Biology

La respirométrie à haute résolution pour évaluer la bioénergétique dans les cellules et les tissus à l’aide de respiromètres à chambre et à plaques

Published: October 26, 2021 doi: 10.3791/63000

Ryan Awadhpersad¹, Christopher B. Jackson¹

¹Department of Biochemistry and Developmental Biology, Faculty of Medicine, University of Helsinki

Summary

L’évaluation de la phosphorylation oxydative à l’aide de respiromètres à haute résolution est devenue une partie intégrante de l’analyse fonctionnelle des mitochondries et du métabolisme énergétique cellulaire. Ici, nous présentons des protocoles pour l’analyse du métabolisme énergétique cellulaire à l’aide de respiromètres haute résolution à chambre et à microplaques et discutons des principaux avantages de chaque appareil.

Abstract

La respirométrie à haute résolution (HRR) permet de surveiller la phosphorylation oxydative en temps réel pour l’analyse des états énergétiques cellulaires individuels et l’évaluation des complexes respiratoires à l’aide de protocoles diversifiés de titrage substrat-découpleur-inhibiteur (SUIT). Ici, l’utilisation de deux appareils de respirométrie à haute résolution est démontrée, et une collection de base de protocoles applicables à l’analyse des cellules cultivées, des fibres musculaires squelettiques et cardiaques et des tissus mous tels que le cerveau et le foie sont présentés. Des protocoles pour les cellules et tissus cultivés sont fournis pour un respiromètre à chambre et des cellules cultivées pour un respiromètre à microplaques, tous deux englobant les protocoles de respiration standard. À des fins de comparaison, des cellules HEK293 conçues par CRISPR et déficientes en traduction mitochondriale provoquant une déficience multiple du système respiratoire sont utilisées avec les deux appareils pour démontrer des défauts cellulaires dans la respiration. Les deux respiromètres permettent une mesure complète de la respiration cellulaire avec leurs mérites techniques respectifs et leur adéquation en fonction de la question de recherche et du modèle à l’étude.

Introduction

Les mitochondries remplissent la fourniture clé d’énergie et sont un organite compartimenté contribuant aux processus bioénergétiques et métaboliques cellulaires essentiels tels que l’anabolisme des nucléotides, des lipides et des acides aminés, la biogenèse des amas fer-soufre et sont impliquées dans la signalisation telle que la mort cellulaire contrôlée ^1,2,3 . La bioénergétique mitochondriale par phosphorylation oxydative contribue à presque tous les processus cellulaires au sein de la cellule et, par conséquent, les dysfonctionnements mitochondriaux d’origine primaire ou secondaire sont associés à un large éventail de maladies ^4,5. Le dysfonctionnement mitochondrial implique non seulement des altérations de la structure ou de la densité mitochondriale, mais aussi de la qualité et de la régulation du système respiratoire⁶. Cet élément qualitatif englobe le contrôle du substrat, les caractéristiques de couplage, les modifications post-traductionnelles, la dynamique des cristae et les supercomplexes respiratoires ^7,8. Par conséquent, une analyse précise de la bioénergétique mitochondriale pour des approches expérimentales et diagnostiques visant à évaluer le métabolisme énergétique de la cellule est importante pour la santé et la maladie.

La phosphorylation oxydative mitochondriale (OXPHOS) est une séquence de réactions au sein du système respiratoire ou du système de transfert d’électrons (ETS) pour la génération d’énergie cellulaire par l’adénosine triphosphate (ATP)⁹. L’étape multi-enzymatique visant à exploiter l’énergie du flux d’électrons à travers les complexes I et II vers le complexe IV génère un gradient électrochimique de protons à travers la membrane mitochondriale interne, utilisé par la suite pour la phosphorylation de l’adénosine diphosphate (ADP) en ATP via le complexe V (F₁F_O ATP synthase) (Figure 1A).

Tout d’abord, des transporteurs à deux électrons sont générés au cours du cycle tricarboxylique (TCA), de la glycolyse et de l’oxydation du pyruvate : nicotinamide adénine dinucléotide (NADH) et dihydroflavine adénine dinucléotide (FADH₂). Le NADH est oxydé au niveau du complexe I (NADH déshydrogénase), au cours duquel deux électrons sont transférés à la coenzyme Q (la quinone est réduite en quinol), tandis que les protons sont pompés dans l’espace intermembranaire (IMS). Deuxièmement, le complexe II (Succinate déshydrogénase) oxyde le FADH₂ et alimente les électrons en coenzyme Q sans pomper de protons. Troisièmement, au complexe III (cytochrome c oxydoréductase), les électrons de la coenzyme Q sont transférés au cytochrome c tandis que les protons sont pompés dans l’IMS. Quatrièmement, le cytochrome c transfère les électrons au complexe IV (Cytochrome c oxydase), le complexe final pour pomper les protons, et où l’oxygène fonctionne comme un accepteur d’électrons pour assimiler les protons, formant finalement de l’eau. C’est cet oxygène que les mitochondries consomment qui peut être mesuré par un oxygraphe. Enfin, les protons générés à partir des complexes I, III et IV sont utilisés pour faire tourner le complexe V, générant ainsi de l’ATP⁹.

Il est important de noter que le transfert d’électrons ne se produit pas seulement de manière linéaire, autrement désigné comme la chaîne de transport d’électrons. Au lieu de cela, les électrons peuvent être transférés au pool de coenzyme Q par de multiples voies respiratoires et faciliter le flux d’électrons convergents. Les substrats de NADH et le succinate, par exemple, peuvent entrer par les complexes I et II, respectivement. Les électrons issus de l’oxydation des acides gras peuvent être donnés via le complexe flavoprotéique de transfert d’électrons. En effet, une analyse complète d’OXPHOS nécessite une approche holistique avec des substrats de combustible appropriés (Figure 1A).

Figure 1 : Phosphorylation oxydative mitochondriale et protocoles spécifiques de substrat et d’inhibiteur. (A) Mitochondrie et schéma du système de transfert d’électrons (CI-CIV) et de la F₁F₀ ATP synthase mitochondriale (CV). Toutes les structures sont de PDB. Les figures ne représentent que les substrats et les inhibiteurs décrits dans cette étude). (B) Échantillon de trace de flux d’oxygène dans des cellules HEK293 intactes utilisant un protocole standard dans un dispositif mHRR. (C) Échantillon de trace de flux d’oxygène dans des cellules HEK293 intactes utilisant un protocole standard dans un dispositif cHRR. (D) Échantillon de trace de flux d’oxygène dans des fibroblastes humains perméabilisés provenant d’un donneur sain avec le protocole SUIT respectif. Abréviations : 1 = Respiration de routine des cellules intactes; 2 = État 2; 3 = État 3(I); 4 = État 3(I) avec cytC; 5 = État 3 (I+II); 6 = Fuite (OM); 7 = capacité du SEQE; 8 = S(ROT); 9 = ROX; 10 = TMPD; 11 = Az. ROT = Roténone, AM = Antimycine, ATP = Adénosine triphosphate, Az = Azide, OM = Oligomycine, FCCP = Cyanure de carbonyle p-trifluoro-méthoxyphényl-hydrazone; Asc = Ascorbate, TMPD = N,N,N′,N′-tétraméthyl-p-phénylènediamine, Succ = Succinate, M = Malate, P = Pyruvate, ADP = Adénosine diphosphate, NAD = Nicotinamide adénine dinucléotide, IMS = Espace intermembranaire, FAD = Flavine adénine dinucléotide. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

L’analyse de la capacité OXPHOS mitochondriale à l’aide de HRR est devenue une méthode biochimique instrumentale de valeur diagnostique non seulement pour les défauts mitochondriaux primaires^10,11, mais s’étendant à tous les autres domaines de la biologie tels que le cancer et le vieillissement¹². HRR permet la détermination de la respiration cellulaire par l’analyse de la capacité mitochondriale OXPHOS, qui reflète directement une déficience individuelle ou combinée du complexe respiratoire mitochondrial, et est indirectement associée à un dysfonctionnement cellulaire et à une altération du métabolisme énergétique⁹. Sur le plan méthodologique, les mesures de la respiration sont effectuées à l’aide de cellules, de^{tissus ou} de mitochondries ^{isolées 11,13,14}, le matériel congelé ne convenant que partiellement^15,16. Il est démontré que les tissus congelés ont un ETS intact avec une stabilité supercomplexe maintenue¹⁵. Ainsi, contrairement aux intermédiaires TCA traditionnels, les substrats respectifs sont directement introduits dans l’ETS. Cependant, le couplage entre la synthèse de l’ETS et de l’ATP est perdu car l’intégrité de la membrane est compromise par les dommages causés par le gel (formation de cristaux de glace).

Les expériences de respiration ont normalement lieu à une température physiologique de 37 °C pour les endothermes dans des cellules ou des tissus non perméabilisés ou perméabilisés. Alors que le premier considère le contexte métabolique cytosolique, le second fournit la contribution énergétique des complexes OXPHOS individuels et de l’ATPase par l’ajout de substrats spécifiques (et d’inhibiteurs). La séquence et la variation des substrats et des inhibiteurs ont conduit au développement d’un large éventail de protocoles SUIT¹⁷ et^{de tests 18} pour répondre à diverses questions scientifiques de la fonction OXPHOS (examinés sous¹²). Le protocole de base de la respiration cellulaire évalue quatre états différents: i) la respiration de routine - la respiration dans un milieu respiratoire respectif sans aucun ajout de substrats ou d’inhibiteurs consommant mais endogènes. Cet état peut révéler des OXPHOS généraux ou des défauts respiratoires induits secondaires causés, par exemple, par des profils de métabolites modifiés. Ensuite, l’ajout de l’inhibiteur de l’ATPase oligomycine révèle la perméabilité de la membrane mitochondriale interne aux protons, définie comme ii) la respiration des fuites. Le titrage ultérieur d’un protonophore tel que le décupleur cyanure de carbonyle p-trifluoro-méthoxyphényl-hydrazone (FCCP) permet de déterminer l’état auquel la capacité ETS est maximale dans un mode de circuit proton transmembranaire ouvert, défini comme iii) respiration non couplée. Il est important de noter qu’un état non couplé peut également se produire par des interventions expérimentales par des dommages mécaniques excessifs aux membranes mitochondriales. Inversement, l’état non couplé fait référence au découplage respiratoire par un mécanisme intrinsèque qui est physiologiquement contrôlé. Enfin, l’inhibition complète de l’ETS par addition de l’inhibiteur du complexe III antimycine et de l’inhibiteur du complexe I roténone détermine la consommation résiduelle d’oxygène (ROX) des processus non mitochondriaux consommant de l’oxygène (Figure 1A-C).

La bioénergétique mitochondriale se compose de cinq états respiratoires distincts^19,20. La respiration de l’état 1 est sans substrats supplémentaires ni ADP, à l’exception de ce qui est disponible de manière endogène. Après l’ajout d’ADP, mais toujours, pas de substrats, la respiration de l’état 2 est atteinte. Lorsque des substrats sont ajoutés, permettant le transfert d’électrons et la synthèse de l’ATP, la respiration de l’état 3 est atteinte. Dans cet état, la capacité OXPHOS peut être définie à des concentrations saturantes d’ADP, de phosphate inorganique, d’oxygène, de substrats liés au NADH et au succinate. La respiration d’état 4 ou respiration LEAK peut être définie comme un état sans ADP ou ATP synthases inhibées chimiquement tout en ayant suffisamment de substrats. Enfin, lorsque tout l’oxygène est épuisé (anoxique) dans un cadre à chambre fermée, la respiration de l’état 5 est observée.

Plusieurs méthodes existent pour évaluer les états d’énergie cellulaire¹⁴ avec deux dispositifs dominant l’évaluation actuelle en temps réel d’OXPHOS par l’analyse de la consommation d’oxygène, mesurée comme la fonction de la diminution de l’oxygène au fil du temps dans un système à chambre fermée avec une applicabilité différente en fonction du modèle expérimental et de la question de recherche: le respiromètre haute résolution Oroboros 2k et l’analyseur de flux extracellulaire Seahorse XF. Les deux appareils enregistrent les taux de consommation d’oxygène sous forme de diminution des picomoles (pmol) d’oxygène (O₂) par seconde en tant que valeur absolue dans la chambre ou le puits de microplaque. La consommation spécifique d’oxygène par masse est obtenue en normalisant la consommation d’oxygène respective dans une recette tampon spécifique par nombre de cellules (millions), poids tissulaire (mg) ou quantité de protéines.

L’O2k (Oroboros Instruments) est un système fermé à deux chambres équipé d’un capteur d’oxygène polarographique (abrégé en respiromètre haute résolution à chambre: cHRR). Chaque chambre expérimentale contient 2 mL de liquide qui est maintenu homogène par des agitateurs magnétiques. Le capteur d’oxygène polarographique utilise une approche ampérométrique pour mesurer l’oxygène: il contient une cathode d’or, une anode argent/chlorure d’argent et entre les deux une solution KCI créant une cellule électrochimique sur laquelle une tension (0,8 V) est appliquée. L’oxygène du milieu d’essai diffuse à travers une membrane d’éthylène propylène fluoré de 25 μm (perméable à_L’O2) et subit une réduction à la cathode, produisant du peroxyde d’hydrogène. À l’anode, l’argent est oxydé par le peroxyde d’hydrogène, générant un courant électrique. Ce courant électrique (ampère) est linéairement lié à la pression partielle d’oxygène. La pression partielle de l’oxygène et le facteur de solubilité en oxygène du milieu d’essai sont utilisés pour calculer la concentration en oxygène. Étant donné que la pression partielle d’oxygène dépend de la température expérimentale et que les mesures polarographiques sont sensibles à la température, les fluctuations de température nécessitent une régulation précise (±0,002 °C) par un bloc chauffant Peltier. La température peut être contrôlée dans une plage de 4 °C et 47 °C.

L’analyseur de flux extracellulaire Seahorse XF (Agilent) est un système à base de plaques au format microplaque à 24 ou 96 puits dans lequel trois électrodes de fluorescence mesurent la consommation d’oxygène au fil du temps dans chaque puits (abrégé en respiromètre haute résolution à base de microplaques: mHRR). Un maximum de quatre ports dans la cartouche de dosage sont disponibles pour l’injection automatisée pendant le test. Un essai contient plusieurs cycles, chacun avec trois phases: 1) mélange, 2) attente et 3) mesure. Pendant la phase de mesure, les sondes de capteur sont abaissées dans la microplaque, créant une chambre temporairement fermée contenant un volume de 7 à 10 μL pour mesurer la lumière émise. Cette lumière est émise par des fluorophores incorporés dans des polymères à l’extrémité des sondes du capteur, qui détectent_O2en fonction de la trempe par phosphorescence. L’intensité du signal de fluorescence est proportionnelle à_O2 et influencée par la température du capteur et du milieu d’essai. Par conséquent, une estimation précise de l’oxygène nécessite une approche relative avec un puits de fond sans aucun échantillon. La restauration de la concentration en oxygène se produit pendant la phase de mélange lorsque le capteur se déplace de haut en bas pour mélanger le volume au-dessus de la chambre temporaire. Chaque cycle calcule un taux de consommation d’oxygène. La température peut être contrôlée dans une plage de 16 °C et 42 °C.

HRR est l’étalon-or pour évaluer la bioénergétique cellulaire dans les maladies primaires et associées aux mitochondries et le métabolisme cellulaire général. Dans cette étude, des protocoles de base pour hrr sont fournis pour évaluer la fonction OXPHOS dans les cellules et les tissus.

Figure 2 : Flux de travail pour les préparations cellulaires et tissulaires pour la RDH et préparation cellulaire pour la respirométrie mHRR. (A) Aperçu des protocoles fournis. (B) Cellules de mammifères (étape 1.2) : pastille HEK293 égale à 3 x 10⁶ cellules (panneau de gauche). Tissu non fibreux (étape 1.3) : Préparation du lysat de cervelet murin dans 2 mL de potier en téflon (panneau central). Perméabilisation musculaire squelettique induite par la saponine (étape 1.4) panneau de droite) pour la respirométrie cHRR. (C) Schéma standard d’ensemencement des microplaques (étape 2.4) et contrôle de la confluence pour l’analyse des cellules eucaryotes (HEK293) pour la respirométrie mHRR. (D, E) Schéma de chargement de l’orifice d’injection pour la respirométrie mHRR (étape 2.4). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

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Protocol

Tous les expérimentations animales sont effectués conformément au Conseil national d’examen de l’expérimentation animale et à l’Agence administrative régionale de l’État pour le sud de la Finlande. Des souris mâles C57BL/6JOlaHsd (âgées de 4 à 6 mois) ont été utilisées dans cette étude. Le consentement pour l’utilisation de lignées cellulaires humaines a été obtenu auprès du comité d’éthique institutionnelle de l’Université d’Helsinki.

1. Respirométrie à haute résolution : respiromètre à chambre (cHRR)

REMARQUE: Les expériences de cette section du protocole ont été réalisées à l’aide de l’Oroboros O2k-Core: Oxygraph-2k (Table des matériaux)

Étalonnage des capteurs d’oxygène
1. Respiromètres pré-exécutés à 37 °C dans 2,1 mL de milieu respiratoire mitochondrial (MiR05, tableau 1, facteur de solubilité : 0,92) pendant >45 min et effectuer l’étalonnage de l’oxygène comme décrit²¹. Procéder si la variation de base se situe dans ± 4 pmol/s.
  REMARQUE: De grandes fluctuations du signal de fond pourraient indiquer un entretien nécessaire de la membrane du capteur ou des traces d’inhibiteurs restant dans la chambre lors d’expériences antérieures. Une correction instrumentale du flux d’oxygène de fond est recommandée avant un lot d’expériences²⁵.
2. Enregistrez les valeurs d’étalonnage de l’oxygène pour surveiller les performances de la membrane du capteur au fil du temps.
  REMARQUE: Cela révèle la fonction du capteur, la stabilité signal-bruit et quand l’entretien de la membrane du capteur est nécessaire. En fonction de la pression ambiante, entre 180 et 200 μmol d’oxygène sont solubilisés dans MiR05.
3. Retirer tout le liquide dans la chambre avant l’ajout de tout échantillon dans le milieu respiratoire.
  REMARQUE: Évaluez le volume des chambres de respiration à exactement 2 mL régulièrement.
Préparation de cellules pour la respirométrie à haute résolution
1. Cultiver des cellules HEK293 dans des boîtes de 10 cm^{et 2} diamètres dans le milieu de l’Aigle modifié (DMEM) de Dulbecco avec un taux élevé de glucose complété par du sérum fœtal bovin (FBS) inactivé par la chaleur à 10%, du GlutaMax, des acides aminés non essentiels et du Na-Pyruvate²² et de l’uridine²³ pour soutenir le métabolisme défectueux d’OXPHOS dans un incubateur à 37 ° C à 5% de CO₂.
  REMARQUE: Tout type de cellule eucaryote peut être cultivé. Pour la plupart des types de cellules, la culture d’un plat de 10 cm² conduit à suffisamment de cellules (généralement >3 x 10⁶ cellules). Vérifiez régulièrement l’infection à mycoplasmes pour éviter les effets sur le métabolisme cellulaire et la respiration.
2. Cultiver des cellules sans dépasser 90 % de confluence (Figure 2C).
  REMARQUE: Les cellules ayant une confluence >90% peuvent présenter des effets inhibiteurs dépendants de la croissance sur la respiration (si elles ne sont pas synchronisées ou post-mitotiques).
3. Lavez les cellules avec 1x PBS, détachez avec 1 mL de trypsine chaude à 0,25%, désactivez la trypsine en ajoutant du DMEM chaud (5 mL / 10 cm² plaque) et comptez les cellules avec un hémocytomètre.
4. Centrifugez doucement la solution cellulaire égale à 2,5 x 10⁶ cellules à 300 x g pendant 5 min, retirez complètement le surnageant et remettez en suspension dans 2,5 mL de MiR05 chaud (1 x 10⁶ cellules/mL) (Figure 2A).
5. Pour les cellules de suspension, compter et retirer la solution égale à 2,5 x 10⁶ cellules, pastille et continuer comme mentionné à l’étape 1.2.4.
6. Exécutez le protocole SUIT pour l’optimisation de la perméabilisation (étape 1.6), la cellule ou le tissu perméabilisé (étape 1.5) ou les cellules intactes (étape 1.7)
  REMARQUE: Pour des résultats cohérents, il est recommandé de maintenir la concentration cellulaire constante (par exemple, 1 x 10⁶ cellules / mL). Bien que la respiration soit indépendante de la densité cellulaire dans le respiromètre²⁴, les substrats et les inhibiteurs sont à une concentration comparable tout au long des expériences si le nombre de cellules est maintenu constant.
Préparation de tissus non fibreux (p. ex. cerveau, foie) pour la respirométrie à haute résolution
1. Excisez un morceau de tissu homogène, de 30 à 40 mg de poids, ou utilisez l’organe entier (cervelet de souris dans ce cas).
  REMARQUE: Si le tissu n’est pas immédiatement utilisé, conserver dans 2 mL de MiR05 glacé permettant une conservation jusqu’à 2 h pour la plupart des tissus. Les temps de stockage individuels des tissus doivent être évalués dans des séries chronologiques.
2. Épongez le tissu avec un papier filtre Whatman (attention: la matière des tissus mous a tendance à coller).
3. Placez le morceau de tissu de 30 à 40 mg dans un homogénéisateur Elvehjem de potier en polytétrafluoroéthylène refroidi à la glace de 2 mL.
4. Ajouter une quantité appropriée de MiR05 pour obtenir 20 mg/mL afin de maintenir le rapport tissu-tampon. Conserver la quantité totale >1,5 mL et <2 mL pour éviter un liquide insuffisant ou excessif pour une perméabilisation mécanique appropriée.
5. Insérez le pilon, lysez le tissu lentement en rétractant soigneusement le pilon tout en évitant la génération d’un vide causant des dommages excessifs aux tissus.
6. Effectuer 7 coups au total (1x défini comme un coup vers le haut et vers le bas) jusqu’à ce qu’il soit lysé (apparent comme un liquide trouble sans débris majeurs) (Figure 2B).
  REMARQUE: Le nombre d’AVC pour une lyse appropriée doit être testé pour chaque tissu en évaluant l’intégrité de la membrane mitochondriale externe via la réponse du cytochrome C (étape 1.5.11). Des parties de tissu conjonctif ou de vaisseau difficiles à lyser peuvent rester.
7. Décantez le tissu lysé dans un tube de centrifugeuse de 15 mL.
8. Lavez l’intérieur du potier avec une quantité égale de MiR05 utilisé dans l’étape de lysage (par exemple, 1,5 mL) et ajoutez au tube de 15 mL contenant maintenant 3-4 mL de MiR05 à 10 mg / mL de lysat de tissu.
9. Ajouter 2 mL de MiR05 ordinaire par chambre pour chauffer à 37 °C.
10. Faire tourbillonner le tube pour une distribution égale avant de pipeter lentement 500 μL (soit 5 mg) de chaque lysat par chambre pour minimiser la contrainte du froid à 37 °C.
11. Attendez >3 min pour que le contenu de la chambre se réchauffe à 37 °C avant de fermer la chambre. Retirer l’excès de liquide sur le dessus du bouchon (quantité par chambre après fermeture: 4 mg).
12. Exécutez le protocole SUIT pour la perméabilisation standard (étape 1.5).
Préparation de tissu fibreux (muscle squelettique, muscle cardiaque) pour la respirométrie à haute résolution
1. Extraire le tissu dur, retirer le tissu conjonctif et la graisse des muscles à l’aide de pinces pointues dans 2 mL de BIOPS glacé (tableau 2) sous un microscope à dissection.
2. Séparez les faisceaux de fibres (~4 mg) le long de l’axe longitudinal avec des pinces pointues. Extraire suffisamment les fibres pour obtenir une structure en forme de maille (Figure 2B).
  REMARQUE: Une séparation mécanique et une perméabilisation appropriées des fibres sont indiquées par la perte de la myoglobine pigmentaire rouge et une translucidité accrue.
3. Laver et perméabiliser le faisceau de fibres dans de la saponine (50 μg/mL dans BIOPS, préparé frais) pendant 20 min à 4 °C (les fibres deviennent translucides, indiquant une perméabilisation complète, Figure 2B).
4. Lavez les fibres deux fois dans MiR05 pendant 5 min par lavage à 4 °C.
5. Sécher avec du papier filtre et peser avant d’ajouter à la chambre remplie de 2,1 mL de MiR05.
6. Introduisez les bouchons sans fermer complètement, puis oxygénez les chambres avec 2 mL_d’O2 pur à l’aide d’une seringue de 20 mL et fermez les chambres en tordant les bouchons dans un mouvement de rotation. Maintenir_la concentration d’O2 entre 300 et 500 μM pendant l’expérience pour éviter la limitation de la diffusion de l’oxygène.
Protocole d’évaluation de la respiration de routine dans les cellules ou les tissus
1. Ajouter l’échantillon à la chambre comme indiqué aux étapes 1.5.2-1.5.3.
2. Ajouter 2,3 mL de suspension chaude de cellules MiR05 (entrée standard : 1 x 10⁶ cellules/mL comme à l’étape 1,2 ou 2 mg de tissu/mL comme à l’étape 1.3)
3. Muscle squelettique et cardiaque (étape 1.4): Ajouter ~ 4 mg de fibres perméabilisées à la saponine à 2,3 mL de MiR05 chaud préavertissé en tenant compte des étapes 1.4.4-1.4.6
4. Faites fonctionner les chambres à 37 °C et à une vitesse d’agitation de 700 tr/min. Attendez >3 min pour permettre au média de dégazer et de fermer les chambres en tordant le bouchon dans un mouvement de rotation. La stabilisation du bloc Peltier indique l’atteinte de la température réglée.
5. (FACULTATIF) Modifiez la vitesse de l’agitateur à 300 tr/min pour permettre aux bulles restantes de s’échapper par le capillaire du bouchon.
6. Aspirer tout excès de liquide sur le dessus du bouchon. Attendez 10 minutes jusqu’à ce qu’un signal de flux d’oxygène stable soit obtenu avec n’importe quel type d’échantillon pour enregistrer la respiration de routine/état 1, Figure 1B).
7. Pour les mesures de la respiration dans les cellules et les tissus perméabilisés, passez à l’étape 1.6. Pour les cellules intactes avec l’étape 1.8.
Protocole pour l’analyse OXPHOS dans les cellules ou tissus perméabilisés
1. Utiliser un échantillon de tissu lysé (perméabilisé) ou perméabiliser des cellules en ajoutant 1 μL de digitonine (8,1 mM de digitonine dans du diméthylsulfoxyde (DMSO)) pour une concentration finale de 5 μg/mL pour perméabiliser les cellules. Le flux va baisser et devrait se stabiliser à >5 min.
  ATTENTION : La digitonine est extrêmement toxique pour les voies respiratoires, au contact de la peau ou lorsqu’elle est avalée.
  REMARQUE: L’injection de tous les produits chimiques est effectuée avec des seringues en verre de précision. Utilisez des seringues uniquement pour les produits chimiques indiqués afin d’éviter la contamination croisée et lavez soigneusement à l’eau et à l’EtOH après utilisation. Les seringues bloquées peuvent nécessiter des ultrasons dans du ddH₂O chaud ou un fil de nettoyage pour déloger les bouchons chimiques. Rétractez toujours un surplus de la solution mère respective dans la seringue pour éviter d’introduire de l’air dans les chambres. Inspectez l’intérieur des chambres pour l’introduction d’air après chaque injection. Enregistrez chaque étape jusqu’à ce que le flux plafonne.
2. Ajouter successivement : 5 μL de 0,4 M de malate (M) pour une concentration finale de 1 mM, 5 μL de 2,0 M de pyruvate (P; préparé fraîchement), pour une concentration finale de 5 mM, 4 μL de glutamate (G) de 2,5 M pour une concentration finale de 5 mM.
3. Après le plateau du flux précédent, ajouter 5 μL (10 μL pour le tissu musculaire) de 0,5 M d’adénosine diphosphate (ADP, aliquotes stockées à -80 °C) pour une concentration finale de 1,25 mM.
  REMARQUE: Les tissus tels que les muscles peuvent avoir besoin d’une concentration différente pour atteindre la saturation.
4. Ajouter 5 μL de cytochrome C (cytC) de 4 mM pour une concentration finale de 10 μM.
  REMARQUE : Facultatif pour les cellules afin d’évaluer la qualité de la perméabilisation.
5. Ajouter 16 μL de succinate (S) de 1,25 M pour une concentration finale de 10 mM. (FACULTATIF) Ajouter 3 μL de 0,5 M ADP pour une concentration finale de 2 mM afin de contrôler la saturation de la concentration d’ADP.
6. Pour les cellules et les tissus non fibreux, ajouter 2 μL de 1 mg/mL d’oligomycine (OM) pour une concentration finale de 1 μg/mL.
  ATTENTION : Tous les inhibiteurs de l’ETS utilisés sont très toxiques.
  REMARQUE: L’oligomycine peut nécessiter un titrage pour une concentration optimale car elle peut réduire la capacité ETS et est omise pour le tissu musculaire. Réoxygénez ici lorsque le tissu musculaire est dosé et si_O2est inférieur à 300 μM.
7. Titrer le FCCP à partir d’un stock de 2 mM, ajouter 0,6 μL avec les étapes suivantes de 0,2 μL jusqu’à ce qu’aucune augmentation de la respiration et la respiration ne soient découplées au maximum (théorique: non couplé).
8. Ajouter 1 μL de roténone (ROT) de 1 mM pour une concentration finale de 0,5 μM. Ajouter 2 μL de 1 mg/mL d’antimycine (AM) pour une concentration finale de 1 μg/mL.
9. Réoxygénez les chambres pour atteindre un niveau d’oxygène similaire (~150 μM) dans toutes les chambres en soulevant lentement le piston en mouvement de torsion.
10. Ajouter 5 μL d’ascorbate de 0,8 M pour une concentration finale de 2 mM immédiatement suivie de 5 μL de 0,2 M de N,N,N′,N′-tétraméthyl-p-phénylènediamine (TMPD) pour une concentration finale de 0,5 mM afin d’évaluer l’activité du complexe IV (facultatif).
11. Ajouter 5 μL d’azoture de 4 M pour une concentration finale de 10 mM immédiatement lorsque le flux maximal_d’O2 est atteint avec le TMPD. Poursuivez la course pendant >5 min pour tester l’auto-oxydation du TMPD pour le calcul complexe du niveau de base IV.
12. Recomptez les cellules pour confirmer le nombre de cellules avant l’exécution et passez à l’étape 1.9.
  REMARQUE: La perméabilisation de la digitonine (pour les cellules uniquement) doit être titrée dans les expériences d’essai pour atteindre le flux maximal et ne pas affecter l’intégrité de la membrane mitochondriale (voir l’étape 1.7). Les échantillons perméabilisés (en particulier le tissu musculaire) présentant une augmentation >10% de la fréquence respiratoire après l’ajout du cytochrome c doivent être exclus d’une analyse plus approfondie en raison de lésions de la membrane mitochondriale externe. Une baisse de flux de courte durée après l’ajout de produits chimiques dissous dans l’EtOH est attendue.
Protocole pour déterminer les conditions optimales de perméabilisation des cellules
1. Ajoutez des cellules comme décrit aux étapes 1.2 et 1.5.2.
2. Prendre 10 μL de 10 mg/mL de digitonine et ajouter 10 μL de DMSO pour diluer à 5 mg/mL.
3. Ajouter 1 μL de roténone (1 mM de bouillon). Ajouter 10 μL de succinate (2 mM de bouillon) et 5 μL d’ADP (0,5 M de bouillon).
4. Titrer 1 μL de digitonine (2,5 mg par étape) à plusieurs reprises jusqu’à ce que la respiration n’augmente plus et soit maximale.
  REMARQUE: Une diminution de la respiration indique une concentration excessive de digitonine.
Protocole pour l’analyse OXPHOS dans des cellules intactes
1. Après la respiration de routine (étape 1.6.1-1.6.6), ajouter 2 μL d’oligomycine de 0,01 mM pour une concentration finale de 10 nM.
2. Titrer le FCCP à partir d’un stock de 2 mM, ajouter 0,6 μL avec les étapes suivantes de 0,2 μL jusqu’à ce qu’aucune autre augmentation de la respiration et la respiration ne soit découplée au maximum (théorique: non couplée)
3. Ajouter 1 μL de roténone de 1 mM pour une concentration finale de 0,5 μM. Ajouter 2 μL de 1 mg/mL de stock d’antimycine pour une concentration finale de 1 μg/mL.
4. Réoxygénez la chambre au même niveau d’oxygène (~150 μM) en soulevant lentement le piston en mouvement de torsion.
5. Ajouter 5 μL d’ascorbate de 0,8 M pour une concentration finale de 2 mM. Ajouter immédiatement 5 μL de 0,2 M TMPD pour une concentration finale de 0,5 mM afin d’évaluer l’activité du complexe IV.
  REMARQUE: Préparez un nouveau lot avant tout ensemble d’expériences plus important, car le TMPD est sujet à l’auto-oxydation. L’activité peut diminuer avec le temps lorsqu’elle est stockée à -20 °C.
6. Ajouter 5 μL d’azoture de 4 M pour une concentration finale de 10 mM immédiatement lorsque le flux maximal_d’O2 est atteint avec le TMPD. Continuer l’exécution pendant >5 minutes pour tester l’auto-oxydation du TMPD pour le calcul complexe du niveau de base IV.
7. Recomptez les cellules pour confirmer le nombre de cellules avant l’exécution et passez à l’étape 1.9.
Collecte d’échantillons post-exécution
1. Collectez exactement 1 mL de suspension MiR05 de chaque chambre (avec agitateurs allumés) dans un tube de 1,5 mL de 1,5 mL.
2. Centrifuger à 1000 x g pour les cellules perméabilisées ou à 20 000 x g pour le lysat tissulaire. Retirer le surnageant et congeler la pastille à -80 °C pour un traitement ultérieur (section 3).
Analyse des protocoles SUIT
1. Analyser le flux d’oxygène (pmol/s, normalisé à l’entrée) à chaque plateau après l’ajout d’un substrat ou d’un inhibiteur (Figure 1C et Figure 3A). Exportez les valeurs dans une feuille de calcul.
2. Soustrayez la valeur de la consommation résiduelle d’oxygène (ROX, Figure 1C et Figure 3C) de toutes les valeurs de chaque essai expérimental. Soustrayez la respiration résiduelle d’azoture de la TMPD pour obtenir une respiration IV complexe.
3. Tracer les valeurs absolues normalisées pour l’entrée de cellules (Figure 3A, B) ou de tissu (Figure 5A,B). Calculez les rapports de contrôle du flux (étape 1.11) ou normalisez-les en fonction de l’apport en protéines (Figure 3C).
Calcul du rapport de contrôle de flux
1. Acquérir un indice de la fonction respiratoire et du contrôle du couplage à l’aide des rapports de contrôle de flux (FCR)^9,26.
  REMARQUE: Cela permet d’évaluer la qualité mitochondriale intrinsèque, indépendamment de la quantité mitochondriale. De plus, les rapports de contrôle du flux (FCR) sont comparables au sein des mêmes lignées cellulaires, ce qui permet le contrôle de la qualité des réactifs (les FCR respectifs sont obtenus à l’aide des valeurs de référence numérotées indiquées dans les figures 1B-D et 3C).
2. Calculer le rapport de contrôle respiratoire pour le couplage d’OXPHOS à LEAK à l’aide de l’équation 1.
  Équation 1 : FCR_ADP = 5/6 = État 3 / État 4
3. Calculer le FCR pour évaluer la respiration dépendante du NADH à l’aide de l’équation 2
  Équation 2 : État FCR_{3 (I)} = 3/5 = État 3 (I) / État 3 (I+II)
4. Calculez le FCR pour évaluer la respiration dépendante du succinate à l’aide de l’équation 3.
  Équation 3 : État FCR_{3 (II)} = 8/7 =_pourriture S /_capacité ETS
5. Calculez le FCR pour évaluer couplé à découplé à l’aide de l’équation 4.
  Équation 4 : FCR_{couplé/découplé}= 5/7 = État 3 (I+II) /_Capacité ETS
6. Pour tester l’intégrité de la membrane externe mitochondriale, utilisez l’équation 5.
  Équation 5 : % de lésions de la membrane externe mitochondriale = 3/4 = État 3 _(I) / État 3 _{(I) avec cyt c}

2. Respirométrie haute résolution : respiromètre à microplaques (mHRR)

REMARQUE: Les expériences de cette section du protocole ont été effectuées à l’aide de l’analyseur de flux extracellulaire Seahorse XFe96 (table des matériaux)

Culture cellulaire
1. Cultivez n’importe quel type de cellule. Les adhérents (p. ex. collagène, laminine) peuvent être utilisés pour faciliter l’attachement cellulaire. Ici, les cellules HEK293 sont cultivées comme avant (étape 1.3).
2. La veille de l’expérience, détachez les cellules et transférez-les dans une microplaque mHRR 96 puits désignée pour obtenir une confluence idéale le jour de l’expérience (80%-100%) (Figure 2C).
  REMARQUE: Pour mHRR, les densités de cellules de microplaques sont critiques. Les propriétés de croissance individuelles des lignées cellulaires ou des traitements affectant la croissance doivent être prises en compte pour assurer une confluence comparable le jour de l’expérience.
Préparation de cellules pour la respirométrie à haute résolution
1. Récolter et remettre en suspension les cellules suffisamment avant l’ensemencement
  REMARQUE: Il est recommandé d’ensemencer des cellules de la même dilution pour les répliques.
2. Ensemencez les cellules en fonction des taux de croissance des lignées cellulaires individuelles ou des propriétés de croissance sous traitement.
  REMARQUE: Optimisez sur une microplaque standard de 96 puits et extrapolez la densité cellulaire à une microplaque spécifique au test de 96 puits. Dans cette configuration, 7 x 10⁴ cellules HEK293 WT ont été ensemencées par puits d’un puits de 96. Les première et dernière colonnes de la plaque de 96 puits sont utilisées pour la détermination des protéines (figure 2C). Les quatre puits d’angle ne doivent contenir aucune cellule et sont utilisés pour la correction expérimentale du fond. Idéalement, les puits près des bords sont vides pour minimiser l’effet de bord (p. ex., les cellules présentent des taux de croissance modifiés causés par les effets de la température) (figure 2C, D).
Préparation des plaques de capteur, chargement des inhibiteurs
1. Le jour du dosage, compléter 38,8 mL de milieu avec 0,4 mL de 1 M glucose, 0,4 mL de glutamine 200 mM et 0,4 mL de Na-Pyruvate 100 mM.
  REMARQUE: la respiration mHRR nécessite un milieu DMEM spécialisé non tamponné à pH 7,4. En général, 40 mL devraient suffire pour une expérience avec une microplaque de 96 puits.
2. Réchauffer le milieu d’essai respiratoire à 37 °C et échanger le milieu de culture cellulaire contre le milieu d’essai respiratoire en lavant deux fois avec 80 μL par puits.
3. Placez la plaque avec les cellules dans un incubateur à 37 °C sans CO₂ pendant 60 min avant le test.
  REMARQUE: Cette étape est essentielle pour dégazer la plaque car le CO₂peut affecter les résultats respiratoires et le sérum dans le milieu peut produire des bulles pendant le test.
4. Les aliquotes inhibitrices préwarm pour OM, FCCP, ROT et AM à 37 °C et sortent la plaque du capteur de l’incubateur.
5. Diluer OM, FCCP, ROT et AM dans 3 mL de milieu d’essai jusqu’à une concentration finale du puits de 1,5 μM, 1,125 μM et 1 μM, respectivement. Remplissez des ports séparés comme indiqué à la figure 2E.
  REMARQUE: Une pipette multicanal est recommandée pour remplir la cartouche du capteur. Étant donné que l’air sous pression est utilisé pour injecter des composés, tous les orifices doivent être remplis avec une quantité égale de volume de liquide chaque fois qu’un orifice est rempli d’un composé. ROT et AM peuvent être combinés en un seul port. Les inhibiteurs peuvent être dissous dans l’EtOH ou le DMSO.
6. Inspectez les ports d’injection et vérifiez un volume de chargement uniforme pour chaque port.
  REMARQUE: Tous les ports contiennent un trou en bas pour l’injection. Des précautions doivent être prises lors du déplacement de la plaque du capteur. Les bulles d’air peuvent être enlevées à l’aide d’une aiguille.
Protocole pour l’évaluation de l’oxygène dans les cellules intactes
1. La veille du test, effectuez les étapes 2.4.2 à 2.4.7.
2. Aliquote 20 mL de la solution d’étrier dans un tube conique de 50 mL.
3. Ouvrez le kit de test de flux extracellulaire et retirez le contenu.
4. Placez la cartouche du capteur inversée à côté de la plaque utilitaire. Pipette 200 μL de solution d’étriquant dans chaque puits de la plaque utilitaire.
5. Fixez la cartouche du capteur sur la plaque d’utilité en veillant à ce que tous les capteurs soient immergés.
6. Placer la plaque dans un incubateur à 37 °C sans CO₂ pendant la nuit ou un minimum de 12 h. Vérifiez que l’humidité à l’intérieur de l’incubateur est suffisante pour empêcher l’évaporation de l’étrier.
7. Allumez le système à base de microplaques et l’ordinateur pour qu’ils soient prêts à être utilisés le lendemain (la machine nécessite un minimum de 3 h pour s’équilibrer à 37 °C avant de procéder à un essai).
  REMARQUE: Pour la stabilité du signal, augmentez les points de mesure à 6 au lieu de 3 cycles de mesure par état respiratoire. Chaque cycle consiste en 3 min de mélange et 3 min de mesure.
8. Le jour du test XF, effectuez les étapes 2.4.9 à 2.4.20.
9. Vérifiez la confluence de la plaque de culture cellulaire, la morphologie des cellules et que les puits de fond sont vides.
10. Laver les cellules avec le milieu respiratoire préparé comme mentionné aux étapes 2.4.11-2.4.12.
11. Retirer la totalité du milieu de culture, sauf 20 μL, de chaque puits. Retirer 55 μL si le milieu de culture était de 80 μL en raison de l’évaporation pendant la nuit (environ 5 μL).
12. Lavez les cellules deux fois avec 90 μL de milieu d’essai. Enfin, ajouter 100 μL de milieu d’essai. Le volume final doit être de 120 μL.
  REMARQUE: Une pipette multicanal est recommandée pour cette étape afin de s’assurer que la même procédure de lavage a été appliquée à chaque condition expérimentale (dépend de la configuration de la plaque). Lors de l’aspiration, inclinez la plaque à un angle de 45 ° et placez les pointes de la pipette dans le coin des puits pour l’aspiration et l’injection de liquides. Il est impératif de faire attention pendant le lavage car certaines cellules peuvent facilement se détacher du fond de la plaque de culture cellulaire.
13. Placer la plaque dans un incubateur à 37 °C sans CO₂ pendant 60 min avant le test.
14. Récupérez la plaque de cartouche de capteur hydratée de l’incubateur sans CO₂.
15. Jeter l’ancienne solution d’étriquant et la remplacer par une solution d’étriquant frais, préavertissée à 37 °C.
16. Préparer les inhibiteurs et le milieu d’essai (3 mL par inhibiteur pour un total de 12 mL de milieu d’essai) et utiliser un réservoir de pipette pour le chargement de l’inhibiteur dans les orifices.
17. Ouvrez le logiciel et exécutez un modèle prédéfini ou nouveau. Remplissez la carte des plaques, ajustez les titrages et les cycles de mesure, puis appuyez sur Démarrer pour lancer l’étalonnage des capteurs optiques.
18. Retirez le couvercle de la cartouche chargée et placez-le dans la fente qui glisse automatiquement hors de la machine, en vérifiant que les marques dans le coin inférieur droit de la plaque s’alignent avec le triangle dans le coin inférieur droit de la fente.
19. Cliquez sur Continuer pour effectuer un étalonnage automatique, d’une durée d’environ 20 min.
20. Après l’étalonnage, retirez la plaque d’utilité contenant l’étrier.
21. Retirez le couvercle de la microplaque contenant les cellules et placez la plaque dans la fente lorsque la machine y invite. Cliquez sur Continuer pour démarrer la course.
Collecte d’échantillons post-exécution
1. Sortez la plaque de la machine, retirez soigneusement le support d’essai restant sans perturber les cellules et congelez la plaque entière à -80 °C pour un traitement ultérieur (section 3).

3. Détermination des protéines à l’aide du dosage de l’acide bicinchoninique (dosage BCA)

Préparer l’albumine sérique bovine diluée (BSA) dans un tampon utilisé pour l’extraction des protéines et compatible avec l’ACA : 2 mg/mL, 1,5 mg/mL, 1 mg/mL, 0,5 mg/mL, 0,25 mg/mL et 0 mg/mL pour la courbe standard en double.
Extraire les protéines en les réutilisant dans un tampon de lyse approprié (p. ex., RIPA) avec 20 μL par puits pour le mHRR ou 100 μL par pastille contenu dans un tube de 1,5 mL pour le cHRR.
Incuber la plaque mHRR ou le tube de 1,5 mL contenant des lysats de protéines pendant 30 min sur de la glace.
Centrifuger le tube de 1,5 mL contenant le lysat de protéine à 4 °C à 20 000 x g pendant 20 min et transférer le surnageant résultant dans un nouveau tube propre de 1,5 mL.
Utiliser 10 μL par échantillon en doublons et étalons dans une plaque de microtitrage. Ajouter 200 μL de réactif de travail BCA et incuber pendant 15 min >.
Lisez la plaque dans un spectrophotomètre standard à une longueur d’onde de 562 nm et calculez les concentrations de protéines à l’aide d’une courbe standard BSA.
Normaliser les résultats de la respiration à la concentration en protéines.
REMARQUE: La normalisation en quantité de protéines permet de corroborer les densités d’ensemencement cellulaire ou l’apport de poids humide. Les protéines extraites conviennent à l’immunobuvardage ultérieur contre les sous-unités de l’ETS par exemple, mais ne représentent pas entièrement l’échantillon natif (par exemple, perte de sites de phosphorylation).

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Representative Results

Ici, nous fournissons des protocoles pour déterminer la bioénergétique mitochondriale dans les cellules eucaryotes, les tissus non fibreux (par exemple, le cervelet) et les tissus fibreux (par exemple, le muscle squelettique). Pour les cellules eucaryotes, HEK293 avec knockout conçu par CRISPR de deux protéines différentes associées à la traduction mitochondriale entraînant un déficit multiple (CRISPR^KO1) et sévère/complet en OXPHOS (CRISPR^KO2) a été mesuré avec cHRR (Figure 3A-C) ou mHRR (Figure 3A-D).

Pour la RDH, les cellules HEK293 ont été perméabilisées à la digitonine et des expériences de respiration ont été effectuées selon le protocole standard (étapes 1.5-1.6) et ont été enregistrées avec succès (Figure 3A). CRISPR^KO1 montre une respiration altérée et CRISPR^KO2 par rapport à WT lorsqu’il est normalisé à la quantité d’entrée cellulaire (Figure 3B). La quantité de protéines a été déterminée à partir d’échantillons prélevés (section 3), et les valeurs de la respiration de routine ont été normalisées en quantité de protéines afin de calculer les valeurs absolues et les FCR respectifs (Figure 3C, la signification de chaque FCR est détaillée dans la discussion). Les quantités optimales d’échantillon produisent des flux de 80 à 160 pmol/s par mL. Idéalement, la quantité de cellules ou de tissus est suffisante pour générer un flux important (20 pmol/s pour la r.a.p. pour la RDH) afin de réduire le bruit de fond tout en évitant une réoxygénation excessive au cours d’une expérience. Dans les échantillons à faible respiration (p. ex., graisse adipeuse blanche, globules blancs) ou dans les échantillons difficiles à obtenir (p. ex., lignées neuronales différenciées selon l’iPS), des flux de 20 pmol/s par mL sont suffisants dans des conditions de travail idéales.

Figure 3 : Traces représentatives de consommation d’oxygène du protocole standard provenant de la CHRR à l’aide de cellules HEK293 présentant une carence combinée en OXPHOS. (A) Traces de consommation brute d’oxygène de cellules WT HEK293 et de cellules HEK293 présentant des défauts de traduction mitochondriale médiés par CRISPR provoquant un déficit multiple en OXPHOS (CRISPR^KO1,2). (B) Traces superposées de consommation d’oxygène normalisées par entrée cellulaire provenant de (A). (C) Quantification normalisée par les protéines de deux expériences indépendantes (moyenne et SD) et des FCR respectives. Des comparaisons entre les conditions ont été effectuées par ANOVA et a posteriori le test de Tukey ou un test t de Student. Significations: **** p < 0,0001; p < 0,001; ** p < 0,01; * p < 0,05. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Ensuite, nous avons utilisé mHRR avec les mêmes cellules dans un protocole standard (2.1-2.5), confirmant les déficiences d’OXPHOS (Figure 4A). En outre, les valeurs d’ECAR ont été augmentées pour un déficit sévère / complet en OXPHOS (CRISPR^KO2), suggérant une compensation du déficit en phosphorylation oxydative mitochondriale dans les cellules HEK293 avec un déficit de traduction mitochondriale spécifique par une glycolyse accrue entraînant une production de lactate (Figure 4A). La quantité de protéines a été déterminée à partir de la plaque de micropuit (section 3), et les valeurs obtenues ont été normalisées à la quantité de protéines (figure 4B) et quantifiées (figure 4C). Les systèmes à base de microplaques sont connus pour leur forte variation intra-puits. Une grande variabilité entre les répétitions peut se produire lorsque la densité d’ensemencement optimale n’a pas été atteinte; les cellules se détachent pendant les étapes de lavage du remplacement du milieu de culture cellulaire par un milieu d’essai, ou une technique de pipetage inappropriée telle que l’introduction de bulles d’air ou l’aspiration de volumes variables. Des temps de mesure prolongés (6 cycles de mesure) sont recommandés avec mHRR pour permettre la stabilisation du flux dans les milieux (Figure 1B et Figure 4A). Les flux faibles provoquent une variation élevée et, selon le type de cellule, le flux peut être trop proche du bruit de fond (jusqu’à 10-15 pmol / s). Les cellules à faible respiration (p. ex., fibroblastes) ou exceptionnellement grandes peuvent produire un flux d’oxygène insuffisant au-dessus du niveau de bruit de fond dans le format de microplaque à 96 puits, même à une confluence de 90 %. Dans ce cas, le mHRR ou le cHRR de 24 puits devrait être considéré. Des changements minimes dans le flux d’oxygène peuvent également indiquer une mauvaise manipulation du chargement des inhibiteurs, tels que des orifices vides, incorrectement ou remplis de manière variable. Il est recommandé d’utiliser des embouts de pipette spécifiques qui pénètrent suffisamment dans les orifices pendant le chargement des produits chimiques pour permettre aux produits chimiques d’atteindre le port individuel (figure 2E).

Figure 4 : Traces représentatives de consommation d’oxygène du protocole standard de mHRR utilisant des cellules HEK293 avec déficit combiné en OXPHOS. (A) Traces de consommation brute d’oxygène de cellules WT HEK293 et de cellules HEK293 avec des défauts de traduction mitochondriale médiés par CRISPR provoquant un déficit multiple en OXPHOS (CRISPR^KO1,2). (B) Taux d’acidification extracellulaire (ECAR) respectifs de (A). (C) Traces de consommation d’oxygène normalisées par les protéines de cellules WT HEK293 et de cellules HEK293 présentant un déficit de traduction mitochondriale médié par CRISPR provoquant un déficit multiple en OXPHOS (CRISPR^KO1,2). (D) Quantification normalisée par les protéines des puits (n = 8 par génotype; moyenne et ET). Des comparaisons entre les conditions ont été effectuées par ANOVA et a posteriori le test de Tukey. Significations: **** p < 0,0001; p < 0,001; ** p < 0,01; * p < 0,05. Abréviations : voir la figure 1. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Un exemple d’expérience de préparation de tissus non fibreux (étapes 1.3 et 1.5-1.6) utilisant le cervelet de souris (figure 5A) et la préparation de tissus fibreux (étapes 1.4 et 1.5-1.6) utilisant le muscle squelettique de souris (soleus) est illustré (figure 5B). En général, la respiration non couplée ne dépasse pas la capacité OXPHOS dans les échantillons de souris. Pour le cervelet de souris, la capacité OXPHOS a diminué par rapport à la capacité ETS maximale. La respiration LEAK a augmenté dans des circonstances physiologiquement contrôlées par rapport à celles induites chimiquement (oligomycine). Cela pourrait être dû au fait que l’ADP endogène disponible est toujours phosphorylé en ATP, alors qu’avec l’induction chimique, la fuite de protons est maximale, ce qui entraîne une surestimation de la respiration LEAK. Contrairement au cervelet, le soléaire a été testé dans des conditions hyperoxiques pour éviter la limitation de la diffusion de l’oxygène et présente une capacité OXPHOS trois fois plus élevée. La respiration dépendante du NADH est différente lors de l’analyse de types spécifiques de tissus, le soléaire ayant plus de capacité à respirer par l’ajout de succinate que le cervelet. Les deux types de tissus présentent un ROX minimal.

Figure 5 : Traces représentatives de la consommation d’oxygène pour les tissus non fibreux (A) et fibreux (B) pour la RDH. (A) Trace de consommation d’oxygène normalisée par les tissus humides du cervelet de souris préparée comme décrit (étape 1.3). (B) Trace humide de consommation d’oxygène normalisée par le poids et les tissus du muscle soléaire de la souris, telle que décrite (étape 1.4). La ligne bleue indique la concentration en oxygène et les points d’injection respectifs. Abréviations : voir la figure 1. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Chimique	Concentration
BSA, sans acides gras	1 g/L
D-saccharose	110 mM
L’EGTA	0,5 mM
HEPES	20 mM
KH₂PO₄	10 mM
Acide lactobionique	60 mM
MgCl₂·6H₂O	3 mM
Taurine	20 mM

Tableau 1 : Composition du milieu respiratoire mitochondrial MiR05 ajustée au pH 7,1²⁷.

Chimique	Concentration
CaK₂EGTA anhydre	2,77 mM
Dithiothréitol (TNT)	0,5 mM
Imidazole	20 mM
K₂EGTA, anhydre	7,23 mM
Hydrate MES	50 mM
MgCl_2-6H ₂O	6,56 mM
Na₂ATP	5,77 mM
Na₂Phosphocréatine	15 mM
Taurine	20 mM

Tableau 2 : Composition de la solution relaxante et de préservation par biopsie (BIOPS) ajustée au pH 7,1²⁸.

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Discussion

Traditionnellement, la bioénergétique mitochondriale a été étudiée avec des électrodes d’oxygène de type Clark. Un manque de résolution et de débit, cependant, justifiait le progrès technologique. À ce jour, l’O2k (appelé cHRR) et l’analyseur de flux Seahorse XF96 (appelé mHRR) ont été largement adoptés dans le domaine de la bioénergétique cellulaire. Ici, nous présentons une collection compréhensible de protocoles pour l’analyse du métabolisme énergétique cellulaire via l’évaluation de la respiration mitochondriale à l’aide de cHRR ou mHRR, discutons des principaux avantages de chaque dispositif et fournissons des conseils pratiques. Les protocoles fournis ici englobent les cellules de mammifères, les tissus fibreux (durs) tels que le muscle squelettique et cardiaque, et les tissus non fibreux (mous) tels que le cerveau et le foie et sont applicables à des types similaires de matériel d’échantillonnage.

Bien que les deux méthodes HRR donnent des données comparables pour les cellules de mammifères, comme en témoigne le HEK293 avec une carence multiple en OXPHOS, les principes de fonctionnement généraux et la configuration technique des dispositifs les rendent adaptés à différentes applications. La configuration mHRR permet l’acquisition automatisée de données et dispose d’une capacité de débit élevé avec une configuration multi-puits de 24 ou 96 nécessitant des quantités d’échantillons minimales. Cependant, le faible volume expérimental et la surface du puits, en plus de l’utilisation de polymères perméables à l’oxygène (polystyrène), peuvent entraîner une forte variation intra-puits (en particulier dans la configuration des plaques de 96 puits), favorisant l’utilisation de puits ≥6 par condition pour des résultats reproductibles. Contrairement au capteur d’oxygène polarographique basé sur cHRR, aucun oxygène n’est consommé par les sondes de capteur du mHRR, qui utilise la détection de phosphorescence éteinte O₂ . Comme le mHRR est un système semi-fermé,_l’O2ambiant peut diffuser dans le milieu respiratoire, exposant l’échantillon et la sonde à l’oxygène. Lorsque la sonde du capteur en forme de piston s’abaisse, une chambre temporairement scellée et isolée est créée pour amplifier les changements de concentration d’O₂et mesurer la consommation d’oxygène. Par la suite, un modèle mathématique est utilisé pour calculer avec précision les taux de consommation d’oxygène en estimant la rétrodiffusion de O₂. Cependant, l’inconvénient est que l’algorithme amplifie également le bruit²⁹. La configuration des microplaques utilise des ports et des plaques spécialisés non réutilisables nécessitant une densité d’ensemencement optimale des cellules. Les sondes du capteur d’oxygène mHRR mesurent la diffusion latérale de l’O₂dans trois zones distinctes par puits équivalentes à la taille de la sonde (~1 mm); par conséquent, une monocouche cellulaire uniformément répartie est cruciale pour déterminer des taux de consommation d’oxygène précis. Si des lacunes importantes sont présentes lors de l’observation de la distribution cellulaire, des taux de consommation d’oxygène incorrects seront calculés, ce qui entraînera une variance élevée des réplications de puits. Compte tenu de cela, le mHRR est semi-automatisé et idéalement adaptable pour les études à haut débit sur les cellules ou les petits organismes (par exemple, C. elegans) avec des dépistages récurrents.

La configuration des respiromètres cHRR est basée sur un système à deux chambres avec mesure polarimétrique de l’oxygène. Dans le système fermé, l’O2 ambiant ne peut pas diffuser dans le milieu respiratoire; ainsi, une baisse de la concentration d’O2 reflète la consommation d’oxygène de l’échantillon biologique. Comme le capteur d’oxygène polarographique cHRR consomme de l’oxygène,la diffusion d’O2 libre est essentielle, ce qui rend difficile de minimiser le volume de la chambre (2 mL, nouveaux dispositifs cHRR 0,5 mL) et nécessite une agitation constante pour assurer l’homogénéité du milieu respiratoire. Par conséquent, des volumes d’échantillons plus importants sont nécessaires pour générer un flux d’oxygène suffisant. Grâce à l’accès direct aux chambres et au titrage manuel, tout protocole de respiration est adaptable et basé sur des produits chimiques largement disponibles dans le commerce, ce qui entraîne des coûts d’exploitation exceptionnellement bas. De plus, l’opérabilité ad hoc permet d’adapter un protocole SUIT par titrage au cours d’une expérience et est importante dans les échantillons uniques dérivés de patients. L’automatisation partielle est possible à l’aide d’une micropompe de titrage-injection, qui permet des protocoles SUIT programmables. Bien que limité à deux échantillons par appareil cHRR, les utilisateurs expérimentés exécuteront plusieurs appareils en parallèle. L’avantage de la polyvalence du développement d’essais et de l’environnement logiciel s’accompagne de la nécessité d’une formation plus spécifique pour faire fonctionner ces dispositifs et d’une maintenance dépendante de l’utilisateur (par exemple, l’étalonnage des capteurs d’oxygène polarographiques) afin d’acquérir des données reproductibles. Pour les applications avancées, des modules supplémentaires sont fixés aux dispositifs cHRR pour enregistrer le pH, un module fluorescent pour tester le potentiel de la membrane via la safranin³⁰, H₂O₂ via AMPLEX red²⁴ et les niveaux de calcium³¹.

Les deux appareils nécessitent des supports respiratoires spécialisés. mHRR utilise un milieu de croissance sans sérum disponible dans le commerce, évitant l’utilisation de bicarbonate, qui se dégaze dans des conditions de faible CO₂ et est essentiel si le taux d’acidification extracellulaire (ECAR) est important. Au cours de la glycolyse, le pyruvate est converti en lactate, qui se dissocie en acide lactique et en protons. Cette augmentation de la concentration de protons entraîne une diminution du pH, ce qui est enregistré sous le nom d’ECAR. Une analyse plus élaborée de l’ECAR est possible avec le test de stress de glycolyse. Ce test consiste d’abord à ajouter des niveaux de glucose saturant pour mesurer le taux glycolytique basal. Après inhibition du complexe ATP synthase avec l’oligomycine, le taux glycolytique maximal est révélé. La dernière étape consiste à mesurer l’acidification non glycolytique en injectant du 2-désoxy-glucose, qui inhibe la glycolyse par liaison compétitive à l’hexokinase et à la phosphoglucose isomérase³². D’autres protocoles basés sur des kits disponibles englobent la glycolyse, l’oxydation des acides gras et l’oxydation de la glutamine. Ici, nous avons utilisé le protocole standard pour mesurer la respiration basale, la respiration liée à l’ATP, la fuite de protons, la respiration maximale, la capacité respiratoire inutilisée et la respiration non mitochondriale (Figure 4A-C). Une approche consistant à utiliser à la fois le protocole de respiration standard en conjonction avec le test d’effort de glycolyse donnerait un aperçu des voies énergétiques aérobies et anaérobies fournissant une vue d’ensemble de la respiration cellulaire.

La bioénergétique cellulaire est généralement accessible dans les cellules adhérentes avec la configuration mHRR de microplaques. Selon le type de cellule, un revêtement spécialisé pour l’adhérence (p. ex. poly-D-lysine, gélatine, etc.) pourrait être nécessaire (pour les cellules en suspension) ainsi que pour les cellules peu adhérentes lâches, car elles peuvent se détacher du fond des cycles de mesure du puits³³. En revanche, les mesures cHRR nécessitent une agitation constante, ce qui permet une mesure respiratoire pour tout échantillon biologique. Pour chaque dispositif, une optimisation telle que le titrage des inhibiteurs (et des substrats) pour les tissus et les lignées cellulaires afin d’évaluer la susceptibilité aux inhibiteurs (courbes dose-réponse) est nécessaire. Les concentrations d’inhibiteurs doivent être testées dans tout modèle expérimental afin d’utiliser les concentrations d’inhibition complète les plus faibles et d’éviter une inhibition non spécifique ainsi qu’une contamination inutile de la chambre. Généralement, 0,25 μM de roténone, 0,5 μg / mL d’oligomycine, 0,5 μg / mL d’antimycine sont suffisants pour la plupart des applications et des quantités d’échantillons. Pour des raisons de reproductibilité, préparer des médicaments à usage unique en quantité suffisante pour l’ensemble des expériences prévues (p. ex., groupes de souris) et maintenir l’entrée de l’échantillon constante dans un tissu ou une lignée cellulaire spécifique. Dans la RDH, les traces d’inhibiteurs restant dans les chambres modifieront le flux sans aucune indication à l’opérateur. En particulier, les traces de roténone sont difficiles à éviter et nécessitent un lavage suffisant avec un nettoyage minimum de la chambre (et du bouchon), qui comprend un lavage 4x avec ddH₂O, 2x 70% EtOH (96% de pureté suffisante), 1x 100% EtOH, 1x 70% EtOH. Le lavage nécessite de tourner les agitateurs et de garder les étapes EtOH pendant > 5 minutes chacune. Pour éviter la contamination bactérienne, 70% d’EtOH est conservé dans toutes les chambres lorsque les machines ne sont pas utilisées. Les contaminants résiduels potentiels peuvent être trempés par l’ajout de lysat de tissu inutilisé. Dans une expérience mHRR, certains produits chimiques peuvent interagir avec les articles en plastique essentiels à usage unique³⁴.

Les données respiratoires obtenues via un protocole perméabilisé donnent un aperçu de l’ETS, tandis qu’un protocole intact donne un aperçu des propriétés mitochondriales telles que l’efficacité du couplage mitochondrial. En effet, les propriétés générales de l’énergie mitochondriale peuvent donner le même résultat, mais le transfert d’électrons sous-jacent entre les complexes peut être modifié. Cela refléterait une altération du métabolisme énergétique mitochondrial et nécessiterait un protocole de perméabilisation pour accéder aux complexes respiratoires. De même, différents tissus et cellules présentent une dépendance altérée du substrat lors de l’évaluation des caractéristiques respiratoires. Par exemple, les fibres musculaires glycolytiques sont connues pour dépendre principalement du glycérol-3-phosphate pour la livraison d’énergie, tandis que les fibres musculaires oxydatives possèdent une capacité de transfert d’électrons deux fois plus élevée de l’oxydation NADH^35,36. Sur la même note, les mitochondries cardiaques, le foie, le tissu adipeux brun peuvent utiliser des acides gras pour synthétiser l’ATP, et à son tour, le cerveau peut utiliser des corps cétoniques, principalement formés par l’oxydation des acides gras ^36,37,38. Par conséquent, la détermination des caractéristiques mitochondriales nécessite une approche holistique par opposition à la respiration standard dépendante du glucose. La mHRR englobe habituellement l’évaluation des cellules adhérentes intactes, bien que la perméabilisation soit réalisable (p. ex., la perfringolysine O recombinante mutante qui perméabilise sélectivement la membrane cellulaire³⁹). Cependant, ces méthodes s’accompagnent d’une complexité accrue en raison de la limitation de quatre ports d’injection. En revanche, les lysats de tissu non fibreux correctement lysés et tout type de cellule sont généralement sans problème pour la RDH. Normalement, il n’est pas possible d’analyser les tissus avec le mHRR; cependant, des approches utilisant des mitochondries isolées d’un tissu ont été établies^40,41.

Il est important de noter que la normalisation de la teneur en protéines entières néglige les quantités mitochondriales absolues. La comparaison des groupes expérimentaux sous divers traitements peut différer considérablement (par exemple, les rats nourris avec un régime riche en protéines de 30 jours ont montré une augmentation de 2,5 fois du contenu mitochondrial dans le foie⁴²), en particulier dans les tissus sensibles à l’accumulation de lipides intracellulaires tels que le tissu adipeux brun, le foie et le muscle squelettique. Dans ces situations, il est également recommandé d’évaluer plusieurs marqueurs mitochondriaux comme approximation de la masse mitochondriale, tels que la copie numéro⁴³ de l’ADNmt, l’activité¹⁰ de la citrate synthase et les protéines mitochondriales omniprésentes (par exemple, VDAC1, TOM20). En combinaison, cela permet de distiller si une altération de la fonction respiratoire est attribuée à la quantité mitochondriale, à la qualité, à l’intégrité ou à une combinaison de ceux-ci. Une autre méthode complémentaire à cela est la mise en œuvre des FCR. Les FCR donnent un aperçu des différents états respiratoires indépendamment du contenu mitochondrial. FCR_ADP dérive si LEAK altéré ou OXPHOS change l’efficacité des mitochondries en phosphorylate ADP. _{L’état FCR 3 (I)}reflète dans quelle mesure l’échantillon dépend du complexe I par rapport au complexe II. L’état FCR_{3 (II)} compare la respiration dépendante du succinate avec l’ETS et fournit un indice de la respiration mitochondriale dérivée du complexe II. FCR_{couplé/découplé}est un rapport fournissant le contrôle de couplage entre OXPHOS et ETS, avec un rapport de 1 n’ayant plus de capacité respiratoire de rechange. L’intégrité de la membrane externe mitochondriale peut être évaluée par l’ajout de cytochrome exogène c. Le cytochrome c est localisé dans l’espace intermembranaire, où il facilite le transfert d’électrons entre le complexe III et le complexe IV. Si la membrane mitochondriale externe est endommagée, le cytochrome c s’échappe des mitochondries, ne contribuant plus à la respiration. La restauration de ce déséquilibre peut être obtenue par l’ajout de cytochrome exogène c, augmentant ainsi la respiration (Figure 1A, D; 5B). L’activité du complexe IV est mesurée individuellement avec TMPD après inhibition complète d’OXPHOS. Le flux_{d’O2 de} base diminuera à mesure que la concentration d’O2 diminuera parce que l’oxydation du TMPD dépend de la concentrationd’O2. Par conséquent, après évaluation ROX, toutes les chambres sont oxygénées à un niveau d’oxygène égal (150 μM). La régression linéaire des points de données du signal après addition d’azoture peut être utilisée pour interpoler le fond chimique et dépendant de l’O₂ du test d’activité IV complexe. Les valeurs ROX doivent être soustraites de toutes les valeurs respiratoires pour corriger la consommation d’oxygène non mitochondriale.

Biologiquement, ROX dans le cas de mitochondries isolées peut être plus faible qu’avec des cellules/tissus perméabilisés ou intacts. En général, la respiration résiduelle est causée par l’activité des enzymes oxydases, les cellules et les tissus ayant plus de substances autodisidisables que les mitochondries isolées⁴⁴. De plus, avec des structures membranaires intracellulaires encore intactes, la difficulté de l’oxygène à pénétrer à travers les membranes cellulaires augmente en raison de sa charge négative. Par conséquent, la diffusion à travers les membranes cellulaires et la disponibilité intracellulaire de l’oxygène peuvent être affectées, ce qui entraîne ROX. Cependant, il a été démontré que l’isolement des mitochondries perturbe la morphologie mitochondriale, augmente la production de peroxyde d’hydrogène mitochondrial et altère la fonction respiratoire mitochondriale⁴⁵. Bien que l’isolement des mitochondries fonctionnelles permette une normalisation spécifique et puisse être nécessaire dans certaines conditions, le processus d’isolement prend du temps, nécessite généralement plus de matériel et peut ne pas préserver l’hétérogénéité mitochondriale. Pour cette raison, nous nous sommes abstenus d’inclure l’isolement mitochondrial dans cette étude. Cependant, pour le muscle squelettique ou cardiaque, l’isolement des mitochondries ou le traitement des fibres à la saponine est essentiel pour les mesures de la respiration. Comme les processus autolytiques se produisent très rapidement après l’euthanasie, il est recommandé d’extraire rapidement les tissus et de respecter un calendrier comparable pour les préparations entre les expériences individuelles.

Dans nos expériences, l’évaluation de la fonction respiratoire mitochondriale des cellules de mammifères a conduit à des résultats comparables avec les deux dispositifs HRR. Cependant, la respiration basale était plus élevée pour le CHRR que pour le mHRR. Outre de nombreux aspects techniques (volume de la chambre, agitation et intégration différente du signal), des raisons biologiques telles que l’altération du milieu respiratoire, le moment de la récolte cellulaire et les cellules non attachées causant une perte de contact cellulaire pourraient infliger les différences observées. Par conséquent, les protocoles respiratoires en général et les concentrations individuelles de substrat et d’inhibiteur ne sont pas interchangeables entre les systèmes pour les raisons présentées, qui pourraient être de nature technique (p. ex., titrage) et généralement différents réactifs d’essai (p. ex., milieux respiratoires, absorbances chimiques du verre ou des polymères). Pour assurer une reproductibilité maximale, plusieurs considérations et recommandations techniques englobent (i) l’utilisation d’aliquotes à usage unique pour minimiser les cycles de contamination croisée ou de gel-dégel, (ii) l’entreposage approprié de tous les produits chimiques (p. ex., ADP à -80 °C pour une stabilité prolongée, pyruvate préparé fraîchement et produits chimiques sensibles à la lumière dans l’obscurité), (iii) réessaiement régulier et rigoureux de l’efficacité des produits chimiques (p. ex., changements de concentration infligés par évaporation, perte d’activité TMPD induite par le stockage) et (iv) nettoyage approfondi pour éliminer tout produit chimique à l’état de traces. Les considérations sur la reproductibilité des études longitudinales (sur plusieurs années) nécessiteraient de surveiller le rendement de l’instrument et d’assurer la stabilité des réactifs dans le temps.

Enfin, une nouvelle technologie basée sur des mesures potentiométriques (pH) et ampérométriques (_O2) combinées à l’aide d’électrodes à base d’oxyde de ruthénium pourrait catalyser un changement de paradigme dans les outils actuels, permettant d’étudier le métabolisme cellulaire en culture et in vivo⁴⁶. Bien que les méthodes actuelles permettent principalement une évaluation ex vivo et in vitro du métabolisme cellulaire, la fluorescence retardée permet une analyse in vivo de l’oxygène mitochondrial comme mesure de la fonction mitochondriale⁴⁷. De même, la respirométrie à base de microfluidique est prometteuse en termes de sensibilité plus élevée, ne nécessitant que quelques centaines de cellules⁴⁸. Alors que de nouvelles méthodologies se profilent à l’horizon, à ce jour, la respirométrie à haute résolution reste l’étalon-or pour évaluer la capacité de respiration cellulaire pour laquelle des protocoles par excellence sont fournis ici, applicables à la plupart des cellules, tissus et organismes pour étudier la respiration mitochondriale.

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Disclosures

Aucun conflit d’intérêts à divulguer.

Acknowledgments

Ce travail a été soutenu par un financement de l’Académie de Finlande (C.B.J), de la Fondation Magnus Ehrnroot (C.B.J) et d’une bourse de doctorat de l’Integrated Life Sciences Graduate School (R.A.).

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
2 mL Potter-Elvehjem Glass/PTFE Tissue Grinder/Homogenizer	Omni International	07-358029
95% O₂, 5% CO₂ medical gas mixture			Potter for tissue grinding
ADP	Sigma	A 4386
Antimycin A	Sigma	A 8674	Chemical
Ascorbate	Merck	PHR1279-1G	Chemical, dissolve in ethanol
BSA (fatty accid free)	Sigma	A 6003	Chemical
CaCO₃	Sigma	C 4830	Chemical
Cytochrome c	Sigma	C 7752	Chemical
Digitonin	Sigma	D 5628	Chemical
Dithiothreitol	Sigma	D 0632	Chemical, dissolve in DMSO
D-Sucrose	Roth	4621.1	Chemical
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (High glucose)	Fisher Scientific	41965-039	Chemical
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (No Glucose)	Fisher Scientific	A14430-01
EGTA	Sigma	E 4378
Etomoxir	Sigma	E1905	Chemical
Falcon 15 ml Conical Centrifuge Tubes	Fisher Scientific	AM12500	Chemical
Falcon 50 ml Conical Centrifuge Tubes	Fisher Scientific	AM12501
FCCP	Sigma	C 2920
Glucose	Sigma	G7021	Chemical, dissolve in ethanol
Glutamate	Sigma	G 1626	Chemical
GlutaMax (100x) (200 nM L-alanyl-L-glutamine dipeptide)	Fisher Scientific	35050061	Chemical
HEK293 cells	ATTC	CRL-1573
Hemocytometer	Fisher Scientific	0267151B	Instrument for cell counting
Hepes	Sigma	H 7523	Chemical
Imidazole	Fluka	56750	Chemical
KCl	Merck	1.04936	Chemical
L-carnitine	Sigma	C0283	Chemical
Malate	Sigma	M 1000	Chemical
MES hydrate	Sigma	M8250	Chemical
MgCl₂	Sigma	M 9272	Chemical
Na₂ATP	Sigma	A 2383	Chemical
Na₂Phosphocreatine	Sigma	P 7936	Chemical
Na-pyruvate (100 mM) (100x)	Fisher Scientific	11360070
NEAA (Non-essential amino acids) 100x	Fisher Scientific	11140035
Normal FBS (10x)	Fisher Scientific	10500064
O₂k-Core: Oxygraph-2k	Oroboros Instruments	10000-02	High-resolution respirometry instrument
O₂k-Titration Set	Oroboros Instruments	20820-03	Hamilton syringes for chemical injections
Oligomycin	Sigma	O 4876	Chemical, dissolve in ethanol
Palmitoylcarnitine	Sigma	P 4509	Chemical
Penicillin-Streptomycin	Fisher Scientific	15140122
Pierce BCA Protein Assay Kit	Fisher Scientific	23227
Pyruvate	Sigma	P 2256	Chemical
RIPA-Buffer	Fisher Scientific	89900	Chemical
Rotenone	Sigma	R 8875	Chemical, dissolve in ethanol
Saponin	Sigma	S7900	Chemical
Seahorse XF DMEM assay medium pack, pH 7.4	Agilent, Santa Clara, CA	103680-100
Seahorse XFe96 Extracellular Flux Analyzer	Agilent, Santa Clara, CA		High-throughput respirometry instrument
Seahorse XFe96 FluxPak	Agilent, Santa Clara, CA		Includes assay plates, cartridges, loading guides for transferring compounds to the assay cartridge, and calibrant solution.
Small scissors	Fisher Scientific	08-951-20
Sodium azide	Sigma	S2002	Chemical
Succinate	Sigma	S 2378	Chemical
Taurine	Sigma	T 8691	Chemical
TMPD	Sigma	T 3134	Chemical
Trypan Blue solution	Merck	72-57-1	Chemical
Trypsin 0.25% EDTA	Fisher Scientific	25200056
Two thin-edged forceps	Fisher Scientific	12-000-122
Uridine stock (500x)	Sigma	U3750	Chemical

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Biology

La respirométrie à haute résolution pour évaluer la bioénergétique dans les cellules et les tissus à l’aide de respiromètres à chambre et à plaques

Summary

Abstract

Introduction

Protocol

Representative Results

Discussion

Disclosures

Acknowledgments

Materials

References

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