Biology

Респирометрия высокого разрешения для оценки биоэнергетики в клетках и тканях с использованием камерных и пластинчатых респирометров

Published: October 26, 2021 doi: 10.3791/63000

Ryan Awadhpersad¹, Christopher B. Jackson¹

¹Department of Biochemistry and Developmental Biology, Faculty of Medicine, University of Helsinki

Summary

Оценка окислительного фосфорилирования с помощью респирометров высокого разрешения стала неотъемлемой частью функционального анализа митохондрий и клеточного энергетического обмена. Здесь мы представляем протоколы анализа клеточного энергетического метаболизма с использованием камерных и микропластинчатых респирометров высокого разрешения и обсуждаем ключевые преимущества каждого устройства.

Abstract

Респирометрия высокого разрешения (HRR) позволяет контролировать окислительное фосфорилирование в режиме реального времени для анализа отдельных клеточных энергетических состояний и оценки дыхательных комплексов с использованием диверсифицированных протоколов титрования субстрат-разъединитель-ингибитор (SUIT). Здесь демонстрируется использование двух устройств респирометрии высокого разрешения, а также представлена базовая коллекция протоколов, применимых для анализа культивируемых клеток, волокон скелетной и сердечной мышц, а также мягких тканей, таких как мозг и печень. Протоколы для культивируемых клеток и тканей предусмотрены для камерного респирометра и культивируемых клеток для респирометра на основе микропластин, оба охватывают стандартные протоколы дыхания. Для сравнения, разработанные CRISPR клетки HEK293 с дефицитом митохондриальной трансляции, вызывающей множественный дефицит дыхательной системы, используются с обоими устройствами для демонстрации клеточных дефектов дыхания. Оба респирометра позволяют комплексно измерять клеточное дыхание с их соответствующими техническими достоинствами и пригодностью в зависимости от исследуемого вопроса исследования и модели.

Introduction

Митохондрии выполняют ключевое обеспечение энергией и представляют собой компартментированную органеллу, способствующую существенным клеточным биоэнергетическим и метаболическим процессам, таким как анаболизм нуклеотидов, липидов и аминокислот, биогенез железо-серного кластера и участвуют в передаче сигналов, таких как контролируемая гибель клеток ^1,2,3 . Митохондриальная биоэнергетика посредством окислительного фосфорилирования способствует практически всем клеточным процессам внутри клетки, и, следовательно, митохондриальные дисфункции первичного или вторичного происхождения связаны с широким спектром заболеваний ^4,5. Митохондриальная дисфункция включает в себя не только изменения в структуре или плотности митохондрий, но и в качестве и регуляции дыхательной системы⁶. Этот качественный элемент включает в себя управление субстратом, характеристики связи, посттрансляционные модификации, динамику крист и дыхательные суперкомплексы ^7,8. Поэтому точный анализ митохондриальной биоэнергетики для экспериментальных и диагностических подходов к оценке энергетического обмена клетки важен для здоровья и болезней.

Митохондриальное окислительное фосфорилирование (OXPHOS) представляет собой последовательность реакций в дыхательной системе или системе переноса электронов (ETS) для генерации клеточной энергии через аденозинтрифосфат (АТФ)⁹. Мультиферментативная стадия для использования энергии от потока электронов через комплексы I и II к комплексу IV генерирует электрохимический протонный градиент через внутреннюю митохондриальную мембрану, впоследствии используемый для фосфорилирования аденозиндифосфата (АДФ) до АТФ через комплекс V (_F1F_O АТФ-синтаза) (Рисунок 1А).

Во-первых, два электронных носителя образуются во время трикарбоксового цикла (TCA), гликолиза и пируватного окисления: никотинамидадениндинуклеотид (NADH) и дигидрофлавинадениндинуклеотид (FADH₂). NADH окисляется в комплексе I (NADH дегидрогеназа), в ходе которого два электрона переносятся в коэнзим Q (хинон восстанавливается до хинола), в то время как протоны закачиваются в межмембранное пространство (IMS). Во-вторых, комплекс II (сукцинатдегидрогеназа) окисляет FADH₂ и подает электроны в коэнзим Q без перекачки протонов. В-третьих, в комплексе III (цитохром c оксидоредуктаза) электроны из коэнзима Q переносятся в цитохром c, в то время как протоны закачиваются в IMS. В-четвертых, цитохром c переносит электроны в комплекс IV (цитохром c оксидаза), конечный комплекс для перекачки протонов, и где кислород функционирует как акцептор электронов для ассимиляции протонов, в конечном итоге образуя воду. Именно этот кислород потребляют митохондрии, который можно измерить с помощью оксиграфа. Наконец, протоны, полученные из комплекса I, комплекса III и комплекса IV, используются для вращения комплекса V, тем самым генерируя АТФ⁹.

Важно отметить, что перенос электронов происходит не только линейным образом, иначе обозначаемым как цепь переноса электронов. Вместо этого электроны могут быть перенесены в пул коэнзима Q через несколько дыхательных путей и облегчают конвергентный поток электронов. NADH-субстраты и сукцинат, например, могут входить через комплекс I и комплекс II соответственно. Электроны от окисления жирных кислот могут быть пожертвованы через электрон-переносящий флавопротеиновый комплекс. Действительно, всесторонний анализ OXPHOS требует целостного подхода с соответствующими топливными субстратами (рисунок 1A).

Рисунок 1: Митохондриальное окислительное фосфорилирование и специфические протоколы субстрата и ингибитора. (А) Митохондрии и схема системы переноса электронов (CI-CIV) и митохондриальная F₁F₀ АТФ-синтаза (CV). Все структуры из PDB. На рисунках изображены только субстраты и ингибиторы, описанные в этом исследовании). (B) Образец следа потока кислорода в неповрежденных ячейках HEK293 с использованием стандартного протокола в устройстве mHRR. (C) Образец следа потока кислорода в неповрежденных ячейках HEK293 с использованием стандартного протокола в устройстве cHRR. (D) Образец следа потока кислорода в пермеабилизированных фибробластах человека от здорового донора с соответствующим протоколом SUIT. Сокращения: 1 = Рутинное дыхание неповрежденных клеток; 2 = состояние 2; 3 = государство 3(I); 4 = состояние 3(I) с cytC; 5 = состояние 3 (I+II); 6 = Утечка(ОМ); 7 = емкость ETS; 8 = S(ROT); 9 = ROX; 10 = TMPD; 11 = Az. ROT = Ротенон, AM = Антимицин, АТФ = Аденозинтрифосфат, Az = Азид, OM = Олигомицин, FCCP = Карбонилцианид-трифтор-метоксифенилгидразон; Asc = Аскорбат, TMPD = N,N,N',N'-тетраметил-p-фенилендиамин, Succ = Сукцинат, M = Малат, P = Пируват, ADP = Аденозиндифосфат, NAD = Никотинамиддениндинуклеотид, IMS = Межмембранное пространство, FAD = Флавинадениндинуклеотид. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Анализ емкости митохондриального OXPHOS с использованием HRR стал инструментальным биохимическим методом диагностической ценности не только для первичных митохондриальных дефектов^10,11^, но и для всех других областей биологии, таких как рак и старение¹² лет. HRR позволяет определить клеточное дыхание путем анализа митохондриальной емкости OXPHOS, которая непосредственно отражает индивидуальную или комбинированную недостаточность митохондриального дыхательного комплекса и косвенно связана с клеточной дисфункцией и измененным энергетическим метаболизмом⁹. Методологически измерения дыхания выполняются с использованием клеток, тканей или изолированных митохондрий ^11,13,14, с замороженным материалом^, только частично подходящим^15,16. Показано, что замороженная ткань имеет неповрежденную ETS с сохраненной суперкомплексной стабильностью¹⁵. Таким образом, в отличие от традиционных промежуточных продуктов TCA, соответствующие субстраты непосредственно подаются в ETS. Однако связь между ETS и синтезом АТФ теряется, поскольку целостность мембраны нарушается из-за повреждения замораживанием (образование кристаллов льда).

Эксперименты по дыханию обычно проводятся при физиологической температуре 37 °C для эндотерм в непроницаемых или пермеабилизированных клетках или тканях. В то время как первый рассматривает цитозольный метаболический контекст, последний обеспечивает энергетический вклад отдельных комплексов OXPHOS и АТФазы путем добавления специфических субстратов (и ингибиторов). Последовательность и вариация субстратов и ингибиторов привели к разработке разнообразного массива протоколов^{SUIT 17} и анализов¹⁸ для решения различных научных вопросов функции OXPHOS (рассмотрено в разделе¹²). Основной протокол клеточного дыхания оценивает четыре различных состояния: i) рутинное дыхание - дыхание в соответствующей дыхательной среде без какого-либо добавления субстратов или ингибиторов, потребляющих только эндогенные субстраты. Это состояние может выявить общий OXPHOS или вторично-индуцированные дефекты дыхания, вызванные, например, измененными профилями метаболитов. Далее добавление ингибитора АТФазы олигомицина выявляет проницаемость внутренней митохондриальной мембраны к протонам, определяемую как ii) утечка дыхания. Последующее титрование протонофора, такого как разъединитель карбонилцианида-трифтор-метоксифенилгидразон (FCCP), позволяет определить состояние, при котором емкость ETS максимальна в режиме открыто-трансмембранного протонного контура, определяемом как iii) несвязанное дыхание. Важно отметить, что несвязанное состояние может также возникать при экспериментальных вмешательствах из-за чрезмерного механического повреждения митохондриальных мембран. И наоборот, несвязанное состояние относится к дыхательному разъединению внутренним механизмом, который физиологически контролируется. Наконец, полное ингибирование ИТС путем добавления комплекса III ингибитора антимицина и комплекса I ингибитора ротенона определяет остаточное потребление кислорода (ROX) от немитохондриальных процессов, потребляющих кислород (Рисунок 1A-C).

Митохондриальная биоэнергетика состоит из пяти различных состояний дыхания^19,20. Дыхание в состоянии 1 не имеет каких-либо дополнительных субстратов или АДФ, за исключением того, что эндогенно доступно. После добавления АДФ, но все же, без субстратов, достигается дыхание состояния 2. Когда добавляются подложки, позволяющие переносить электроны и синтез АТФ, достигается дыхание состояния 3. В этом состоянии емкость OXPHOS может быть определена при насыщенных концентрациях АДФ, неорганических фосфатов, кислорода, NADH- и сукцинат-связанных субстратов. Состояние дыхания 4 или дыхание LEAK может быть определено как состояние без АДФ или химически ингибированных АТФ-синтаз при наличии достаточного количества субстратов. Наконец, когда весь кислород обеднен (бескислородный) в условиях закрытой камеры, наблюдается дыхание в состоянии 5.

Существует несколько методов оценки клеточных энергетических состояний¹⁴ с двумя устройствами, доминирующими в текущей оценке OXPHOS в реальном времени путем анализа потребления кислорода, измеренного как функция снижения кислорода с течением времени в системе с закрытой камерой с различной применимостью в зависимости от экспериментальной модели и исследовательского вопроса: респирометр высокого разрешения Oroboros 2k и внеклеточный анализатор потока Seahorse XF. Оба прибора регистрируют скорость потребления кислорода как снижение пикомолей (пмоль) кислорода (_О2) в секунду как абсолютное значение в камере или микропластине скважины. Удельное потребление кислорода на массу получают путем нормализации соответствующего потребления кислорода в определенном буферном рецепте на количество клеток (миллионы), вес ткани (мг) или количество белка.

O2k (Oroboros Instruments) представляет собой закрытую двухкамерную систему, оснащенную полярографическим датчиком кислорода (сокращенно камерный респирометр высокого разрешения: cHRR). Каждая экспериментальная камера вмещает 2 мл жидкости, которая поддерживается однородной магнитными мешалками. Полярографический датчик кислорода использует амперометрический подход для измерения кислорода: он содержит катод золота, анод хлорида серебра / серебра, а между раствором KCI создается электрохимическая ячейка, на которую подается напряжение (0,8 В). Кислород из пробирной среды диффундирует через 25-мкм фторированную этиленпропиленовую мембрану (O 2-проницаемую) и подвергается восстановлению на катоде, производя перекись водорода. На аноде серебро окисляется перекисью водорода, генерируя электрический ток. Этот электрический ток (ампер) линейно связан с парциальным давлением кислорода. Парциальное давление кислорода и коэффициент растворимости кислорода пробирной среды используются для расчета концентрации кислорода. Поскольку парциальное давление кислорода зависит от экспериментальной температуры, а полярографические измерения чувствительны к температуре, колебания температуры нуждаются в точном (±0,002 °C) регулировании нагревательным блоком Пельтье. Температура может контролироваться в диапазоне 4 °C и 47 °C.

Внеклеточный анализатор потока Seahorse XF (Agilent) представляет собой пластинчатую систему с 24- или 96-луночным форматом микропластин, в которой три флуоресцентных электрода измеряют потребление кислорода с течением времени в каждой скважине (сокращенно респирометр высокого разрешения на основе микропластин: mHRR). Максимум четыре порта в картридже для анализа доступны для автоматического впрыска во время анализа. Анализ содержит несколько циклов, каждый из которых состоит из трех фаз: 1) смешивание, 2) ожидание и 3) измерение. Во время фазы измерения датчики опускаются в микропластинку, создавая временно закрытую камеру, содержащую объем 7-10 мкл для измерения излучаемого света. Этот свет излучается встроенными в полимер флуорофорами на кончике сенсорных зондов, которые ощущают O₂на основе закалки фосфоресценции. Интенсивность флуоресцентного сигнала пропорциональна O₂ и зависит от температуры датчика и пробирной среды. Поэтому точная оценка кислорода требует относительного подхода с фоновой скважиной без какой-либо выборки. Восстановление концентрации кислорода происходит во время фазы перемешивания, когда датчик перемещается вверх и вниз, чтобы смешать объем над временной камерой. Каждый цикл вычисляет одну норму потребления кислорода. Температура может контролироваться в диапазоне 16 °C и 42 °C.

HRR является золотым стандартом для оценки клеточной биоэнергетики при первичных и митохондриальных заболеваниях и общем клеточном метаболизме. В этом исследовании представлены основные протоколы HRR для оценки функции OXPHOS в клетках и тканях.

Рисунок 2: Рабочий процесс для клеточных и тканевых препаратов для cHRR и клеточной подготовки к mHRR респирометрии. (A) Краткое описание предоставленных протоколов. (B) Клетки млекопитающих (этап 1.2): гранулы HEK293, равные 3 x 10⁶ клеткам (левая панель). Неволокнистая ткань (этап 1.3): Получение лизата мозжечка мышей в 2 мл тефлонового гончара (средняя панель). Сапонин-индуцированная пермеабилизация скелетных мышц (шаг 1.4) правая панель) для cHRR-респирометрии. (C) Стандартная схема посева микропластин (этап 2.4) и проверка слияния для анализа эукариотических клеток (HEK293) для респирометрии mHRR. (Д, Д) Схема загрузки инжекторного порта для респирометрии mHRR (шаг 2.4). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Все эксперименты на животных проводятся в соответствии с Национальным советом по обзору экспериментов на животных и Региональным государственным административным агентством Южной Финляндии. В этом исследовании использовались самцы мышей C57BL/6JOlaHsd (4-6 месяцев). Согласие на использование клеточных линий человека было получено от институционального комитета по этике Хельсинкского университета.

1. Респирометрия высокого разрешения: камерный респирометр (cHRR)

ПРИМЕЧАНИЕ: Эксперименты в этом разделе протокола проводились с использованием Oroboros O2k-Core: Oxygraph-2k (Таблица материалов)

Калибровка датчиков кислорода
1. Предварительно запускают дыхательные аппараты при 37 °C в 2,1 мл митохондриальной дыхательной среды (MiR05, таблица 1, коэффициент растворимости: 0,92) в течение >45 мин и выполняют кислородную калибровку, как описано²¹. Продолжайте, если изменение базового уровня находится в пределах ± 4 пмоль/с.
  ПРИМЕЧАНИЕ: Большие колебания фонового сигнала могут указывать на необходимость поддержания мембраны датчика или следов ингибиторов, оставшихся в камере от предыдущих экспериментов. Инструментальная коррекция фонового потока кислорода рекомендуется перед серией экспериментов²⁵.
2. Записывайте значения калибровки кислорода для мониторинга производительности мембраны датчика с течением времени.
  ПРИМЕЧАНИЕ: Это показывает функцию датчика, стабильность сигнал-шум и когда требуется обслуживание мембраны датчика. В зависимости от давления окружающей среды, в MiR05 солюбилизируется 180-200 мкмоль кислорода.
3. Удалите всю жидкость в камере перед добавлением любого образца в дыхательную среду.
  ПРИМЕЧАНИЕ: Регулярно оценивайте объем дыхательных камер ровно в 2 мл.
Подготовка клеток к респирометрии высокого разрешения
1. Культивируйте клетки HEK293 в чашках диаметром 10^см2 в среде Dulbecco's Modified Eagle's (DMEM) с высоким содержанием глюкозы, дополненной 10% термоинактивированной фетальной бычьей сывороткой (FBS), GlutaMax, заменимыми аминокислотами и Na-пируватом²² и уридином²³ для поддержки OXPHOS-дефектного метаболизма в инкубаторе при 37 °C при 5% CO₂.
  ПРИМЕЧАНИЕ: Любой тип эукариотической клетки может быть культивирован. Для большинства типов клеток культивирование чашки размером 10^см2 приводит к достаточному количеству клеток (обычно >3 х 10⁶ клеток). Регулярно проверяйте микоплазменную инфекцию, чтобы избежать воздействия на клеточный метаболизм и дыхание.
2. Растите клетки без превышения 90% конфюсации (рисунок 2С).
  ПРИМЕЧАНИЕ: Клетки со слиянием >90% могут проявлять зависящее от роста ингибирующее действие на дыхание (если оно не синхронизировано или постмитотическое).
3. Промыть клетки 1x PBS, отсоединить 1 мл теплого 0,25% трипсина, деактивировать трипсин, добавив теплый DMEM (5 мл / 10 см² пластины) и подсчитать клетки с помощью гемоцитометра.
4. Осторожно центрифугируют клеточный раствор, равный 2,5 х 10⁶ ячеек при 300 х г в течение 5 мин, удаляют супернатант полностью и повторно суспендируют в 2,5 мл теплого MiR05 (1 х 10⁶ клеток/мл) (рисунок 2А).
5. Для суспензионных ячеек подсчитайте и удалите раствор, равный 2,5 х 10⁶ ячеек, гранулируют и продолжают, как указано на этапе 1.2.4.
6. Запустите протокол SUIT для оптимизации пермеабилизации (шаг 1.6), пермеабилизированной клетки или ткани (шаг 1.5) или интактных клеток (шаг 1.7)
  ПРИМЕЧАНИЕ: Для получения стабильных результатов рекомендуется поддерживать постоянную концентрацию клеток (например, 1 x 10⁶ клеток/мл). Хотя дыхание не зависит от плотности клеток в респирометре²⁴, субстраты и ингибиторы находятся в сопоставимой концентрации на протяжении всех экспериментов, если количество клеток остается постоянным.
Подготовка нефиброзной ткани (например, мозга, печени) к респирометрии высокого разрешения
1. Иссекните однородный кусочек ткани, весом 30-40 мг, или используйте весь орган (в данном случае мозжечок мыши).
  ПРИМЕЧАНИЕ: Если ткань не используется сразу, держите в 2 мл ледяного MiR05, обеспечивая сохранение до 2 ч для большинства тканей. Индивидуальное время хранения тканей должно оцениваться во временных рядах.
2. Смочите ткань насухо фильтровальной бумагой Whatman (осторожно: мягкие ткани имеют тенденцию прилипать).
3. Поместите кусок ткани 30-40 мг в охлажденный льдом гомогенизатор политетрафторэтиленового гончара Elvehjem.
4. Добавьте соответствующее количество MiR05 для получения 20 мг/мл для поддержания соотношения ткани к буферу. Держите общее количество >1,5 мл и <2 мл, чтобы избежать недостаточного или избыточного количества жидкости для соответствующей механической пермеабилизации.
5. Вставьте пестик, медленно лизируйте ткань, осторожно втягивая пестик, избегая при этом образования вакуума, вызывающего чрезмерное повреждение тканей.
6. Выполните в общей сложности 7 ударов (1 удар, определяемый как один удар вверх и вниз) до лизирования (видимого в виде мутной жидкости без крупных обломков) (рисунок 2B).
  ПРИМЕЧАНИЕ: Количество ударов для соответствующего лизиса должно быть проверено для каждой ткани путем оценки целостности внешней митохондриальной мембраны через цитохромный С-ответ (этап 1.5.11). Трудноизвлекаемая соединительная ткань или части сосудов могут остаться.
7. Декантируйте лизированную ткань в центрифужную трубку объемом 15 мл.
8. Промыть внутреннюю часть гончара равным количеством MiR05, используемым на стадии лизирования (например, 1,5 мл), и добавить в 15 мл пробирку, содержащую теперь 3-4 мл MiR05 при 10 мг/мл тканевого лизата.
9. Добавьте 2 мл обычного MiR05 на камеру до температуры до 37 °C.
10. Медленно вращайте трубку для равномерного распределения перед пипеткой 500 мкл (что равно 5 мг) каждого лизата на камеру, чтобы свести к минимуму напряжение от холода до 37 °C.
11. Подождите >3 мин, пока содержимое камеры нагреется до 37 °C, прежде чем закрывать камеру. Удалите лишнюю жидкость сверху пробки (количество на камеру после закрытия: 4 мг).
12. Запустите протокол SUIT для стандартной пермеабилизации (шаг 1.5).
Подготовка фиброзной ткани (скелетной мышцы, сердечной мышцы) к респирометрии высокого разрешения
1. Извлеките твердую ткань, удалите соединительную ткань и жир из мышц с помощью острых щипцов в 2 мл ледяного BIOPS (таблица 2) под рассеченным микроскопом.
2. Отделите пучки волокон (~4 мг) вдоль продольной оси острыми щипцами. Выдавливайте волокна достаточно, чтобы получить сетчатую структуру (рисунок 2B).
  ПРИМЕЧАНИЕ: О правильном механическом разделении и пермеабилизации волокон свидетельствует потеря красного пигмента миоглобина и повышенная полупрозрачность.
3. Промыть и пермеабилизировать пучок волокон в сапонине (50 мкг/мл в BIOPS, приготовленном в свежем виде) в течение 20 мин при 4 °C (волокна становятся полупрозрачными, что указывает на полную пермеабилизацию, рисунок 2B).
4. Промывайте волокна дважды в MiR05 в течение 5 мин на одну стирку при 4 °C.
5. Промокните фильтровальной бумагой и взвесьте перед добавлением в камеру, заполненную 2,1 мл MiR05.
6. Введите пробки без полного закрытия, затем насытите камеры 2 мл чистого O₂ с помощью шприца объемом 20 мл и закройте камеры, скручивая пробки во вращающемся движении. Поддерживайте концентрацию_O2 в пределах 300-500 мкМ во время эксперимента, чтобы избежать ограничения диффузии кислорода.
Протокол оценки рутинного дыхания в клетках или тканях
1. Добавить образец в камеру, как указано на этапах 1.5.2-1.5.3.
2. Добавьте 2,3 мл теплой клеточной суспензии MiR05 (стандартный вход: 1 x 10⁶ клеток/мл, как на этапе 1,2 или 2 мг ткани/мл, как на этапе 1.3)
3. Скелетная и сердечная мышцы (шаг 1.4): Добавьте ~ 4 мг сапонин-пермеабилизированных волокон к предварительно расплавленным 2,3 мл теплого MiR05 с учетом шагов 1.4.4-1.4.6
4. Рабочие камеры при 37 °C и скорости перемешивания 700 об/мин. Подождите >3 мин, чтобы среда могла дегазировать и закрыть камеры, покрутив пробку во вращающемся движении. Стабилизация блока Пельтье указывает на достижение заданной температуры.
5. (НЕОБЯЗАТЕЛЬНО) Измените скорость мешалки на 300 об/мин, чтобы оставшиеся пузырьки могли выйти через капилляр пробки.
6. Аспирируйте любую лишнюю жидкость поверх пробки. Подождите 10 минут, пока не будет достигнут стабильный сигнал потока кислорода с любым типом образца, чтобы записать рутинное /состояние дыхания 1, рисунок 1B).
7. Для измерения дыхания в пермеабилизированных клетках и тканях перейдите к шагу 1.6. Для интактных ячеек с шагом 1.8.
Протокол анализа OXPHOS в пермеабилизированных клетках или тканях
1. Используйте лизированный (пермеабилизированный) образец ткани или пермеабилизируйте клетки, добавляя 1 мкл дигитонина (запас дигитонина 8,1 мМ в диметилсульфоксиде (ДМСО)) для конечной концентрации 5 мкг/мл для пермеабилизации клеток. Поток будет падать и должен стабилизироваться через >5 мин.
  ВНИМАНИЕ: Дигитонин остро токсичен для дыхательных путей, при контакте с кожей или при проглатывании.
  ПРИМЕЧАНИЕ: Впрыскивание всех химических веществ осуществляется с помощью прецизионных стеклянных шприцев. Используйте шприцы только для указанных химических веществ, чтобы избежать перекрестного загрязнения и тщательно промыть в воде и EtOH после использования. Заблокированные шприцы могут потребовать ультразвука в теплом ddH_2Oили чистящей проволоки для вытеснения любых химических засоров. Всегда втягивайте излишки соответствующего раствора в шприц, чтобы избежать попадания воздуха в камеры. Осмотрите внутреннюю часть камер на предмет введения воздуха после каждого впрыска. Записывайте каждый шаг до тех пор, пока поток не достигнет плато.
2. Добавить в быстрой последовательности: 5 мкл 0,4 М малата (М) для конечной концентрации 1 мМ, 5 мкл 2,0 М пирувата (Р; приготовленного в свежем виде), для конечной концентрации 5 мМ, 4 мкл 2,5 М глутамата (G) для конечной концентрации 5 мМ.
3. После того, как предыдущий поток стабилизировался, добавляют 5 мкл (10 мкл для мышечной ткани) 0,5 М аденозиндифосфата (АДФ, аликвоты, хранящиеся при -80 °C) для конечной концентрации 1,25 мМ.
  ПРИМЕЧАНИЕ: Ткани, такие как мышцы, могут нуждаться в другой концентрации для достижения насыщения.
4. Добавьте 5 мкл 4 мМ цитохрома C (cytC) для конечной концентрации 10 мкМ.
  ПРИМЕЧАНИЕ: Необязательно для ячеек для оценки качества пермеабилизации.
5. Добавьте 16 мкл 1,25 М сукцината (S) для конечной концентрации 10 мМ. (НЕОБЯЗАТЕЛЬНО) Добавьте 3 мкл 0,5 М АДФ для конечной концентрации 2 мМ для контроля насыщенности концентрации АДФ.
6. Для клеток и неволокнистой ткани добавляют 2 мкл 1 мг/мл олигомицина (ОМ) для конечной концентрации 1 мкг/мл.
  ВНИМАНИЕ: Все используемые ингибиторы ETS являются высокотоксичными.
  ПРИМЕЧАНИЕ: Олигомицин может потребовать титрования для оптимальной концентрации, поскольку он может подавлять способность ETS и опускается для мышечной ткани. Реоксигенат здесь, когда мышечная ткань анализируется и если O₂ниже 300 мкМ.
7. Титруйте FCCP из запаса 2 мМ, добавляйте 0,6 мкл с последующими шагами 0,2 мкл до тех пор, пока увеличение дыхания и дыхания не будет максимально разъединено (теоретически: несвязано).
8. Добавьте 1 мкл 1 мМ ротенона (ROT) для конечной концентрации 0,5 мкМ. Добавьте 2 мкл запаса антимицина (AM) 1 мг/мл для конечной концентрации 1 мкг/мл.
9. Повторное насыщение камер для достижения аналогичного уровня кислорода (~150 мкМ) во всех камерах путем медленного подъема плунжера в скручивающем движении.
10. Добавьте 5 мкл аскорбата 0,8 М для конечной концентрации 2 мМ, за которым сразу же следует 5 мкл 0,2 М N,N,N',N'-тетраметил--фенилендиамин (TMPD) для конечной концентрации 0,5 мМ для оценки активности комплекса IV (необязательно).
11. Добавьте 5 мкл 4 М азида для конечной концентрации 10 мМ сразу же после достижения пика потока_O2 с TMPD. Продолжайте работу в течение >5 мин для анализа автоокисления TMPD для комплексного расчета базового уровня IV.
12. Пересчитайте ячейки, чтобы подтвердить количество ячеек перед запуском, и продолжите шаг 1.9.
  ПРИМЕЧАНИЕ: Дигитонин-пермеабилизация (только для клеток) должна быть титрована в пробных экспериментах, чтобы достичь максимального потока и не влиять на целостность митохондриальной мембраны (см. шаг 1.7). Пермеабилизированные образцы (особенно мышечной ткани) с увеличением скорости дыхания >10% после добавления цитохрома с следует исключить из дальнейшего анализа из-за повреждения наружной митохондриальной мембраны. Ожидается кратковременное падение потока после добавления растворенных EtOH химических веществ.
Протокол определения оптимальных условий пермеабилизации клеток
1. Добавьте ячейки, как описано на шагах 1.2 и 1.5.2.
2. Возьмите 10 мкл 10 мг/мл дигитонина и добавьте 10 мкл ДМСО для разбавления до 5 мг/мл.
3. Добавить 1 мкл ротенона (запас 1 мМ). Добавьте 10 мкл сукцината (запас 2 мМ) и 5 мкл АДФ (запас 0,5 млн).
4. Титруйте 1 мкл дигитонина (2,5 мг на шаг) многократно до тех пор, пока дыхание не увеличится дальше и не станет максимальным.
  ПРИМЕЧАНИЕ: Снижение дыхания указывает на чрезмерную концентрацию дигитонина.
Протокол анализа OXPHOS в интактных клетках
1. После обычного дыхания (стадия 1.6.1-1.6.6) добавляют 2 мкл олигомицина 0,01 мМ для конечной концентрации 10 нМ.
2. Титруйте FCCP из запаса 2 мМ, добавляйте 0,6 мкл с последующими шагами 0,2 мкл до тех пор, пока дальнейшее увеличение дыхания и дыхания не будет максимально разъединено (теоретически: несвязано)
3. Добавьте 1 мкл 1 мМ ротенона для конечной концентрации 0,5 мкМ. Добавьте 2 мкл 1 мг/мл антимицинового сырья для конечной концентрации 1 мкг/мл.
4. Повторное осаждение камеры до того же уровня кислорода (~150 мкМ), медленно поднимая плунжер в скручивающем движении.
5. Добавьте 5 мкл 0,8 М аскорбата для конечной концентрации 2 мМ. Немедленно добавляют 5 мкл 0,2 М TMPD для конечной концентрации 0,5 мМ для оценки активности комплекса IV.
  ПРИМЕЧАНИЕ: Подготовьте свежую партию перед любым большим набором экспериментов, так как TMPD склонен к автоокислению. Активность может снижаться с течением времени при хранении при температуре -20 °C.
6. Добавьте 5 мкл 4 М азида для конечной концентрации 10 мМ сразу же после достижения пика потока_O2 с TMPD. Продолжайте работу в течение >5 мин для анализа автоокисления TMPD для сложного расчета базового уровня IV.
7. Пересчитайте ячейки, чтобы подтвердить количество ячеек перед запуском, и перейдите к шагу 1.9.
Коллекция образцов после запуска
1. Соберите ровно 1 мл MiR05-суспензии из каждой камеры (с включенными мешалками) в трубку 1,5 мл 1,5 мл.
2. Центрифуга при 1000 х г для пермеабилизированных клеток или при 20 000 х г для тканевого лизата. Удалите супернатант и заморозьте гранулы при -80 °C для дальнейшей обработки (раздел 3).
Анализ протоколов SUIT
1. Анализ потока кислорода (пмоль/с, нормализованный для ввода) на каждом плато после добавления субстрата или ингибитора (Рисунок 1С и Рисунок 3А). Экспортируйте значения в электронную таблицу.
2. Вычтите значение остаточного потребления кислорода (ROX, рисунок 1C и рисунок 3C) из всех значений каждого экспериментального запуска. Вычтите азидное остаточное дыхание из TMPD для получения сложного внутривенного дыхания.
3. График абсолютных значений, нормализованных для клеточного (рисунок 3A, B) или тканевого ввода (рисунок 5A,B). Рассчитайте коэффициенты управления потоком (шаг 1.11) или нормализуйте их до поступления белка (рисунок 3C).
Расчет коэффициента регулирования потока
1. Получить индекс дыхательной функции и управления муфтой с помощью коэффициентов регулирования потока (FCR)^9,26.
  ПРИМЕЧАНИЕ: Это позволяет оценить внутреннее качество митохондрий, независимо от количества митохондрий. Кроме того, коэффициенты регулирования потока (FCR) сопоставимы в пределах одних и тех же клеточных линий, что позволяет контролировать качество реагентов (соответствующие FCR получаются с помощью указанных пронумерованных эталонных значений на рисунке 1B-D и рисунке 3C).
2. Рассчитайте коэффициент управления дыханием для связи OXPHOS с УТЕЧКОЙ с помощью уравнения 1.
  Уравнение 1: FCR_ADP = 5/6 = Состояние 3 / Состояние 4
3. Вычисление FCR для оценки NADH-зависимого дыхания с помощью уравнения 2
  Уравнение 2: Состояние FCR_{3 (I)} = 3/5 = Состояние 3 (I) / Состояние 3 (I+II)
4. Вычислите FCR для оценки сукцинат-зависимого дыхания с помощью уравнения 3.
  Уравнение 3: состояние FCR_{3 (II)} = 8/7 =_{S rot} /_{емкость} ETS
5. Вычислите FCR для оценки, связанного с несвязанным с помощью уравнения 4.
  Уравнение 4: FCR_{связанный/несвязанный}= 5/7 = Состояние 3 (I+II) /_{Емкость} ETS
6. Чтобы проверить целостность внешней мембраны митохондрий, используйте уравнение 5.
  Уравнение 5: % повреждения наружной мембраны митохондрий = 3/4 = Состояние 3 _(I) / Состояние 3 _{(I) с цитой c}

2. Респирометрия высокого разрешения: микропластинчатый респирометр (mHRR)

ПРИМЕЧАНИЕ: Эксперименты в этом разделе протокола проводились с использованием анализатора внеклеточного потока Seahorse XFe96 (Таблица материалов)

Клеточная культура
1. Культивируйте клетки любого типа. Адгезивы (например, коллаген, ламинин) могут быть использованы для облегчения прикрепления клеток. Здесь клетки HEK293 культивируются, как и раньше (шаг 1.3).
2. За день до эксперимента отделяют клетки и переносят их в назначенную mHRR 96-луночную микропластину для получения идеальной сливаемости в день эксперимента (80%-100%) (рисунок 2С).
  ПРИМЕЧАНИЕ: Для mHRR плотность микропластинчатых ячеек имеет решающее значение. Индивидуальные свойства роста клеточных линий или методы лечения, влияющие на рост, должны быть учтены, чтобы обеспечить сопоставимое слияние в день эксперимента.
Подготовка клеток к респирометрии высокого разрешения
1. Заготавливайте и повторно суспендируйте клетки в достаточном объеме перед посевом
  ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется сеять клетки из того же разведения для реплик.
2. Посев клеток в соответствии со скоростью роста отдельных клеточных линий или свойствами роста под обработкой.
  ПРИМЕЧАНИЕ: Оптимизируйте на стандартной 96-луночной микропластине и экстраполируйте плотность ячейки на 96-луночную микропластинку, специфичную для анализа. В этой установке 7 x 10⁴ клеток HEK293 WT были посеяны на скважину 96-лунки. Первая и последняя колонны 96-луночной пластины используются для определения белка (рисунок 2С). Четырехугольные колодцы не должны содержать никаких ячеек и используются для экспериментальной коррекции фона. В идеале, скважины, расположенные близко к краям, пусты, чтобы свести к минимуму эффект кромки (например, клетки показывают измененные темпы роста, вызванные температурными эффектами) (рисунок 2C, D).
Подготовка сенсорных пластин, загрузка ингибиторов
1. В день анализа дополните 38,8 мл среды 0,4 мл 1 М глюкозы, 0,4 мл 200 мМ глутамина и 0,4 мл 100 мМ Na-пирувата.
  ПРИМЕЧАНИЕ: дыхание mHRR требует специализированной небуферизованной среды DMEM при рН 7,4. В целом, 40 мл должно хватить на один эксперимент с одной 96-луночной микропластиной.
2. Нагрейте среду для анализа дыхания до 37 °C и замените среду клеточной культуры на среду для анализа дыхания, промыв дважды по 80 мкл на лунку.
3. Установите пластину с ячейками в инкубатор при температуре 37 °C без CO₂ за 60 мин до анализа.
  ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг необходим для дегазации пластины, так как CO₂может влиять на результаты дыхания, а сыворотка в среде может производить пузырьки во время анализа.
4. Предваряемые ингибиторы аликвот для OM, FCCP, ROT и AM до 37 °C и вынимают сенсорную пластину из инкубатора.
5. Разбавляют OM, FCCP, ROT и AM в 3 мл пробирной среды до конечной концентрации в скважине 1,5 мкМ, 1,125 мкМ и 1 мкМ соответственно. Заполните отдельные порты, как показано на рисунке 2E.
  ПРИМЕЧАНИЕ: Для заполнения картриджа датчика рекомендуется использовать многоканальную пипетку. Поскольку для нагнетания соединений используется воздух под давлением, все порты должны быть заполнены равным количеством объема жидкости всякий раз, когда порт заполняется соединением. ROT и AM могут быть объединены в одном порту. Ингибиторы могут быть растворены в EtOH или DMSO.
6. Проверьте порты впрыска и проверьте равномерность загрузки для каждого порта.
  ПРИМЕЧАНИЕ: Все порты имеют отверстие в нижней части для инъекции. Следует соблюдать осторожность при перемещении сенсорной пластины. Пузырьки воздуха можно удалить с помощью иглы.
Протокол оценки кислорода в интактных клетках
1. За день до анализа выполните шаги 2.4.2-2.4.7.
2. Аликвот 20 мл калибрантного раствора в коническую трубку объемом 50 мл.
3. Откройте набор для анализа внеклеточного потока и удалите содержимое.
4. Поместите перевернутый картридж датчика рядом с полезной пластиной. Пипетка 200 мкл калибрантного раствора в каждую скважину полезной пластины.
5. Прикрепите картридж датчика к вспомогательной пластине, обращая внимание, что все датчики погружены в воду.
6. Установите пластину в инкубатор при температуре 37 °C без CO₂ на ночь или минимум 12 ч. Убедитесь, что влажность внутри инкубатора достаточна для предотвращения испарения калибранта.
7. Включите систему на основе микропластин и компьютер, чтобы быть готовыми к использованию на следующий день (машине требуется минимум 3 часа, чтобы уравновесить до 37 ° C перед проведением анализа).
  ПРИМЕЧАНИЕ: Для обеспечения стабильности сигнала увеличьте точки измерения до 6 вместо 3 циклов измерения на состояние дыхания. Каждый цикл состоит из 3 минут смешивания и 3 минут измерения.
8. В день анализа XF выполните шаги 2.4.9-2.4.20.
9. Проверьте слияние пластины клеточной культуры, морфологию клеток и то, что фоновые колодцы пусты.
10. Промыть клетки подготовленной дыхательной средой, как указано в шагах 2.4.11-2.4.12.
11. Удалите все, кроме 20 мкл питательной среды из каждой лунки. Удаляют 55 мкл, если культуральная среда была 80 мкл из-за испарения в течение ночи (приблизительно 5 мкл).
12. Дважды промыть клетки 90 мкл пробирной среды. Наконец, добавьте 100 мкл пробирной среды. Конечный объем должен составлять 120 мкл.
  ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе рекомендуется использовать многоканальную пипетку, чтобы обеспечить применение одной и той же процедуры стирки к каждому экспериментальному состоянию (зависит от установки пластины). При аспирации наклоните пластину под углом 45° и поместите наконечники пипетки в угол колодцев для аспирации и закачки жидкостей. Крайне важно соблюдать осторожность во время промывки, так как некоторые клетки могут легко отсоединиться от нижней части пластины для культивирования клеток.
13. Установите пластину в инкубатор при температуре 37 °C без CO₂ за 60 минут до анализа.
14. Извлеките гидратированную пластину картриджа датчика из инкубатора без_CO2.
15. Откажитесь от старого раствора калибранта и замените его свежим раствором калибранта, предварительно расплавленным до 37 °C.
16. Приготовьте ингибиторы и пробирную среду (3 мл на ингибитор в общей сложности 12 мл пробирной среды) и используйте резервуар для пипетки для загрузки ингибитора в порты.
17. Откройте программное обеспечение и запустите предварительно разработанный или новый шаблон. Заполните карту пластин, отрегулируйте титрование и циклы измерения, а затем нажмите клавишу Пуск , чтобы начать калибровку оптических датчиков.
18. Снимите крышку с заряженного картриджа и поместите ее в слот, который автоматически выскальзывает из устройства, убедившись, что маркировка в правом нижнем углу пластины совпадает с треугольником в правом нижнем углу слота.
19. Нажмите кнопку Продолжить , чтобы выполнить автоматическую калибровку продолжительностью около 20 минут.
20. После калибровки снимите опорную пластину, содержащую калибрант.
21. Снимите крышку с микропластины, содержащей ячейки, и поместите пластину в прорезь по запросу устройства. Нажмите кнопку Продолжить , чтобы начать запуск.
Коллекция образцов после запуска
1. Выньте пластину из машины, осторожно удалите оставшиеся пробирные среды, не нарушая ячейки, и заморозьте всю пластину при -80 °C для дальнейшей обработки (раздел 3).

3. Определение белка с помощью анализа бицинхониновой кислоты (BCA assay)

Приготовьте разбавленный бычий сывороточный альбумин (BSA) в буфере, используемом для экстракции белка и совместимом с BCA: 2 мг/мл, 1,5 мг/мл, 1 мг/мл, 0,5 мг/мл, 0,25 мг/мл и 0 мг/мл для стандартной кривой в дубликатах.
Экстрагируйте белки путем повторного использования в соответствующем буфере лизиса (например, RIPA) с 20 мкл на лунку для mHRR или 100 мкл на гранулу, содержащуюся в пробирке 1,5 мл для cHRR.
Инкубировать пластину mHRR или пробирку объемом 1,5 мл, содержащую белковые лизаты, в течение 30 мин на льду.
Центрифугируют пробирку объемом 1,5 мл, содержащую лизат белка при 4 °C при 20 000 х г в течение 20 мин, и перенесут полученный супернатант в новую чистую трубку объемом 1,5 мл.
Используйте 10 мкл на образец в дубликатах и эталонах в микротитерной пластине. Добавьте 200 мкл рабочего реагента BCA и инкубируйте в течение >15 мин.
Считайте пластину в стандартном спектрофотометре на длине волны 562 нм и рассчитайте концентрации белка с помощью стандартной кривой BSA.
Нормализуйте результаты дыхания до концентрации белка.
ПРИМЕЧАНИЕ: Нормализация количества белка позволяет подтвердить плотность посева клеток или ввод влажного веса. Экстрагированные белки пригодны для последующего иммуноблоттинга против субъединиц ETS, например, но не полностью представляют нативный образец (например, потеря участков фосфорилирования).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Здесь мы предоставляем протоколы для определения митохондриальной биоэнергетики в эукариотических клетках, неволокнистой ткани (например, мозжечке) и фиброзной ткани (например, скелетных мышцах). Для эукариотических клеток HEK293 с CRISPR-инженерным нокаутом двух различных белков, связанных с митохондриальной трансляцией, приводящей к множественному (CRISPR^KO1) и тяжелому/ полному дефициту OXPHOS (CRISPR^KO2), измеряли либо с помощью cHRR (рисунок 3A-C), либо mHRR (рисунок 3A-D).

Для cHRR клетки HEK293 были проницаемы дигитонином, а эксперименты с дыханием проводились в соответствии со стандартным протоколом (этап 1.5-1.6) и были успешно зарегистрированы (рисунок 3A). CRISPR^KO1 показывает нарушение, а CRISPR^KO2 не имеет дыхания по сравнению с WT при нормализации до входной величины ячейки (рисунок 3B). Количество белка определяли по собранным образцам (раздел 3), а значения рутинного дыхания нормализовали до количества белка с целью расчета абсолютных значений и соответствующих FCR (рисунок 3C, значение каждого FCR подробно описано в обсуждении). Оптимальное количество проб производит потоки 80-160 пмоль/с на мл. В идеале количество клеток или тканей достаточно для генерации значительного потока (20 пмоль/с для кХРР) для уменьшения фонового шума при одновременном уклонении от чрезмерной реоксигенации во время эксперимента. При низком дыхании (например, белый жировой жир, белые кровяные клетки) или труднодоступных образцах (например, iPS-дифференцированных нейронных линиях) потоков 20 пмоль/с на мл достаточно в идеальных условиях работы.

Рисунок 3: Репрезентативный стандартный протокол потребления кислорода следы от cHRR с использованием клеток HEK293 с комбинированным дефицитом OXPHOS. (A) Следы потребления сырого кислорода клетками WT HEK293 и клетками HEK293 с CRISPR-опосредованными митохондриальными дефектами трансляции, вызывающими множественный дефицит OXPHOS (CRISPR^KO1,2). (B) Наложенные на клетки нормализованные следы потребления кислорода от (A). (C) Нормализация белками двух независимых экспериментов (среднего и SD) и соответствующих FCR. Сравнения между условиями проводились ANOVA и апостериорным тестом Туки или t-тестом Стьюдента. Значения: **** p < 0,0001; p < 0,001; ** p < 0,01; * p < 0,05. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Далее мы использовали mHRR с теми же клетками в стандартном протоколе (2.1-2.5), подтверждающем недостатки OXPHOS (рисунок 4A). Кроме того, значения ECAR были увеличены для тяжелого/полного дефицита OXPHOS (CRISPR^KO2), что предполагает компенсацию дефицита митохондриального окислительного фосфорилирования в клетках HEK293 со специфическим дефицитом трансляции митохондрий за счет увеличения гликолиза, приводящего к выработке лактата (рисунок 4A). Количество белка определяли из пластины микролунки (раздел 3), а полученные значения нормализовали до количества белка (рисунок 4B) и количественно оценивали (рисунок 4C). Системы на основе микропластин печально известны высокими внутрискважинными вариациями. Высокая изменчивость между репликами может возникать, когда оптимальная плотность посева не достигнута; клетки отделяются во время этапов промывки замены клеточной культуральной среды пробирной средой или неправильного метода пипетирования, такого как введение пузырьков воздуха или аспирация различных объемов. Увеличенное время измерения (6 циклов измерения) рекомендуется с mHRR для обеспечения стабилизации потока в средах (рисунок 1B и рисунок 4A). Низкие потоки вызывают высокие вариации, и в зависимости от типа ячейки поток может быть слишком близок к фоновому шуму (до 10-15 пмоль/с). Низкодыхлающие (например, фибробласты) или исключительно большие клетки могут производить недостаточный поток кислорода выше уровня фонового шума в формате 96-луночной микропластины даже при 90% слиянии. В этом случае следует рассмотреть вопрос о 24-луночном mHRR или cHRR. Минимальные изменения в потоке кислорода могут также указывать на неправильную обработку загрузки ингибиторов, таких как пустые, неправильно или переменно заполненные порты. Рекомендуется использовать специальные наконечники пипеток, которые в достаточной степени поступают в порты во время погрузки химических веществ, чтобы позволить химическим веществам достичь отдельного порта (рисунок 2E).

Рисунок 4: Репрезентативный стандартный протокол потребления кислорода следы от mHRR с использованием клеток HEK293 с комбинированным дефицитом OXPHOS. (A) Следы потребления сырого кислорода клетками WT HEK293 и клетками HEK293 с CRISPR-опосредованными митохондриальными дефектами трансляции, вызывающими множественный дефицит OXPHOS (CRISPR^KO1,2). (B) Соответствующие показатели внеклеточного подкисления (ECAR) от (A). (C) Нормализованные по белку следы потребления кислорода клетками WT HEK293 и клетками HEK293 с CRISPR-опосредованным дефицитом митохондриальной трансляции, вызывающим множественный дефицит OXPHOS (CRISPR^KO1,2). D) нормализованная белковая количественная оценка скважин (n = 8 на генотип; среднее и SD). Сравнения между условиями были сделаны ANOVA и апостериорным тестом Туки. Значения: **** p < 0,0001; p < 0,001; ** p < 0,01; * p < 0,05. Сокращения: см. рисунок 1. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Показан пример эксперимента по подготовке неволокнистой ткани (этапы 1.3 и 1.5-1.6) с использованием мозжечка мыши (рисунок 5А) и подготовки фиброзной ткани (этап 1.4 и 1,5-1.6) с использованием скелетных мышц мыши (камбала). В целом, несвязанное дыхание не превышает емкость OXPHOS в образцах мыши. Для мозжечка мыши емкость OXPHOS уменьшилась по сравнению с максимальной емкостью ETS. Дыхание УТЕЧКИ увеличивалось при физиологически контролируемых обстоятельствах по сравнению с химически индуцированным (олигомицин). Это может быть связано с тем, что эндогенный доступный АДФ по-прежнему фосфорилируется к АТФ, тогда как при химической индукции утечка протонов максимальна, что приводит к переоценке дыхания УТЕЧКИ. В отличие от мозжечка, камбала была протестирована в гипероксических условиях, чтобы избежать ограничения диффузии кислорода и показывает в три раза более высокую емкость OXPHOS. NADH-зависимое дыхание отличается при анализе конкретных типов тканей, причем камбала обладает большей способностью к дыханию за счет добавления сукцината, чем мозжечок. Оба типа тканей показывают минимальный ROX.

Рисунок 5: Репрезентативные следы потребления кислорода для неволокнистых (А) и волокнистых (В) тканей для cHRR. (А) Влажный вес ткани нормализовали потребление кислорода след мозжечка мыши, приготовленный как описано (этап 1.3). (B) Влажный вес- нормализованный по весу след потребления кислорода камбаловидной мышцей мыши, как описано (этап 1.4). Синяя линия показывает соответствующую концентрацию кислорода и точки впрыска. Сокращения: см. рисунок 1. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Химический	Концентрация
BSA, без жирных кислот	1 г/л
D-сахароза	110 мМ
ЭГТА	0,5 мМ
ХЕПЕС	20 мМ
KH₂PO₄	10 мМ
Лактобионовая кислота	60 мМ
MgCl₂·6H_2O	3 мМ
Таурин	20 мМ

Таблица 1: Состав митохондриальной среды дыхания MiR05 скорректирован до рН 7,1²⁷.

Химический	Концентрация
CaK₂EGTA безводный	2,77 мМ
Дитиотрейтол (DTT)	0,5 мМ
Имидазол	20 мМ
K₂EGTA, безводный	7,23 мМ
MES гидрат	50 мМ
MgCl_2-6H _2O	6.56 мМ
Na₂ATP	5.77 мМ
_Na2Фосфокреатин	15 мМ
Таурин	20 мМ

Таблица 2: Расслабляющий и биопсийно-консервирующий раствор (БИОПС) состав, скорректированный до рН 7,1²⁸.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Традиционно митохондриальная биоэнергетика изучалась с помощью кислородных электродов типа Кларка. Однако отсутствие разрешения и пропускной способности оправдывало технический прогресс. На сегодняшний день O2k (называемый cHRR) и анализатор потока Seahorse XF96 (называемый mHRR) широко распространены в области клеточной биоэнергетики. Здесь мы представляем понятную коллекцию протоколов для анализа клеточного энергетического метаболизма путем оценки митохондриального дыхания с использованием cHRR или mHRR, обсуждаем ключевые преимущества каждого устройства и предоставляем практическое руководство. Протоколы, представленные здесь, охватывают клетки млекопитающих, волокнистые (твердые) ткани, такие как скелетная и сердечная мышцы, и неволокнистые (мягкие) ткани, такие как мозг и печень, и применимы к аналогичным типам образца материала.

В то время как оба метода HRR приводят к сопоставимым данным для клеток млекопитающих, как показано на примере HEK293 с множественным дефицитом OXPHOS, общие принципы работы и техническая настройка устройств делают их пригодными для различных применений. Установка mHRR позволяет автоматизировать сбор данных и обладает высокой пропускной способностью с установкой на 24 или 96 многолуночных скважин, требующих минимального количества проб. Однако низкий экспериментальный объем и поверхность скважины, в дополнение к использованию кислородопроницаемых полимеров (полистирола), могут вызывать высокие внутрискважинные вариации (особенно в установке плиты на 96 скважин), способствуя использованию скважин ≥6 на условие для воспроизводимых результатов. В отличие от полярографического датчика кислорода на основе cHRR, кислород не потребляется сенсорными зондами mHRR, которые используют закаленную фосфоресценцию O₂ . Поскольку mHRR представляет собой полузакрытую систему, окружающая среда O₂может диффундировать в дыхательную среду, подвергая образец и зонд воздействию кислорода. Когда датчик поршня опускается, создается временно герметичная и изолированная камера для усиления изменений концентрации O₂и измерения потребления кислорода. Впоследствии математическая модель используется для точного расчета скорости потребления кислорода путем оценки обратной диффузии O₂. Однако недостатком является то, что алгоритм также усиливает шум²⁹. В установке микропластин используются многоразовые специализированные порты и пластины, требующие оптимальной плотности посева ячеек. Датчики кислорода mHRR измеряют боковую диффузию O₂в трех различных областях на скважину, что эквивалентно размеру зонда (~1 мм); поэтому равномерно распределенный монослой клеток имеет решающее значение для определения точных скоростей потребления кислорода. Если при наблюдении за распределением клеток присутствуют какие-либо значительные пробелы, будут рассчитаны неправильные скорости потребления кислорода, что приведет к высокой дисперсии реплик скважин. Принимая это во внимание, mHRR является полуавтоматизированным и идеально адаптируемым для высокопроизводительных клеточных или небольших исследований на основе организмов (например, C. elegans) с повторяющимися скринингами.

Установка респирометров cHRR основана на двухкамерной системе с поляриметрическим измерением кислорода. В замкнутой системе окружающая среда O₂ не может диффундировать в дыхательную среду; таким образом, снижение концентрации_О2 отражает потребление кислорода биологическим образцом. Поскольку полярографический датчик кислорода cHRR потребляет кислород, диффузия свободного O₂имеет важное значение, что затрудняет минимизацию объема камеры (2 мл, новые устройства cHRR 0,5 мл) и требует постоянного перемешивания для обеспечения однородности дыхательной среды. Следовательно, для создания достаточного потока кислорода требуются большие объемы образцов. Благодаря прямому доступу к камерам и ручному титрованию любой протокол дыхания адаптируется и основан на широко коммерчески доступных химических веществах приводит к исключительно низким эксплуатационным расходам. Кроме того, специальная работоспособность позволяет адаптировать протокол SUIT путем титрования во время эксперимента и важна в одноразовых образцах, полученных пациентом. Частичная автоматизация возможна с использованием микронасоса титрования-впрыска, который обеспечивает программируемые протоколы SUIT. Несмотря на то, что они ограничены двумя образцами на устройство cHRR, опытные пользователи будут запускать несколько устройств параллельно. Преимущество универсальности разработки анализов и программной среды связано с необходимостью более конкретного обучения работе с этими устройствами и пользовательского обслуживания (например, калибровки полярографических датчиков кислорода) для получения воспроизводимых данных. Для расширенных применений к устройствам cHRR подключаются дополнительные модули для регистрации pH, флуоресцентный модуль для анализа мембранного потенциала через сафранин³⁰, H₂O₂ через AMPLEX красный²⁴ и уровни кальция³¹.

Оба устройства требуют специализированных дыхательных сред. mHRR использует коммерчески доступную безымянную питательную среду, избегая использования бикарбоната, который дегазирует в условиях низкого уровня CO₂ и необходим, если скорость внеклеточного подкисления (ECAR) имеет важное значение. Во время гликолиза пируват превращается в лактат, который диссоциирует на молочную кислоту и протоны. Эта повышенная концентрация протонов вызывает снижение рН, что регистрируется как ECAR. Более сложный анализ ECAR возможен с помощью гликолизного стресс-теста. Этот анализ состоит сначала из добавления насыщающих уровней глюкозы для измерения базальной гликолитической скорости. После ингибирования комплекса АТФ-синтазы олигомицином выявляется максимальная гликолитическая скорость. Заключительным этапом является измерение негликолитической подкисленности путем введения 2-дезокси-глюкозы, которая ингибирует гликолиз через конкурентное связывание с гексокиназой и фосфоглюкозой изомеразой³². Другие доступные протоколы на основе набора включают гликолиз, окисление жирных кислот и окисление глутамина. Здесь мы использовали стандартный протокол для измерения базального дыхания, АТФ-связанного дыхания, утечки протонов, максимального дыхания, запасной дыхательной способности и немитохондриального дыхания (рисунок 4A-C). Подход использования как стандартного протокола дыхания в сочетании со стресс-тестом на гликолиз, даст представление об аэробных и анаэробных энергетических путях, обеспечивая обзор клеточного дыхания.

Доступ к клеточной биоэнергетике обычно осуществляется в адгезивных клетках с микропластинчатой установкой mHRR. В зависимости от типа ячейки может потребоваться специализированное покрытие для адгезии (например, поли-D-лизин, желатин и т.д.) (для суспензионных ячеек), а также для слабо адгезивных клеток, поскольку они могут отделяться от нижней части циклов измерения^{скважины 33}. Напротив, измерения cHRR требуют постоянного перемешивания, что позволяет измерять дыхательные пути для любого биологического образца. Для каждого устройства требуется оптимизация, такая как титрование ингибиторов (и субстратов) для тканей и клеточных линий для оценки чувствительности к ингибиторам (кривые «доза-реакция»). Концентрации ингибиторов должны быть испытаны в любой экспериментальной модели для использования самых низких полностью ингибирующих концентраций и предотвращения неспецифического ингибирования, а также ненужного загрязнения камеры. Как правило, 0,25 мкМ ротенона, 0,5 мкг / мл олигомицина, 0,5 мкг / мл антимицина являются достаточными для большинства применений и количеств образцов. Для обеспечения воспроизводимости подготовьте одноразовые препараты в достаточных количествах для всех запланированных экспериментов (например, мышиных групп) и держите ввод образца постоянным в пределах определенной ткани или клеточной линии. В cHRR следы ингибиторов, остающиеся в камерах, будут изменять поток без каких-либо указаний для оператора. Особенно трудно избежать следов ротенона и они требуют достаточной промывки с минимальной очисткой камеры (и пробки), которая включает в себя промывку 4x с ddH₂O, 2x 70% EtOH (достаточная чистота 96%), 1x 100% EtOH, 1x 70% EtOH. Стирка требует поворота мешалок и хранения EtOH-ступеней в течение > 5 минут каждая. Для предотвращения бактериального загрязнения 70% EtOH хранится во всех камерах, когда машины не используются. Потенциальные остаточные загрязнения могут быть утолены добавлением неиспользованного тканевого лизата. В эксперименте mHRR некоторые химические вещества могут взаимодействовать с основной одноразовой пластиковой посудой³⁴.

Дыхательные данные, полученные с помощью пермеабилизированного протокола, дают представление о ETS, тогда как интактный протокол дает представление о свойствах митохондрий, таких как эффективность митохондриальной связи. Действительно, общие митохондриальные энергетические свойства могут дать тот же результат, но основной перенос электронов между комплексами может быть изменен. Это будет отражать измененный митохондриальный энергетический метаболизм и требует протокола пермеабилизации для доступа к дыхательным комплексам. Аналогичным образом, различные ткани и клетки демонстрируют измененную зависимость субстрата при оценке респираторных характеристик. Например, известно, что гликолитические мышечные волокна полагаются в основном на глицерин-3-фосфат для доставки энергии, тогда как окислительные мышечные волокна обладают в два раза более высокой способностью переноса электронов от окисления NADH^35,36. На той же ноте митохондрии сердца, печень, коричневая жировая ткань могут использовать жирные кислоты для синтеза АТФ, а в свою очередь, мозг может использовать кетоновые тела, преимущественно образованные окислением жирных кислот 36,37,38. Поэтому определение митохондриальных характеристик требует целостного подхода в отличие от стандартного глюкозозависимого дыхания. mHRR обычно охватывает оценку интактных адгезивных клеток, хотя пермеабилизация достижима (например, мутантный рекомбинантный перфринголизин O, который избирательно проникает в клеточную мембрану³⁹). Однако эти методы сопряжены с повышенной сложностью из-за ограничения четырех портов впрыска. Напротив, правильно лизированные нефиброзные тканевые лизаты и любой тип клеток обычно не имеют проблем для cHRR. В норме анализ тканей с помощью mHRR невозможен; однако подходы с использованием изолированных митохондрий из ткани были установлены^40,41.

Важно отметить, что нормализация содержания цельного белка пренебрегает абсолютными митохондриальными количествами. Сравнение экспериментальных групп при различных методах лечения может значительно различаться (например, 30-дневные крысы с высоким содержанием белка, получавшие диету, показали 2,5-кратное увеличение содержания митохондрий в печени⁴²), особенно в тканях, восприимчивых к внутриклеточному накоплению липидов, таких как коричневая жировая ткань, печень и скелетные мышцы. В этих ситуациях также рекомендуется оценить несколько митохондриальных маркеров в качестве приближения к митохондриальной массе, таких как копия мтДНК No⁴³, активность цитратсинтазы¹⁰ и вездесущие митохондриальные белки (например, VDAC1, TOM20). В комбинации это позволяет дистиллировать, независимо от того, приписывается ли измененная дыхательная функция митохондриальному количеству, качеству, целостности или их комбинации. Другим дополнительным методом к этому является реализация FCR. FCR дают представление о различных респираторных состояниях, независимых от содержания митохондрий. FCR_ADP выводит, изменяет ли измененная УТЕЧКА или OXPHOS эффективность митохондрий на фосфорилят АДФ. Состояние FCR_{3 (I)}отражает, в какой степени выборка зависит от комплекса I по сравнению с комплексом II. Состояние FCR_{3 (II)} сравнивает сукцинат-зависимое дыхание с ETS и обеспечивает индекс митохондриального дыхания, полученного из комплекса II. FCR_{связанный/несвязанный}- это соотношение, обеспечивающее управление связью между OXPHOS и ETS, при этом соотношение 1 не имеет запасной дыхательной способности. Целостность внешней мембраны митохондрий может быть оценена путем добавления экзогенного цитохрома c. Цитохром c локализуется в межмембранном пространстве, где облегчает перенос электронов между комплексом III и комплексом IV. Если внешняя митохондриальная мембрана повреждена, цитохром c вытекает из митохондрий, больше не способствуя дыханию. Восстановление этого дисбаланса может быть достигнуто путем добавления экзогенного цитохрома c, что, следовательно, увеличивает дыхание (рисунок 1A, D; 5B). Активность комплекса IV измеряется индивидуально с TMPD после полного ингибирования OXPHOS. Базовый поток_O2 будет уменьшаться по мере снижения концентрации_O2, поскольку окисление TMPD зависит от концентрации_O2 . Следовательно, после оценки ROX все камеры насыщаются кислородом до равного уровня кислорода (150 мкМ). Линейная регрессия точек данных от сигнала после добавления азида может быть использована для интерполяции химического и_{О2-зависимого} фона комплексного IV анализа активности. Значения ROX должны быть вычтены из всех значений дыхания, чтобы скорректировать потребление немитохондриального кислорода.

Биологически ROX в случае изолированных митохондрий может быть ниже, чем с пермеабилизированными или интактными клетками / тканью. В целом, остаточное дыхание вызвано активностью ферментов оксидазы, при этом клетки и ткани имеют больше аутоксидизируемых веществ, чем изолированные митохондрии⁴⁴. Кроме того, поскольку внутриклеточные мембранные структуры все еще неповреждены, трудность проникновения кислорода через клеточные мембраны увеличивается из-за его отрицательного заряда. Следовательно, диффузия через клеточные мембраны и внутриклеточная доступность кислорода могут быть затронуты, что приводит к ROX. Однако было показано, что выделение митохондрий нарушает морфологию митохондрий, увеличивает выработку митохондриальной перекиси водорода наряду с измененной митохондриальной дыхательной функцией⁴⁵. В то время как изоляция функциональных митохондрий обеспечивает специфическую нормализацию и может потребоваться в определенных условиях, процесс выделения занимает много времени, обычно требует больше материала и может не сохранять митохондриальную гетерогенность. По этой причине мы воздержались от включения митохондриальной изоляции в это исследование. Однако для скелетной или сердечной мышцы выделение митохондрий или лечение волокон сапонином имеет важное значение для измерения дыхания. Поскольку аутолитические процессы происходят очень быстро после эвтаназии, рекомендуется быстрое извлечение тканей и соблюдение сопоставимых сроков для препаратов между отдельными экспериментами.

В наших экспериментах оценка митохондриальной дыхательной функции клеток млекопитающих привела к сопоставимым результатам с обоими устройствами HRR. Тем не менее, базальное дыхание было выше для cHRR по сравнению с mHRR. Помимо многочисленных технических аспектов (объем камеры, перемешивание и различная интеграция сигналов), биологические причины, такие как измененная среда дыхания, время сбора клеток и неприсоединенные клетки, вызывающие потерю клеточного контакта, могут вызывать наблюдаемые различия. Следовательно, протоколы дыхания в целом и отдельные концентрации субстрата и ингибитора не являются взаимозаменяемыми между системами по представленным причинам, которые могут носить технический характер (например, титрование) и, как правило, различные реагенты для анализа (например, дыхательные среды, химические поглощения стекла или полимеров). Для обеспечения высочайшей воспроизводимости ряд технических соображений и рекомендаций включают в себя i) использование одноразовых аликвот для сведения к минимуму перекрестного загрязнения или циклов замораживания-оттаивания, ii) надлежащее хранение всех химических веществ (например, АДФ при -80°С для обеспечения длительной стабильности, пируват, приготовленный свеже- и светочувствительными химическими веществами в темноте), iii) регулярное и строгое повторное тестирование химических веществ на эффективность (например, изменения концентрации, вызванные испарением, потеря активности TMPD, вызванная хранением) и (iv) обширная очистка для удаления любых следов химического вещества. Соображения о воспроизводимости продольных исследований (в течение нескольких лет) потребуют мониторинга производительности устройства и обеспечения стабильности реагентов с течением времени.

Наконец, новая технология, основанная на комбинированных потенциометрических (рН) и амперометрических (_О2) измерениях с помощью электродов на основе оксида рутения, может катализировать смену парадигмы в современных инструментах, позволяя изучать клеточный метаболизм в культуре и in vivo⁴⁶. Хотя современные методы позволяют преимущественно ex vivo и in vitro оценивать клеточный метаболизм, замедленная флуоресценция позволяет проводить анализ in vivo митохондриального кислорода в качестве меры митохондриальной функции⁴⁷. Аналогичным образом, респирометрия на основе микрофлюидики показывает перспективность в более высокой чувствительности, требуя всего несколько сотен клеток⁴⁸. В то время как новые методологии находятся на горизонте, на сегодняшний день респирометрия с высоким разрешением остается золотым стандартом для оценки способности клеточного дыхания, для которой здесь представлены квинтэссенциальные протоколы, применимые к большинству клеток, тканей и организмов для изучения митохондриального дыхания.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Отсутствие конфликта интересов для раскрытия.

Acknowledgments

Эта работа была поддержана финансированием Академии Финляндии (C.B.J), Фонда Магнуса Эрнрута (C.B.J)) и докторской стипендии Интегрированной высшей школы наук о жизни (R.A.).

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
2 mL Potter-Elvehjem Glass/PTFE Tissue Grinder/Homogenizer	Omni International	07-358029
95% O₂, 5% CO₂ medical gas mixture			Potter for tissue grinding
ADP	Sigma	A 4386
Antimycin A	Sigma	A 8674	Chemical
Ascorbate	Merck	PHR1279-1G	Chemical, dissolve in ethanol
BSA (fatty accid free)	Sigma	A 6003	Chemical
CaCO₃	Sigma	C 4830	Chemical
Cytochrome c	Sigma	C 7752	Chemical
Digitonin	Sigma	D 5628	Chemical
Dithiothreitol	Sigma	D 0632	Chemical, dissolve in DMSO
D-Sucrose	Roth	4621.1	Chemical
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (High glucose)	Fisher Scientific	41965-039	Chemical
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (No Glucose)	Fisher Scientific	A14430-01
EGTA	Sigma	E 4378
Etomoxir	Sigma	E1905	Chemical
Falcon 15 ml Conical Centrifuge Tubes	Fisher Scientific	AM12500	Chemical
Falcon 50 ml Conical Centrifuge Tubes	Fisher Scientific	AM12501
FCCP	Sigma	C 2920
Glucose	Sigma	G7021	Chemical, dissolve in ethanol
Glutamate	Sigma	G 1626	Chemical
GlutaMax (100x) (200 nM L-alanyl-L-glutamine dipeptide)	Fisher Scientific	35050061	Chemical
HEK293 cells	ATTC	CRL-1573
Hemocytometer	Fisher Scientific	0267151B	Instrument for cell counting
Hepes	Sigma	H 7523	Chemical
Imidazole	Fluka	56750	Chemical
KCl	Merck	1.04936	Chemical
L-carnitine	Sigma	C0283	Chemical
Malate	Sigma	M 1000	Chemical
MES hydrate	Sigma	M8250	Chemical
MgCl₂	Sigma	M 9272	Chemical
Na₂ATP	Sigma	A 2383	Chemical
Na₂Phosphocreatine	Sigma	P 7936	Chemical
Na-pyruvate (100 mM) (100x)	Fisher Scientific	11360070
NEAA (Non-essential amino acids) 100x	Fisher Scientific	11140035
Normal FBS (10x)	Fisher Scientific	10500064
O₂k-Core: Oxygraph-2k	Oroboros Instruments	10000-02	High-resolution respirometry instrument
O₂k-Titration Set	Oroboros Instruments	20820-03	Hamilton syringes for chemical injections
Oligomycin	Sigma	O 4876	Chemical, dissolve in ethanol
Palmitoylcarnitine	Sigma	P 4509	Chemical
Penicillin-Streptomycin	Fisher Scientific	15140122
Pierce BCA Protein Assay Kit	Fisher Scientific	23227
Pyruvate	Sigma	P 2256	Chemical
RIPA-Buffer	Fisher Scientific	89900	Chemical
Rotenone	Sigma	R 8875	Chemical, dissolve in ethanol
Saponin	Sigma	S7900	Chemical
Seahorse XF DMEM assay medium pack, pH 7.4	Agilent, Santa Clara, CA	103680-100
Seahorse XFe96 Extracellular Flux Analyzer	Agilent, Santa Clara, CA		High-throughput respirometry instrument
Seahorse XFe96 FluxPak	Agilent, Santa Clara, CA		Includes assay plates, cartridges, loading guides for transferring compounds to the assay cartridge, and calibrant solution.
Small scissors	Fisher Scientific	08-951-20
Sodium azide	Sigma	S2002	Chemical
Succinate	Sigma	S 2378	Chemical
Taurine	Sigma	T 8691	Chemical
TMPD	Sigma	T 3134	Chemical
Trypan Blue solution	Merck	72-57-1	Chemical
Trypsin 0.25% EDTA	Fisher Scientific	25200056
Two thin-edged forceps	Fisher Scientific	12-000-122
Uridine stock (500x)	Sigma	U3750	Chemical

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

McBride, H. M., Neuspiel, M., Wasiak, S. Mitochondria: More than just a powerhouse. Current Biology. 16 (14), 551-560 (2006).
Mehta, M. M., Weinberg, S. E., Chandel, N. S. Mitochondrial control of immunity. Beyond ATP. Nature Reviews Immunology. 17 (10), 608-620 (2017).
Spinelli, J. B., Haigis, M. C. The multifaceted contributions of mitochondria to cellular metabolism. Nature Cell Biology. 20 (7), 745-754 (2018).
Gnaiger, E. Capacity of oxidative phosphorylation in human skeletal muscle. New perspectives of mitochondrial physiology. International Journal of Biochemistry and Cell Biology. 41 (10), 1837-1845 (2009).
Gorman, G. S., et al. Mitochondrial diseases. Nature Reviews Disease Primers. 2, 1-23 (2016).
Boushel, R., Gnaiger, E., Schjerling, P., Skovbro, M., Kraunsøe, R., Dela, F. Patients with type 2 diabetes have normal mitochondrial function in skeletal muscle. Diabetologia. 50 (4), 790-796 (2007).
Cogliati, S., et al. Mitochondrial cristae shape determines respiratory chain supercomplexes assembly and respiratory efficiency. Cell. 155 (1), 160-171 (2013).
Kühlbrandt, W. Structure and function of mitochondrial membrane protein complexes. BMC Biology. 13, 1-11 (2015).
Gnaiger, E. Mitochondrial pathways and Respiratory control. An introduction to OXPHOS analysis. Bioenergetics communications. 5th ed. , Steiger Druck GmbH. Axams, Austria. (2020).
Jackson, C. B., et al. Mutations in SDHD lead to autosomal recessive encephalomyopathy and isolated mitochondrial complex II deficiency. Journal of Medical Genetics. 51 (3), 170-175 (2014).
Pesta, D., Gnaiger, E. High-resolution respirometry: OXPHOS protocols for human cells and permeabilized fibers from small biopsies of human muscle. Methods in Molecular Biology. 810, Clifton, N.J. 25-58 (2012).
Horan, M. P., Pichaud, N., Ballard, J. W. O. Review: Quantifying mitochondrial dysfunction in complex diseases of aging. Journals of Gerontology - Series A Biological Sciences and Medical Sciences. 67 (10), 1022-1035 (2012).
Doerrier, C., Garcia-Souza, L. F., Krumschnabel, G., Wohlfarter, Y., Mészáros, A. T., Gnaiger, E. High-resolution fluorespirometry and oxphos protocols for human cells, permeabilized fibers from small biopsies of muscle, and isolated mitochondria. Methods in Molecular Biology. 1782, Clifton, N.J. 31-70 (2018).
Zhang, J., et al. Measuring energy metabolism in cultured cells, including human pluripotent stem cells and differentiated cells. Nature Protocols. 7 (6), 1068-1085 (2012).
García-Roche, M., Casal, A., Carriquiry, M., Radi, R., Quijano, C., Cassina, A. Respiratory analysis of coupled mitochondria in cryopreserved liver biopsies. Redox Biology. 17, 207-212 (2018).
Acin-Perez, R., et al. A novel approach to measure mitochondrial respiration in frozen biological samples. The EMBO Journal. 39 (13), 1-18 (2020).
SUITBrowserWeb. , Available from: http://suitbrowser.oroboros.at/ (2021).
Cell metabolism assay kits. Seahorse assay kits and media. , Available from: https://www.agilent.com/en/product/cell-analysis/real-time-cell-metabolic-analysis/xf-assay-lits-reagents-cell-assay-media (2021).
Chance, B., Williams, G. R. A method for the localization of sites for oxidative phosphorylation. Nature. 176 (4475), 250-254 (1955).
Gnaiger, E., et al. Mitochondrial respiratory states and rates. MitoFit Preprint Arch. , (2019).
Gnaiger, E. O2k-procedures: SOP O2k quality control 1: Polarographic oxygen sensors and accuracy of calibration Section Page. Oroboros. 03 (18), http://wiki.oroboros.at/index.php/MiPNet06.03_POS-Calibration-SOP 1-21 (2020).
Robinson, B. H., Petrova-Benedict, R., Buncic, J. R., Wallace, D. C. Nonviability of cells with oxidative defects in galactose medium: A screening test for affected patient fibroblasts. Biochemical Medicine and Metabolic Biology. 48 (2), 122-126 (1992).
King, M. P., Attardi, G. Human cells lacking mtDNA: Repopulation with exogenous mitochondria by complementation. Science. 246 (4929), 500-503 (1989).
Makrecka-Kuka, M., Krumschnabel, G., Gnaiger, E. High-resolution respirometry for simultaneous measurement of oxygen and hydrogen peroxide fluxes in permeabilized cells, tissue homogenate and isolated mitochondria. Biomolecules. 5 (3), 1319-1338 (2015).
Fasching, M., Gnaiger, E. O2k quality control 2: Instrumental oxygen background correction and accuracy of oxygen flux. Mitochondrial Physiology Network. 14 (06), 1-14 (2016).
Gnaiger, E., Lassnig, B., Kuznetsov, A., Rieger, G., Margreiter, R. Excess capacity of cytochrome c oxidase. Journal of Experimental Biology. 1139, 1129-1139 (1998).
Gnaiger, E., et al. Mitochondria in the Cold. Life in the Cold. , Springer. Berlin, Heidelberg. 431-442 (2000).
Fontana-Ayoub,, Fasching, M., Gnaiger, E. Selected media and chemicals for respirometry with mitochondrial preparations. Mitochondrial Physiology Network. 02 (17), 1-9 (2014).
Gerencser, A. A., et al. Quantitative microplate-based respirometry with correction for oxygen diffusion. Analytical Chemistry. 81 (16), 6868-6878 (2009).
Krumschnabel, G., Eigentler, A., Fasching, M., Gnaiger, E. Use of safranin for the assessment of mitochondrial membrane potential by high-resolution respirometry and fluorometry. Methods in Enzymology. 542, 163-181 (2014).
Nászai, A., Terhes, E., Kaszaki, J., Boros, M., Juhász, L. Ca(2+)N it be measured? Detection of extramitochondrial calcium movement with high-resolution fluorespirometry. Scientific Reports. 9 (1), 1-13 (2019).
Pajak, B., et al. 2-Deoxy-d-Glucose and its analogs: From diagnostic to therapeutic agents. International Journal of Molecular Sciences. 21 (1), 234 (2019).
Mercier-Letondal, P., Marton, C., Godet, Y., Galaine, J. Validation of a method evaluating T cell metabolic potential in compliance with ICH Q2 (R1). Journal of Translational Medicine. 19 (1), 1-15 (2021).
Sauerbeck, A., et al. Analysis of regional brain mitochondrial bioenergetics and susceptibility to mitochondrial inhibition utilizing a microplate based system. Journal of Neuroscience Methods. 198 (1), 36-43 (2011).
Jackman, M. R., Willis, W. T. Characteristics of mitochondria isolated from type I and type IIb skeletal muscle. American Journal of Physiology - Cell Physiology. 270 (2), 673-678 (1996).
Ponsot, E., et al. Mitochondrial tissue specificity of substrates utilization in rat cardiac and skeletal muscles. Journal of Cellular Physiology. 203 (3), 479-486 (2005).
Schönfeld, P., Reiser, G. Why does brain metabolism not favor burning of fatty acids to provide energy-Reflections on disadvantages of the use of free fatty acids as fuel for brain. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 33 (10), 1493-1499 (2013).
Calderon-Dominguez, M., Mir, J. F., Fucho, R., Weber, M., Serra, D., Herrero, L. Fatty acid metabolism and the basis of brown adipose tissue function. Adipocyte. 5 (2), 98-118 (2016).
Divakaruni, A. S., Rogers, G. W., Murphy, A. N. Measuring mitochondrial function in permeabilized cells using the seahorse XF analyzer or a clark-type oxygen electrode. Current Protocols in Toxicology. 2014, 1-16 (2014).
Iuso, A., Repp, B., Biagosch, C., Terrile, C., Prokisch, H. Assessing mitochondrial bioenergetics in isolated mitochondria from various mouse tissues using Seahorse XF96 analyzer. Methods in Molecular Biology. 1567, 217-230 (2017).
Rogers, G. W., et al. High throughput microplate respiratory measurements using minimal quantities of isolated mitochondria. PLoS ONE. 6 (7), 21746 (2011).
Jordá, A., Zaragozá, R., Portolés, M., Báguena-Cervellera, R., Renau-Piqueras, J. Long-term high-protein diet induces biochemical and ultrastructural changes in rat liver mitochondria. Archives of Biochemistry and Biophysics. 265 (2), 241-248 (1988).
Jackson, C. B., Gallati, S., Schaller, A. QPCR-based mitochondrial DNA quantification: Influence of template DNA fragmentation on accuracy. Biochemical and Biophysical Research Communications. 423 (3), 441-447 (2012).
Hirsch, H. M. Tissue autoxidation inhibitors: II. The presence of inhibitor in intact cells; Assay of liver and hepatoma effect on radio-oxidations. Cancer Research. 16 (11), 1076-1082 (1956).
Picard, M., et al. Mitochondrial structure and function are disrupted by standard Isolation methods. PLoS ONE. 6 (3), 18317 (2011).
Tanumihardja, E., Slaats, R. H., Van Der Meer, A. D., Passier, R., Olthuis, W., Van Den Berg, A. Measuring both pH and O2 with a single On-Chip sensor in cultures of human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes to track induced changes in cellular metabolism. ACS Sensors. 6 (1), 267-274 (2021).
Harms, F., Stolker, R. J., Mik, E. Cutaneous respirometry as novel technique to monitor mitochondrial function: A feasibility study in healthy volunteers. PLoS ONE. 11 (7), 159544 (2016).
Levitsky, Y., et al. Micro-respirometry of whole cells and isolated mitochondria. RSC Advances. 9 (57), 33257-33267 (2019).

Biology

Респирометрия высокого разрешения для оценки биоэнергетики в клетках и тканях с использованием камерных и пластинчатых респирометров

Summary

Abstract

Introduction

Protocol

Representative Results

Discussion

Disclosures

Acknowledgments

Materials

References

Tags

Cite this Article

Summary

Abstract

Introduction

Protocol

Representative Results

Discussion

Disclosures

Acknowledgments

Materials

References

Tags

Cite this Article

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.