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Biology

चैंबर- और प्लेट-आधारित रेस्पिरोमीटर का उपयोग करके कोशिकाओं और ऊतकों में बायोएनर्जेटिक्स का आकलन करने के लिए उच्च-रिज़ॉल्यूशन रेस्पिरोमेट्री

Published: October 26, 2021 doi: 10.3791/63000
Automatic Translation
1, 1
1Department of Biochemistry and Developmental Biology, Faculty of Medicine, University of Helsinki

Summary

उच्च-रिज़ॉल्यूशन रेस्पिरोमीटर का उपयोग करके ऑक्सीडेटिव फॉस्फोराइलेशन का आकलन माइटोकॉन्ड्रिया और सेलुलर ऊर्जा चयापचय के कार्यात्मक विश्लेषण का एक अभिन्न अंग बन गया है। यहां, हम चैंबर और माइक्रोप्लेट-आधारित उच्च-रिज़ॉल्यूशन रेस्पिरोमीटर का उपयोग करके सेलुलर ऊर्जा चयापचय के विश्लेषण के लिए प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं और प्रत्येक डिवाइस के प्रमुख लाभों पर चर्चा करते हैं।

Abstract

उच्च-रिज़ॉल्यूशन रेस्पिरोमेट्री (एचआरआर) व्यक्तिगत सेलुलर ऊर्जा राज्यों के विश्लेषण और विविध सब्सट्रेट-अनकपलर-इनहिबिटर अनुमापन (सूट) प्रोटोकॉल का उपयोग करके श्वसन परिसरों के मूल्यांकन के लिए वास्तविक समय में ऑक्सीडेटिव फॉस्फोराइलेशन की निगरानी करने की अनुमति देता है। यहां, दो उच्च-रिज़ॉल्यूशन श्वसन उपकरणों के उपयोग का प्रदर्शन किया जाता है, और सुसंस्कृत कोशिकाओं, कंकाल और हृदय की मांसपेशियों के तंतुओं और मस्तिष्क और यकृत जैसे नरम ऊतकों के विश्लेषण के लिए लागू प्रोटोकॉल का एक बुनियादी संग्रह प्रस्तुत किया जाता है। सुसंस्कृत कोशिकाओं और ऊतकों के लिए प्रोटोकॉल एक कक्ष-आधारित रेस्पिरोमीटर और माइक्रोप्लेट-आधारित रेस्पिरोमीटर के लिए सुसंस्कृत कोशिकाओं के लिए प्रदान किए जाते हैं, दोनों मानक श्वसन प्रोटोकॉल को शामिल करते हैं। तुलनात्मक प्रयोजनों के लिए, सीआरआईएसपीआर-इंजीनियर एचईके 293 कोशिकाओं में माइटोकॉन्ड्रियल अनुवाद में कमी होती है जिससे श्वसन प्रणाली की कमी होती है, श्वसन में सेलुलर दोषों को प्रदर्शित करने के लिए दोनों उपकरणों के साथ उपयोग किया जाता है। दोनों रेस्पिरोमीटर अध्ययन के तहत अनुसंधान प्रश्न और मॉडल पर निर्भर अपने संबंधित तकनीकी गुणों और उपयुक्तता के साथ सेलुलर श्वसन के व्यापक माप की अनुमति देते हैं।

Introduction

माइटोकॉन्ड्रिया ऊर्जा के प्रमुख प्रावधान को पूरा करता है और एक कम्पार्टमेंटल ऑर्गेनेल है जो न्यूक्लियोटाइड, लिपिड और अमीनो एसिड के उपचय, लौह-सल्फर क्लस्टर बायोजेनेसिस जैसे आवश्यक सेलुलर बायोएनर्जेटिक और चयापचय प्रक्रियाओं में योगदान देता है और नियंत्रित कोशिका मृत्यु 1,2,3 जैसे सिग्नलिंग में फंसा हुआ है . ऑक्सीडेटिव फॉस्फोराइलेशन के माध्यम से माइटोकॉन्ड्रियल बायोएनर्जेटिक्स कोशिका के भीतर लगभग सभी सेलुलर प्रक्रियाओं में योगदान देता है, और परिणामस्वरूप, प्राथमिक या माध्यमिक मूल के माइटोकॉन्ड्रियल डिसफंक्शन रोग की स्थिति 4,5 की एक विस्तृत स्पेक्ट्रम से जुड़े होते हैं। माइटोकॉन्ड्रियल शिथिलता में न केवल संरचना या माइटोकॉन्ड्रियल घनत्व में परिवर्तन शामिल है, बल्कि श्वसन प्रणाली की गुणवत्ता और विनियमन में भी शामिलहै 6. इस गुणात्मक तत्व में सब्सट्रेट नियंत्रण, युग्मन विशेषताओं, पोस्ट-ट्रांसलेशनल संशोधन, क्रिस्टे गतिशीलता और श्वसन सुपरकॉम्प्लेक्स 7,8 शामिल हैं। इसलिए, कोशिका के ऊर्जा चयापचय का आकलन करने के लिए प्रयोगात्मक और नैदानिक दृष्टिकोण के लिए माइटोकॉन्ड्रियल बायोएनर्जेटिक्स का सटीक विश्लेषण स्वास्थ्य और बीमारी में महत्वपूर्ण है।

माइटोकॉन्ड्रियल ऑक्सीडेटिव फास्फारिलीकरण (ओएक्सपीएचओएस) एडेनोसिन ट्राइफॉस्फेट (एटीपी) 9 के माध्यम से सेलुलर ऊर्जा की पीढ़ी के लिए श्वसन प्रणाली या इलेक्ट्रॉन हस्तांतरण प्रणाली (ईटीएस) के भीतर प्रतिक्रियाओं का एक अनुक्रम है। कॉम्प्लेक्स I और II से कॉम्प्लेक्स IV के माध्यम से इलेक्ट्रॉन प्रवाह से ऊर्जा का दोहन करने के लिए बहु-एंजाइमेटिक कदम आंतरिक माइटोकॉन्ड्रियल झिल्ली में एक इलेक्ट्रोकेमिकल प्रोटॉन ढाल उत्पन्न करता है, बाद में जटिल वी (एफ1एफओ एटीपी सिंथेज़) (चित्रा 1 ए) के माध्यम से एटीपी के लिए एडेनोसिन डिफॉस्फेट (एडीपी) के फॉस्फोराइलेशन के लिए उपयोग किया जाता है।

सबसे पहले, ट्राइकार्बोक्जिलिक चक्र (टीसीए), ग्लाइकोलाइसिस और पाइरूवेट ऑक्सीकरण के दौरान दो-इलेक्ट्रॉन वाहक उत्पन्न होते हैं: निकोटिनामाइड एडेनिन डाइन्यूक्लियोटाइड (एनएडीएच) और डाइहाइड्रोफ्लेविन एडेनिन डाइन्यूक्लियोटाइड (एफएडीएच2)। एनएडीएच को जटिल आई (एनएडीएच डिहाइड्रोजनेज) में ऑक्सीकरण किया जाता है, जिसके दौरान दो इलेक्ट्रॉनों को कोएंजाइम क्यू (क्विनोन को क्विनोल में कम कर दिया जाता है) में स्थानांतरित किया जाता है, जबकि प्रोटॉन को इंटरमेम्ब्रेन स्पेस (आईएमएस) में पंप किया जाता है। दूसरा, कॉम्प्लेक्स द्वितीय (सक्सिनेट डिहाइड्रोजनेज) एफएडीएच2 को ऑक्सीकरण करता है और प्रोटॉन को पंप किए बिना इलेक्ट्रॉनों को कोएंजाइम क्यू में खिलाता है। तीसरा, जटिल III (साइटोक्रोम सी ऑक्सीडोरडक्टेस) में, कोएंजाइम क्यू से इलेक्ट्रॉनों को साइटोक्रोम सी में स्थानांतरित किया जाता है जबकि प्रोटॉन को आईएमएस में पंप किया जाता है। चौथा, साइटोक्रोम सी इलेक्ट्रॉनों को जटिल चतुर्थ (साइटोक्रोम सी ऑक्सीडेज) में स्थानांतरित करता है, प्रोटॉन पंप करने के लिए अंतिम परिसर, और जहां ऑक्सीजन प्रोटॉन को आत्मसात करने के लिए इलेक्ट्रॉन स्वीकर्ता के रूप में कार्य करता है, अंततः पानी बनाता है। यह ऑक्सीजन है जो माइटोकॉन्ड्रिया का उपभोग करता है जिसे ऑक्सीग्राफ द्वारा मापा जा सकता है। अंत में, जटिल I, जटिल III और जटिल IV से उत्पन्न प्रोटॉन का उपयोग जटिल V को घुमाने के लिए किया जाता है, जिससे ATP9 उत्पन्न होता है।

महत्वपूर्ण रूप से, इलेक्ट्रॉन हस्तांतरण न केवल एक रैखिक फैशन में होता है, अन्यथा इलेक्ट्रॉन परिवहन श्रृंखला के रूप में निरूपित किया जाता है। इसके बजाय, इलेक्ट्रॉनों को कई श्वसन मार्गों के माध्यम से कोएंजाइम क्यू पूल में स्थानांतरित किया जा सकता है और अभिसरण इलेक्ट्रॉन प्रवाह की सुविधा प्रदान की जा सकती है। एनएडीएच-सब्सट्रेट और सक्सिनेट, उदाहरण के लिए, क्रमशः जटिल I और जटिल II के माध्यम से प्रवेश कर सकते हैं। फैटी एसिड ऑक्सीकरण से इलेक्ट्रॉनों को फ्लेवोप्रोटीन कॉम्प्लेक्स को स्थानांतरित करने वाले इलेक्ट्रॉन के माध्यम से दान किया जा सकता है। दरअसल, ओएक्सपीएचओएस के व्यापक विश्लेषण के लिए उपयुक्त ईंधन सब्सट्रेट (चित्रा 1 ए) के साथ एक समग्र दृष्टिकोण की आवश्यकता होती है।

Figure 1
चित्रा 1: माइटोकॉन्ड्रियल ऑक्सीडेटिव फॉस्फोराइलेशन और विशिष्ट सब्सट्रेट और अवरोधक प्रोटोकॉल ( ए ) माइटोकॉन्ड्रियन और इलेक्ट्रॉन हस्तांतरण प्रणाली (सीआई-सीआईवी) और माइटोकॉन्ड्रियल एफ1एफ0 एटीपी सिंथेज़ (सीवी) की योजना। सभी संरचनाएं पीडीबी से हैं। आंकड़े केवल इस अध्ययन में वर्णित सब्सट्रेट और अवरोधकों को दर्शाते हैं)। (बी) एक एमएचआरआर डिवाइस में मानक प्रोटोकॉल का उपयोग करते हुए बरकरार एचईके 293 कोशिकाओं में ऑक्सीजन प्रवाह का नमूना ट्रेस। (सी) एक सीएचआरआर डिवाइस में मानक प्रोटोकॉल का उपयोग करते हुए बरकरार एचईके 293 कोशिकाओं में ऑक्सीजन प्रवाह का नमूना ट्रेस। (डी) संबंधित सूट प्रोटोकॉल के साथ एक स्वस्थ दाता से पारगम्य मानव फाइब्रोब्लास्ट में ऑक्सीजन प्रवाह का नमूना ट्रेस। संक्षिप्त नाम: 1 = बरकरार कोशिकाओं का नियमित श्वसन; 2 = राज्य 2; 3 = राज्य 3 (मैं); 4 = साइटसी के साथ राज्य 3 (आई); 5 = राज्य 3 (मैं + द्वितीय); 6 = रिसाव (ओएम); 7 = ईटीएस क्षमता; 8 = एस (आरओटी); 9 = रॉक्स; 10 = टीएमपीडी; आरओटी = रोटेनोन, एएम = एंटीमाइसिन, एटीपी = एडेनोसिन ट्राइफॉस्फेट, एज़ = एज़ाइड, ओएम = ओलिगोमाइसिन, एफसीसीपी = कार्बोनिल साइनाइड पी-ट्राइफ्लोरो-मेथॉक्सीफेनिल-हाइड्राज़ोन; एएससी = एस्कॉर्बेट, टीएमपीडी = एन, एन,एन', एन'-टेट्रामिथाइल-पी-फेनिलेनेडियामाइन, सक्क = सक्सिनेट, एम = मैलेट, पी = पाइरूवेट, एडीपी = एडेनोसिन डिफॉस्फेट, एनएडी = निकोटिनामाइड एडेनिन डाइन्यूक्लियोटाइड, आईएमएस = इंटरमेम्ब्रेन स्पेस, एफएडी = फ्लेविन एडेनिन डाइन्यूक्लियोटाइड कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

एचआरआर का उपयोग करके माइटोकॉन्ड्रियल ओएक्सपीएचओएस क्षमता का विश्लेषण न केवल प्राथमिक माइटोकॉन्ड्रियल दोष10,11 के लिए नैदानिक मूल्य का एक वाद्य जैव रासायनिक तरीका बन गया है, बल्कि जीव विज्ञान के अन्य सभी क्षेत्रों जैसे कैंसर और उम्र बढ़ने12 तक फैला हुआ है। एचआरआर माइटोकॉन्ड्रियल ओएक्सपीएचओएस क्षमता के विश्लेषण द्वारा सेलुलर श्वसन के निर्धारण की अनुमति देता है, जो सीधे व्यक्तिगत या संयुक्त माइटोकॉन्ड्रियल श्वसन जटिल कमी को दर्शाता है, और अप्रत्यक्ष रूप से सेलुलर शिथिलता और परिवर्तित ऊर्जा चयापचय9 से जुड़ा हुआ है। पद्धतिगत रूप से, श्वसन माप कोशिकाओं, ऊतक, या पृथक माइटोकॉन्ड्रिया 11,13,14 का उपयोग करके किया जाता है, जिसमें जमे हुए सामग्री केवल आंशिक रूप से उपयुक्त 15,16 होती है। जमे हुए ऊतक को बनाए रखा सुपरकॉम्प्लेक्स स्थिरता15 के साथ एक बरकरार ईटीएस दिखाया गया है। इस प्रकार, पारंपरिक टीसीए मध्यवर्ती के विपरीत, संबंधित सब्सट्रेट को सीधे ईटीएस में खिलाया जाता है। हालांकि, ईटीएस और एटीपी संश्लेषण के बीच युग्मन खो जाता है क्योंकि झिल्ली अखंडता फ्रीज क्षति (बर्फ क्रिस्टल गठन) के माध्यम से समझौता किया जाता है।

श्वसन प्रयोग आमतौर पर गैर-पारगम्य या पारगम्य कोशिकाओं या ऊतक में एंडोथर्म के लिए 37 डिग्री सेल्सियस के शारीरिक तापमान पर होते हैं। जबकि पूर्व साइटोसोलिक चयापचय संदर्भ पर विचार करता है, उत्तरार्द्ध विशिष्ट सब्सट्रेट (और अवरोधकों) के अलावा के माध्यम से व्यक्तिगत ओएक्सपीएचओएस परिसरों और एटीपीज़ का ऊर्जावान योगदान प्रदान करता है। सब्सट्रेट और अवरोधकों के अनुक्रम और भिन्नता ने ओएक्सपीएचओएस फ़ंक्शन (12 के तहत समीक्षा की गई) के विभिन्न वैज्ञानिक प्रश्नों को संबोधित करने के लिए सूट प्रोटोकॉल17 और परख 18 की एक विविध सरणी के विकास का नेतृत्व किया है। सेलुलर श्वसन का मूल प्रोटोकॉल चार अलग-अलग राज्यों का आकलन करता है: i) नियमित श्वसन - सब्सट्रेट या अवरोधकों के किसी भी अतिरिक्त के बिना संबंधित श्वसन मीडिया में श्वसन लेकिन अंतर्जात सब्सट्रेट का उपभोग करता है। यह स्थिति सामान्य ओएक्सपीएचओएस या माध्यमिक-प्रेरित श्वसन दोषों को प्रकट कर सकती है, उदाहरण के लिए, परिवर्तित मेटाबोलाइट प्रोफाइल द्वारा। अगला, एटीपीस अवरोधक ओलिगोमाइसिन के अलावा प्रोटॉन के लिए आंतरिक माइटोकॉन्ड्रियल झिल्ली की पारगम्यता का पता चलता है, जिसे ii) रिसाव श्वसन के रूप में परिभाषित किया गया है। प्रोटोनोफोर के बाद अनुमापन जैसे कि अनकपलर कार्बोनिल साइनाइड पी-ट्राइफ्लोरो-मेथॉक्सीफेनिल-हाइड्राज़ोन (एफसीसीपी) उस स्थिति को निर्धारित करने की अनुमति देता है जिस पर ईटीएस क्षमता ओपन-ट्रांसमेम्ब्रेन प्रोटॉन सर्किट मोड में अधिकतम होती है, जिसे परिभाषित किया जाता है iii) अयुग्मित श्वसन। महत्वपूर्ण रूप से, माइटोकॉन्ड्रियल झिल्ली को अत्यधिक यांत्रिक क्षति के माध्यम से प्रयोगात्मक हस्तक्षेप द्वारा एक अयुग्मित अवस्था भी हो सकती है। इसके विपरीत, गैर-युग्मित अवस्था एक आंतरिक तंत्र द्वारा श्वसन अनकपलिंग को संदर्भित करती है जो शारीरिक रूप से नियंत्रित होती है। अंत में, जटिल III अवरोधक एंटीमाइसिन और जटिल I अवरोधक रोटेनोन के अलावा ईटीएस का पूर्ण निषेध गैर-माइटोकॉन्ड्रियल ऑक्सीजन खपत प्रक्रियाओं (चित्रा 1 ए-सी) से अवशिष्ट ऑक्सीजन खपत (आरओएक्स) निर्धारित करता है।

माइटोकॉन्ड्रियल बायोएनर्जेटिक्स में पांच अलग-अलग श्वसन अवस्थाएं19,20 होती हैं। राज्य 1 श्वसन किसी भी अतिरिक्त सब्सट्रेट या एडीपी के बिना है, सिवाय अंतर्जात रूप से उपलब्ध होने के। एडीपी के अलावा के बाद, लेकिन फिर भी, कोई सब्सट्रेट नहीं, राज्य 2 श्वसन प्राप्त किया जाता है। जब सब्सट्रेट जोड़े जाते हैं, तो इलेक्ट्रॉन हस्तांतरण और एटीपी संश्लेषण की अनुमति मिलती है, राज्य 3 श्वसन तक पहुंच जाता है। इस अवस्था में, ओएक्सपीएचओएस क्षमता को एडीपी, अकार्बनिक फॉस्फेट, ऑक्सीजन, एनएडीएच- और सक्सिनेट-लिंक्ड सब्सट्रेट की संतृप्त सांद्रता पर परिभाषित किया जा सकता है। राज्य 4 श्वसन या रिसाव श्वसन को पर्याप्त सब्सट्रेट होने पर एडीपी या रासायनिक रूप से बाधित एटीपी सिंथेस के बिना एक राज्य के रूप में परिभाषित किया जा सकता है। अंत में, जब सभी ऑक्सीजन एक बंद-कक्ष सेटिंग में समाप्त हो जाती है (एनोक्सिक), तो राज्य 5 श्वसन मनाया जाता है।

ऑक्सीजन की खपत के विश्लेषण के माध्यम से ओएक्सपीएचओएस के वर्तमान वास्तविक समय के मूल्यांकन पर हावी होने वाले दो उपकरणों के साथ सेलुलर ऊर्जा राज्यों14 का आकलन करने के लिए कई तरीके मौजूद हैं, प्रयोगात्मक मॉडल और अनुसंधान प्रश्न पर निर्भर विभिन्न प्रयोज्यता के साथ एक बंद-कक्ष प्रणाली में समय के साथ ऑक्सीजन में कमी के कार्य के रूप में मापा जाता है: ओरोबोरोस 2 के उच्च-रिज़ॉल्यूशन श्वसनमापी और सीहॉर्स एक्सएफ बाह्य प्रवाह विश्लेषक। दोनों उपकरण कक्ष या माइक्रोप्लेट के भीतर एक पूर्ण मूल्य के रूप में प्रति सेकंड ऑक्सीजन (ओ2) के पिकोमोल (पीएमओएल) में कमी के रूप में ऑक्सीजन की खपत दर को रिकॉर्ड करते हैं। प्रति द्रव्यमान विशिष्ट ऑक्सीजन की खपत कोशिकाओं (लाखों), ऊतक वजन (मिलीग्राम), या प्रोटीन राशि की संख्या के अनुसार एक विशिष्ट बफर नुस्खा में संबंधित ऑक्सीजन की खपत को सामान्य करके प्राप्त की जाती है।

ओ 2 के (ओरोबोरोस इंस्ट्रूमेंट्स) एक पोलरोग्राफिक ऑक्सीजन सेंसर (चैंबर-आधारित उच्च-रिज़ॉल्यूशन रेस्पिरोमीटर: सीएचआरआर के रूप में संक्षिप्त) से लैस एक बंद दो-कक्ष प्रणाली है। प्रत्येक प्रायोगिक कक्ष में 2 मिलीलीटर तरल होता है जिसे चुंबकीय उत्तेजक द्वारा समरूप रखा जाता है। पोलरोग्राफिक ऑक्सीजन सेंसर ऑक्सीजन को मापने के लिए एक एम्परोमेट्रिक दृष्टिकोण का उपयोग करता है: इसमें एक सोना कैथोड, एक चांदी / चांदी क्लोराइड एनोड होता है, और एक केसीआई समाधान के बीच में एक विद्युत रासायनिक सेल बनाता है जिस पर एक वोल्टेज (0.8 वी) लागू होता है। परख माध्यम से ऑक्सीजन एक 25 μm फ्लोरिनेटेड एथिलीन प्रोपलीन झिल्ली (हे 2-पारगम्य) के माध्यम से फैलता है और कैथोड में कमी से गुजरता है, हाइड्रोजन पेरोक्साइड का उत्पादन करता है। एनोड पर, हाइड्रोजन पेरोक्साइड द्वारा चांदी को ऑक्सीकरण किया जाता है, जिससे विद्युत प्रवाह उत्पन्न होता है। यह विद्युत प्रवाह (एम्पीयर) रैखिक रूप से आंशिक ऑक्सीजन दबाव से संबंधित है। ऑक्सीजन के आंशिक दबाव और परख माध्यम के ऑक्सीजन घुलनशीलता कारक का उपयोग ऑक्सीजन एकाग्रता की गणना करने के लिए किया जाता है। चूंकि ऑक्सीजन आंशिक दबाव प्रयोगात्मक तापमान पर निर्भर है और पोलरोग्राफिक माप तापमान-संवेदनशील हैं, इसलिए तापमान में उतार-चढ़ाव को पेल्टियर हीटिंग ब्लॉक द्वारा सटीक (±0.002 डिग्री सेल्सियस) विनियमन की आवश्यकता होती है। तापमान को 4 डिग्री सेल्सियस और 47 डिग्री सेल्सियस की सीमा के भीतर नियंत्रित किया जा सकता है।

सीहॉर्स एक्सएफ बाह्य प्रवाह विश्लेषक (एगिलेंट) 24- या 96-अच्छी तरह से माइक्रोप्लेट प्रारूप के साथ एक प्लेट-आधारित प्रणाली है जिसमें तीन प्रतिदीप्ति इलेक्ट्रोड प्रत्येक कुएं में समय के साथ ऑक्सीजन की खपत को मापते हैं (माइक्रोप्लेट-आधारित उच्च-रिज़ॉल्यूशन रेस्पिरोमीटर: एमएचआरआर के रूप में संक्षिप्त)। परख कारतूस में चार बंदरगाहों की एक अधिकतम परख के दौरान स्वचालित इंजेक्शन के लिए उपलब्ध हैं. एक परख में कई चक्र होते हैं, जिनमें से प्रत्येक में तीन चरण होते हैं: 1) मिश्रण, 2) प्रतीक्षा, और 3) माप। माप चरण के दौरान, सेंसर जांच उत्सर्जित प्रकाश को मापने के लिए 7-10 μL मात्रा युक्त एक अस्थायी रूप से बंद कक्ष बनाने माइक्रोप्लेट में उतारा जाता है। यह प्रकाश सेंसर जांच की नोक पर बहुलक-एम्बेडेड फ्लोरोफोरस द्वारा उत्सर्जित होता है, जो फॉस्फोरेसेंस शमन के आधार पर ओ2 को समझता है। प्रतिदीप्ति संकेत की तीव्रता ओ2 के लिए आनुपातिक है और सेंसर और परख माध्यम के तापमान से प्रभावित है। इसलिए, सटीक ऑक्सीजन अनुमान के लिए किसी भी नमूने के बिना पृष्ठभूमि के साथ एक सापेक्ष दृष्टिकोण की आवश्यकता होती है। ऑक्सीजन एकाग्रता को बहाल करना मिश्रण चरण के दौरान होता है जब सेंसर अस्थायी कक्ष के ऊपर मात्रा को मिलाने के लिए ऊपर और नीचे जाता है। प्रत्येक चक्र एक ऑक्सीजन खपत दर की गणना करता है। तापमान को 16 डिग्री सेल्सियस और 42 डिग्री सेल्सियस की सीमा के भीतर नियंत्रित किया जा सकता है।

एचआरआर प्राथमिक और माइटोकॉन्ड्रिया से जुड़ी बीमारियों और सामान्य सेलुलर चयापचय में सेलुलर बायोएनर्जेटिक्स का आकलन करने के लिए स्वर्ण मानक है। इस अध्ययन में, कोशिकाओं और ऊतकों में ओएक्सपीएचओएस फ़ंक्शन का आकलन करने के लिए एचआरआर के लिए बुनियादी प्रोटोकॉल प्रदान किए जाते हैं।

Figure 2
चित्रा 2: सीएचआरआर के लिए सेल और ऊतक तैयारी के लिए वर्कफ़्लो, और एमएचआरआर श्वसनमिति के लिए सेल तैयारी। (बी) स्तनधारी कोशिकाओं (चरण 1.2): एचईके 293 गोली 3 x 106 कोशिकाओं (बाएं पैनल) के बराबर है। गैर-रेशेदार ऊतक (चरण 1.3): 2 एमएल टेफ्लॉन पॉटर (मध्य पैनल) में म्यूरिन सेरिबैलम लाइसेट की तैयारी। "सीएचआरआर श्वसनमिति के लिए सैपोनिन-प्रेरित कंकाल की मांसपेशी पारगम्यता (चरण 1.4) सही पैनल)" (चरण 1.4) (सी) मानक माइक्रोप्लेट सीडिंग लेआउट (चरण 2.4) और एमएचआरआर श्वसनमिति के लिए यूकेरियोटिक कोशिकाओं (एचईके 293) के विश्लेषण के लिए संगम जांच। (डी, ई) एमएचआरआर श्वसनमिति के लिए इंजेक्शन पोर्ट लोडिंग की योजना (चरण 2.4)। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Protocol

सभी पशु प्रयोग राष्ट्रीय पशु प्रयोग समीक्षा बोर्ड और दक्षिणी फिनलैंड के लिए क्षेत्रीय राज्य प्रशासनिक एजेंसी के अनुसार किया जाता है। इस अध्ययन में नर सी57बीएल/6जेओएलएचएसडी चूहों (4-6 महीने के) का इस्तेमाल किया गया था। हेलसिंकी विश्वविद्यालय की संस्थागत नैतिकता समिति से मानव कोशिका लाइनों के उपयोग के लिए सहमति प्राप्त की गई थी।

1. उच्च-रिज़ॉल्यूशन श्वसनमिति: चैंबर-आधारित रेस्पिरोमीटर (सीएचआरआर)

नोट: प्रोटोकॉल के इस खंड में प्रयोगों ओरोबोरोस ओ 2 के-कोर का उपयोग करके प्रदर्शन किया गया था: ऑक्सीग्राफ -2 के (सामग्री की तालिका)

  1. ऑक्सीजन सेंसर का अंशांकन
    1. माइटोकॉन्ड्रियल श्वसन माध्यम (एमआईआर 05, तालिका 1, घुलनशीलता कारक: 0.92) के 2.1 मिलीलीटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर प्री-रन रेस्पिरोमीटर >45 मिनट के लिए और21 वर्णित के रूप में ऑक्सीजन अंशांकन करते हैं। यदि आधारभूत भिन्नता ± 4 पीएमओएल / सेकंड के भीतर है तो आगे बढ़ें।
      नोट: पृष्ठभूमि संकेत में बड़े उतार-चढ़ाव सेंसर झिल्ली के आवश्यक रखरखाव या पिछले प्रयोग से कक्ष में शेष अवरोधकों के निशान का संकेत दे सकते हैं। प्रयोगों के एक बैच से पहले एक वाद्य पृष्ठभूमि ऑक्सीजन प्रवाह सुधार की सिफारिश की जाती है25.
    2. समय के साथ सेंसर झिल्ली प्रदर्शन की निगरानी के लिए ऑक्सीजन अंशांकन मूल्यों को रिकॉर्ड करें।
      नोट: यह सेंसर फ़ंक्शन, सिग्नल-टू-शोर स्थिरता और जब सेंसर झिल्ली रखरखाव की आवश्यकता होती है, तो पता चलता है। परिवेश के दबाव पर निर्भर करते हुए, एमआईआर 05 में 180-200 μmol ऑक्सीजन घुलनशील है।
    3. श्वसन माध्यम में किसी भी नमूने के अलावा से पहले कक्ष में सभी तरल निकालें।
      नोट: श्वसन कक्षों की मात्रा का मूल्यांकन नियमित रूप से ठीक 2 मिलीलीटर होने के लिए करें।
  2. उच्च-रिज़ॉल्यूशन श्वसनमिति के लिए कोशिकाओं की तैयारी
    1. 10% गर्मी-निष्क्रिय भ्रूण गोजातीय सीरम (एफबीएस), ग्लूटामैक्स, गैर-आवश्यक अमीनो एसिड, और ना-पाइरूवेट22 और यूरिडीन 23 के साथ पूरक उच्च ग्लूकोज के साथ डलबेको के संशोधित ईगल के माध्यम (डीएमईएम) में 10 सेमी2 व्यास व्यंजनों में संस्कृति एचईके 293 कोशिकाएं 5% सीओ2 पर37 डिग्री सेल्सियस पर एक इनक्यूबेटर में ऑक्सफोस-दोषपूर्ण चयापचय का समर्थन करने के लिए।
      नोट: किसी भी प्रकार के यूकेरियोटिक सेल को सुसंस्कृत किया जा सकता है। अधिकांश सेल प्रकारों के लिए, 10 सेमी2 डिश संवर्धन पर्याप्त कोशिकाओं (आमतौर पर >3 x 106 कोशिकाओं) की ओर जाता है। सेलुलर चयापचय और श्वसन पर प्रभाव से बचने के लिए नियमित रूप से माइकोप्लाज्मा संक्रमण की जांच करें।
    2. 90% संगम (चित्रा 2 सी) से अधिक के बिना कोशिकाओं को विकसित करें।
      नोट: >90% संगम वाली कोशिकाएं श्वसन पर विकास-निर्भर निरोधात्मक प्रभाव दिखा सकती हैं (यदि सिंक्रनाइज़ या पोस्ट-माइटोटिक नहीं हैं)।
    3. 1एक्स पीबीएस के साथ कोशिकाओं को धो लें, गर्म 0.25% ट्रिप्सिन के 1 एमएल के साथ अलग करें, गर्म डीएमईएम (5 एमएल / 10 सेमी2 प्लेट) जोड़कर ट्रिप्सिन को निष्क्रिय करें और हेमोसाइटोमीटर के साथ कोशिकाओं की गिनती करें।
    4. धीरे अपकेंद्रित्र 5 मिनट के लिए 300 एक्स जी पर 2.5 x 106 कोशिकाओं के बराबर सेल समाधान, सतह पर तैरनेवाला पूरी तरह से हटा दें, और गर्म एमआईआर 05 (1 एक्स 106 कोशिकाओं /
    5. निलंबन कोशिकाओं के लिए, गिनती और 2.5 x 106 कोशिकाओं, गोली के बराबर समाधान निकालें और चरण 1.2.4 में उल्लिखित के रूप में जारी रखें।
    6. पारगम्य अनुकूलन (चरण 1.6), पारगम्य सेल या ऊतक (चरण 1.5), या बरकरार कोशिकाओं (चरण 1.7) के लिए सूट प्रोटोकॉल चलाएं
      नोट: लगातार परिणामों के लिए, सेल एकाग्रता स्थिर रखने की सिफारिश की जाती है (उदाहरण के लिए, 1 एक्स 106 कोशिकाओं / यद्यपि श्वसन श्वसनमापी24 में कोशिका घनत्व से स्वतंत्र है, सब्सट्रेट और अवरोधक प्रयोगों के दौरान तुलनीय एकाग्रता में हैं यदि सेल नंबर स्थिर रखे जाते हैं।
  3. उच्च-रिज़ॉल्यूशन श्वसन के लिए गैर-रेशेदार ऊतक (जैसे, मस्तिष्क, यकृत) की तैयारी
    1. ऊतक का एक समरूप टुकड़ा, वजन में 30-40 मिलीग्राम, या पूरे अंग (इस मामले में माउस सेरिबैलम) का उपयोग करें।
      नोट: यदि ऊतक का तुरंत उपयोग नहीं किया जाता है, तो अधिकांश ऊतकों के लिए 2 घंटे तक संरक्षण की अनुमति देने वाले बर्फ-ठंडे एमआईआर 05 के 2 एमएल में रखें। व्यक्तिगत ऊतक भंडारण समय का मूल्यांकन समय श्रृंखला में किया जाना चाहिए।
    2. व्हाटमैन फिल्टर पेपर के साथ ऊतक को सूखा धब्बा करें (सावधान: नरम ऊतक पदार्थ छड़ी करने के लिए जाता है)।
    3. 30-40 मिलीग्राम ऊतक टुकड़े को बर्फ से ठंडा 2 मिलीलीटर पॉलीटेट्राफ्लोरोइथिलीन कुम्हार एल्वेहजेम होमोजेनाइज़र में रखें।
    4. ऊतक-से-बफर अनुपात को बनाए रखने के लिए 20 मिलीग्राम / एमएल प्राप्त करने के लिए एमआईआर 05 की उचित मात्रा जोड़ें। उपयुक्त यांत्रिक पारगम्यता > लिए अपर्याप्त या अत्यधिक तरल पदार्थ से बचने के लिए कुल मात्रा <1.5 एमएल और <2 एमएल रखें।
    5. मूसल डालें, अत्यधिक ऊतक क्षति के कारण वैक्यूम की पीढ़ी से परहेज करते हुए मूसल को सावधानीपूर्वक वापस लेकर धीरे-धीरे ऊतक को लाइज करें।
    6. कुल मिलाकर 7 स्ट्रोक करें (1x एक ऊपर और नीचे स्ट्रोक के रूप में परिभाषित) जब तक कि लाइसेड (प्रमुख मलबे के बिना टर्बिड तरल के रूप में स्पष्ट) (चित्रा 2 बी)।
      नोट: साइटोक्रोम सी प्रतिक्रिया (चरण 1.5.11) के माध्यम से बाहरी माइटोकॉन्ड्रियल झिल्ली अखंडता का आकलन करके प्रत्येक ऊतक के लिए उपयुक्त लिसिस के लिए स्ट्रोक की संख्या का परीक्षण करने की आवश्यकता है। हार्ड-टू-लाइज संयोजी ऊतक या पोत भाग बने रह सकते हैं।
    7. लाइज्ड ऊतक को 15 एमएल अपकेंद्रित्र ट्यूब में डिकेंट करें।
    8. कुम्हार के अंदर को लाइजिंग चरण (जैसे, 1.5 एमएल) में उपयोग किए जाने वाले एमआईआर 05 की समान मात्रा के साथ धोएं और 15 एमएल ट्यूब में जोड़ें जिसमें अब 10 मिलीग्राम /
    9. 37 डिग्री सेल्सियस तक गर्म करने के लिए प्रति कक्ष सादे एमआईआर 05 के 2 मिलीलीटर जोड़ें।
    10. ठंड से 37 डिग्री सेल्सियस तक तनाव को कम करने के लिए धीरे-धीरे प्रति कक्ष प्रत्येक लाइसेट के 500 μL (5 मिलीग्राम के बराबर) पाइपिंग से पहले समान वितरण के लिए ट्यूब घुमाएं।
    11. कक्ष को बंद करने से पहले कक्ष सामग्री को 37 डिग्री सेल्सियस तक गर्म करने के लिए >3 मिनट प्रतीक्षा करें। डाट के शीर्ष पर अतिरिक्त तरल पदार्थ निकालें (बंद होने के बाद प्रति कक्ष मात्रा: 4 मिलीग्राम)।
    12. मानक पारगम्य (चरण 1.5) के लिए सूट प्रोटोकॉल चलाएं।
  4. उच्च-रिज़ॉल्यूशन श्वसनमिति के लिए रेशेदार ऊतक (कंकाल की मांसपेशी, हृदय की मांसपेशी) की तैयारी
    1. कठिन ऊतक निकालें, एक विच्छेदन माइक्रोस्कोप के तहत बर्फ ठंडा BIOPS (तालिका 2) के 2 मिलीलीटर में तेज संदंश का उपयोग कर मांसपेशियों से संयोजी ऊतक और वसा को हटा दें।
    2. तेज संदंश के साथ अनुदैर्ध्य अक्ष के साथ फाइबर बंडलों (~ 4 मिलीग्राम) को अलग करें। एक जाल जैसी संरचना (चित्रा 2 बी) प्राप्त करने के लिए तंतुओं को पर्याप्त रूप से चिढ़ाएं।
      नोट: उचित यांत्रिक फाइबर पृथक्करण और पारगम्यता लाल वर्णक मायोग्लोबिन के नुकसान और पारदर्शिता में वृद्धि से संकेत मिलता है।
    3. 4 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए सैपोनिन (बीआईओपीएस में 50 μg / एमएल, ताजा तैयार) में फाइबर बंडल को धोएं और पारगम्य करें (फाइबर पारभासी हो जाते हैं, पूर्ण पारगम्यता, चित्रा 2 बी का संकेत देते हैं)।
    4. 4 डिग्री सेल्सियस पर धोने प्रति 5 मिनट के लिए एमआईआर 05 में फाइबर को दो बार धो लें।
    5. फिल्टर पेपर के साथ सूखा धब्बा और 2.1 एमएल एमआईआर 05 से भरे कक्ष में जोड़ने से पहले वजन।
    6. पूरी तरह से बंद किए बिना स्टॉपर्स का परिचय दें, फिर 20 एमएल सिरिंज का उपयोग करके शुद्ध ओ2 के 2 एमएल के साथ कक्षों को ऑक्सीजन दें और घूर्णन गति में स्टॉपर्स को घुमाकर कक्षों को बंद करें। ऑक्सीजन प्रसार सीमा से बचने के लिए प्रयोग के दौरान 300-500 μM के बीच ओ2 एकाग्रता रखें।
  5. कोशिकाओं या ऊतकों में नियमित श्वसन का आकलन करने के लिए प्रोटोकॉल
    1. 1.5.2-1.5.3 चरणों में उल्लिखित कक्ष में नमूना जोड़ें।
    2. गर्म एमआईआर 05 सेल निलंबन के 2.3 एमएल जोड़ें (मानक इनपुट: चरण 1.2 या 2 मिलीग्राम ऊतक / एमएल के रूप में चरण 1.3 के रूप में 1 x 106 कोशिकाओं /
    3. कंकाल और हृदय की मांसपेशी (चरण 1.4): चरणों 1.4.4-1.4.6 पर विचार करते हुए 2.3 मिलीलीटर गर्म एमआईआर 05 को प्रीवॉर्फ करने के लिए ~ 4 मिलीग्राम सैपोनिन-पारगम्य फाइबर जोड़ें
    4. 37 डिग्री सेल्सियस और 700 आरपीएम की सरगर्मी गति पर कक्षों चलाएं। मीडिया को घूर्णन गति में डाट घुमाकर कक्षों को बंद करने और बंद करने की अनुमति देने के लिए >3 मिनट तक प्रतीक्षा करें। पेल्टियर ब्लॉक स्थिरीकरण निर्धारित तापमान तक पहुंचने का संकेत देता है।
    5. (वैकल्पिक) शेष बुलबुले को डाट की केशिका के माध्यम से बचने की अनुमति देने के लिए 300 आरपीएम तक हलचल की गति बदलें।
    6. डाट के शीर्ष पर किसी भी अतिरिक्त तरल की आकांक्षा करें। राज्य 1 श्वसन, चित्रा 1 बी रिकॉर्ड करने के लिए किसी भी नमूना प्रकार के साथ एक स्थिर ऑक्सीजन प्रवाह संकेत प्राप्त होने तक 10 मिनट तक प्रतीक्षा करें)।
    7. पारगम्य कोशिकाओं और ऊतक में श्वसन माप के लिए, चरण 1.6 के साथ जारी रखें। चरण 1.8 के साथ बरकरार कोशिकाओं के लिए।
  6. पारगम्य कोशिकाओं या ऊतकों में ओएक्सपीएचओएस विश्लेषण के लिए प्रोटोकॉल
    1. एमएल की अंतिम एकाग्रता के लिए डिजिटोनिन के 1 μL (डाइमिथाइल सल्फोक्साइड (डीएमएसओ)) में 8.1 एमएम डिजिटोनिन स्टॉक) जोड़कर लाइसेड (पारगम्य) ऊतक नमूने या पारगम्य कोशिकाओं का उपयोग करें। प्रवाह गिर जाएगा और >5 मिनट में स्थिर होना चाहिए।
      सावधानी: डिजिटोनिन श्वसन पथ के लिए तीव्रता से विषाक्त है, त्वचा के संपर्क में है, या जब निगल लिया जाता है।
      नोट: सभी रसायनों का इंजेक्शन सटीक ग्लास सिरिंज के साथ किया जाता है। क्रॉस-संदूषण से बचने के लिए केवल संकेतित रसायनों के लिए सिरिंज का उपयोग करें और उपयोग के बाद पानी और ईटीओएच में अच्छी तरह से धो लें। अवरुद्ध सिरिंज को किसी भी रासायनिक क्लॉग को हटाने के लिए गर्म डीडीएच2ओ या सफाई तार में अल्ट्रासोनिकेशन की आवश्यकता हो सकती है। कक्षों में हवा पेश करने से बचने के लिए हमेशा सिरिंज में संबंधित स्टॉक समाधान के अधिशेष को वापस लें। प्रत्येक इंजेक्शन के बाद हवा की शुरूआत के लिए कक्षों के अंदर का निरीक्षण करें। प्रवाह पठारों तक प्रत्येक चरण रिकॉर्ड करें।
    2. तेजी से उत्तराधिकार में जोड़ें: 1 एमएम की अंतिम एकाग्रता के लिए 0.4 एम मैलेट (एम) का 5 μL, 2.0 एम पाइरूवेट (पी; ताजा तैयार) का 5 μL, 5 एमएम की अंतिम एकाग्रता के लिए, 5 एमएम की अंतिम एकाग्रता के लिए 2.5 एम ग्लूटामेट (जी) का 4 μL।
    3. पिछले प्रवाह पठार के बाद, 1.25 एमएम की अंतिम एकाग्रता के लिए 0.5 एम एडेनोसिन डिफॉस्फेट (एडीपी, -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत विभाज्य) के 5 μL (मांसपेशियों के ऊतकों के लिए 10 μL) जोड़ें।
      नोट: मांसपेशियों जैसे ऊतक को संतृप्ति तक पहुंचने के लिए एक अलग एकाग्रता की आवश्यकता हो सकती है।
    4. 10 μM की अंतिम एकाग्रता के लिए 4 एमएम साइटोक्रोम सी (साइटसी) के 5 μL जोड़ें।
      नोट: पारगम्यीकरण की गुणवत्ता का आकलन करने के लिए कोशिकाओं के लिए वैकल्पिक।
    5. 10 एमएम की अंतिम एकाग्रता के लिए 1.25 एम सक्सीनेट (एस) के 16 μL जोड़ें। (वैकल्पिक) एडीपी एकाग्रता की संतृप्ति को नियंत्रित करने के लिए 2 एमएम की अंतिम एकाग्रता के लिए 0.5 एम एडीपी के 3 μL जोड़ें।
    6. कोशिकाओं और गैर-रेशेदार ऊतक के लिए, 1 μg / एमएल की अंतिम एकाग्रता के लिए 1 मिलीग्राम / एमएल ओलिगोमाइसिन (ओएम) के 2 μL जोड़ें।
      सावधानी: उपयोग किए जाने वाले सभी ईटीएस अवरोधक अत्यधिक विषाक्त हैं।
      नोट: ओलिगोमाइसिन को इष्टतम एकाग्रता के लिए अनुमापन की आवश्यकता हो सकती है क्योंकि यह ईटीएस क्षमता को दबा सकता है और मांसपेशियों के ऊतकों के लिए छोड़ा जाता है। जब मांसपेशियों के ऊतकों की जांच की जाती है और यदि ओ2 300 μM से नीचे है तो यहां पुन: ऑक्सीजन करें।
    7. 2 एमएम स्टॉक से टिट्रेट एफसीसीपी, बाद के 0.2 μL चरणों के साथ 0.6 μL जोड़ें जब तक कि श्वसन और श्वसन में कोई वृद्धि अधिकतम रूप से अयुग्मित न हो (सैद्धांतिक: गैर-युग्मित)।
    8. 0.5 μM की अंतिम सांद्रता के लिए 1 mM रोटेनोन (ROT) का 1 μL जोड़ें। 1 μg/mL की अंतिम सांद्रता के लिए 1 मिलीग्राम/एमएल एंटीमाइसिन (AM) स्टॉक के 2 μL जोड़ें।
    9. घुमा गति में सवार को धीरे-धीरे उठाकर सभी कक्षों में एक समान ऑक्सीजन स्तर (~ 150 μM) प्राप्त करने के लिए कक्षों को पुन: ऑक्सीजन करें।
    10. जटिल चतुर्थ गतिविधि (वैकल्पिक) का आकलन करने के लिए 0.5 एमएम की अंतिम एकाग्रता के लिए 0.2 एम एन, एन, एन', एन'-टेट्रामिथाइल-पी-फेनिलेनेडियामाइन (टीएमपीडी) के 5 μL के तुरंत बाद 2 एमएम की अंतिम एकाग्रता के लिए 0.8 एम एस्कॉर्बेट का 5 μL जोड़ें।
    11. टीएमपीडी के साथ चोटी ओ2 प्रवाह तक पहुंचने पर तुरंत 10 एमएम की अंतिम एकाग्रता के लिए 4 एम एजाइड के 5 μL जोड़ें। जटिल चतुर्थ आधार स्तर गणना के लिए टीएमपीडी के ऑटो ऑक्सीकरण परख करने के लिए >5 मिनट के लिए रन जारी रखें।
    12. कक्ष गणना पूर्व-रन की पुष्टि करने और चरण 1.9 के साथ जारी रखने के लिए कक्षों को याद करें।
      नोट: डिजिटोनिन-पारगम्यीकरण (केवल कोशिकाओं के लिए) को अधिकतम प्रवाह तक पहुंचने और माइटोकॉन्ड्रियल झिल्ली अखंडता को प्रभावित नहीं करने के लिए परीक्षण प्रयोगों में शीर्षक की आवश्यकता होती है (चरण 1.7 देखें)। साइटोक्रोम सी के अलावा श्वसन दर में >10% वृद्धि के साथ पारगम्य नमूने (विशेष रूप से मांसपेशियों के ऊतकों) को बाहरी माइटोकॉन्ड्रियल झिल्ली क्षति के कारण आगे के विश्लेषण से बाहर रखा जाना चाहिए। ईटीओएच-भंग रसायनों के अलावा प्रवाह में थोड़े समय की डुबकी की उम्मीद है।
  7. प्रोटोकॉल कोशिकाओं के लिए इष्टतम पारगम्यता की स्थिति निर्धारित करने के लिए
    1. चरण 1.2 और 1.5.2 में वर्णित के रूप में कक्ष जोड़ें।
    2. एमएल डिजिटोनिन स्टॉक का 10 μL लें और 5 मिलीग्राम / एमएल तक पतला करने के लिए डीएमएसओ के 10 μL जोड़ें।
    3. रोटेनोन (1 एमएम स्टॉक) के 1 μL जोड़ें। सक्सिनेट के 10 μL (2 एमएम स्टॉक) और एडीपी के 5 μL (0.5 M स्टॉक) जोड़ें।
    4. डिजिटोनिन के 1 μL (प्रति चरण 2.5 मिलीग्राम) को बार-बार टाइट्रेट करें जब तक कि श्वसन आगे नहीं बढ़ता है और अधिकतम होता है।
      नोट: श्वसन में कमी डिजिटोनिन की अत्यधिक एकाग्रता को इंगित करती है।
  8. बरकरार कोशिकाओं में OXPHOS विश्लेषण के लिए प्रोटोकॉल
    1. नियमित श्वसन (चरण 1.6.1-1.6.6) के बाद, 10 एनएम की अंतिम एकाग्रता के लिए 0.01 एमएम ओलिगोमाइसिन के 2 μL जोड़ें।
    2. 2 एमएम स्टॉक से टिट्रेट एफसीसीपी, बाद के 0.2 μL चरणों के साथ 0.6 μL जोड़ें जब तक कि श्वसन और श्वसन में कोई और वृद्धि अधिकतम रूप से असंबद्ध न हो (सैद्धांतिक: गैर-युग्मित)
    3. 0.5 μM की अंतिम सांद्रता के लिए 1 mM रोटेनोन का 1 μL जोड़ें। 1 μg/mL की अंतिम सांद्रता के लिए 1 मिलीग्राम/एमएल एंटीमाइसिन स्टॉक के 2 μL जोड़ें।
    4. घुमा गति में सवार को धीरे-धीरे उठाकर कक्ष को उसी ऑक्सीजन स्तर (~ 150 μM) पर पुन: ऑक्सीजन करें।
    5. 2 एमएम की अंतिम एकाग्रता के लिए 0.8 एम एस्कॉर्बेट के 5 μL जोड़ें। जटिल चतुर्थ गतिविधि का आकलन करने के लिए 0.5 एमएम की अंतिम एकाग्रता के लिए तुरंत 0.2 एम टीएमपीडी के 5 μL जोड़ें।
      नोट: प्रयोगों के किसी भी बड़े सेट से पहले एक ताजा बैच तैयार करें क्योंकि टीएमपीडी ऑटो-ऑक्सीकरण के लिए प्रवण है। -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत होने पर गतिविधि समय के साथ घट सकती है।
    6. टीएमपीडी के साथ चोटी ओ2 प्रवाह तक पहुंचने पर तुरंत 10 एमएम की अंतिम एकाग्रता के लिए 4 एम एजाइड के 5 μL जोड़ें। जटिल चतुर्थ आधार स्तर गणना के लिए टीएमपीडी के ऑटो ऑक्सीकरण परख करने के लिए >5 मिनट के लिए चलाने के लिए जारी रखें।
    7. कक्ष गणना प्री-रन की पुष्टि करने और चरण 1.9 के साथ जारी रखने के लिए कक्षों को याद करें।
  9. पोस्ट-रन नमूना संग्रह
    1. एक 1.5 एमएल ट्यूब 1.5 एमएल ट्यूब में प्रत्येक कक्ष (हलचल के साथ) से एमआईआर 05-निलंबन के बिल्कुल 1 एमएल ले लीजिए।
    2. पारगम्य कोशिकाओं के लिए 1000 एक्स जी पर अपकेंद्रित्र या ऊतक लाइसेट के लिए 20,000 एक्स जी पर। सतह पर तैरनेवाला निकालें और आगे की प्रक्रिया (धारा 3) के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर गोली फ्रीज।
  10. सूट प्रोटोकॉल का विश्लेषण
    1. सब्सट्रेट या अवरोधक (चित्रा 1 सी और चित्रा 3 ए) जोड़ने के बाद प्रत्येक पठार पर ऑक्सीजन प्रवाह (पीएमओएल / मानों को स्प्रेडशीट में निर्यात करें.
    2. प्रत्येक प्रयोगात्मक रन के सभी मूल्यों से अवशिष्ट ऑक्सीजन खपत (आरओएक्स, चित्रा 1 सी और चित्रा 3 सी) मूल्य घटाएं। जटिल चतुर्थ श्वसन प्राप्त करने के लिए टीएमपीडी से एजाइड अवशिष्ट श्वसन घटाएं।
    3. सेल (चित्रा 3 ए, बी) या ऊतक इनपुट (चित्रा 5 ए, बी) के लिए सामान्यीकृत पूर्ण मूल्यों को प्लॉट करें। प्रवाह नियंत्रण अनुपात (चरण 1.11) की गणना करें या उन्हें प्रोटीन इनपुट (चित्रा 3 सी) में सामान्य करें।
  11. प्रवाह नियंत्रण अनुपात गणना
    1. प्रवाह नियंत्रण अनुपात (एफसीआर) 9,26 का उपयोग करके श्वसन समारोह और युग्मन नियंत्रण का सूचकांक प्राप्त करें।
      नोट: यह माइटोकॉन्ड्रियल मात्रा से स्वतंत्र आंतरिक माइटोकॉन्ड्रियल गुणवत्ता का आकलन करने की अनुमति देता है। इसके अलावा, प्रवाह नियंत्रण अनुपात (एफसीआर) अभिकर्मक गुणवत्ता नियंत्रण के लिए अनुमति देने वाली एक ही सेल लाइनों के भीतर तुलनीय हैं (संबंधित एफसीआर चित्रा 1 बी-डी और चित्रा 3 सी में संकेतित क्रमांकित संदर्भ मूल्यों के माध्यम से प्राप्त किए जाते हैं)।
    2. समीकरण 1 का उपयोग करके लीक करने के लिए ओएक्सपीएचओएस के युग्मन के लिए श्वसन नियंत्रण अनुपात की गणना करें।
      समीकरण 1: एफसीआरएडीपी = 5/6 = राज्य 3 /
    3. समीकरण 2 का उपयोग करके एनएडीएच-निर्भर श्वसन का आकलन करने के लिए एफसीआर की गणना करें
      समीकरण 2: एफसीआरस्थिति 3 (I) = 3/5 = राज्य 3 (I) /
    4. समीकरण 3 का उपयोग करके सक्सीनेट-निर्भर श्वसन का आकलन करने के लिए एफसीआर की गणना करें।
      समीकरण 3: एफसीआरराज्य 3 (द्वितीय) = 8/7 = एससड़ांध /
    5. समीकरण 4 का उपयोग करके युग्मित करने के लिए युग्मित का आकलन करने के लिए एफसीआर की गणना करें।
      समीकरण 4: एफसीआरयुग्मित/अयुग्मित = 5/7 = राज्य 3 (मैं +द्वितीय) / ईटीएसक्षमता
    6. माइटोकॉन्ड्रियल बाहरी झिल्ली अखंडता का परीक्षण करने के लिए, समीकरण 5 का उपयोग करें।
      समीकरण 5: % माइटोकॉन्ड्रियल बाहरी झिल्ली क्षति = 3/4 = राज्य 3 (I) / राज्य 3 (I) साइट c के साथ

2. उच्च-रिज़ॉल्यूशन श्वसन: माइक्रोप्लेट-आधारित रेस्पिरोमीटर (एमएचआरआर)

नोट: प्रोटोकॉल के इस खंड में प्रयोगसीहॉर्स XFe96 बाह्य प्रवाह विश्लेषक (सामग्री की तालिका) का उपयोग कर प्रदर्शन किया गया

  1. सेल संस्कृति
    1. किसी भी प्रकार की कोशिका की संस्कृति। अनुयायियों (जैसे, कोलेजन, लैमिनिन) का उपयोग सेल लगाव की सुविधा के लिए किया जा सकता है। यहां, एचईके 293 कोशिकाओं को पहले की तरह सुसंस्कृत किया जाता है (चरण 1.3)।
    2. प्रयोग से एक दिन पहले, कोशिकाओं को अलग करें और प्रयोग (80% -100%) (चित्रा 2 सी) के दिन आदर्श संगम प्राप्त करने के लिए उन्हें एक नामित एमएचआरआर 96-अच्छी तरह से माइक्रोप्लेट में स्थानांतरित करें।
      नोट: एमएचआरआर के लिए, माइक्रोप्लेट सेल घनत्व महत्वपूर्ण हैं। प्रयोग के दिन तुलनीय संगम सुनिश्चित करने के लिए कोशिकाओं की रेखाओं या विकास को प्रभावित करने वाले उपचारों के व्यक्तिगत विकास गुणों का हिसाब लगाया जाना चाहिए।
  2. उच्च-रिज़ॉल्यूशन श्वसनमिति के लिए कोशिकाओं की तैयारी
    1. फसल और बीजारोपण से पहले कोशिकाओं को पर्याप्त रूप से पुन: निलंबित करें
      नोट: प्रतिकृतियों के लिए एक ही कमजोर पड़ने से बीज कोशिकाओं की सिफारिश की जाती है।
    2. उपचार के तहत व्यक्तिगत सेल लाइनों या विकास गुणों की वृद्धि दर के अनुसार कोशिकाओं को बीज दें।
      नोट: एक मानक 96-अच्छी तरह से माइक्रोप्लेट पर अनुकूलन करें और सेल घनत्व को 96-अच्छी तरह से परख-विशिष्ट माइक्रोप्लेट में एक्सट्रपलेशन करें। इस सेटअप में, 7 x 104 HEK293 डब्ल्यूटी कोशिकाओं को 96-अच्छी तरह से प्रति अच्छी तरह से वरीयता दी गई थी। 96-अच्छी तरह से प्लेट के पहले और अंतिम कॉलम प्रोटीन निर्धारण (चित्रा 2 सी) के लिए उपयोग किए जाते हैं। चार कोने कुओं में कोई कोशिका नहीं होनी चाहिए और प्रयोगात्मक पृष्ठभूमि सुधार के लिए उपयोग किया जाता है। आदर्श रूप से, किनारों के करीब कुएं किनारे के प्रभाव को कम करने के लिए खाली हैं (उदाहरण के लिए, कोशिकाएं तापमान प्रभाव के कारण परिवर्तित वृद्धि दर दिखाती हैं) (चित्रा 2 सी, डी)।
  3. सेंसर प्लेटों की तैयारी, अवरोधकों की लोडिंग
    1. परख के दिन, 1 एम ग्लूकोज के 0.4 एमएल, 200 एमएम ग्लूटामाइन के 0.4 एमएल और 100 एमएम ना-पाइरूवेट के 0.4 एमएल के साथ 38.8 एमएल मध्यम के पूरक।
      नोट: एमएचआरआर श्वसन पीएच 7.4 पर एक विशेष गैर-बफर डीएमईएम माध्यम की आवश्यकता होती है। सामान्य तौर पर, 40 एमएल एक 96-अच्छी तरह से माइक्रोप्लेट के साथ एक प्रयोग के लिए पर्याप्त होना चाहिए।
    2. 37 डिग्री सेल्सियस करने के लिए श्वसन परख माध्यम गर्म और अच्छी तरह से प्रति 80 μL के साथ दो बार धोने से श्वसन परख माध्यम के लिए सेल संस्कृति माध्यम का आदान-प्रदान।
    3. परख से पहले 60 मिनट के लिए सीओ 2 के बिनाएक 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में कोशिकाओं के साथ प्लेट सेट करें।
      नोट: यह कदम सीओ2 श्वसन परिणामों को प्रभावित कर सकते हैं के रूप में प्लेट डीगास करने के लिए आवश्यक है, और माध्यम में सीरम परख के दौरान बुलबुले का उत्पादन कर सकते हैं।
    4. ओएम, एफसीसीपी, आरओटी और एएम के लिए प्रीवार्म अवरोधक विभाज्य 37 डिग्री सेल्सियस तक और सेंसर प्लेट को इनक्यूबेटर से बाहर निकालें।
    5. क्रमशः 1.5 μM, 1.125 μM, और 1 μM की अंतिम अच्छी तरह से एकाग्रता के लिए परख माध्यम के 3 मिलीलीटर में पतला ओएम, एफसीसीपी, आरओटी, और एएम। चित्रा 2 ई में दर्शाए गए अनुसार अलग-अलग बंदरगाहों में भरें।
      नोट: सेंसर कारतूस को भरने के लिए एक मल्टीचैनल पिपेट की सिफारिश की जाती है। चूंकि दबाव वाली हवा का उपयोग यौगिकों को इंजेक्ट करने के लिए किया जाता है, इसलिए जब भी कोई बंदरगाह एक यौगिक से भरा होता है तो सभी बंदरगाहों को समान मात्रा में तरल मात्रा से भरा जाना चाहिए। आरओटी और एएम को एक बंदरगाह में जोड़ा जा सकता है। इनहिबिटर को ईटीओएच या डीएमएसओ में भंग किया जा सकता है।
    6. इंजेक्शन बंदरगाहों का निरीक्षण करें और प्रत्येक पोर्ट के लिए एक समान लोडिंग वॉल्यूम सत्यापित करें।
      नोट: सभी बंदरगाहों इंजेक्शन के लिए नीचे एक छेद होते हैं। सेंसर प्लेट को हिलाते समय सावधानी बरतनी चाहिए। सुई का उपयोग करके हवा के बुलबुले को हटाया जा सकता है।
  4. बरकरार कोशिकाओं में ऑक्सीजन मूल्यांकन के लिए प्रोटोकॉल
    1. परख से पहले दिन पर, कदम 2.4.2-2.4.7 प्रदर्शन करते हैं।
    2. एक 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में कैलिब्रेंट समाधान के 20 मिलीलीटर विभाज्य।
    3. बाह्य प्रवाह परख किट खोलें और सामग्री को हटा दें।
    4. उपयोगिता प्लेट के बगल में सेंसर कारतूस उल्टा रखें। विंदुक उपयोगिता प्लेट के प्रत्येक कुएं में कैलिब्रेंट समाधान के 200 μL।
    5. उपयोगिता प्लेट पर सेंसर कारतूस संलग्न करें ध्यान दें कि सभी सेंसर जलमग्न हैं।
    6. सीओ 2 रातोंरात या12 घंटे की एक न्यूनतम के बिना एक 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में प्लेट सेट करें। सत्यापित करें कि इनक्यूबेटर के अंदर आर्द्रता कैलिब्रेंट के वाष्पीकरण को रोकने के लिए पर्याप्त है।
    7. माइक्रोप्लेट-आधारित प्रणाली और कंप्यूटर को अगले दिन उपयोग करने के लिए तैयार होने के लिए चालू करें (मशीन को परख आयोजित करने से पहले 37 डिग्री सेल्सियस तक संतुलित करने के लिए न्यूनतम 3 घंटे की आवश्यकता होती है)।
      नोट: सिग्नल स्थिरता के लिए, श्वसन अवस्था प्रति 3 माप चक्रों के बजाय माप बिंदुओं को 6 तक बढ़ाएं। प्रत्येक चक्र मिश्रण के 3 मिनट और मापने के 3 मिनट के होते हैं।
    8. एक्सएफ परख के दिन, चरण 2.4.9-2.4.20 प्रदर्शन करें।
    9. सेल संस्कृति प्लेट की संगमता, कोशिकाओं की आकृति विज्ञान की पुष्टि करें, और पृष्ठभूमि के कुएं खाली हैं।
    10. चरणों 2.4.11-2.4.12 में उल्लिखित तैयार श्वसन माध्यम के साथ कोशिकाओं को धो लें।
    11. प्रत्येक कुएं से संस्कृति माध्यम के सभी लेकिन 20 μL निकालें। 55 μL निकालें यदि संस्कृति माध्यम रात भर वाष्पीकरण (लगभग 5 μL) के कारण 80 μL था।
    12. परख माध्यम के 90 μL के साथ दो बार कोशिकाओं को धो लें। अंत में, परख माध्यम के 100 μL जोड़ें। अंत मात्रा 120 μL होना चाहिए।
      नोट: एक मल्टीचैनल पिपेट सुनिश्चित करने के लिए इस कदम के लिए एक ही धोने की प्रक्रिया प्रत्येक प्रयोगात्मक स्थिति (प्लेट सेटअप पर निर्भर करता है) पर लागू किया गया है की सिफारिश की है। आकांक्षा करते समय, प्लेट को 45 ° कोण पर झुकाएं और तरल पदार्थ की आकांक्षा और इंजेक्शन के लिए कुओं के कोने में पिपेट युक्तियों को रखें। धोने के दौरान देखभाल करना अनिवार्य है क्योंकि कुछ कोशिकाएं आसानी से सेल संस्कृति प्लेट के नीचे से अलग हो सकती हैं।
    13. परख से पहले 60 मिनट के लिए सीओ2 के बिना एक 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में प्लेट सेट करें।
    14. सीओ2 मुक्त इनक्यूबेटर से हाइड्रेटेड सेंसर कारतूस प्लेट को पुनः प्राप्त करें।
    15. पुराने कैलिब्रेंट समाधान को त्यागें और इसे ताजा कैलिब्रेंट समाधान के साथ बदलें, जो 37 डिग्री सेल्सियस तक पहले से घिरा हुआ है।
    16. अवरोधक और परख माध्यम (परख माध्यम के कुल 12 मिलीलीटर के लिए 3 एमएल प्रति अवरोधक) तैयार करें और बंदरगाहों में अवरोधक लोडिंग के लिए एक विंदुक जलाशय का उपयोग करें।
    17. सॉफ़्टवेयर खोलें और एक पूर्व-डिज़ाइन या नया टेम्पलेट चलाएं। प्लेट मानचित्र भरें, अनुमापन और माप चक्र समायोजित करें, और फिर ऑप्टिकल सेंसर के अंशांकन को शुरू करने के लिए प्रारंभ दबाएं ।
    18. लोड किए गए कारतूस से ढक्कन निकालें और इसे स्लॉट में रखें जो स्वचालित रूप से मशीन से बाहर स्लाइड करता है, यह सत्यापित करता है कि प्लेट के निचले दाएं कोने पर निशान स्लॉट के निचले दाएं कोने पर त्रिकोण के साथ पंक्तिबद्ध होते हैं।
    19. पर क्लिक करें स्वचालित अंशांकन, लगभग 20 मिनट तक चलने के लिए जारी रखें।
    20. अंशांकन के बाद, कैलिब्रेंट युक्त उपयोगिता प्लेट को हटा दें।
    21. कोशिकाओं युक्त माइक्रोप्लेट से ढक्कन निकालें और मशीन द्वारा संकेत दिए जाने पर प्लेट को स्लॉट में रखें। रन शुरू करने के लिए जारी रखें पर क्लिक करें।
  5. पोस्ट-रन नमूना संग्रह
    1. मशीन से प्लेट बाहर ले लो, ध्यान से कोशिकाओं परेशान किए बिना शेष परख मीडिया को हटाने और आगे की प्रक्रिया (धारा 3) के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर पूरी प्लेट फ्रीज।

3. बिसिनकोनिनिक एसिड परख (बीसीए परख) का उपयोग करके प्रोटीन का निर्धारण

  1. प्रोटीन निष्कर्षण के लिए उपयोग किए जाने वाले बफर में पतला गोजातीय सीरम एल्बुमिन (बीएसए) तैयार करें और बीसीए के साथ संगत: डुप्लिकेट में मानक वक्र के लिए 2 मिलीग्राम / एमएल, 1.5 मिलीग्राम / एमएल, 1 मिलीग्राम / एमएल, 0.5 मिलीग्राम / एमएल, 0.25 मिलीग्राम / एमएल और 0 मिलीग्राम / एमएल।
  2. एमएचआरआर के लिए 20 μL प्रति अच्छी तरह से या सीएचआरआर के लिए 1.5 एमएल ट्यूब के भीतर निहित 100 μL प्रति गोली के साथ एक उपयुक्त लाइसिस बफर (जैसे, आरआईपीए) में पुन: निलंबित करके प्रोटीन निकालें।
  3. बर्फ पर 30 मिनट के लिए प्रोटीन लाइसेट्स युक्त एमएचआरआर प्लेट या 1.5 एमएल ट्यूब सेते हैं।
  4. 20 मिनट के लिए 20,000 एक्स जी पर 4 डिग्री सेल्सियस पर प्रोटीन लाइसेट युक्त 1.5 एमएल ट्यूब अपकेंद्रित्र और परिणामस्वरूप सतह पर तैरनेवाला एक नए साफ 1.5 एमएल ट्यूब में स्थानांतरित करें।
  5. एक माइक्रोटिटर प्लेट में डुप्लिकेट और मानकों में नमूना प्रति 10 μL का उपयोग करें। बीसीए काम अभिकर्मक के 200 μL जोड़ें और >15 मिनट के लिए सेते हैं।
  6. 562 एनएम की तरंग दैर्ध्य पर एक मानक स्पेक्ट्रोफोटोमीटर में प्लेट पढ़ें और बीएसए मानक वक्र का उपयोग करके प्रोटीन सांद्रता की गणना करें।
  7. प्रोटीन एकाग्रता के लिए श्वसन परिणामों को सामान्य करें।
    नोट: प्रोटीन राशि के लिए सामान्यीकरण सेल सीडिंग घनत्व या गीला वजन इनपुट की पुष्टि करने की अनुमति देता है। निकाले गए प्रोटीन उदाहरण के लिए ईटीएस के सबयूनिट्स के खिलाफ बाद में इम्यूनोब्लॉटिंग के लिए उपयुक्त हैं, लेकिन पूरी तरह से देशी नमूने का प्रतिनिधित्व नहीं करते हैं (उदाहरण के लिए, फॉस्फोराइलेशन साइटों का नुकसान)।

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Representative Results

यहां, हम यूकेरियोटिक कोशिकाओं, गैर-रेशेदार ऊतक (जैसे, सेरिबैलम), और रेशेदार ऊतक (जैसे, कंकाल की मांसपेशी) में माइटोकॉन्ड्रियल बायोएनर्जेटिक्स निर्धारित करने के लिए प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं। यूकेरियोटिक कोशिकाओं के लिए, माइटोकॉन्ड्रियल अनुवाद से जुड़े दो अलग-अलग प्रोटीनों के सीआरआईएसपीआर-इंजीनियर नॉकआउट के साथ एचईके 2 9 3 जिसके परिणामस्वरूप कई (सीआरआईएसपीआरकेओ 1) और गंभीर / पूर्ण ओएक्सपीएचओएस की कमी (सीआरआईएसपीआरकेओ 2) को सीएचआरआर (चित्रा 3 ए-सी) या एमएचआरआर (चित्रा 3 ए-डी) के साथ मापा गया था।

सीएचआरआर के लिए, एचईके 293 कोशिकाओं को डिजिटोनिन-पारगम्य किया गया था, और मानक प्रोटोकॉल (चरण 1.5-1.6) के बाद किए गए श्वसन प्रयोग किए गए थे और सफलतापूर्वक दर्ज किए गए थे (चित्रा 3 ए)। सीआरआईएसपीआर केओ 1 सेल इनपुट राशि (चित्रा 3 बी) के लिए सामान्यीकृत होने पर डब्ल्यूटी की तुलना में बिगड़ा हुआ और सीआरआईएसपीआरकेओ 2 कोई श्वसन नहीं दिखाता है। प्रोटीन की मात्रा एकत्र किए गए नमूनों (धारा 3) से निर्धारित की गई थी, और नियमित श्वसन के मूल्यों को पूर्ण मूल्यों और संबंधित एफसीआर (चित्रा 3 सी, प्रत्येक एफसीआर का अर्थ चर्चा में विस्तृत है) की गणना करने के लिए प्रोटीन राशि के लिए सामान्यीकृत किया गया था। इष्टतम नमूना मात्रा प्रति एमएल 80-160 पीएमओएल / आदर्श रूप से, कोशिकाओं या ऊतक की मात्रा एक प्रयोग के दौरान अत्यधिक पुन: ऑक्सीजन से बचने के दौरान पृष्ठभूमि शोर को कम करने के लिए एक महत्वपूर्ण प्रवाह (सीएचआरआर के लिए 20 पीएमओएल / कम श्वसन (जैसे, सफेद वसा वसा, सफेद रक्त कोशिकाओं) या हार्ड-टू-प्राप्त नमूनों (जैसे, आईपीएस-विभेदित न्यूरोनल वंशावली) में, आदर्श कामकाजी परिस्थितियों में प्रति एमएल 20 पीएमओएल /

Figure 3
चित्रा 3: संयुक्त ओएक्सपीएचओएस की कमी के साथ एचईके 293 कोशिकाओं का उपयोग करके सीएचआरआर से प्रतिनिधि मानक प्रोटोकॉल ऑक्सीजन की खपत के निशान ( ए ) डब्ल्यूटी एचईके 293 कोशिकाओं और सीआरआईएसपीआर-मध्यस्थता माइटोकॉन्ड्रियल अनुवाद दोषों के साथ एचईके 2 9 3 कोशिकाओं के कच्चे ऑक्सीजन खपत निशान कई ओएक्सपीएचओएस की कमी (सीआरआईएसपीआरकेओ 1, 2) का कारण बनते हैं। (बी) ओवरलैड सेल-इनपुट-सामान्यीकृत ऑक्सीजन खपत निशान (ए) से। (सी) दो स्वतंत्र प्रयोगों (मतलब और एसडी) और संबंधित एफसीआर के प्रोटीन-सामान्यीकृत मात्रा का ठहराव एनोवा और एक पश्चवर्ती तुकी के परीक्षण या एक छात्र के टी-टेस्ट द्वारा स्थितियों के बीच तुलना की गई थी। महत्व: **** पी < 0.0001; पी < 0.001; ** पी < 0.01; * पी < 0.05. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

अगला, हमने एक मानक प्रोटोकॉल (2.1-2.5) में एक ही कोशिकाओं के साथ एमएचआरआर का उपयोग किया, जो ओएक्सपीएचओएस की कमी (चित्रा 4 ए) की पुष्टि करता है। पूर्ण ओएक्सपीएचओएस की कमी (सीआरआईएसपीआर केओ 2) के लिए ईसीएआर मूल्यों में वृद्धि हुई थी, जो बढ़े हुए ग्लाइकोलाइसिस के माध्यम से विशिष्ट माइटोकॉन्ड्रियल अनुवाद की कमी के साथ एचईके 293 कोशिकाओं में माइटोकॉन्ड्रियल ऑक्सीडेटिव फॉस्फोराइलेशन की कमी के मुआवजे का सुझाव देता है जिसके परिणामस्वरूप लैक्टेट उत्पादन (चित्रा 4 ए)। प्रोटीन की मात्रा माइक्रोवेल प्लेट (धारा 3) से निर्धारित की गई थी, और प्राप्त मूल्यों को प्रोटीन राशि (चित्रा 4 बी) और मात्रा निर्धारित (चित्रा 4 सी) के लिए सामान्यीकृत किया गया था। माइक्रोप्लेट-आधारित सिस्टम उच्च इंट्रा-वेल भिन्नता के लिए कुख्यात हैं। प्रतिकृतियों के बीच उच्च परिवर्तनशीलता तब हो सकती है जब इष्टतम बोने का घनत्व प्राप्त नहीं किया गया हो; कोशिकाएं परख माध्यम के साथ सेल संस्कृति माध्यम को बदलने के धोने के चरणों के दौरान अलग हो जाती हैं, या अनुचित पाइपिंग तकनीक जैसे हवा के बुलबुले की शुरूआत या अलग-अलग मात्रा की आकांक्षा। मीडिया (चित्रा 1 बी और चित्रा 4 ए) में प्रवाह के स्थिरीकरण के लिए अनुमति देने के लिए एमएचआरआर के साथ विस्तारित माप समय (6 माप चक्र) की सिफारिश की जाती है। कम प्रवाह उच्च भिन्नता का कारण बनता है, और सेल प्रकार पर निर्भर करता है, प्रवाह पृष्ठभूमि शोर (10-15 पीएमओएल / कम-श्वसन (जैसे, फाइब्रोब्लास्ट) या असाधारण रूप से बड़ी कोशिकाएं 96-अच्छी तरह से माइक्रोप्लेट प्रारूप में पृष्ठभूमि शोर स्तर से ऊपर अपर्याप्त ऑक्सीजन प्रवाह का उत्पादन कर सकती हैं, यहां तक कि 90% संगम पर भी। उस स्थिति में, 24-अच्छी तरह से एमएचआरआर या सीएचआरआर पर विचार किया जाना चाहिए। ऑक्सीजन प्रवाह में न्यूनतम परिवर्तन अवरोधकों को लोड करने के दोषपूर्ण हैंडलिंग का भी संकेत दे सकते हैं, जैसे कि खाली, गलत तरीके से, या विभिन्न रूप से भरे हुए बंदरगाह। रसायनों की लोडिंग के दौरान पर्याप्त रूप से बंदरगाहों में प्रवेश करने वाले विशिष्ट विंदुक युक्तियों का उपयोग रसायनों को व्यक्तिगत बंदरगाह (चित्रा 2 ई) तक पहुंचने की अनुमति देने के लिए अनुशंसित है।

Figure 4
चित्रा 4: प्रतिनिधि मानक प्रोटोकॉल ऑक्सीजन की खपत संयुक्त ओएक्सपीएचओएस की कमी के साथ एचईके 293 कोशिकाओं का उपयोग करके एमएचआरआर से निशान( ए) डब्ल्यूटी एचईके 293 कोशिकाओं और सीआरआईएसपीआर-मध्यस्थता माइटोकॉन्ड्रियल अनुवाद दोषों के साथ एचईके 293 कोशिकाओं के कच्चे ऑक्सीजन खपत निशान कई ओएक्सपीएचओएस की कमी (सीआरआईएसपीआरकेओ 1,2) का कारण बनते हैं। (बी) (ए) से संबंधित बाह्य अम्लीकरण दर (ईसीएआर)। (सी) सीआरआईएसपीआर-मध्यस्थता वाले माइटोकॉन्ड्रियल अनुवाद की कमी के साथ डब्ल्यूटी एचईके 293 कोशिकाओं और एचईके 293 कोशिकाओं के प्रोटीन-सामान्यीकृत ऑक्सीजन खपत निशान कई ओएक्सपीएचओएस की कमी (सीआरआईएसपीआरकेओ 1,2) का कारण बनते हैं। (डी) कुओं के प्रोटीन-सामान्यीकृत परिमाणीकरण (एन = 8 प्रति जीनोटाइप; माध्य और एसडी)। स्थितियों के बीच तुलना एनोवा और एक पश्चवर्ती तुकी के परीक्षण द्वारा की गई थी। महत्व: **** पी < 0.0001; पी < 0.001; ** पी < 0.01; * पी < 0.05. संक्षिप्त नाम: चित्र 1 देखें। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

माउस कंकाल की मांसपेशी (एकमात्र) का उपयोग करके माउस सेरिबैलम (चित्रा 5 ए) और रेशेदार ऊतक तैयारी (चरण 1.4 और 1.5-1.6) का उपयोग करके गैर-रेशेदार ऊतक तैयारी (चरण 1.3 और 1.5-1.6) के लिए एक उदाहरण प्रयोग दिखाया गया है (चित्रा 5 बी)। सामान्य तौर पर, माउस नमूनों में अयुग्मित श्वसन ओएक्सपीएचओएस क्षमता से अधिक नहीं होता है। माउस सेरिबैलम के लिए, अधिकतम ईटीएस क्षमता के साथ तुलना करते समय ओएक्सपीएचओएस क्षमता कम हो गई। रासायनिक रूप से प्रेरित (ओलिगोमाइसिन) बनाम शारीरिक रूप से नियंत्रित परिस्थितियों में रिसाव श्वसन में वृद्धि हुई। यह इस तथ्य के कारण हो सकता है कि अंतर्जात उपलब्ध एडीपी अभी भी एटीपी के लिए फॉस्फोराइलेटेड है, जबकि रासायनिक प्रेरण के साथ, प्रोटॉन रिसाव अधिकतम है, जिसके परिणामस्वरूप लीक श्वसन का अधिक अनुमान है। सेरिबैलम के विपरीत, ऑक्सीजन प्रसार सीमा से बचने के लिए हाइपरॉक्सिक स्थितियों में सोलस का परीक्षण किया गया था और तीन गुना अधिक ओएक्सपीएचओएस क्षमता दिखाता है। विशिष्ट प्रकार के ऊतकों का विश्लेषण करते समय एनएडीएच-निर्भर श्वसन अलग होता है, जिसमें सेरिबैलम की तुलना में सक्सीनेट के अलावा एकमात्र के माध्यम से श्वसन करने की अधिक क्षमता होती है। दोनों प्रकार के ऊतक न्यूनतम आरओएक्स दिखाते हैं।

Figure 5
चित्रा 5: सीएचआरआर के लिए गैर-रेशेदार (ए) और रेशेदार (बी) ऊतकों के लिए ऑक्सीजन की खपत के प्रतिनिधि निशान (ए) वर्णित के रूप में तैयार माउस सेरिबैलम के गीले वजन ऊतक-सामान्यीकृत ऑक्सीजन खपत ट्रेस (चरण 1.3)। (बी) वर्णित के रूप में माउस एकमात्र मांसपेशी के गीले वजन-ऊतक-सामान्यीकृत ऑक्सीजन खपत ट्रेस (चरण 1.4)। ब्लू लाइन संबंधित ऑक्सीजन एकाग्रता और इंजेक्शन अंक दिखाती है। संक्षिप्त नाम: चित्र 1 देखें। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

रासायनिक एकाग्रता
बीएसए, फैटी एसिड मुक्त 1 ग्राम/लीटर
डी-सुक्रोज 110 एमएम
ईजीटीए 0.5 एमएम
हेप्स 20 एमएम
केएच2पीओ4 10 एमएम
लैक्टोबायोनिक एसिड 60 एमएम
एमजीसीएल2 ·6 एच2ओ 3 एमएम
टॉरिन 20 एमएम

तालिका 1: माइटोकॉन्ड्रियल श्वसन माध्यम एमआईआर 05 संरचना पीएच 7.1 27 में समायोजित की गई।

रासायनिक एकाग्रता
सीएके2ईजीटीए निर्जल 2.77 एमएम
डाइथियोथ्रिटोल (डीटीटी) 0.5 एमएम
इमिडाज़ोल 20 एमएम
के2ईजीटीए, निर्जल 7.23 एमएम
एमईएस हाइड्रेट 50 एमएम
एमजीसीएल2-6 एच2ओ 6.56 एमएम
एनए2एटीपी 5.77 एमएम
2फॉस्फोक्रिएटिन 15 एमएम
टॉरिन 20 एमएम

तालिका 2: आराम और बायोप्सी संरक्षण समाधान (BIOPS) संरचना पीएच 7.1 28 करने के लिए समायोजित।

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Discussion

परंपरागत रूप से, माइटोकॉन्ड्रियल बायोएनर्जेटिक्स का अध्ययन क्लार्क-प्रकार के ऑक्सीजन इलेक्ट्रोड के साथ किया गया है। संकल्प और थ्रूपुट की कमी, हालांकि, तकनीकी उन्नति के लिए वारंट किया गया था। आज तक, ओ 2 के (सीएचआरआर के रूप में संदर्भित) और सीहॉर्स एक्सएफ 96 फ्लक्स विश्लेषक (एमएचआरआर के रूप में संदर्भित) को सेलुलर बायोएनर्जेटिक्स के क्षेत्र में व्यापक रूप से अपनाया गया है। यहां, हम या तो सीएचआरआर या एमएचआरआर का उपयोग करके माइटोकॉन्ड्रियल श्वसन के मूल्यांकन के माध्यम से सेलुलर ऊर्जा चयापचय के विश्लेषण के लिए प्रोटोकॉल का एक बोधगम्य संग्रह प्रस्तुत करते हैं, प्रत्येक डिवाइस के प्रमुख लाभों पर चर्चा करते हैं और व्यावहारिक मार्गदर्शन प्रदान करते हैं। यहां प्रदान किए गए प्रोटोकॉल में स्तनधारी कोशिकाएं, रेशेदार (कठोर) ऊतक जैसे कंकाल और हृदय की मांसपेशी, और मस्तिष्क और यकृत जैसे गैर-रेशेदार (नरम) ऊतक शामिल हैं और समान प्रकार की नमूना सामग्री पर लागू होते हैं।

जबकि दोनों एचआरआर विधियों के परिणामस्वरूप स्तनधारी कोशिकाओं के लिए तुलनीय डेटा होता है जैसा कि कई ओएक्सपीएचओएस की कमी के साथ एचईके 293 के साथ उदाहरण दिया गया है, सामान्य कार्य सिद्धांत और उपकरणों के तकनीकी सेटअप उन्हें विभिन्न अनुप्रयोगों के लिए उपयुक्त प्रदान करते हैं। एमएचआरआर सेटअप स्वचालित डेटा अधिग्रहण की अनुमति देता है और इसमें 24- या 96 बहु-अच्छी तरह से सेटअप के साथ उच्च-थ्रूपुट क्षमता होती है जिसमें न्यूनतम नमूना मात्रा की आवश्यकता होती है। हालांकि, कम प्रयोगात्मक मात्रा और अच्छी तरह से सतह, ऑक्सीजन-पारगम्य पॉलिमर (पॉलीस्टाइनिन) के उपयोग के अलावा, उच्च इंट्रा-वेल भिन्नता (विशेष रूप से 96-अच्छी तरह से प्लेट सेटअप में) का कारण बन सकती है, जो प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य परिणामों के लिए प्रति स्थिति ≥6 कुओं के उपयोग को बढ़ावा देती है। सीएचआरआर आधारित-पोलरोग्राफिक ऑक्सीजन सेंसर के विपरीत, एमएचआरआर की सेंसर जांच द्वारा कोई ऑक्सीजन का उपभोग नहीं किया जाता है, जो बुझे हुए फॉस्फोरेसेंस ओ2 सेंसिंग का उपयोग करता है। चूंकि एमएचआरआर एक अर्ध-बंद प्रणाली है, परिवेश ओ2 श्वसन माध्यम में फैल सकता है, नमूना और जांच को ऑक्सीजन में उजागर कर सकता है। जब पिस्टन की तरह सेंसर जांच कम हो जाती है, तो ओ2 एकाग्रता में परिवर्तन को बढ़ाने और ऑक्सीजन की खपत को मापने के लिए एक अस्थायी रूप से सील और पृथक कक्ष बनाया जाता है। इसके बाद, ओ2 के पीछे प्रसार का अनुमान लगाकर ऑक्सीजन खपत दरों की सटीक गणना करने के लिए एक गणितीय मॉडल नियोजित किया जाता है। हालांकि, दोष यह है कि एल्गोरिथ्म शोर29 को भी बढ़ाता है। माइक्रोप्लेट सेटअप गैर-पुन: प्रयोज्य विशेष बंदरगाहों और प्लेटों का उपयोग करता है जिन्हें इष्टतम सेल सीडिंग घनत्व की आवश्यकता होती है। एमएचआरआर ऑक्सीजन सेंसर जांच जांच के आकार (~ 1 मिमी) के बराबर अच्छी तरह से प्रति तीन अलग-अलग क्षेत्रों में पार्श्व ओ2 प्रसार को मापते हैं; इसलिए, सटीक ऑक्सीजन खपत दर निर्धारित करने के लिए एक समान रूप से वितरित सेल मोनोलेयर महत्वपूर्ण है। यदि सेल वितरण का अवलोकन करते समय कोई महत्वपूर्ण अंतराल मौजूद है, तो गलत ऑक्सीजन खपत दरों की गणना की जाएगी, जिसके परिणामस्वरूप अच्छी तरह से प्रतिकृतियों का उच्च विचरण होगा। इसे ध्यान में रखते हुए, एमएचआरआर अर्ध-स्वचालित है और आवर्ती स्क्रीनिंग के साथ उच्च-थ्रूपुट सेल या छोटे-जीव-आधारित अध्ययन (जैसे, सी।

सीएचआरआर रेस्पिरोमीटर सेटअप ऑक्सीजन के ध्रुवीय माप के साथ दो-कक्ष प्रणाली पर आधारित है। बंद-आधारित प्रणाली में, परिवेश ओ2 श्वसन माध्यम में फैल नहीं सकता है; इस प्रकार, ओ2 एकाग्रता में गिरावट जैविक नमूने की ऑक्सीजन खपत को दर्शाती है। चूंकि सीएचआरआर पोलरोग्राफिक ऑक्सीजन सेंसर ऑक्सीजन की खपत करता है, इसलिए मुक्त ओ2 का प्रसार आवश्यक है, जिससे चैंबर वॉल्यूम (2 एमएल, नए सीएचआरआर डिवाइस 0.5 एमएल) को कम करना मुश्किल हो जाता है और श्वसन माध्यम की एकरूपता सुनिश्चित करने के लिए निरंतर सरगर्मी की आवश्यकता होती है। नतीजतन, पर्याप्त ऑक्सीजन प्रवाह उत्पन्न करने के लिए बड़े नमूना वॉल्यूम की आवश्यकता होती है। कक्षों और मैनुअल अनुमापन तक सीधी पहुंच के कारण, कोई भी श्वसन प्रोटोकॉल अनुकूलनीय है और व्यापक रूप से व्यावसायिक रूप से उपलब्ध रसायनों पर आधारित है जिसके परिणामस्वरूप असाधारण रूप से कम चल रही लागत होती है। इसके अलावा, तदर्थ संचालन एक प्रयोग के दौरान अनुमापन द्वारा एक सूट प्रोटोकॉल को अनुकूलित करने की अनुमति देता है और एकल-समय रोगी-व्युत्पन्न नमूनों में महत्वपूर्ण है। आंशिक स्वचालन एक अनुमापन-इंजेक्शन माइक्रोपंप का उपयोग करके संभव है, जो प्रोग्राम करने योग्य सूट प्रोटोकॉल को सक्षम बनाता है। हालांकि सीएचआरआर डिवाइस प्रति दो नमूनों तक सीमित है, अनुभवी उपयोगकर्ता समानांतर में कई उपकरण चलाएंगे। परख विकास और सॉफ्टवेयर पर्यावरण की बहुमुखी प्रतिभा का लाभ प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य डेटा प्राप्त करने के लिए इन उपकरणों और उपयोगकर्ता-निर्भर रखरखाव (जैसे, पोलरोग्राफिक ऑक्सीजन सेंसर का अंशांकन) को संचालित करने के लिए अधिक विशिष्ट प्रशिक्षण की आवश्यकता के साथ आता है। उन्नत अनुप्रयोगों के लिए, अतिरिक्त मॉड्यूल पीएच रिकॉर्ड करने के लिए सीएचआरआर उपकरणों से जुड़े होते हैं, फ्लोरोसेंट मॉड्यूल सैफ्रानिन30 के माध्यम से झिल्ली क्षमता परख करने के लिए, एच2ओ2 एएमपीईएक्स लाल24 के माध्यम से, और कैल्शियम का स्तर31।

दोनों उपकरणों को विशेष श्वसन मीडिया की आवश्यकता होती है। एमएचआरआर व्यावसायिक रूप से उपलब्ध सीरम मुक्त विकास माध्यम का उपयोग करता है, बाइकार्बोनेट के उपयोग से बचता है, जो कम सीओ 2 स्थितियों के तहत विघटितहोता है और यदि बाह्य अम्लीकरण दर (ईसीएआर) का महत्व है तो आवश्यक है। ग्लाइकोलाइसिस के दौरान, पाइरूवेट लैक्टेट में परिवर्तित हो जाता है, जो लैक्टिक एसिड और प्रोटॉन में अलग हो जाता है। यह बढ़ी हुई प्रोटॉन एकाग्रता पीएच को कम करने का कारण बनती है, जिसे ईसीएआर के रूप में दर्ज किया जाता है। ग्लाइकोलाइसिस तनाव परीक्षण के साथ ईसीएआर का अधिक विस्तृत विश्लेषण संभव है। इस परख बेसल ग्लाइकोलाइटिक दर को मापने के लिए संतृप्त ग्लूकोज के स्तर को जोड़ने के पहले होते हैं। ओलिगोमाइसिन के साथ एटीपी सिंथेज़ कॉम्प्लेक्स के निषेध के बाद, अधिकतम ग्लाइकोलाइटिक दर का पता चलता है। अंतिम चरण 2-डीऑक्सी-ग्लूकोज को इंजेक्ट करके गैर-ग्लाइकोलाइटिक अम्लीकरण को मापना है, जो हेक्सोकिनेज और फॉस्फोग्लूकोज आइसोमेरेज़32 के लिए प्रतिस्पर्धी बंधन के माध्यम से ग्लाइकोलाइसिस को रोकता है। उपलब्ध अन्य किट-आधारित प्रोटोकॉल में ग्लाइकोलाइसिस, फैटी एसिड ऑक्सीकरण और ग्लूटामाइन ऑक्सीकरण शामिल हैं। यहां, हमने बेसल श्वसन, एटीपी-लिंक्ड श्वसन, प्रोटॉन रिसाव, अधिकतम श्वसन, अतिरिक्त श्वसन क्षमता और गैर-माइटोकॉन्ड्रियल श्वसन (चित्रा 4 ए-सी) को मापने के लिए मानक प्रोटोकॉल का उपयोग किया। ग्लाइकोलाइसिस तनाव परीक्षण के साथ संयोजन के रूप में दोनों मानक श्वसन प्रोटोकॉल का उपयोग करने का एक दृष्टिकोण सेलुलर श्वसन का अवलोकन प्रदान करने वाले एरोबिक और एनारोबिक ऊर्जा मार्गों में अंतर्दृष्टि देगा।

सेलुलर बायोएनर्जेटिक्स आमतौर पर माइक्रोप्लेट एमएचआरआर सेटअप के साथ अनुयायी कोशिकाओं में एक्सेस किया जाता है। सेल प्रकार पर निर्भर, पालन के लिए विशेष कोटिंग (जैसे, पॉली-डी-लाइसिन, जिलेटिन, आदि) की आवश्यकता हो सकती है (निलंबन कोशिकाओं के लिए) साथ ही शिथिल अनुयायी कोशिकाओं के लिए क्योंकि वे अच्छी तरह से माप चक्र33 के नीचे से अलग हो सकते हैं। इसके विपरीत, सीएचआरआर माप को निरंतर सरगर्मी की आवश्यकता होती है, जिससे किसी भी जैविक नमूने के लिए श्वसन माप की अनुमति मिलती है। प्रत्येक डिवाइस के लिए, अवरोधक-संवेदनशीलता (खुराक-प्रतिक्रिया घटता) का आकलन करने के लिए ऊतक और सेल लाइनों के लिए अवरोधकों (और सब्सट्रेट) के अनुमापन जैसे अनुकूलन की आवश्यकता होती है। अवरोधक सांद्रता को किसी भी प्रयोगात्मक मॉडल में सबसे कम पूरी तरह से बाधित सांद्रता का उपयोग करने और अविशिष्ट निषेध के साथ-साथ अनावश्यक कक्ष संदूषण को रोकने के लिए परीक्षण किया जाना चाहिए। आम तौर पर, 0.25 μM रोटेनोन, 0.5 μg / एमएल ओलिगोमाइसिन, 0.5 μg / एमएल एंटीमाइसिन अधिकांश अनुप्रयोगों और नमूना मात्रा के लिए पर्याप्त हैं। प्रजनन क्षमता के लिए, पूरे नियोजित प्रयोगों (जैसे, माउस समूह) के लिए पर्याप्त मात्रा में एकल-उपयोग वाली दवाएं तैयार करें और एक विशिष्ट ऊतक या सेल लाइन के भीतर नमूना इनपुट स्थिर रखें। सीएचआरआर में, कक्षों में शेष अवरोधकों के निशान ऑपरेटर को किसी भी संकेत के बिना प्रवाह को बदल देंगे। विशेष रूप से रोटेनोन निशान से बचना मुश्किल है और न्यूनतम कक्ष (और स्टॉपर) सफाई के साथ पर्याप्त धोने की आवश्यकता होती है, जिसमें डीडीएच 2 ओ,2x70% ईटीओएच (96% शुद्धता पर्याप्त), 1 एक्स 100% ईटीओएच, 1 एक्स 70% ईटीओएच के साथ 4 एक्स धोना शामिल है। धोने के लिए उत्तेजक को मोड़ने और ईटीओएच-चरणों को > 5 मिनट तक रखने की आवश्यकता होती है। जीवाणु संदूषण को रोकने के लिए, 70% ईटीओएच को सभी कक्षों में रखा जाता है जब मशीनें उपयोग में नहीं होती हैं। अप्रयुक्त ऊतक लाइसेट के अलावा संभावित अवशिष्ट दूषित पदार्थों को बुझाया जा सकता है। एक एमएचआरआर प्रयोग में, कुछ रसायन आवश्यक एकल-उपयोग प्लास्टिकवेयर34 के साथ बातचीत कर सकते हैं।

पारगम्य प्रोटोकॉल के माध्यम से प्राप्त श्वसन डेटा ईटीएस में अंतर्दृष्टि देता है, जबकि एक बरकरार प्रोटोकॉल माइटोकॉन्ड्रियल युग्मन दक्षता जैसे माइटोकॉन्ड्रियल गुणों में अंतर्दृष्टि प्रदान करता है। दरअसल, सामान्य माइटोकॉन्ड्रियल ऊर्जा गुण एक ही परिणाम दे सकते हैं, लेकिन परिसरों के बीच अंतर्निहित इलेक्ट्रॉन हस्तांतरण को बदला जा सकता है। यह परिवर्तित माइटोकॉन्ड्रियल ऊर्जा चयापचय को प्रतिबिंबित करेगा और श्वसन परिसरों तक पहुंचने के लिए एक पारगम्यप्रोटोकॉल की आवश्यकता होगी। इसी तरह, श्वसन विशेषताओं का आकलन करते समय विभिन्न ऊतक और कोशिकाएं परिवर्तित सब्सट्रेट निर्भरता दिखाती हैं। उदाहरण के लिए, ग्लाइकोलाइटिक मांसपेशी फाइबर को ऊर्जा वितरण के लिए मुख्य रूप से ग्लिसरॉल -3-फॉस्फेट पर भरोसा करने के लिए जाना जाता है, जबकि ऑक्सीडेटिव मांसपेशी फाइबर में एनएडीएच ऑक्सीकरण35,36 से दो गुना अधिक इलेक्ट्रॉन हस्तांतरण क्षमता होती है। उसी नोट पर, हृदय माइटोकॉन्ड्रिया, यकृत, भूरे वसा ऊतक एटीपी को संश्लेषित करने के लिए फैटी एसिड का उपयोग कर सकते हैं, और बदले में, मस्तिष्क कीटोन निकायों का उपयोग कर सकता है, मुख्य रूप से फैटी एसिड ऑक्सीकरण36,37,38 द्वारा गठित किया जाता है। इसलिए, माइटोकॉन्ड्रियल विशेषताओं का निर्धारण करने के लिए मानक ग्लूकोज-निर्भर श्वसन के विपरीत एक समग्र दृष्टिकोण की आवश्यकता होती है। एमएचआरआर में आमतौर पर बरकरार अनुयायी कोशिकाओं का आकलन शामिल होता है, हालांकि पारगम्यता प्राप्त करने योग्य है (उदाहरण के लिए, उत्परिवर्ती पुनः संयोजक परफ्रिंगोलिसिन ओ जो चुनिंदा रूप से कोशिका झिल्ली39 को पारगम्य बनाता है)। हालांकि, ये विधियां चार इंजेक्शन बंदरगाहों की सीमा के कारण बढ़ी हुई जटिलता के साथ आती हैं। इसके विपरीत, सही ढंग से गैर-रेशेदार ऊतक लाइसेट्स और किसी भी सेल प्रकार आमतौर पर सीएचआरआर के लिए समस्या मुक्त होते हैं। आम तौर पर, एमएचआरआर के साथ ऊतक परख करना संभव नहीं है; हालांकि, एक ऊतक से पृथक माइटोकॉन्ड्रिया का उपयोग करने वाले दृष्टिकोण40,41 स्थापित किए गए हैं।

ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि पूरे प्रोटीन सामग्री के लिए सामान्यीकरण पूर्ण माइटोकॉन्ड्रियल मात्रा की उपेक्षा करता है। विभिन्न उपचारों के तहत प्रयोगात्मक समूहों की तुलना काफी भिन्न हो सकती है (उदाहरण के लिए, 30 दिन उच्च प्रोटीन आहार-खिलाया चूहों ने यकृत42 में माइटोकॉन्ड्रियल सामग्री में 2.5 गुना वृद्धि दिखाई), विशेष रूप से इंट्रासेल्युलर लिपिड संचय जैसे भूरे रंग के वसा ऊतक, यकृत और कंकाल की मांसपेशियों के लिए अतिसंवेदनशील ऊतक में। इन स्थितियों में, माइटोकॉन्ड्रियल द्रव्यमान के लिए सन्निकटन के रूप में कई माइटोकॉन्ड्रियल मार्करों का आकलन करने की भी सिफारिश की जाती है, जैसे कि एमटीडीएनए कॉपी नंबर43, साइट्रेट सिंथेज़ गतिविधि10, और सर्वव्यापी माइटोकॉन्ड्रियल प्रोटीन (जैसे, वीडीएसी 1, टीओएम 20)। संयोजन में, यह आसवन करने की अनुमति देता है कि क्या एक परिवर्तित श्वसन समारोह माइटोकॉन्ड्रियल मात्रा, गुणवत्ता, अखंडता या उसके संयोजन के लिए जिम्मेदार है। इसका एक अन्य पूरक तरीका एफसीआर का कार्यान्वयन है एफसीआर माइटोकॉन्ड्रियल सामग्री से स्वतंत्र विभिन्न श्वसन राज्यों में अंतर्दृष्टि प्रदान करते हैं। एफसीआरएडीपी प्राप्त करता है कि क्या परिवर्तित लीक या ऑक्सफोस माइटोकॉन्ड्रिया की दक्षता को फॉस्फोराइलेट एडीपी में बदलते हैं। एफसीआरराज्य 3 (I) दर्शाता है कि नमूना जटिल II की तुलना में जटिल I पर किस हद तक निर्भर है। एफसीआरराज्य 3 (द्वितीय) ईटीएस के साथ सक्सीनेट-निर्भर श्वसन की तुलना करता है और जटिल द्वितीय से प्राप्त माइटोकॉन्ड्रियल श्वसन के लिए एक सूचकांक प्रदान करता है। एफसीआर युग्मित / अयुग्मित एक अनुपात है जो ओएक्सपीएचओएस और ईटीएस के बीच युग्मन नियंत्रण प्रदान करता है, जिसमें 1 का अनुपात कोई अतिरिक्त श्वसन क्षमता नहीं बचता है। माइटोकॉन्ड्रियल बाहरी झिल्ली अखंडता का आकलन बहिर्जात साइटोक्रोम सी के अलावा के माध्यम से किया जा सकता है। साइटोक्रोम सी इंटरमेम्ब्रेन स्पेस में स्थानीयकृत है, जहां यह जटिल III और जटिल IV के बीच इलेक्ट्रॉनों के हस्तांतरण की सुविधा प्रदान करता है। यदि बाहरी माइटोकॉन्ड्रियल झिल्ली क्षतिग्रस्त हो जाती है, तो साइटोक्रोम सी माइटोकॉन्ड्रिया से बाहर निकलता है, अब श्वसन में योगदान नहीं देता है। इस असंतुलन को बहाल करना बहिर्जात साइटोक्रोम सी के अलावा के माध्यम से प्राप्त किया जा सकता है, जिसके परिणामस्वरूप श्वसन में वृद्धि होती है (चित्रा 1 ए, डी; 5 बी)। जटिल चतुर्थ गतिविधि को ओएक्सपीएचओएस के पूर्ण निषेध के बाद टीएमपीडी के साथ व्यक्तिगत रूप से मापा जाता है। बेसलाइन ओ2 प्रवाह में गिरावट आएगी क्योंकि ओ2 एकाग्रता गिरजाती है क्योंकि टीएमपीडी ऑक्सीकरण ओ2 एकाग्रता-निर्भर है। इसलिए आरओएक्स मूल्यांकन के बाद, सभी कक्षों को समान ऑक्सीजन स्तर (150 μM) तक ऑक्सीजन दिया जाता है। एजाइड के अलावा के बाद सिग्नल से डेटा बिंदुओं के रैखिक प्रतिगमन का उपयोग जटिल चतुर्थ गतिविधि परख के रासायनिक और ओ2-निर्भर पृष्ठभूमि को प्रक्षेपित करने के लिए किया जा सकता है। गैर-माइटोकॉन्ड्रियल ऑक्सीजन की खपत के लिए सही करने के लिए आरओएक्स मूल्यों को सभी श्वसन मूल्यों से घटाया जाना चाहिए।

जैविक रूप से, पृथक माइटोकॉन्ड्रिया के मामले में आरओएक्स पारगम्य या बरकरार कोशिकाओं / ऊतक की तुलना में कम हो सकता है। सामान्य तौर पर, अवशिष्ट श्वसन ऑक्सीडेज एंजाइमों की गतिविधि के कारण होता है, कोशिकाओं और ऊतकों में पृथक माइटोकॉन्ड्रिया44 की तुलना में अधिक ऑटोक्सीडाइजेबल पदार्थ होते हैं। इसके अलावा, इंट्रासेल्युलर झिल्ली संरचनाओं के साथ अभी भी बरकरार है, कोशिका झिल्ली के माध्यम से प्रवेश करने के लिए ऑक्सीजन की कठिनाई इसके नकारात्मक चार्ज के कारण बढ़ जाती है। नतीजतन, सेलुलर झिल्ली के माध्यम से प्रसार और ऑक्सीजन की इंट्रासेल्युलर उपलब्धता प्रभावित हो सकती है, जिसके परिणामस्वरूप आरओएक्स होता है। हालांकि, माइटोकॉन्ड्रियल के अलगाव को माइटोकॉन्ड्रियल आकृति विज्ञान को बाधित करने, माइटोकॉन्ड्रियल हाइड्रोजन पेरोक्साइड उत्पादन में वृद्धि करने के साथ-साथ परिवर्तित माइटोकॉन्ड्रियल श्वसन समारोह45 के साथ दिखाया गया है। जबकि कार्यात्मक माइटोकॉन्ड्रिया का अलगाव विशिष्ट सामान्यीकरण की अनुमति देता है और कुछ स्थितियों में इसकी आवश्यकता हो सकती है, अलगाव प्रक्रिया समय लेने वाली है, आमतौर पर अधिक सामग्री की आवश्यकता होती है, और माइटोकॉन्ड्रियल विषमता को संरक्षित नहीं कर सकती है। इस कारण से, हमने इस अध्ययन में माइटोकॉन्ड्रियल अलगाव को शामिल करने से परहेज किया है। हालांकि, कंकाल या हृदय की मांसपेशियों के लिए, श्वसन माप के लिए माइटोकॉन्ड्रिया या फाइबर के सैपोनिन-उपचार का अलगाव आवश्यक है। चूंकि इच्छामृत्यु के बाद ऑटोलाइटिक प्रक्रियाएं बहुत जल्दी होती हैं, इसलिए तेजी से ऊतक निष्कर्षण और व्यक्तिगत प्रयोगों के बीच तैयारी के लिए तुलनीय समय का पालन करने की सिफारिश की जाती है।

हमारे प्रयोगों में, स्तनधारी कोशिकाओं के माइटोकॉन्ड्रियल श्वसन समारोह के मूल्यांकन ने दोनों एचआरआर उपकरणों के साथ तुलनीय परिणाम दिए। हालांकि, एमएचआरआर की तुलना में सीएचआरआर के लिए बेसल श्वसन अधिक था। कई तकनीकी पहलुओं (चैंबर वॉल्यूम, सरगर्मी और अलग-अलग सिग्नल एकीकरण) के अलावा, जैविक कारण जैसे परिवर्तित श्वसन माध्यम, सेल कटाई का समय और सेल संपर्क के नुकसान के कारण गैर-संलग्न कोशिकाएं मनाए गए मतभेदों को भड़का सकती हैं। नतीजतन, सामान्य रूप से श्वसन प्रोटोकॉल और व्यक्तिगत सब्सट्रेट और अवरोधक सांद्रता प्रस्तुत कारणों के लिए सिस्टम के बीच विनिमेय नहीं हैं, जो प्रकृति में तकनीकी हो सकते हैं (उदाहरण के लिए, अनुमापन) और आम तौर पर अलग-अलग परख अभिकर्मक (जैसे, श्वसन मीडिया, कांच या पॉलिमर के रासायनिक अवशोषण)। उच्चतम प्रजनन क्षमता सुनिश्चित करने के लिए, कई तकनीकी विचारों और सिफारिशों में (i) क्रॉस-संदूषण या फ्रीज-पिघलना चक्रों को कम करने के लिए एकल-उपयोग विभाज्य का उपयोग, (ii) सभी रसायनों का उचित भंडारण (उदाहरण के लिए, लंबे समय तक स्थिरता के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर एडीपी, अंधेरे में ताजा और हल्के संवेदनशील रसायनों को तैयार पाइरूवेट), (iii) प्रभावकारिता के लिए रसायनों का नियमित और कठोर पुन: परीक्षण (उदा। भंडारण प्रेरित टीएमपीडी गतिविधि हानि) और (iv) किसी भी ट्रेस रासायनिक को हटाने के लिए व्यापक सफाई। अनुदैर्ध्य अध्ययन (कई वर्षों से अधिक) की प्रजनन क्षमता पर विचार करने के लिए डिवाइस के प्रदर्शन की निगरानी और समय के साथ अभिकर्मकों की स्थिरता सुनिश्चित करने की आवश्यकता होगी।

अंत में, रूथेनियम ऑक्साइड-आधारित इलेक्ट्रोड के माध्यम से संयुक्त पोटेंशियोमेट्रिक (पीएच) और एम्परोमेट्रिक (ओ 2) मापपर आधारित उपन्यास प्रौद्योगिकी वर्तमान उपकरणों में एक प्रतिमान बदलाव को उत्प्रेरित कर सकती है, जिससे संस्कृति में और विवो46 में सेलुलर चयापचय का अध्ययन करने की अनुमति मिलती है। यद्यपि वर्तमान विधियां मुख्य रूप से पूर्व विवो और सेलुलर चयापचय के इन विट्रो मूल्यांकन की अनुमति देती हैं, विलंबित प्रतिदीप्ति माइटोकॉन्ड्रियल फ़ंक्शन47 के उपाय के रूप में माइटोकॉन्ड्रियल ऑक्सीजन के विवो विश्लेषण में सक्षम बनाती है। इसी तरह, माइक्रोफ्लुइडिक्स-आधारित श्वसनमिति उच्च संवेदनशीलता में वादा दिखाती है, केवल कुछ सौ कोशिकाओं की आवश्यकता होतीहै 48. जबकि नई पद्धतियां क्षितिज पर हैं, आज तक, उच्च-रिज़ॉल्यूशन रेस्पिरोमेट्री सेलुलर श्वसन क्षमता का आकलन करने के लिए स्वर्ण मानक बनी हुई है, जिसके लिए सर्वोत्कृष्ट प्रोटोकॉल यहां प्रदान किए जाते हैं, माइटोकॉन्ड्रियल श्वसन का अध्ययन करने के लिए अधिकांश कोशिकाओं, ऊतकों और जीवों पर लागू होते हैं।

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Disclosures

खुलासा करने के लिए हितों का कोई टकराव नहीं।

Acknowledgments

इस काम को फिनलैंड अकादमी (सीबीजे), मैग्नस एर्नरोट फाउंडेशन (सीबीजे), और इंटीग्रेटेड लाइफ साइंसेज ग्रेजुएट स्कूल (आरए) की डॉक्टरेट फैलोशिप से वित्त पोषण द्वारा समर्थित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2 mL Potter-Elvehjem Glass/PTFE Tissue Grinder/Homogenizer Omni International 07-358029
95% O2, 5% CO2 medical gas mixture Potter for tissue grinding
ADP Sigma A 4386
Antimycin A Sigma A 8674 Chemical
Ascorbate Merck PHR1279-1G Chemical, dissolve in ethanol
BSA (fatty accid free) Sigma A 6003 Chemical
CaCO3 Sigma C 4830 Chemical
Cytochrome c Sigma C 7752 Chemical
Digitonin Sigma D 5628 Chemical
Dithiothreitol Sigma D 0632 Chemical, dissolve in DMSO
D-Sucrose Roth 4621.1 Chemical
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (High glucose) Fisher Scientific 41965-039 Chemical
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (No Glucose) Fisher Scientific A14430-01
EGTA Sigma E 4378
Etomoxir Sigma E1905 Chemical
Falcon 15 ml Conical Centrifuge Tubes Fisher Scientific AM12500 Chemical
Falcon 50 ml Conical Centrifuge Tubes Fisher Scientific AM12501
FCCP Sigma C 2920
Glucose Sigma G7021 Chemical, dissolve in ethanol
Glutamate Sigma G 1626 Chemical
GlutaMax (100x) (200 nM L-alanyl-L-glutamine dipeptide) Fisher Scientific 35050061 Chemical
HEK293 cells ATTC CRL-1573
Hemocytometer Fisher Scientific 0267151B Instrument for cell counting
Hepes Sigma H 7523 Chemical
Imidazole Fluka 56750 Chemical
KCl Merck 1.04936 Chemical
L-carnitine Sigma C0283 Chemical
Malate Sigma M 1000 Chemical
MES hydrate Sigma M8250 Chemical
MgCl2 Sigma M 9272 Chemical
Na2ATP Sigma A 2383 Chemical
Na2Phosphocreatine Sigma P 7936 Chemical
Na-pyruvate (100 mM) (100x) Fisher Scientific 11360070
NEAA (Non-essential amino acids) 100x Fisher Scientific 11140035
Normal FBS (10x) Fisher Scientific 10500064
O2k-Core: Oxygraph-2k Oroboros Instruments 10000-02 High-resolution respirometry instrument
O2k-Titration Set Oroboros Instruments 20820-03 Hamilton syringes for chemical injections
Oligomycin Sigma O 4876 Chemical, dissolve in ethanol
Palmitoylcarnitine Sigma P 4509 Chemical
Penicillin-Streptomycin Fisher Scientific 15140122
Pierce BCA Protein Assay Kit Fisher Scientific 23227
Pyruvate Sigma P 2256 Chemical
RIPA-Buffer Fisher Scientific 89900 Chemical
Rotenone Sigma R 8875 Chemical, dissolve in ethanol
Saponin Sigma S7900 Chemical

Seahorse XF DMEM assay medium pack, pH 7.4
Agilent, Santa Clara, CA		 103680-100
Seahorse XFe96 Extracellular Flux Analyzer
Agilent, Santa Clara, CA		 High-throughput respirometry instrument
Seahorse XFe96 FluxPak
Agilent, Santa Clara, CA
Includes assay plates, cartridges, loading guides for transferring compounds to the assay cartridge, and calibrant solution.
Small scissors Fisher Scientific 08-951-20
Sodium azide Sigma S2002 Chemical
Succinate Sigma S 2378 Chemical
Taurine Sigma T 8691 Chemical
TMPD Sigma T 3134 Chemical
Trypan Blue solution Merck 72-57-1 Chemical
Trypsin 0.25% EDTA Fisher Scientific 25200056
Two thin-edged forceps Fisher Scientific 12-000-122
Uridine stock (500x) Sigma U3750 Chemical

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जीव विज्ञान अंक 176 माइटोकॉन्ड्रियल बायोएनर्जेटिक्स श्वसन श्रृंखला माइटोकॉन्ड्रियल रोग ऑक्सीडेटिव फॉस्फोराइलेशन फ्लक्स विश्लेषक बाह्य प्रवाह एचईके 293 ऑक्सीजन की खपत माइटोकॉन्ड्रियल अनुवाद
चैंबर- और प्लेट-आधारित रेस्पिरोमीटर का उपयोग करके कोशिकाओं और ऊतकों में बायोएनर्जेटिक्स का आकलन करने के लिए उच्च-रिज़ॉल्यूशन रेस्पिरोमेट्री
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Awadhpersad, R., Jackson, C. B. High-Resolution Respirometry to Assess Bioenergetics in Cells and Tissues Using Chamber- and Plate-Based Respirometers. J. Vis. Exp. (176), e63000, doi:10.3791/63000 (2021).

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