Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Högupplöst respirometri för att bedöma bioenergetik i celler och vävnader med hjälp av kammar- och plattbaserade respirometrar

Published: October 26, 2021 doi: 10.3791/63000
Automatic Translation
1, 1
1Department of Biochemistry and Developmental Biology, Faculty of Medicine, University of Helsinki

Summary

Att bedöma oxidativ fosforylering med hjälp av högupplösta respirometrar har blivit en integrerad del av den funktionella analysen av mitokondrier och cellulär energimetabolism. Här presenterar vi protokoll för analys av cellulär energimetabolism med hjälp av kammar- och mikroplattbaserade högupplösta respirometrar och diskuterar de viktigaste fördelarna med varje enhet.

Abstract

Högupplöst respirometri (HRR) möjliggör övervakning av oxidativ fosforylering i realtid för analys av enskilda cellulära energitillstånd och bedömning av andningskomplex med hjälp av diversifierade substrat-uncoupler-inhibitor-titreringsprotokoll (SUIT). Här demonstreras användningen av två högupplösta respirometrianordningar, och en grundläggande samling protokoll som är tillämpliga för analys av odlade celler, skelett- och hjärtmuskelfibrer och mjuka vävnader som hjärna och lever presenteras. Protokoll för odlade celler och vävnader tillhandahålls för en kammarbaserad respirometer och odlade celler för en mikroplattbaserad respirometer, som båda omfattar standardandningsprotokoll. För jämförande ändamål används CRISPR-konstruerade HEK293-celler som saknar mitokondriell översättning som orsakar multipel andningsbrist med båda enheterna för att visa cellulära defekter i andningen. Båda respirometrarna möjliggör omfattande mätning av cellulär andning med sina respektive tekniska fördelar och lämplighet beroende på forskningsfrågan och modellen som studeras.

Introduction

Mitokondrier uppfyller den viktigaste energiförsörjningen och är en uppdelad organell som bidrar till väsentliga cellulära bioenergetiska och metaboliska processer såsom anabolism av nukleotider, lipider och aminosyror, järn-svavelklusterbiogenes och är inblandade i signalering såsom kontrollerad celldöd 1,2,3 . Mitokondriell bioenergetik genom oxidativ fosforylering bidrar till nästan alla cellulära processer i cellen, och följaktligen är mitokondriella dysfunktioner av primärt eller sekundärt ursprung associerade med ett brett spektrum av sjukdomstillstånd 4,5. Mitokondriell dysfunktion innebär inte bara förändringar i struktur eller mitokondriell densitet utan också i andningsorganens kvalitet och reglering6. Detta kvalitativa element omfattar substratkontroll, kopplingsegenskaper, post-translationella modifieringar, cristae-dynamik och respiratoriska superkomplex 7,8. Därför är noggrann analys av mitokondriell bioenergetik för experimentella och diagnostiska metoder för att bedöma cellens energimetabolism viktig för hälsa och sjukdom.

Mitokondriell oxidativ fosforylering (OXPHOS) är en sekvens av reaktioner i andningsorganen eller elektronöverföringssystemet (ETS) för generering av cellulär energi genom adenosintrifosfat (ATP)9. Det multienzymatiska steget att utnyttja energi från elektronflöde genom komplex I och II till komplex IV genererar en elektrokemisk protongradient över det inre mitokondriella membranet, som därefter används för fosforylering av adenosindifosfat (ADP) till ATP via komplex V (F1FO ATP-syntas) (Figur 1A).

Först genereras tvåelektronbärare under trikarboxylcykeln (TCA), glykolys och pyruvatoxidation: nikotinamidadenindinukleotid (NADH) och dihydroflavinadenindinukleotid (FADH2). NADH oxideras vid komplex I (NADH-dehydrogenas), under vilken två elektroner överförs till koenzym Q (kinon reduceras till kinnol), medan protoner pumpas in i intermembranutrymmet (IMS). För det andra oxiderar komplex II (succinatdehydrogenas)FADH2 och matar elektronerna till koenzym Q utan att pumpa protoner. För det tredje, vid komplex III (Cytokrom c-oxidoreduktas), överförs elektroner från koenzym Q till cytokrom c medan protoner pumpas in i IMS. För det fjärde överför cytokrom c elektronerna till komplex IV (Cytokrom c-oxidas), det sista komplexet för att pumpa protoner, och där syre fungerar som en elektronacceptor för att assimilera protoner och i slutändan bilda vatten. Det är detta syre som mitokondrier förbrukar som kan mätas med en oxygraf. Slutligen används protonerna som genereras från komplex I, komplex III och komplex IV för att rotera komplex V och därigenom genereraATP9.

Viktigt är att elektronöverföring inte bara sker linjärt, annars betecknat som elektrontransportkedjan. Istället kan elektroner överföras till koenzym Q-poolen genom flera andningsvägar och underlätta konvergent elektronflöde. NADH-substrat och succinat kan till exempel komma in via komplex I respektive komplex II. Elektroner från fettsyraoxidation kan doneras via det elektronöverförande flavoproteinkomplexet. Faktum är att en omfattande analys av OXPHOS kräver en helhetssyn med lämpliga bränslesubstrat (figur 1A).

Figure 1
Figur 1: Mitokondriell oxidativ fosforylering och specifika substrat- och inhibitorprotokoll. Alla strukturer är från PDB. Siffrorna visar endast substrat och hämmare som beskrivs i denna studie). (B) Provspår av syreflöde i intakta HEK293-celler med hjälp av standardprotokoll i en mHRR-enhet. (C) Provspår av syreflöde i intakta HEK293-celler med hjälp av standardprotokoll i en cHRR-enhet. (D) Provspår av syreflöde i permeabiliserade humana fibroblaster från en frisk donator med respektive SUIT-protokoll. Förkortningar: 1 = Rutinmässig andning av intakta celler; 2 = Tillstånd 2; 3 = Tillstånd 3(I); 4 = Tillstånd 3(I) med cytC; 5 = Tillstånd 3 (I+II); 6 = Läcka (OM); 7 = ETS-kapacitet; 8 = S(ROT); 9 = ROX; 10 = TMPD; ROT = Rotenon, AM = Antimycin, ATP = Adenosintrifosfat, Az = Azid, OM = Oligomycin, FCCP = Karbonylcyanid p-trifluor-metoxifenyl-hydrazon; Asc = Askorbat, TMPD = N,N,N′,N′-tetrametyl-p-fenylendiamin, Succ = Succinat, M = Malat, P = Pyruvat, ADP = Adenosindifosfat, NAD = Nikotinamidadenindinukleotid, IMS = Intermembranutrymme, FAD = Flavinadenindinukleotid. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Analys av mitokondriell OXPHOS-kapacitet med HRR har blivit en instrumentell biokemisk metod för diagnostiskt värde, inte bara för primära mitokondriella defekter 10,11 utan sträcker sig till alla andra områden av biologi som cancer och åldrande12. HRR möjliggör bestämning av cellulär andning genom analys av mitokondriell OXPHOS-kapacitet, som direkt återspeglar individuell eller kombinerad mitokondriell respiratorisk komplexbrist och indirekt är associerad med cellulär dysfunktion och förändrad energimetabolism9. Metodologiskt utförs andningsmätningar med celler, vävnad eller isolerade mitokondrier 11,13,14, med fryst material endast delvis lämpligt15,16. Fryst vävnad har visat sig ha en intakt ETS med bibehållen superkomplex stabilitet15. Således, i motsats till traditionella TCA-intermediärer, matas respektive substrat direkt in i ETS. Kopplingen mellan ETS- och ATP-syntesen går dock förlorad eftersom membranintegriteten äventyras genom frysskador (iskristallbildning).

Andningsförsök äger normalt rum vid en fysiologisk temperatur på 37 °C för endotermer i antingen icke-permeabiliserade eller permeabiliserade celler eller vävnader. Medan den förra betraktar det cytosoliska metaboliska sammanhanget, ger det senare det energiska bidraget från enskilda OXPHOS-komplex och ATPas genom tillsats av specifika substrat (och hämmare). Sekvensen och variationen av substrat och hämmare har lett till utvecklingen av ett varierat utbud av SUIT-protokoll17 och analyser18 för att ta itu med olika vetenskapliga frågor om OXPHOS-funktion (granskad under12). Det grundläggande protokollet för cellulär andning bedömer fyra olika tillstånd: i) rutinmässig andning - andningen i respektive andningsmedium utan tillsats av substrat eller hämmare som konsumerar men endogena substrat. Detta tillstånd kan avslöja allmänna OXPHOS eller sekundärinducerade andningsdefekter orsakade av exempelvis förändrade metabolitprofiler. Därefter avslöjar tillsatsen av ATPas-hämmaren oligomycin permeabiliteten hos det inre mitokondriella membranet till protoner, definierat som ii) läckageandning. Efterföljande titrering av en protonofor, såsom den ocoupler karbonylcyanid p-trifluor-metoxifenyl-hydrazon (FCCP) gör det möjligt att bestämma det tillstånd vid vilket ETS-kapaciteten är maximal i ett öppet transmembran protonkretsläge, definierat som iii) okopplad andning. Viktigt är att ett frikopplat tillstånd också kan uppstå genom experimentella ingrepp genom överdriven mekanisk skada på mitokondriella membran. Omvänt hänvisar det icke-kopplade tillståndet till andningslöskoppling genom en inneboende mekanism som är fysiologiskt kontrollerad. Slutligen bestämmer fullständig hämning av ETS genom tillsats av den komplexa III-hämmaren antimycin och komplex I-hämmare rotenon återstående syreförbrukning (ROX) från icke-mitokondriella syrekrävande processer (figur 1A-C).

Mitokondriell bioenergetik består av fem distinkta andningstillstånd19,20. Tillstånd 1 andning är utan några ytterligare substrat eller ADP, förutom vad som är endogent tillgängligt. Efter tillsats av ADP, men fortfarande, inga substrat, uppnås tillstånd 2 andning. När substrat tillsätts, vilket möjliggör elektronöverföring och ATP-syntes, uppnås tillstånd 3-andning. I detta tillstånd kan OXPHOS-kapacitet definieras vid mättande koncentrationer av ADP, oorganiskt fosfat, syre, NADH- och succinatbundna substrat. Tillstånd 4 andning eller LEAK-andning kan definieras som ett tillstånd utan ADP eller kemiskt hämmade ATP-syntaser samtidigt som det har tillräckligt med substrat. Slutligen, när allt syre är utarmat (anoxiskt) i en sluten kammare, observeras tillstånd 5 andning.

Flera metoder finns för att bedöma cellulära energitillstånd14 med två enheter som dominerar den nuvarande realtidsbedömningen av OXPHOS genom analys av syreförbrukning, mätt som funktionen av minskningen av syre över tid i ett slutet kammarsystem med olika tillämplighet beroende på experimentell modell och forskningsfråga: Oroboros 2k högupplöst respirometer och Seahorse XF extracellulär flödesanalysator. Båda enheterna registrerar syreförbrukningshastigheterna som en minskning av picomoles (pmol) syre (O2) per sekund som ett absolut värde i kammaren eller mikroplattbrunnen. Den specifika syreförbrukningen per massa erhålls genom att normalisera respektive syreförbrukning i ett specifikt buffertrecept per antal celler (miljoner), vävnadsvikt (mg) eller proteinmängd.

O2k (Oroboros Instruments) är ett slutet tvåkammarsystem utrustat med en polarografisk syresensor (förkortad som kammarbaserad högupplöst respirometer: cHRR). Varje försökskammare rymmer 2 ml vätska som hålls homogen med magnetomrörare. Den polarografiska syresensorn använder ett amperometriskt tillvägagångssätt för att mäta syret: den innehåller en guldkatod, en silver/ silverkloridanod och däremellan en KCI-lösning som skapar en elektrokemisk cell på vilken en spänning (0,8 V) appliceras. Syre från analysmediet diffunderar genom ett 25 μm fluorerat etylenpropylenmembran (O2-permeabelt) och genomgår reduktion vid katoden och producerar väteperoxid. Vid anoden oxideras silver av väteperoxid, vilket genererar en elektrisk ström. Denna elektriska ström (ampere) är linjärt relaterad till det partiella syretrycket. Partialtrycket av syre och syrelöslighetsfaktorn för analysmediet används för att beräkna syrekoncentrationen. Eftersom syredeltrycket är beroende av experimentell temperatur och polarografiska mätningar är temperaturkänsliga, behöver temperaturfluktuationer exakt (±0,002 °C) reglering av ett Peltier-värmeblock. Temperaturen kan styras inom ett intervall på 4 °C och 47 °C.

Seahorse XF extracellulär flödesanalysator (Agilent) är ett plattbaserat system med 24- eller 96-brunns mikroplattformat där tre fluorescenselektroder mäter syreförbrukningen över tid i varje brunn (förkortat mikroplattbaserad högupplöst respirometer: mHRR). Högst fyra portar i analyskassetten är tillgängliga för automatisk injektion under analysen. En analys innehåller flera cykler, var och en med tre faser: 1) blandning, 2) väntan och 3) mätning. Under mätfasen sänks sensorprober ner i mikroplattan och skapar en tillfälligt sluten kammare innehållande 7-10 μL volym för att mäta utsänt ljus. Detta ljus avges av polymerinbäddade fluoroforer på spetsen av sensorproberna, som känner avO2 baserat på fosforescenskylning. Intensiteten hos fluorescenssignalen är proportionell motO2 och påverkas av sensorns och analysmediets temperatur. Därför kräver noggrann syreuppskattning ett relativt tillvägagångssätt med en bakgrundsbrunn utan något prov. Återställning av syrekoncentrationen sker under blandningsfasen när sensorn rör sig upp och ner för att blanda volymen ovanför den tillfälliga kammaren. Varje cykel beräknar en syreförbrukningshastighet. Temperaturen kan styras inom ett intervall på 16 °C och 42 °C.

HRR är guldstandarden för att bedöma cellulär bioenergetik vid primära och mitokondrier-associerade sjukdomar och allmän cellulär metabolism. I denna studie tillhandahålls grundläggande protokoll för HRR för att bedöma OXPHOS-funktionen i celler och vävnader.

Figure 2
Figur 2: Arbetsflöde för cell- och vävnadspreparat för cHRR och cellberedning för mHRR-respirometri. (B) Däggdjursceller (steg 1.2): HEK293 pellet som motsvarar 3 x 106 celler (vänster panel). Icke-fibrös vävnad (steg 1.3): Beredning av murin cerebellumlysat i 2 ml teflon keramiker (mittpanel). Saponininducerad skelettmuskelpermeabilisering (steg 1.4) höger panel) för cHRR-respirometri. (C) Standardutsåddslayout för mikroplattor (steg 2.4) och sammanflödeskontroll för analys av eukaryota celler (HEK293) för mHRR-respirometri. (D, E) Schema för insprutningsportbelastning för mHRR-respirometri (steg 2.4). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alla djurförsök utförs i enlighet med Djurförsöksnämnden och Regionförvaltningsverket i Södra Finland. Manliga C57BL/6JOlaHsd möss (4-6 månader gamla) användes i denna studie. Samtycke till användning av mänskliga cellinjer erhölls från Helsingfors universitets institutionella etikkommitté.

1. Högupplöst respirometri: Kammarbaserad respirometer (cHRR)

OBS: Experimenten i detta avsnitt av protokollet utfördes med hjälp av Oroboros O2k-Core: Oxygraph-2k (Materialtabell)

  1. Kalibrering av syresensorer
    1. Pre-run respirometrar vid 37 °C i 2,1 ml mitokondriellt andningsmedium (MiR05, tabell 1, löslighetsfaktor: 0,92) för >45 min och utför syrekalibrering enligt beskrivningen21. Fortsätt om baslinjevariationen ligger inom ± 4 pmol/s.
      OBS: Stora fluktuationer i bakgrundssignalen kan indikera nödvändigt underhåll av sensormembranet eller spår av hämmare kvar i kammaren från tidigare experiment. En instrumentell bakgrundssyreflödeskorrigering rekommenderas före en sats experiment25.
    2. Registrera syrekalibreringsvärden för att övervaka sensormembranets prestanda över tid.
      OBS: Detta avslöjar sensorfunktion, signal-brusstabilitet och när sensormembranunderhåll krävs. Beroende på omgivningstryck solubiliseras mellan 180-200 μmol syre i MiR05.
    3. Avlägsna all vätska i kammaren innan något prov tillsätts i andningsmediet.
      OBS: Utvärdera volymen av andningskamrarna till exakt 2 ml regelbundet.
  2. Framställning av celler för högupplöst respirometri
    1. Odla HEK293-celler i 10 cm2-diameter i Dulbeccos Modified Eagle's medium (DMEM) med hög glukos kompletterad med 10% värmeinaktiverat fetalt bovint serum (FBS), GlutaMax, icke-essentiella aminosyror och Na-Pyruvate22 och uridin23 för att stödja OXPHOS-defekt metabolism i en inkubator vid 37 ° C vid 5% CO2.
      OBS: Alla typer av eukaryota celler kan odlas. För de flesta celltyper leder odling av en 10 cm2 skål till tillräckliga celler (vanligtvis >3 x 106 celler). Kontrollera rutinmässigt om det finns mykoplasmainfektion för att undvika effekter på cellulär metabolism och andning.
    2. Växa celler utan att överstiga 90% sammanflöde (Figur 2C).
      OBS: Celler med >90% sammanflöde kan visa tillväxtberoende hämmande effekter på andning (om de inte är synkroniserade eller post-mitotiska).
    3. Tvätta cellerna med 1x PBS, lossa med 1 ml varmt 0,25% trypsin, inaktivera trypsin genom att tillsätta varm DMEM (5 ml /10 cm2 platta) och räkna cellerna med en hemocytometer.
    4. Centrifugera försiktigt celllösningen som motsvarar 2,5 x 106 celler vid 300 x g i 5 minuter, avlägsna supernatanten helt och återsuspendera i 2,5 ml varm MiR05 (1 x 106 celler/ml) (figur 2A).
    5. För suspensionsceller, räkna och avlägsna lösning som motsvarar 2,5 x 106 celler, pellet och fortsätt enligt beskrivningen i steg 1.2.4.
    6. Kör SUIT-protokollet för permeabiliseringsoptimering (steg 1.6), permeabiliserad cell eller vävnad (steg 1.5) eller intakta celler (steg 1.7)
      OBS: För konsekventa resultat rekommenderas att cellkoncentrationen hålls konstant (t.ex. 1 x 106 celler / ml). Även om andningen är oberoende av celltätheten i respirometern24, är substrat och hämmare i jämförbar koncentration under experiment om cellantalet hålls konstant.
  3. Beredning av icke-fibrös vävnad (t.ex. hjärna, lever) för högupplöst respirometri
    1. Skär ut en homogen bit vävnad, 30-40 mg i vikt, eller använd hela organet (mus cerebellum i detta fall).
      OBS: Om vävnad inte används omedelbart, förvara i 2 ml iskall MiR05 vilket möjliggör konservering i upp till 2 timmar för de flesta vävnader. Individuella vävnadslagringstider måste bedömas i tidsserier.
    2. Torka av vävnaden med ett Whatman-filterpapper (försiktigt: mjukvävnadsmaterial tenderar att fastna).
    3. Placera vävnadsbiten på 30-40 mg i en iskyld 2 ml polytetrafluoretylenker Elvehjem homogenisator.
    4. Tillsätt en lämplig mängd MiR05 för att erhålla 20 mg/ml för att bibehålla förhållandet mellan vävnad och buffert. Håll den totala mängden >1,5 ml och <2 ml för att undvika otillräcklig eller överdriven vätska för lämplig mekanisk permeabilisering.
    5. Sätt i stöten, lysera vävnaden långsamt genom att dra tillbaka stöten försiktigt samtidigt som du undviker att ett vakuum bildas som orsakar överdriven vävnadsskada.
    6. Utför totalt 7 slag (1x definierat som ett upp- och nedåtgående slag) tills det är lyserat (uppenbart som en grumlig vätska utan större skräp) (figur 2B).
      OBS: Antalet slag för lämplig lys måste testas för varje vävnad genom att bedöma yttre mitokondriell membranintegritet via cytokrom C-svar (steg 1.5.11). Svår att lysera bindväv eller kärldelar kan finnas kvar.
    7. Dekantera den lysade vävnaden i ett 15 ml centrifugrör.
    8. Tvätta insidan av krukmakaren med en lika stor mängd MiR05 som används i lysningssteget (t.ex. 1,5 ml) och lägg till 15 ml röret som nu innehåller 3-4 ml MiR05 vid 10 mg / ml vävnadslysat.
    9. Tillsätt 2 ml vanlig MiR05 per kammare för att värma till 37 °C.
    10. Virvla röret för lika fördelning innan du pipetterar 500 μL (motsvarande 5 mg) av varje lysat per kammare långsamt för att minimera spänningen från kyla till 37 °C.
    11. Vänta >3 min tills kammarens innehåll värms upp till 37 °C innan du stänger kammaren. Ta bort överskott av vätska ovanpå proppen (mängd per kammare efter stängning: 4 mg).
    12. Kör SUIT-protokollet för standardpermeabilized (steg 1.5).
  4. Beredning av fibrös vävnad (skelettmuskel, hjärtmuskel) för högupplöst respirometri
    1. Extrahera den hårda vävnaden, ta bort bindväv och fett från musklerna med hjälp av skarpa pincett i 2 ml iskall BIOPS (tabell 2) under ett dissektionsmikroskop.
    2. Separera fiberbuntarna (~ 4 mg) längs längdaxeln med skarpa pincett. Reta ut fibrerna tillräckligt för att få en nätliknande struktur (figur 2B).
      OBS: Korrekt mekanisk fiberseparation och permeabilisering indikeras av förlusten av det röda pigmentet myoglobin och ökad genomskinlighet.
    3. Tvätta och permeabilisera fiberbunten i saponin (50 μg/ml i BIOPS, beredd färsk) i 20 min vid 4 °C (fibrerna blir genomskinliga, vilket indikerar fullständig permeabilisering, figur 2B).
    4. Tvätta fibrerna två gånger i MiR05 i 5 min per tvätt vid 4 °C.
    5. Torka med filterpapper och väg innan du lägger till kammaren fylld med 2,1 ml MiR05.
    6. Inför proppar utan att stänga helt, syresätt sedan kamrarna med 2 ml ren O2 med hjälp av en 20 ml spruta och stäng kamrarna genom att vrida propparna i en roterande rörelse. Håll O2-koncentrationen mellan 300-500 μM under experimentet för att undvika syrediffusionsbegränsning.
  5. Protokoll för bedömning av rutinmässig andning i celler eller vävnader
    1. Lägg till prov i kammaren enligt stegen 1.5.2–1.5.3.
    2. Tillsätt 2,3 ml varm MiR05-cellsuspension (standardingång: 1 x 106 celler/ml som i steg 1,2 eller 2 mg vävnad/ml som i steg 1.3)
    3. Skelett- och hjärtmuskel (steg 1.4): Tillsätt ~ 4 mg saponinpermeabiliserade fibrer till förvärmda 2,3 ml varm MiR05 med tanke på steg 1.4.4-1.4.6
    4. Kör kammare vid 37 °C och en omrörningshastighet på 700 rpm. Vänta i >3 minuter för att låta media avgasa och stänga kamrarna genom att vrida proppen i en roterande rörelse. Peltier blockstabilisering indikerar att man når den inställda temperaturen.
    5. (VALFRITT) Ändra omrörarhastigheten till 300 rpm så att de återstående bubblorna kan fly genom proppens kapillär.
    6. Aspirera eventuell överskottsvätska ovanpå proppen. Vänta i 10 minuter tills en stabil syreflödessignal uppnås med valfri provtyp för att registrera rutin / tillstånd 1 andning, figur 1B).
    7. För andningsmätningar i permeabiliserade celler och vävnader, fortsätt med steg 1.6. För intakta celler med steg 1.8.
  6. Protokoll för OXPHOS-analys i permeabiliserade celler eller vävnader
    1. Använd lyserat (permeabiliserat) vävnadsprov eller permeabilisera celler genom att tillsätta 1 μL digitonin (8,1 mM digitoninbestånd i dimetylsulfoxid (DMSO)) för en slutlig koncentration av 5 μg / ml för att permeabilisera celler. Flödet sjunker och bör stabiliseras vid >5 min.
      VARNING: Digitonin är akut giftigt för luftvägarna, i kontakt med huden eller vid förtäring.
      OBS: Injektion av alla kemikalier utförs med precisionsglassprutor. Använd endast sprutor för angivna kemikalier för att undvika korskontaminering och tvätta noggrant i vatten och EtOH efter användning. Blockerade sprutor kan kräva ultraljud i varm ddH2O eller en rengöringstråd för att lossa eventuella kemiska träskor. Dra alltid in ett överskott av respektive stamlösning i sprutan för att undvika att luft förs in i kamrarna. Kontrollera insidan av kamrarna för införande av luft efter varje injektion. Registrera varje steg tills flödesplatåer.
    2. Lägg till i snabb följd: 5 μl 0,4 M malat (M) för en slutlig koncentration på 1 mM, 5 μL 2,0 M pyruvat (P; nyberedd), för en slutlig koncentration på 5 mM, 4 μL 2,5 M glutamat (G) för en slutlig koncentration på 5 mM.
    3. Efter föregående flödesplatå, tillsätt 5 μL (10 μL för muskelvävnad) 0,5 M adenosindifosfat (ADP, alikvoter lagrade vid -80 °C) för en slutlig koncentration på 1,25 mM.
      OBS: Vävnad som muskler kan behöva en annan koncentration för att nå mättnad.
    4. Tillsätt 5 μL 4 mM cytokrom C (cytC) för en slutlig koncentration på 10 μM.
      OBS: Valfritt för celler att bedöma kvaliteten på permeabilisering.
    5. Tillsätt 16 μl 1,25 M succinat (S) för en slutlig koncentration på 10 mM. (VALFRITT) Tillsätt 3 μl 0,5 M ADP för en slutlig koncentration på 2 mM för att kontrollera mättnaden av ADP-koncentrationen.
    6. För celler och fibervävnad, tillsätt 2 μl 1 mg/ml oligomycin (OM) för en slutlig koncentration på 1 μg/ml.
      VARNING: Alla ETS-hämmare som används är mycket giftiga.
      OBS: Oligomycin kan kräva titrering för optimal koncentration eftersom det kan undertrycka ETS-kapacitet och utelämnas för muskelvävnad. Reoxygenate här när muskelvävnad analyseras och omO2 är under 300 μM.
    7. Titrera FCCP från ett 2 mM-lager, tillsätt 0,6 μL med efterföljande steg på 0,2 μL tills ingen ökning av andning och andning är maximalt frikopplad (teoretisk: icke-kopplad).
    8. Tillsätt 1 μl 1 mM rotenon (ROT) för en slutlig koncentration på 0,5 μM. Tillsätt 2 μL 1 mg/ml antimycin (AM) för en slutlig koncentration på 1 μg/ml.
    9. Reoxygenera kamrarna för att uppnå en liknande syrenivå (~ 150 μM) i alla kamrar genom att långsamt lyfta kolven i vridningsrörelse.
    10. Tillsätt 5 μL 0,8 M askorbat för en slutlig koncentration på 2 mM omedelbart följt av 5 μL 0,2 M N,N,N′,N′-tetrametyl-p-fenylendiamin (TMPD) för en slutlig koncentration på 0,5 mM för att bedöma komplex IV-aktivitet (valfritt).
    11. Tillsätt 5 μL 4 M azid för en slutlig koncentration på 10 mM omedelbart när toppO2-flöde uppnås med TMPD. Fortsätt körningen i >5 minuter för att analysera automatisk oxidation av TMPD för komplex IV-basnivåberäkning.
    12. Berätta om cellerna för att bekräfta cellantalet förkörning och fortsätt med steg 1.9.
      OBS: Digitonin-permeabilisering (endast för celler) måste titreras i försöksexperiment för att nå maximalt flöde och inte påverka mitokondriell membranintegritet (se steg 1.7). Permeabiliserade prover (särskilt muskelvävnad) med >10% ökning av andningshastigheten efter tillsats av cytokrom c bör uteslutas från vidare analys på grund av yttre mitokondriell membranskada. En kortvarig dopp i flödet efter tillsats av EtOH-upplösta kemikalier förväntas.
  7. Protokoll för att bestämma optimala permeabiliseringsförhållanden för celler
    1. Lägg till celler enligt beskrivningen i steg 1.2 och 1.5.2.
    2. Ta 10 μl 10 mg/ml digitoninlager och tillsätt 10 μl DMSO för att späda ut till 5 mg/ml.
    3. Tillsätt 1 μl rotenon (1 mM lager). Tillsätt 10 μl succinat (2 mM lager) och 5 μl ADP (0,5 M lager).
    4. Titrera 1 μl digitonin (2,5 mg per steg) upprepade gånger tills andningen inte ökar ytterligare och är maximal.
      OBS: En minskning av andningen indikerar en överdriven koncentration av digitonin.
  8. Protokoll för OXPHOS-analys i intakta celler
    1. Efter rutinmässig andning (steg 1.6.1-1.6.6), tillsätt 2 μl 0,01 mM oligomycin för en slutlig koncentration av 10 nM.
    2. Titrera FCCP från 2 mM lager, tillsätt 0,6 μL med efterföljande steg på 0,2 μl tills ingen ytterligare ökning av andning och andning är maximalt frikopplad (teoretisk: icke-kopplad)
    3. Tillsätt 1 μl 1 mM rotenon för en slutlig koncentration på 0,5 μM. Tillsätt 2 μL 1 mg/ml antimycinstock för en slutlig koncentration på 1 μg/ml.
    4. Reoxygenera kammaren till samma syrenivå (~ 150 μM) genom att långsamt lyfta kolven i vridande rörelse.
    5. Tillsätt 5 μL 0,8 M askorbat för slutlig koncentration på 2 mM. Tillsätt omedelbart 5 μl 0,2 M TMPD för en slutlig koncentration på 0,5 mM för att bedöma komplex IV-aktivitet.
      OBS: Förbered en ny sats innan någon större uppsättning experiment eftersom TMPD är benägen för automatisk oxidation. Aktiviteten kan minska med tiden när den lagras vid -20 °C.
    6. Tillsätt 5 μL 4 M azid för en slutlig koncentration på 10 mM omedelbart när toppO2-flöde uppnås med TMPD. Fortsätt köra i >5 minuter för att analysera automatisk oxidation av TMPD för komplex IV-basnivåberäkning.
    7. Räkna om celler för att bekräfta cellantalet förkörning och fortsätt med steg 1.9.
  9. Exempelinsamling efter körning
    1. Samla exakt 1 ml MiR05-suspension från varje kammare (med omrörare på) i ett 1,5 ml rör 1,5 ml rör.
    2. Centrifugera vid 1000 x g för permeabiliserade celler eller vid 20 000 x g för vävnadslysat. Avlägsna supernatanten och frys pelleten vid -80 °C för vidare bearbetning (avsnitt 3).
  10. Analys av SUIT-protokoll
    1. Analysera syreflödet (pmol / s, normaliserat till inmatning) vid varje platå efter tillsats av ett substrat eller en hämmare (figur 1C och figur 3A). Exportera värdena till ett kalkylblad.
    2. Subtrahera det återstående syreförbrukningsvärdet (ROX, figur 1C och figur 3C) från alla värden för varje experimentell körning. Subtrahera azidresterande andning från TMPD för att erhålla komplex IV-andning.
    3. Plotta de absoluta värden som normaliserats för cell (figur 3A, B) eller vävnadsinmatning (figur 5A,B). Beräkna flödeskontrollförhållandena (steg 1.11) eller normalisera dem till proteininmatning (figur 3C).
  11. Beräkning av flödeskontrollförhållande
    1. Skaffa ett index för andningsfunktion och kopplingskontroll med hjälp av flödeskontrollförhållanden (FCR)9,26.
      OBS: Detta gör det möjligt att bedöma inneboende mitokondriell kvalitet, oberoende av mitokondriell kvantitet. Dessutom är flödeskontrollförhållandena (FCR) jämförbara inom samma cellinjer, vilket möjliggör reagenskvalitetskontroll (respektive FCR erhålls genom de angivna numrerade referensvärdena i figur 1B-D och figur 3C).
    2. Beräkna andningskontrollförhållandet för kopplingen av OXPHOS till LEAK med hjälp av ekvation 1.
      Ekvation 1: FCRADP = 5/6 = Tillstånd 3 / Tillstånd 4
    3. Beräkna FCR för att bedöma NADH-beroende andning med hjälp av ekvation 2
      Ekvation 2:FCR-tillstånd 3 (I) = 3/5 = Tillstånd 3 (I) / Tillstånd 3 (I+II)
    4. Beräkna FCR för att bedöma succinatberoende andning med hjälp av ekvation 3.
      Ekvation 3:FCR-tillstånd 3 (II) = 8/7 =S-råtta / ETS-kapacitet
    5. Beräkna FCR för att bedöma kopplad till frikopplad med hjälp av ekvation 4.
      Ekvation 4:FCR-kopplad/frikopplad = 5/7 = Tillstånd 3 (I + II) /ETS-kapacitet
    6. Använd ekvation 5 för att testa mitokondriell yttre membranintegritet.
      Ekvation 5: % mitokondriell yttre membranskada = 3/4 = Tillstånd 3 (I) / Tillstånd 3 (I) med cyt c

2. Högupplöst respirometri: Mikroplattbaserad respirometer (mHRR)

OBS: Experimenten i detta avsnitt av protokollet utfördes med seahorse XFe96 extracellulär flödesanalysator (materialtabell)

  1. Cellodling
    1. Odla vilken typ av cell som helst. Adherenter (t.ex. kollagen, laminin) kan användas för att underlätta cellbindning. Här odlas HEK293-celler som tidigare (steg 1.3).
    2. Dagen före experimentet, lossa cellerna och överför dem till en utsedd mHRR 96-brunns mikroplatta för att erhålla idealisk sammanflöde på experimentdagen (80% -100%) (Figur 2C).
      OBS: För mHRR är mikroplattcelldensiteter kritiska. Individuella tillväxtegenskaper hos celllinjer eller behandlingar som påverkar tillväxten måste redovisas för att säkerställa jämförbar sammanflöde på experimentdagen.
  2. Framställning av celler för högupplöst respirometri
    1. Skörda och återsuspendera cellerna tillräckligt före sådd
      ANMÄRKNING: Det rekommenderas att fröa celler från samma utspädning för replikat.
    2. Frö cellerna enligt tillväxthastigheter för enskilda cellinjer eller tillväxtegenskaper under behandling.
      OBS: Optimera på en standard 96-brunns mikroplatta och extrapolera celldensiteten till en 96-brunns analysspecifik mikroplatta. I denna inställning såddes 7 x 104 HEK293 WT-celler per brunn av en 96-brunn. De första och sista kolumnerna på 96-brunnsplattan används för proteinbestämning (figur 2C). De fyra hörnbrunnarna bör inte innehålla några celler och används för experimentell bakgrundskorrigering. Helst är brunnar nära kanterna tomma för att minimera kanteffekten (t.ex. celler visar förändrade tillväxthastigheter orsakade av temperatureffekter) (Figur 2C, D).
  3. Framställning av sensorplattor, laddning av hämmare
    1. På analysdagen, komplettera 38,8 ml medium med 0,4 ml 1 M glukos, 0,4 ml 200 mM glutamin och 0,4 ml 100 mM Na-pyruvat.
      OBS: mHRR-andning kräver ett specialiserat icke-buffrat DMEM-medium vid pH 7,4. I allmänhet bör 40 ml räcka för ett experiment med en 96-brunns mikroplatta.
    2. Värm andningsanalysmediet till 37 °C och byt ut cellodlingsmediet mot andningsanalysmediet genom att tvätta två gånger med 80 μl per brunn.
    3. Ställ plattan med cellerna i en 37 °C inkubator utan CO2 i 60 minuter före analysen.
      OBS: Detta steg är viktigt för att avgasa plattan eftersom CO2 kan påverka andningsresultaten, och serum i mediet kan producera bubblor under analysen.
    4. Alikvoter för prewarmhämmare för OM, FCCP, ROT och AM till 37 °C och ta ut sensorplattan ur inkubatorn.
    5. Späd OM, FCCP, ROT och AM i 3 ml analysmedium till en slutlig brunnskoncentration på 1,5 μM, 1,125 μM respektive 1 μM. Fyll i separata portar enligt figur 2E.
      OBS: En flerkanalig pipett rekommenderas för att fylla sensorkassetten. Eftersom tryckluft används för att injicera föreningar måste alla portar fyllas med lika stor vätskevolym när en port fylls med en förening. ROT och AM kan kombineras i en port. Hämmare kan lösas i EtOH eller DMSO.
    6. Inspektera injektionsportarna och kontrollera en jämn lastvolym för varje port.
      OBS: Alla portar innehåller ett hål i botten för injektion. Försiktighet bör iakttas när du flyttar sensorplattan. Luftbubblor kan tas bort med en nål.
  4. Protokoll för syrebedömning i intakta celler
    1. Dagen före analysen utför du steg 2.4.2-2.4.7.
    2. Alikvot 20 ml av kalibrantlösningen i ett 50 ml koniskt rör.
    3. Öppna Extracellular Flux Assay Kit och ta bort innehållet.
    4. Placera sensorkassetten inverterad bredvid verktygsplattan. Pipettera 200 μL kalibrantlösning i varje brunn på verktygsplattan.
    5. Fäst sensorkassetten på verktygsplattan och var uppmärksam på att alla sensorer är nedsänkta.
    6. Ställ plattan i en 37 °C inkubator utan CO2 över natten eller minst 12 timmar. Kontrollera att fuktigheten inuti inkubatorn är tillräcklig för att förhindra avdunstning av kalibranten.
    7. Slå på det mikroplattbaserade systemet och datorn för att vara redo att användas nästa dag (maskinen kräver minst 3 timmar för att balansera till 37 °C innan du utför en analys).
      OBS: För signalstabilitet, öka mätpunkterna till 6 istället för 3 mätcykler per andningstillstånd. Varje cykel består av 3 min blandning och 3 min mätning.
    8. På dagen för XF-analysen utför du steg 2.4.9-2.4.20.
    9. Kontrollera sammanflödet av cellodlingsplattan, cellernas morfologi och att bakgrundsbrunnarna är tomma.
    10. Tvätta cellerna med det beredda andningsmediet enligt anvisningarna i steg 2.4.11-2.4.12.
    11. Ta bort alla utom 20 μl av odlingsmediet från varje brunn. Avlägsna 55 μl om odlingsmediet var 80 μl på grund av avdunstning över natten (cirka 5 μl).
    12. Tvätta cellerna två gånger med 90 μl analysmedium. Slutligen tillsätt 100 μl analysmedium. Slutvolymen ska vara 120 μl.
      OBS: En flerkanalspipett rekommenderas för detta steg för att säkerställa att samma tvättprocedur har tillämpats på varje experimentellt tillstånd (beror på plattinställningen). När du assisterar, luta plattan till en 45 ° vinkel och placera pipettspetsarna i hörnet av brunnarna för aspiration och injektion av vätskor. Det är absolut nödvändigt att vara försiktig under tvätten eftersom vissa celler lätt kan lossna från botten av cellodlingsplattan.
    13. Ställ plattan i en 37 °C inkubator utan CO2 i 60 minuter före analysen.
    14. Hämta den hydratiserade sensorpatronplattan från den CO2-fria inkubatorn.
    15. Kassera den gamla kalibrantlösningen och ersätt den med en ny kalibrantlösning, förvärmd till 37 °C.
    16. Förbered hämmare och analysmedium (3 ml per hämmare för totalt 12 ml analysmedium) och använd en pipettbehållare för inhibitorbelastningen i hamnar.
    17. Öppna programvaran och kör en fördesignad eller ny mall. Fyll plattkartan, justera titreringarna och mätcyklerna och tryck sedan på Start för att initiera kalibreringen av de optiska sensorerna.
    18. Ta bort locket från den laddade patronen och placera det i spåret som automatiskt glider ut ur maskinen och verifierar att markeringarna i det nedre högra hörnet av plattan stämmer överens med triangeln i spårets nedre högra hörn.
    19. Klicka på Fortsätt för att utföra automatisk kalibrering, som varar cirka 20 minuter.
    20. Efter kalibrering, ta bort verktygsplattan som innehåller kalibranten.
    21. Ta bort locket från mikroplattan som innehåller cellerna och placera plattan i spåret när du uppmanas av maskinen. Klicka på Fortsätt för att starta körningen.
  5. Exempelinsamling efter körning
    1. Ta ut plattan ur maskinen, ta försiktigt bort det återstående analysmediet utan att störa cellerna och frys hela plattan vid -80 °C för vidare bearbetning (avsnitt 3).

3. Bestämning av protein med användning av bicinchoninsyraanalysen (BCA-analys)

  1. Förbered utspätt bovint serumalbumin (BSA) i en buffert som används för proteinextraktion och är kompatibel med BCA: 2 mg/ml, 1,5 mg/ml, 1 mg/ml, 0,5 mg/ml, 0,25 mg/ml och 0 mg/ml för standardkurva i dubbletter.
  2. Extrahera proteiner genom att återsuspera i en lämplig lysbuffert (t.ex. RIPA) med 20 μl per brunn för mHRR eller 100 μL per pellet som finns i ett 1,5 ml rör för cHRR.
  3. Inkubera mHRR-plattan eller 1,5 ml rör som innehåller proteinlysater i 30 minuter på is.
  4. Centrifugera 1,5 ml-röret som innehåller proteinet lysat vid 4 °C vid 20 000 x g i 20 minuter och överför den resulterande supernatanten till ett nytt rent 1,5 ml-rör.
  5. Använd 10 μl per prov i dubbletter och standarder i en mikrotiterplatta. Tillsätt 200 μl BCA-arbetsreagens och inkubera i >15 minuter.
  6. Läs av plattan i en standardspektrofotometer vid en våglängd på 562 nm och beräkna proteinkoncentrationerna med hjälp av en BSA-standardkurva.
  7. Normalisera andningsresultaten till proteinkoncentrationen.
    OBS: Normalisering till proteinmängd gör det möjligt att bekräfta cell sådddensiteter eller våtviktsingång. De extraherade proteinerna är lämpliga för efterföljande immunoblotting mot underenheter i ETS till exempel men representerar inte helt det ursprungliga provet (t.ex. förlust av fosforyleringsställen).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Här tillhandahåller vi protokoll för att bestämma mitokondriell bioenergetik i eukaryota celler, icke-fibrös vävnad (t.ex. cerebellum) och fibrös vävnad (t.ex. skelettmuskulatur). För eukaryota celler mättes HEK293 med CRISPR-konstruerad knockout av två olika proteiner associerade med mitokondriell translation som resulterade i multipel (CRISPRKO1) och svår/fullständig OXPHOS-brist (CRISPRKO2) med antingen cHRR (figur 3A-C) eller mHRR (figur 3A-D).

För cHRR digitaliserades HEK293-celler och andningsexperiment utfördes enligt standardprotokollet (steg 1,5-1,6) och registrerades framgångsrikt (figur 3A). CRISPRKO1 visar nedsatt och CRISPRKO2 ingen andning jämfört med WT när den normaliseras till cellens ingångsmängd (figur 3B). Proteinmängden bestämdes från insamlade prover (avsnitt 3), och värdena för rutinmässig andning normaliserades till proteinmängd för att beräkna absoluta värden och respektive FCR (Figur 3C, betydelsen av varje FCR beskrivs i diskussionen). Optimala provmängder ger flöden på 80-160 pmol/s per ml. Helst är mängden celler eller vävnad tillräcklig för att generera ett signifikant flöde (20 pmol / s för cHRR) för att minska bakgrundsbrus samtidigt som man undviker överdriven reoxygenering under ett experiment. Vid låg respiring (t.ex. vitt fettfett, vita blodkroppar) eller svåråtkomliga prover (t.ex. iPS-differentierade neuronala linjer) är flöden på 20 pmol /s per ml tillräckliga under idealiska arbetsförhållanden.

Figure 3
Figur 3: Representativa standardprotokollspår för syreförbrukning från cHRR med hjälp av HEK293-celler med kombinerad OXPHOS-brist. (B) Överlagrade cellinmatningsnormaliserade syreförbrukningsspår från (A). (C) Proteinnormaliserad kvantifiering av två oberoende experiment (medelvärde och SD) och respektive FCR. Jämförelser mellan förhållanden gjordes av ANOVA och a posteriori Tukeys test eller en Students t-test. Betydelser: **** p < 0,0001; p < 0,001; ** p < 0,01; * p < 0,05. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Därefter använde vi mHRR med samma celler i ett standardprotokoll (2.1-2.5), vilket bekräftade OXPHOS-bristerna (Figur 4A). Dessutom ökade ECAR-värdena för svår/fullständig OXPHOS-brist (CRISPRKO2), vilket tyder på kompensation av mitokondriell oxidativ fosforyleringsbrist i HEK293-celler med specifik mitokondriell översättningsbrist genom ökad glykolys som resulterar i laktatproduktion (figur 4A). Proteinmängden bestämdes från mikrowellplattan (avsnitt 3) och erhållna värden normaliserades till proteinmängd (figur 4B) och kvantifierades (figur 4C). Mikroplattbaserade system är ökända för hög variation inom brunnen. Hög variabilitet mellan replikat kan uppstå när den optimala sådddensiteten inte har uppnåtts. celler lossnar under tvättstegen för att ersätta cellodlingsmediet med analysmedium eller felaktig pipetteringsteknik såsom införande av luftbubblor eller aspiration av varierande volymer. Förlängda mättider (6 mätcykler) rekommenderas med mHRR för att möjliggöra stabilisering av flödet i media (figur 1B och figur 4A). Låga flöden orsakar hög variation, och beroende på celltyp kan flödet vara för nära bakgrundsbrus (upp till 10-15 pmol / s). Lågrespirerande (t.ex. fibroblaster) eller exceptionellt stora celler kan producera otillräckligt syreflöde över bakgrundsbrusnivån i 96-brunns mikroplattformatet även vid 90% sammanflöde. I så fall bör 24-brunns mHRR eller cHRR övervägas. Minimala förändringar i syreflödet kan också indikera felaktig hantering av laddning av hämmarna, såsom tomma, felaktigt eller varierande fyllda portar. Användning av specifika pipettspetsar som kommer in i hamnarna tillräckligt under lastning av kemikalierna rekommenderas så att kemikalier kan nå den enskilda porten (figur 2E).

Figure 4
Figur 4: Representativa standardprotokollspår för syreförbrukning från mHRR med hjälp av HEK293-celler med kombinerad OXPHOS-brist. (B) Respektive extracellulär syrningsgrad (ECAR) från (A). (C) Proteinnormaliserade syreförbrukningsspår av WT HEK293-celler och HEK293-celler med CRISPR-medierad mitokondriell översättningsbrist som orsakar multipel OXPHOS-brist (CRISPRKO1,2). (D) Proteinnormaliserad kvantifiering av brunnar (n = 8 per genotyp; medelvärde och SD). Jämförelser mellan förhållanden gjordes av ANOVA och a posteriori Tukeys test. Betydelser: **** p < 0,0001; p < 0,001; ** p < 0,01; * p < 0,05. Förkortningar: se figur 1. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Ett exempelexperiment för icke-fibrös vävnadsberedning (steg 1.3 och 1.5-1.6) med mushjärna (figur 5A) och fibrös vävnadsberedning (steg 1.4 och 1.5-1.6) med musskelettmuskulatur (soleus) visas (figur 5B). I allmänhet överstiger okopplad andning inte OXPHOS-kapaciteten i musprover. För mushjärna minskade OXPHOS-kapaciteten vid jämförelse med maximal ETS-kapacitet. LEAK-andningen ökade under fysiologiskt kontrollerade omständigheter jämfört med kemiskt inducerad (oligomycin). Detta kan bero på det faktum att endogen tillgänglig ADP fortfarande fosforyleras till ATP, medan med kemisk induktion är protonläckage maximal, vilket resulterar i en överskattning av LEAK-andning. Till skillnad från lillhjärnan testades soleus vid hyperoxiska förhållanden för att undvika syrediffusionsbegränsning och visar tre gånger högre OXPHOS-kapacitet. NADH-beroende andning är annorlunda vid analys av specifika typer av vävnad, med soleus som har mer kapacitet att respirera genom tillsats av succinat än cerebellum. Båda typerna av vävnad visar minimal ROX.

Figure 5
Figur 5: Representativa spår av syreförbrukning för icke-fibrösa (A) och fibrösa (B) vävnader för cHRR. (A) Vävnadsnormaliserat syreförbrukningsspår för mus cerebellum berett enligt beskrivningen (steg 1.3). (B) Våtviktsvävnadsnormaliserat syreförbrukningsspår av mus soleusmuskel enligt beskrivningen (steg 1.4). Blå linje visar respektive syrekoncentration och injektionspunkter. Förkortningar: se figur 1. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Kemisk Koncentration
BSA, fettsyrafri 1 g/l
D-sackaros 110 mM
EGTS 0,5 mM
HEPES 20 mM
KH2PO4 10 mM
Laktobionsyra 60 mM
MgCl2·6H2O 3 mM
Taurin 20 mM

Tabell 1: Mitokondriell andningsmedium MiR05-komposition justerad till pH 7,127.

Kemisk Koncentration
CaK2EGTA vattenfri 2,77 mM
Ditiotreitol (DTT) 0,5 mM
Imidazol 20 mM
K2EGTS, vattenfri 7,23 mM
MES-hydrat 50 mM
MgCl 2-6H2 O 6,56 mM
Na2ATP 5,77 mM
Na2Fosfokreatin 15 mM
Taurin 20 mM

Tabell 2: Sammansättning av avslappnande och biopsikonserveringslösning (BIOPS) justerad till pH 7,128.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Traditionellt har mitokondriell bioenergetik studerats med syreelektroder av Clark-typ. Brist på upplösning och genomströmning motiverade dock för teknisk utveckling. Hittills har O2k (kallad cHRR) och Seahorse XF96 Flux Analyzer (kallad mHRR) antagits allmänt inom cellulär bioenergetik. Här presenterar vi en begriplig samling protokoll för analys av cellulär energimetabolism via bedömning av mitokondriell andning med antingen cHRR eller mHRR, diskuterar viktiga fördelar med varje enhet och ger praktisk vägledning. Protokollen som tillhandahålls här omfattar däggdjursceller, fibrösa (hårda) vävnader såsom skelett- och hjärtmuskler och icke-fibrösa (mjuka) vävnader såsom hjärna och lever och är tillämpliga på liknande typer av provmaterial.

Medan båda HRR-metoderna resulterar i jämförbara data för däggdjursceller som exemplifieras med HEK293 med multipel OXPHOS-brist, gör allmänna arbetsprinciper och teknisk installation av enheterna dem lämpliga för olika applikationer. mHRR-installationen möjliggör automatiserad datainsamling och har kapacitet med hög genomströmning med en 24- eller 96-installation med flera brunnar som kräver minimala provmängder. Den låga experimentella volymen och brunnsytan, förutom användningen av syregenomsläppliga polymerer (polystyren), kan emellertid orsaka hög variation inom brunnen (särskilt i 96-brunnsplattan), vilket främjar användningen av ≥6 brunnar per tillstånd för reproducerbara resultat. Till skillnad från den cHRR-baserade polarografiska syresensorn förbrukas inget syre av sensorproberna i mHRR, som använder släckt fosforescensO2-avkänning . Eftersom mHRR är ett halvslutet system kan omgivandeO2 diffundera in i andningsmediet och utsätta provet och sonden för syre. När den kolvliknande sensorsonden sänks skapas en tillfälligt förseglad och isolerad kammare för att förstärka förändringar iO2-koncentrationen och mäta syreförbrukningen. Därefter används en matematisk modell för att exakt beräkna syreförbrukningshastigheter genom att uppskatta bakdiffusionen avO2. Nackdelen är dock att algoritmen också förstärker brus29. Mikroplattinställningen använder icke-återanvändbara specialportar och plattor som kräver optimal cellsåddstäthet. mHRR-syresensorproberna mäter lateral O2-diffusion i tre distinkta områden per brunn som motsvarar sondens storlek (~ 1 mm); därför är ett jämnt fördelat cellmonolager avgörande för att bestämma exakta syreförbrukningshastigheter. Om det finns några signifikanta luckor när man observerar cellfördelningen kommer felaktiga syreförbrukningshastigheter att beräknas, vilket resulterar i en hög varians av brunnsreplikat. Med hänsyn till detta är mHRR halvautomatiserad och idealiskt anpassningsbar för cell- eller småorganismbaserade studier med hög genomströmning (t.ex . C. elegans) med återkommande screeningar.

Inställningen av cHRR-respirometrar är baserad på ett tvåkammarsystem med polarimetrisk mätning av syre. I det slutna systemet kan omgivandeO2 inte diffundera in i andningsmediet; således återspeglar en minskning avO2-koncentrationen syreförbrukningen hos det biologiska provet. Eftersom den polarografiska syresensorn cHRR förbrukar syre är diffusion av fri O2 avgörande, vilket gör det svårt att minimera kammarvolymen (2 ml, nya cHRR-enheter 0,5 ml) och kräver konstant omrörning för att säkerställa andningsmediets homogenitet. Följaktligen krävs större provvolymer för att generera tillräckligt med syreflöde. På grund av direkt åtkomst till kamrarna och manuell titrering är alla andningsprotokoll anpassningsbara och baserat på allmänt kommersiellt tillgängliga kemikalier resulterar det i exceptionellt låga driftskostnader. Dessutom möjliggör ad hoc-funktion anpassning av ett SUIT-protokoll genom titrering under ett experiment och är viktigt i enstaka patient-härledda prover. Partiell automatisering är möjlig med hjälp av en titreringsinjektionsmikropump, vilket möjliggör programmerbara SUIT-protokoll. Även om det är begränsat till två exempel per cHRR-enhet, kommer erfarna användare att köra flera enheter parallellt. Fördelen med mångsidigheten i analysutveckling och mjukvarumiljö kommer med behovet av mer specifik utbildning för att använda dessa enheter och användarberoende underhåll (t.ex. kalibrering av polarografiska syresensorer) för att erhålla reproducerbara data. För avancerade applikationer kan ytterligare moduler fästas på cHRR-enheterna för att registrera pH, fluorescerande modul för att analysera membranpotential via safranin30,H2O2via AMPLEX röd24 och kalciumnivåer31.

Båda enheterna kräver specialiserade andningsmedier. mHRR använder ett kommersiellt tillgängligt serumfritt tillväxtmedium, vilket undviker användning av bikarbonat, som avgasar under låga CO2-förhållanden och är viktigt om extracellulär försurningshastighet (ECAR) är av betydelse. Under glykolys omvandlas pyruvat till laktat, som dissocieras till mjölksyra och protoner. Denna ökade protonkoncentration får pH att minska, vilket registreras som ECAR. En mer detaljerad analys av ECAR är möjlig med glykolysstresstestet. Denna analys består först av att tillsätta mättande glukosnivåer för att mäta den basala glykolytiska hastigheten. Efter hämning av ATP-syntaskomplexet med oligomycin avslöjas den maximala glykolytiska hastigheten. Det sista steget är att mäta icke-glykolytisk försurning genom att injicera 2-deoxi-glukos, vilket hämmar glykolys via konkurrenskraftig bindning till hexokinas och fosfoglukosisomeras32. Andra kitbaserade protokoll som finns tillgängliga omfattar glykolys, fettsyraoxidation och glutaminoxidation. Här använde vi standardprotokollet för att mäta basal andning, ATP-länkad andning, protonläckage, maximal andning, extra andningskapacitet och icke-mitokondriell andning (figur 4A-C). Ett tillvägagångssätt för att använda både standardandningsprotokollet i samband med glykolysstresstestet skulle ge insikt i aeroba och anaeroba energivägar som ger en översikt över cellulär andning.

Cellulär bioenergetik nås vanligtvis i vidhäftande celler med mikroplattan mHRR-inställning. Beroende på celltyp kan specialiserad beläggning för vidhäftning (t.ex. poly-D-lysin, gelatin, etc.) krävas (för suspensionsceller) såväl som för löst vidhäftande celler eftersom de kan lossna från botten avbrunnsmätningscyklerna 33. Däremot kräver cHRR-mätningar konstant omrörning, vilket möjliggör andningsmätning för alla biologiska prover. För varje enhet krävs optimering såsom titrering av hämmare (och substrat) för vävnads- och cellinjer för att bedöma inhibitorkänslighet (dos-responskurvor). Inhibitorkoncentrationer bör testas i alla experimentella modeller för att använda de lägsta helt hämmande koncentrationerna och för att förhindra ospecifik hämning samt onödig kammarkontaminering. I allmänhet är 0,25 μM rotenon, 0,5 μg / ml oligomycin, 0,5 μg / ml antimycin tillräckliga för de flesta applikationer och provmängder. För reproducerbarhet, förbered engångsläkemedel i tillräckliga mängder för hela de planerade experimenten (t.ex. musgrupper) och håll provinmatningen konstant inom en specifik vävnads- eller cellinje. I cHRR kommer spår av hämmare som finns kvar i kamrarna att förändra flödet utan någon indikation till operatören. Särskilt rotenonspår är svåra att undvika och kräver tillräcklig tvätt med en minimal kammarrengöring (och stopp), som omfattar tvätt 4x med ddH2O, 2x 70% EtOH (96% renhet tillräcklig), 1x 100% EtOH, 1x 70% EtOH. Tvätt kräver vridning av omrörare och håller EtOH-steg i > 5 minuter vardera. För att förhindra bakteriell kontaminering hålls 70% EtOH i alla kamrar när maskiner inte används. Potentiella kvarvarande föroreningar kan släckas genom tillsats av oanvänd vävnadslysat. I ett mHRR-experiment kan vissa kemikalier interagera med den väsentliga plastartikeln för engångsbruk34.

Andningsdata som erhållits via ett permeabiliserat protokoll ger insikt i ETS, medan ett intakt protokoll ger insikt i mitokondriella egenskaper som mitokondriell kopplingseffektivitet. Faktum är att allmänna mitokondriella energiegenskaper kan ge samma resultat, men underliggande elektronöverföring mellan komplex kan förändras. Detta skulle återspegla förändrad mitokondriell energimetabolism och kräver ett permeabiliseringsprotokoll för att komma åt andningskomplexen. På samma sätt visar olika vävnader och celler förändrat substratberoende vid bedömning av andningsegenskaper. Till exempel är glykolytiska muskelfibrer kända för att främst förlita sig på glycerol-3-fosfat för energileverans, medan oxidativa muskelfibrer har en två gånger högre elektronöverföringskapacitet från NADH-oxidation35,36. På samma sätt kan hjärtmitokondrier, lever, brun fettvävnad använda fettsyror för att syntetisera ATP, och i sin tur kan hjärnan använda ketonkroppar, främst bildade av fettsyraoxidation 36,37,38. Därför kräver bestämning av mitokondriella egenskaper ett helhetsgrepp i motsats till den vanliga glukosberoende andningen. mHRR omfattar vanligtvis att bedöma intakta vidhäftande celler, även om permeabilisering är uppnåelig (t.ex. mutant rekombinant perfringolysin O som selektivt permeabiliserar cellmembranet39). Dessa metoder har dock ökad komplexitet på grund av begränsningen av fyra injektionsportar. Däremot är korrekt lyserade icke-fibrösa vävnadslysater och vilken celltyp som helst vanligtvis problemfria för cHRR. Normalt är det inte möjligt att analysera vävnad med mHRR; emellertid har metoder som använder isolerade mitokondrier från en vävnad fastställts40,41.

Viktigt att notera är att normalisering till hela proteininnehållet försummar absoluta mitokondriella mängder. Jämförelse av experimentella grupper under olika behandlingar kan skilja sig avsevärt (t.ex. 30 dagars proteinrika dietmatade råttor visade en 2,5-faldig ökning av mitokondriellt innehåll i lever42), särskilt i vävnad som är mottaglig för intracellulär lipidackumulering såsom brun fettvävnad, lever och skelettmuskulatur. I dessa situationer rekommenderas det också att bedöma flera mitokondriella markörer som en approximation för mitokondriell massa, såsom mtDNA-kopia nummer43, citratsyntasaktivitet10 och allestädes närvarande mitokondriella proteiner (t.ex. VDAC1, TOM20). I kombination tillåter detta att destillera om en förändrad andningsfunktion tillskrivs mitokondriell kvantitet, kvalitet, integritet eller en kombination därav. En annan kompletterande metod till detta är implementeringen av FCR. FCR ger insikt i olika andningstillstånd oberoende av mitokondriellt innehåll. FCRADP härleder oavsett om förändrad LEAK eller OXPHOS förändrar mitokondriernas effektivitet till fosforylat ADP. FCR-tillstånd 3 (I) återspeglar i vilken grad provet är beroende av komplex I som en jämförelse med komplex II. FCR-tillstånd 3 (II) jämför succinatberoende andning med ETS och ger ett index för mitokondriell andning härledd från komplex II. FCR-kopplad/frikopplad är ett förhållande som ger kopplingskontrollen mellan OXPHOS och ETS, med ett förhållande på 1 som inte har någon extra andningskapacitet kvar. Den mitokondriella yttre membranintegriteten kan bedömas genom tillsats av exogent cytokrom c. Cytokrom c är lokaliserat i intermembranutrymmet, där det underlättar överföringen av elektroner mellan komplex III och komplex IV. Om det yttre mitokondriella membranet är skadat läcker cytokrom c ut ur mitokondrierna och bidrar inte längre till andningen. Återställande av denna obalans kan uppnås genom tillsats av exogent cytokrom c, vilket följaktligen ökar andningen (figur 1A, D; 5B). Komplex IV-aktivitet mäts individuellt med TMPD efter fullständig hämning av OXPHOS. Baslinje O2-flödet kommer att minska närO2-koncentrationen sjunker eftersom TMPD-oxidation ärO2-koncentrationsberoende . Därför syresätts alla kamrar efter ROX-bedömning till samma syrenivå (150 μM). Linjär regression av datapunkter från signal efter tillsats av azid kan användas för att interpolera kemisk ochO2-beroende bakgrund av komplex IV-aktivitetsanalys. ROX-värden ska subtraheras från alla andningsvärden för att korrigera för icke-mitokondriell syreförbrukning.

Biologiskt kan ROX vid isolerade mitokondrier vara lägre än med permeabiliserade eller intakta celler/vävnad. I allmänhet orsakas kvarvarande andning av aktiviteten hos oxidasenzymer, med celler och vävnad som har mer autoxidiserbara substanser än isolerade mitokondrier44. Dessutom, med intracellulära membranstrukturer fortfarande intakta, ökar svårigheten för syre att tränga igenom cellmembran på grund av dess negativa laddning. Följaktligen kan diffusion genom cellulära membran och intracellulär tillgänglighet av syre påverkas, vilket resulterar i ROX. Isolering av mitokondrier har dock visat sig störa mitokondriell morfologi, öka mitokondriell väteperoxidproduktion, tillsammans med förändrad mitokondriell andningsfunktion45. Medan isolering av funktionella mitokondrier möjliggör specifik normalisering och kan krävas under vissa förhållanden, är isoleringsprocessen tidskrävande, kräver vanligtvis mer material och kanske inte bevarar mitokondriell heterogenitet. Av denna anledning har vi avstått från att inkludera mitokondriell isolering i denna studie. För skelett- eller hjärtmuskel är dock isolering av mitokondrier eller saponinbehandling av fibrer avgörande för andningsmätningar. Eftersom autolytiska processer sker mycket snabbt efter eutanasi rekommenderas snabb vävnadsextraktion och efterlevnad av jämförbar tidpunkt för preparat mellan enskilda experiment.

I våra experiment ledde bedömningen av den mitokondriella andningsfunktionen hos däggdjursceller till jämförbara resultat med båda HRR-enheterna. Basal andning var dock högre för cHRR jämfört med mHRR. Bortsett från många tekniska aspekter (kammarvolym, omrörning och olika signalintegration) kan biologiska orsaker som förändrat andningsmedium, tidpunkt för cellskörd och icke-fästa celler som orsakar förlust av cellkontakt orsaka de observerade skillnaderna. Följaktligen är andningsprotokoll i allmänhet och enskilda substrat- och inhibitorkoncentrationer inte utbytbara mellan system av de presenterade skälen, som kan vara av teknisk natur (t.ex. titrering) och i allmänhet olika analysreagenser (t.ex. andningsmedier, kemiska absorbanser av glas eller polymerer). För att säkerställa högsta reproducerbarhet omfattar flera tekniska överväganden och rekommendationer i) användning av alikvoter för engångsbruk för att minimera korskontaminering eller frys-tö-cykler, ii) lämplig lagring av alla kemikalier (t.ex. ADP vid -80 °C för långvarig stabilitet, pyruvat beredda ny- och ljuskänsliga kemikalier i mörker), iii) regelbunden och rigorös omtestning av kemikalier för effektivitet (t.ex. avdunstningspåverkade koncentrationsförändringar, lagringsinducerad TMPD-aktivitetsförlust) och (iv) omfattande rengöring för att avlägsna eventuella spårkemikalier. Överväganden om reproducerbarheten av longitudinella studier (över flera år) skulle kräva övervakning av produktens prestanda och säkerställande av reagensernas stabilitet över tid.

Slutligen kan ny teknik baserad på kombinerade potentiometriska (pH) och amperometriska (O2) mätningar genom ruteniumoxidbaserade elektroder katalysera ett paradigmskifte i nuvarande verktyg, vilket gör det möjligt att studera cellulär metabolism i kultur och in vivo46. Även om nuvarande metoder huvudsakligen tillåter ex vivo - och in vitro-bedömning av cellulär metabolism, möjliggör fördröjd fluorescens in vivo-analys av mitokondriellt syre som ett mått på mitokondriell funktion47. På samma sätt visar mikrofluidikbaserad respirometri löfte i högre känslighet, vilket bara kräver några hundra celler48. Medan nya metoder är i horisonten, är hittills högupplöst respirometri fortfarande guldstandarden för att bedöma cellulär andningskapacitet för vilken typiska protokoll tillhandahålls här, tillämpliga på de flesta celler, vävnader och organismer för att studera mitokondriell andning.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Ingen intressekonflikt att avslöja.

Acknowledgments

Detta arbete stöddes av finansiering från Finlands Akademi (C.B.J), Magnus Ehrnroot Foundation (C.B.J) och ett doktorandstipendium från Integrated Life Sciences Graduate School (R.A.).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2 mL Potter-Elvehjem Glass/PTFE Tissue Grinder/Homogenizer Omni International 07-358029
95% O2, 5% CO2 medical gas mixture Potter for tissue grinding
ADP Sigma A 4386
Antimycin A Sigma A 8674 Chemical
Ascorbate Merck PHR1279-1G Chemical, dissolve in ethanol
BSA (fatty accid free) Sigma A 6003 Chemical
CaCO3 Sigma C 4830 Chemical
Cytochrome c Sigma C 7752 Chemical
Digitonin Sigma D 5628 Chemical
Dithiothreitol Sigma D 0632 Chemical, dissolve in DMSO
D-Sucrose Roth 4621.1 Chemical
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (High glucose) Fisher Scientific 41965-039 Chemical
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (No Glucose) Fisher Scientific A14430-01
EGTA Sigma E 4378
Etomoxir Sigma E1905 Chemical
Falcon 15 ml Conical Centrifuge Tubes Fisher Scientific AM12500 Chemical
Falcon 50 ml Conical Centrifuge Tubes Fisher Scientific AM12501
FCCP Sigma C 2920
Glucose Sigma G7021 Chemical, dissolve in ethanol
Glutamate Sigma G 1626 Chemical
GlutaMax (100x) (200 nM L-alanyl-L-glutamine dipeptide) Fisher Scientific 35050061 Chemical
HEK293 cells ATTC CRL-1573
Hemocytometer Fisher Scientific 0267151B Instrument for cell counting
Hepes Sigma H 7523 Chemical
Imidazole Fluka 56750 Chemical
KCl Merck 1.04936 Chemical
L-carnitine Sigma C0283 Chemical
Malate Sigma M 1000 Chemical
MES hydrate Sigma M8250 Chemical
MgCl2 Sigma M 9272 Chemical
Na2ATP Sigma A 2383 Chemical
Na2Phosphocreatine Sigma P 7936 Chemical
Na-pyruvate (100 mM) (100x) Fisher Scientific 11360070
NEAA (Non-essential amino acids) 100x Fisher Scientific 11140035
Normal FBS (10x) Fisher Scientific 10500064
O2k-Core: Oxygraph-2k Oroboros Instruments 10000-02 High-resolution respirometry instrument
O2k-Titration Set Oroboros Instruments 20820-03 Hamilton syringes for chemical injections
Oligomycin Sigma O 4876 Chemical, dissolve in ethanol
Palmitoylcarnitine Sigma P 4509 Chemical
Penicillin-Streptomycin Fisher Scientific 15140122
Pierce BCA Protein Assay Kit Fisher Scientific 23227
Pyruvate Sigma P 2256 Chemical
RIPA-Buffer Fisher Scientific 89900 Chemical
Rotenone Sigma R 8875 Chemical, dissolve in ethanol
Saponin Sigma S7900 Chemical

Seahorse XF DMEM assay medium pack, pH 7.4
Agilent, Santa Clara, CA		 103680-100
Seahorse XFe96 Extracellular Flux Analyzer
Agilent, Santa Clara, CA		 High-throughput respirometry instrument
Seahorse XFe96 FluxPak
Agilent, Santa Clara, CA
Includes assay plates, cartridges, loading guides for transferring compounds to the assay cartridge, and calibrant solution.
Small scissors Fisher Scientific 08-951-20
Sodium azide Sigma S2002 Chemical
Succinate Sigma S 2378 Chemical
Taurine Sigma T 8691 Chemical
TMPD Sigma T 3134 Chemical
Trypan Blue solution Merck 72-57-1 Chemical
Trypsin 0.25% EDTA Fisher Scientific 25200056
Two thin-edged forceps Fisher Scientific 12-000-122
Uridine stock (500x) Sigma U3750 Chemical

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. McBride, H. M., Neuspiel, M., Wasiak, S. Mitochondria: More than just a powerhouse. Current Biology. 16 (14), 551-560 (2006).
  2. Mehta, M. M., Weinberg, S. E., Chandel, N. S. Mitochondrial control of immunity. Beyond ATP. Nature Reviews Immunology. 17 (10), 608-620 (2017).
  3. Spinelli, J. B., Haigis, M. C. The multifaceted contributions of mitochondria to cellular metabolism. Nature Cell Biology. 20 (7), 745-754 (2018).
  4. Gnaiger, E. Capacity of oxidative phosphorylation in human skeletal muscle. New perspectives of mitochondrial physiology. International Journal of Biochemistry and Cell Biology. 41 (10), 1837-1845 (2009).
  5. Gorman, G. S., et al. Mitochondrial diseases. Nature Reviews Disease Primers. 2, 1-23 (2016).
  6. Boushel, R., Gnaiger, E., Schjerling, P., Skovbro, M., Kraunsøe, R., Dela, F. Patients with type 2 diabetes have normal mitochondrial function in skeletal muscle. Diabetologia. 50 (4), 790-796 (2007).
  7. Cogliati, S., et al. Mitochondrial cristae shape determines respiratory chain supercomplexes assembly and respiratory efficiency. Cell. 155 (1), 160-171 (2013).
  8. Kühlbrandt, W. Structure and function of mitochondrial membrane protein complexes. BMC Biology. 13, 1-11 (2015).
  9. Gnaiger, E. Mitochondrial pathways and Respiratory control. An introduction to OXPHOS analysis. Bioenergetics communications. 5th ed. , Steiger Druck GmbH. Axams, Austria. (2020).
  10. Jackson, C. B., et al. Mutations in SDHD lead to autosomal recessive encephalomyopathy and isolated mitochondrial complex II deficiency. Journal of Medical Genetics. 51 (3), 170-175 (2014).
  11. Pesta, D., Gnaiger, E. High-resolution respirometry: OXPHOS protocols for human cells and permeabilized fibers from small biopsies of human muscle. Methods in Molecular Biology. 810, Clifton, N.J. 25-58 (2012).
  12. Horan, M. P., Pichaud, N., Ballard, J. W. O. Review: Quantifying mitochondrial dysfunction in complex diseases of aging. Journals of Gerontology - Series A Biological Sciences and Medical Sciences. 67 (10), 1022-1035 (2012).
  13. Doerrier, C., Garcia-Souza, L. F., Krumschnabel, G., Wohlfarter, Y., Mészáros, A. T., Gnaiger, E. High-resolution fluorespirometry and oxphos protocols for human cells, permeabilized fibers from small biopsies of muscle, and isolated mitochondria. Methods in Molecular Biology. 1782, Clifton, N.J. 31-70 (2018).
  14. Zhang, J., et al. Measuring energy metabolism in cultured cells, including human pluripotent stem cells and differentiated cells. Nature Protocols. 7 (6), 1068-1085 (2012).
  15. García-Roche, M., Casal, A., Carriquiry, M., Radi, R., Quijano, C., Cassina, A. Respiratory analysis of coupled mitochondria in cryopreserved liver biopsies. Redox Biology. 17, 207-212 (2018).
  16. Acin-Perez, R., et al. A novel approach to measure mitochondrial respiration in frozen biological samples. The EMBO Journal. 39 (13), 1-18 (2020).
  17. SUITBrowserWeb. , Available from: http://suitbrowser.oroboros.at/ (2021).
  18. Cell metabolism assay kits. Seahorse assay kits and media. , Available from: https://www.agilent.com/en/product/cell-analysis/real-time-cell-metabolic-analysis/xf-assay-lits-reagents-cell-assay-media (2021).
  19. Chance, B., Williams, G. R. A method for the localization of sites for oxidative phosphorylation. Nature. 176 (4475), 250-254 (1955).
  20. Gnaiger, E., et al. Mitochondrial respiratory states and rates. MitoFit Preprint Arch. , (2019).
  21. Gnaiger, E. O2k-procedures: SOP O2k quality control 1: Polarographic oxygen sensors and accuracy of calibration Section Page. Oroboros. 03 (18), http://wiki.oroboros.at/index.php/MiPNet06.03_POS-Calibration-SOP 1-21 (2020).
  22. Robinson, B. H., Petrova-Benedict, R., Buncic, J. R., Wallace, D. C. Nonviability of cells with oxidative defects in galactose medium: A screening test for affected patient fibroblasts. Biochemical Medicine and Metabolic Biology. 48 (2), 122-126 (1992).
  23. King, M. P., Attardi, G. Human cells lacking mtDNA: Repopulation with exogenous mitochondria by complementation. Science. 246 (4929), 500-503 (1989).
  24. Makrecka-Kuka, M., Krumschnabel, G., Gnaiger, E. High-resolution respirometry for simultaneous measurement of oxygen and hydrogen peroxide fluxes in permeabilized cells, tissue homogenate and isolated mitochondria. Biomolecules. 5 (3), 1319-1338 (2015).
  25. Fasching, M., Gnaiger, E. O2k quality control 2: Instrumental oxygen background correction and accuracy of oxygen flux. Mitochondrial Physiology Network. 14 (06), 1-14 (2016).
  26. Gnaiger, E., Lassnig, B., Kuznetsov, A., Rieger, G., Margreiter, R. Excess capacity of cytochrome c oxidase. Journal of Experimental Biology. 1139, 1129-1139 (1998).
  27. Gnaiger, E., et al. Mitochondria in the Cold. Life in the Cold. , Springer. Berlin, Heidelberg. 431-442 (2000).
  28. Fontana-Ayoub,, Fasching, M., Gnaiger, E. Selected media and chemicals for respirometry with mitochondrial preparations. Mitochondrial Physiology Network. 02 (17), 1-9 (2014).
  29. Gerencser, A. A., et al. Quantitative microplate-based respirometry with correction for oxygen diffusion. Analytical Chemistry. 81 (16), 6868-6878 (2009).
  30. Krumschnabel, G., Eigentler, A., Fasching, M., Gnaiger, E. Use of safranin for the assessment of mitochondrial membrane potential by high-resolution respirometry and fluorometry. Methods in Enzymology. 542, 163-181 (2014).
  31. Nászai, A., Terhes, E., Kaszaki, J., Boros, M., Juhász, L. Ca(2+)N it be measured? Detection of extramitochondrial calcium movement with high-resolution fluorespirometry. Scientific Reports. 9 (1), 1-13 (2019).
  32. Pajak, B., et al. 2-Deoxy-d-Glucose and its analogs: From diagnostic to therapeutic agents. International Journal of Molecular Sciences. 21 (1), 234 (2019).
  33. Mercier-Letondal, P., Marton, C., Godet, Y., Galaine, J. Validation of a method evaluating T cell metabolic potential in compliance with ICH Q2 (R1). Journal of Translational Medicine. 19 (1), 1-15 (2021).
  34. Sauerbeck, A., et al. Analysis of regional brain mitochondrial bioenergetics and susceptibility to mitochondrial inhibition utilizing a microplate based system. Journal of Neuroscience Methods. 198 (1), 36-43 (2011).
  35. Jackman, M. R., Willis, W. T. Characteristics of mitochondria isolated from type I and type IIb skeletal muscle. American Journal of Physiology - Cell Physiology. 270 (2), 673-678 (1996).
  36. Ponsot, E., et al. Mitochondrial tissue specificity of substrates utilization in rat cardiac and skeletal muscles. Journal of Cellular Physiology. 203 (3), 479-486 (2005).
  37. Schönfeld, P., Reiser, G. Why does brain metabolism not favor burning of fatty acids to provide energy-Reflections on disadvantages of the use of free fatty acids as fuel for brain. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 33 (10), 1493-1499 (2013).
  38. Calderon-Dominguez, M., Mir, J. F., Fucho, R., Weber, M., Serra, D., Herrero, L. Fatty acid metabolism and the basis of brown adipose tissue function. Adipocyte. 5 (2), 98-118 (2016).
  39. Divakaruni, A. S., Rogers, G. W., Murphy, A. N. Measuring mitochondrial function in permeabilized cells using the seahorse XF analyzer or a clark-type oxygen electrode. Current Protocols in Toxicology. 2014, 1-16 (2014).
  40. Iuso, A., Repp, B., Biagosch, C., Terrile, C., Prokisch, H. Assessing mitochondrial bioenergetics in isolated mitochondria from various mouse tissues using Seahorse XF96 analyzer. Methods in Molecular Biology. 1567, 217-230 (2017).
  41. Rogers, G. W., et al. High throughput microplate respiratory measurements using minimal quantities of isolated mitochondria. PLoS ONE. 6 (7), 21746 (2011).
  42. Jordá, A., Zaragozá, R., Portolés, M., Báguena-Cervellera, R., Renau-Piqueras, J. Long-term high-protein diet induces biochemical and ultrastructural changes in rat liver mitochondria. Archives of Biochemistry and Biophysics. 265 (2), 241-248 (1988).
  43. Jackson, C. B., Gallati, S., Schaller, A. QPCR-based mitochondrial DNA quantification: Influence of template DNA fragmentation on accuracy. Biochemical and Biophysical Research Communications. 423 (3), 441-447 (2012).
  44. Hirsch, H. M. Tissue autoxidation inhibitors: II. The presence of inhibitor in intact cells; Assay of liver and hepatoma effect on radio-oxidations. Cancer Research. 16 (11), 1076-1082 (1956).
  45. Picard, M., et al. Mitochondrial structure and function are disrupted by standard Isolation methods. PLoS ONE. 6 (3), 18317 (2011).
  46. Tanumihardja, E., Slaats, R. H., Van Der Meer, A. D., Passier, R., Olthuis, W., Van Den Berg, A. Measuring both pH and O2 with a single On-Chip sensor in cultures of human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes to track induced changes in cellular metabolism. ACS Sensors. 6 (1), 267-274 (2021).
  47. Harms, F., Stolker, R. J., Mik, E. Cutaneous respirometry as novel technique to monitor mitochondrial function: A feasibility study in healthy volunteers. PLoS ONE. 11 (7), 159544 (2016).
  48. Levitsky, Y., et al. Micro-respirometry of whole cells and isolated mitochondria. RSC Advances. 9 (57), 33257-33267 (2019).

Tags

Biologi Utgåva 176 mitokondriell bioenergetik andningskedja mitokondriell sjukdom oxidativ fosforylering Flux Analyzer extracellulärt flöde HEK293 syreförbrukning mitokondriell översättning
Högupplöst respirometri för att bedöma bioenergetik i celler och vävnader med hjälp av kammar- och plattbaserade respirometrar
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Awadhpersad, R., Jackson, C. B.… More

Awadhpersad, R., Jackson, C. B. High-Resolution Respirometry to Assess Bioenergetics in Cells and Tissues Using Chamber- and Plate-Based Respirometers. J. Vis. Exp. (176), e63000, doi:10.3791/63000 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter