor in cultures of human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes to track induced changes in cellular metabolism. ACS Sensors. 6 (1), 267-274 (2021).
  47. Harms, F., Stolker, R. J., Mik, E. Cutaneous respirometry as novel technique to monitor mitochondrial function: A feasibility study in healthy volunteers. PLoS ONE. 11 (7), 159544 (2016).
  48. Levitsky, Y., et al. Micro-respirometry of whole cells and isolated mitochondria. RSC Advances. 9 (57), 33257-33267 (2019).

Tags

Biologi udgave 176 mitokondriebioenergetik respiratorisk kæde mitokondriesygdom oxidativ phosphorylering fluxanalysator ekstracellulær flux HEK293 iltforbrug mitokondrieoversættelse
Respirometri i høj opløsning til vurdering af bioenergetik i celler og væv ved hjælp af kammer- og pladebaserede åndedrætsværn
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Awadhpersad, R., Jackson, C. B.… More

Awadhpersad, R., Jackson, C. B. High-Resolution Respirometry to Assess Bioenergetics in Cells and Tissues Using Chamber- and Plate-Based Respirometers. J. Vis. Exp. (176), e63000, doi:10.3791/63000 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter