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Biology

Respirometria de alta resolução para avaliar bioenergésicos em células e tecidos usando respirômetros baseados em câmara e placas

Published: October 26, 2021 doi: 10.3791/63000
Automatic Translation
1, 1
1Department of Biochemistry and Developmental Biology, Faculty of Medicine, University of Helsinki

Summary

Avaliar a fosforilação oxidativa usando respirômetros de alta resolução tornou-se parte integrante da análise funcional das mitocôndrias e do metabolismo de energia celular. Aqui, apresentamos protocolos para a análise do metabolismo de energia celular usando respirômetros de alta resolução baseados em câmara e microplatos e discutimos os principais benefícios de cada dispositivo.

Abstract

A respirometria de alta resolução (HRR) permite monitorar a fosforilação oxidativa em tempo real para análise de estados de energia celular individuais e avaliação de complexos respiratórios usando protocolos diversificados de titulação inibidora de substrato-uncoupler (SUIT). Aqui, demonstra-se o uso de dois dispositivos de respirometria de alta resolução, e uma coleção básica de protocolos aplicáveis para a análise de células cultivadas, fibras musculares esqueléticas e cardíacas, e tecidos moles como o cérebro e o fígado são apresentados. Protocolos para células e tecidos cultivados são fornecidos para um respirômetro baseado em câmara e células cultivadas para um respirômetro à base de microplato, ambos abrangendo protocolos de respiração padrão. Para fins comparativos, as células HEK293 projetadas pelo CRISPR deficientes na tradução mitocondrial que causam deficiência múltipla do sistema respiratório são usadas com ambos os dispositivos para demonstrar defeitos celulares na respiração. Ambos os respirômetros permitem uma medição abrangente da respiração celular com seus respectivos méritos técnicos e adequação dependente da questão da pesquisa e do modelo em estudo.

Introduction

Mitocôndrias cumprem a oferta-chave de energia e são uma organela compartimentalizada contribuindo para processos bioenergetics celulares essenciais e metabólicos, como anabolismo de nucleotídeos, lipídios e aminoácidos, biogênese do aglomerado de enxofre de ferro e estão implicados em sinalização como morte celular controlada 1,2,3 . A bioenergeticia mitocondrial através da fosforilação oxidativa contribui para quase todos os processos celulares dentro da célula e, consequentemente, disfunções mitocondriais de origem primária ou secundária estão associadas a um amplo espectro de condições da doença 4,5. A disfunção mitocondrial envolve não apenas alterações na estrutura ou densidade mitocondrial, mas também na qualidade e regulação do sistema respiratório6. Este elemento qualitativo abrange controle de substrato, características de acoplamento, modificações pós-translacionais, dinâmica cristae e supercomplexos respiratórios 7,8. Portanto, a análise precisa da bioenergetics mitocondrial para abordagens experimentais e diagnósticas para avaliar o metabolismo energético da célula é importante na saúde e na doença.

Fosforilação oxidativa mitocondrial (OXPHOS) é uma sequência de reações dentro do sistema respiratório ou sistema de transferência de elétrons (ETS) para a geração de energia celular através de triptosfato de adenosina (ATP)9. O passo multienzimático para aproveitar a energia do fluxo de elétrons através dos complexos I e II ao complexo IV gera um gradiente eletroquímico de prótons através da membrana mitocondrial interna, posteriormente utilizado para fosforilação de difosfato de adenosina (ADP) para ATP via complexo V (F1FO ATP synthase) (Figura 1A).

Primeiro, os portadores de dois elétrons são gerados durante o ciclo tricarboxílico (TCA), glicolise e oxidação piruvato: dinucleotídeo de adenina de nicotinamida (NADH) e dinucleotídeo de adenina dihidroflavina (FADH2). O NADH é oxidado no complexo I (NADH desidrogenase), durante o qual dois elétrons são transferidos para a coenzima Q (quinona é reduzida a quinol), enquanto prótons são bombeados para o espaço intermembrano (IMS). Em segundo lugar, o complexo II (Succinato desidrogenase) oxida FADH2 e alimenta os elétrons para coenzima Q sem bombear prótons. Em terceiro lugar, no complexo III (Cytochrome c oxidoreductase), elétrons da coenzima Q são transferidos para citocromo c enquanto prótons são bombeados para o IMS. Em quarto lugar, o citocromo c transfere os elétrons para o complexo IV (Cytochrome c oxidase), o complexo final para bombear prótons, e onde o oxigênio funciona como um aceitador de elétrons para assimilar prótons, formando água. É esse oxigênio que as mitocôndrias consomem que pode ser medido por um oxígrafo. Finalmente, os prótons gerados a partir do complexo I, complexo III e complexo IV são usados para rodar o complexo V, gerando ASSIM ATP9.

É importante ressaltar que a transferência de elétrons ocorre não apenas de forma linear, de outra forma denotada como a cadeia de transporte de elétrons. Em vez disso, os elétrons podem ser transferidos para a piscina coenzima Q através de múltiplas vias respiratórias e facilitar o fluxo de elétrons convergentes. Os substratos e succinatos do NADH, por exemplo, podem entrar por meio do complexo I e do complexo II, respectivamente. Elétrons da oxidação de ácidos graxos podem ser doados através do complexo de flavoproteína de transferência de elétrons. De fato, uma análise abrangente do OXPHOS requer uma abordagem holística com substratos de combustível apropriados (Figura 1A).

Figure 1
Figura 1: Fosforilação oxidativa mitocondrial e protocolos específicos de substrato e inibidor. (A) Mitoconddrion e esquema do sistema de transferência de elétrons (CI-CIV) e mitocondrial F1F0 ATP synthase (CV). Todas as estruturas são do PDB. As figuras retratam apenas substratos e inibidores descritos neste estudo). (B) Traços de amostra de fluxo de oxigênio em células HEK293 intactas usando protocolo padrão em um dispositivo mHRR. (C) Traços amostrais de fluxo de oxigênio em células HEK293 intactas usando protocolo padrão em um dispositivo cHRR. (D) Traços amostrais de fluxo de oxigênio em fibroblastos humanos permeabilizados de um doador saudável com o respectivo protocolo SUIT. Abreviaturas: 1 = Respiração rotineira de células intactas; 2 = Estado 2; 3 = Estado 3(I); 4 = Estado 3(I) com cítara; 5 = Estado 3 (I+II); 6 = Vazamento(OM); 7 = Capacidade de ETS; 8 = S(ROT); 9 = ROX; 10 = TMPD; 11 = Az. ROT = Rotenone, AM = Antimicina, ATP = Adenosina triphosfato, Az = Azide, OM = Oligomicina, FCCP = Cianeto carbonilizado p-trifluoro-metoxifenil-hidratante; Asc = Ascorbate, TMPD = N,N,N′,N'-tetramethyl-p-fenilelenediamina, Succ = Succinato, M = Malato, P = Piruado, ADP = Difosfato de Adenosina, NAD = Nicotinamida adenina dinucleotídeo, IMS = Espaço Intermembrano, FAD = Flavin adenina dinucleotídeo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

A análise da capacidade mitocondrial oxphos usando HRR tornou-se um método bioquímico instrumental de valor diagnóstico não apenas para defeitos mitocondriais primários10,11, mas estendendo-se a todos os outros domínios da biologia, como câncer e envelhecimento12. O HRR permite a determinação da respiração celular pela análise da capacidade mitocondrial de OXPHOS, que reflete diretamente deficiência do complexo respiratório mitocondrial individual ou combinado, e indiretamente está associada à disfunção celular e ao metabolismo energético alterado9. Metodologicamente, as medidas respiratórias são realizadas utilizando células, tecidos ou mitocôndrias isoladas 11,13,14, com material congelado apenas parcialmente adequado15,16. O tecido congelado é mostrado ter um ETS intacto com estabilidade de supercomplex mantido15. Assim, ao contrário dos intermediários tradicionais do TCA, os respectivos substratos são diretamente alimentados no ETS. No entanto, o acoplamento entre a síntese de ETS e ATP é perdido à medida que a integridade da membrana é comprometida por danos congelantes (formação de cristais de gelo).

Experimentos de respiração normalmente ocorrem a uma temperatura fisiológica de 37 °C para endotermias em células ou tecidos não permeabilizados ou permeabilizados. Enquanto o primeiro considera o contexto metabólico citosomático, este último fornece a contribuição energética dos complexos oxphos individuais e do ATPase através da adição de substratos específicos (e inibidores). A sequência e variação de substratos e inibidores levaram ao desenvolvimento de uma matriz diversificada de protocolos SUIT17 e ensaios18 para abordar várias questões científicas da função OXPHOS (revisadas abaixo de12). O protocolo básico de respiração celular avalia quatro estados diferentes: i) respiração de rotina - a respiração em uma respectiva mídia respiratória sem qualquer adição de substratos ou inibidores que consumam, mas substratos endógenos. Este estado pode revelar defeitos de respiração geralmente ou induzidos por secundários causados, por exemplo, por perfis metabólitos alterados. Em seguida, a adição do oligomicina inibidora de ATPase revela a permeabilidade da membrana mitocondrial interna aos prótons, definida como ii) respiração de vazamento. A titulação subsequente de um prótonophore como o desacontedor cianeto de cyanide carbonyl p-trifluoro-metoxiphenyl-hydrazone (FCCP) permite determinar o estado em que a capacidade de ETS é máxima em um modo de circuito de próton aberto transmembrano, definido como iii) respiração nãocopada. É importante ressaltar que um estado desacoplado também pode ocorrer por intervenções experimentais através de danos mecânicos excessivos às membranas mitocondriais. Por outro lado, o estado não acoplado refere-se ao desacoplamento respiratório por um mecanismo intrínseco que é fisiologicamente controlado. Finalmente, a inibição completa do ETS por adição do complexo inibidor III antimicina e do inibidor complexo I rotenona determina o consumo residual de oxigênio (ROX) de processos não mitocondriais de consumo de oxigênio (Figura 1A-C).

A bioenergetics mitocondrial consiste em cinco estados de respiração distintos19,20. A respiração do estado 1 é sem substratos adicionais ou ADP, exceto pelo que está disponível de forma endógena. Após a adição de ADP, mas ainda assim, sem substratos, a respiração estadual 2 é alcançada. Quando substratos são adicionados, permitindo transferência de elétrons e síntese ATP, a respiração do estado 3 é atingida. Neste estado, a capacidade oxphos pode ser definida em concentrações saturadas de ADP, fosfato inorgânico, oxigênio, nadh- e substratos ligados ao succinato. A respiração do estado 4 ou a respiração DE VAZAMENTO podem ser definidas como um estado sem ADP ou sintetizadores ATP quimicamente inibidos enquanto têm substratos suficientes. Por fim, quando todo o oxigênio é esgotado (anoxico) em um ambiente de câmara fechada, o estado 5 respiração é observado.

Existem vários métodos para avaliar os estados de energia celular14 com dois dispositivos dominando a avaliação atual em tempo real do OXPHOS através da análise do consumo de oxigênio, medido como função da diminuição do oxigênio ao longo do tempo em um sistema de câmara fechada com diferentes aplicabilidade dependentes do modelo experimental e da questão da pesquisa: o respirômetro oroboros de alta resolução e o analisador de fluxo extracelular Seahorse XF. Ambos os dispositivos registram as taxas de consumo de oxigênio como uma diminuição nos picomoles (pmol) de oxigênio (O2) por segundo como um valor absoluto dentro da câmara ou poço de microplato. O consumo específico de oxigênio por massa é obtido pela normalização do respectivo consumo de oxigênio em uma receita tampão específica por número de células (milhões), peso tecidual (mg) ou quantidade de proteína.

O O2k (Instrumentos Oroboros) é um sistema fechado de duas câmaras equipado com um sensor de oxigênio polarográfico (abreviado como respirômetro de alta resolução baseado em câmara: cHRR). Cada câmara experimental contém 2 mL de líquido que é mantido homogêneo por agitadores magnéticos. O sensor de oxigênio polarográfico utiliza uma abordagem amperométrica para medir o oxigênio: contém um cátodo de ouro, um ânodo de cloreto de prata/prata, e entre uma solução KCI criando uma célula eletroquímica sobre a qual uma tensão (0,8 V) é aplicada. O oxigênio do ensaio difere através de uma membrana fluorina de etileno fluorado de 25 μm (O 2-permeável) e sofre redução no cátodo, produzindo peróxido de hidrogênio. No ânodo, a prata é oxidada por peróxido de hidrogênio, gerando uma corrente elétrica. Esta corrente elétrica (ampere) está linearmente relacionada com a pressão parcial de oxigênio. A pressão parcial do oxigênio e o fator de solubilidade de oxigênio do meio de ensaio são usados para calcular a concentração de oxigênio. Uma vez que a pressão parcial do oxigênio depende da temperatura experimental e as medidas polarográficas são sensíveis à temperatura, as flutuações na temperatura precisam de regulação precisa (±0,002 °C) por um bloco de aquecimento Peltier. A temperatura pode ser controlada dentro de uma faixa de 4 °C e 47 °C.

O analisador de fluxo extracelular Seahorse XF (Agilent) é um sistema baseado em placas com formato de microplaca de 24 ou 96 poços no qual três eletrodos de fluorescência medem o consumo de oxigênio ao longo do tempo em cada poço (abreviado como respirômetro de alta resolução baseado em microplaca: mHRR). Um máximo de quatro portas no cartucho de ensaio estão disponíveis para injeção automatizada durante o ensaio. Um ensaio contém vários ciclos, cada um com três fases: 1) mistura, 2) espera e 3) medição. Durante a fase de medição, as sondas de sensores são reduzidas na microplacão criando uma câmara temporariamente fechada contendo volume de 7-10 μL para medir a luz emitida. Esta luz é emitida por fluoroforos embutidos em polímero na ponta das sondas do sensor, que sentem O2 com base na saciamento da fosforescência. A intensidade do sinal de fluorescência é proporcional a O2 e influenciada pela temperatura do sensor e do meio de ensaio. Portanto, a estimativa precisa de oxigênio requer uma abordagem relativa com um poço de fundo sem qualquer amostra. A restauração da concentração de oxigênio ocorre durante a fase de mistura quando o sensor se move para cima e para baixo para misturar o volume acima da câmara temporária. Cada ciclo calcula uma taxa de consumo de oxigênio. A temperatura pode ser controlada dentro de uma faixa de 16 °C e 42 °C.

O HRR é o padrão-ouro para avaliar bioenergetics celulares em doenças primárias e mitocôndrias associadas e metabolismo celular geral. Neste estudo, protocolos básicos para HRR são fornecidos para avaliar a função OXPHOS em células e tecidos.

Figure 2
Figura 2: Fluxo de trabalho para preparações celulares e tecidos para rCR, e preparação celular para respirometria mHRR. (A) Esboço dos protocolos fornecidos. (B) Células mamíferas (passo 1.2): pelota HEK293 igual a 3 x 106 células (painel esquerdo). Tecido não fibroso (passo 1.3): Preparação de cerebelo murino em 2 mL Teflon potter (painel médio). Permeabilização do músculo esquelético induzida por sapona (etapa 1.4) painel direito) para respirometria de HRR. (C) Layout de semeamento de microplaca padrão (etapa 2.4) e verificação de confluência para a análise de células eucarióticas (HEK293) para respirometria mHRR. (D, E) Esquema de carregamento da porta de injeção para respirometria mHRR (etapa 2.4). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Protocol

Toda a experimentação animal é realizada de acordo com o National Animal Experiment Review Board e a Agência Regional De Administração Estadual para o Sul da Finlândia. Foram utilizados neste estudo camundongos C57BL/6JOlaHsd masculinos (4-6 meses de idade). O consentimento para o uso de linhas celulares humanas foi obtido do comitê de ética institucional da Universidade de Helsinque.

1. Respirometria de alta resolução: respirômetro baseado em câmara (cHRR)

NOTA: Os experimentos nesta seção do protocolo foram realizados utilizando-se o Oroboros O2k-Core: Oxygraph-2k (Tabela de Materiais)

  1. Calibração dos sensores de oxigênio
    1. Respirômetros pré-executados a 37 °C em 2,1 mL de meio de respiração mitocondrial (MiR05, Tabela 1, fator de solubilidade: 0,92) para >45 min e realizar calibração de oxigênio conforme descrito21. Proceda se a variação da linha de base estiver dentro ± 4 pmol/s.
      NOTA: Grandes flutuações no sinal de fundo podem indicar a manutenção necessária da membrana do sensor ou traços de inibidores remanescentes na câmara de experimentações anteriores. Recomenda-se uma correção instrumental de fluxo de oxigênio de fundo antes de um lote de experimentos25.
    2. Regisso valores de calibração de oxigênio para monitorar o desempenho da membrana do sensor ao longo do tempo.
      NOTA: Isso revela a função do sensor, a estabilidade do sinal ao ruído e quando a manutenção da membrana do sensor é necessária. Dependente da pressão ambiente, entre 180-200 μmol de oxigênio é solubilizado em MiR05.
    3. Remova todo o líquido da câmara antes da adição de qualquer amostra no meio de respiração.
      NOTA: Avalie o volume de câmaras de respiração para ser exatamente 2 mL regularmente.
  2. Preparação de células para respirometria de alta resolução
    1. Cultura HEK293 células em pratos de 10 cmde 2 diâmetros no meio de Águia Modificada (DMEM) de Dulbecco com alta glicose suplementada com 10% de soro bovino fetal inativado por calor (FBS), GlutaMax, Aminoácidos não essenciais, e Na-Pyrunato22 e uridine23 para suportar o metabolismo com defeito oxphos em uma incubadora a 37 °C a 5% de CO2.
      NOTA: Qualquer tipo de célula eucariótica pode ser cultivada. Para a maioria dos tipos de células, a cultura de um prato de 10 cm2 leva a células suficientes (geralmente >3 x 106 células). Verifique rotineiramente a infecção por mycoplasma para evitar efeitos no metabolismo celular e respiração.
    2. Crescer células sem exceder 90% de confluência (Figura 2C).
      NOTA: Células com confluência >90% podem apresentar efeitos inibitórios dependentes do crescimento na respiração (se não sincronizadas ou pós-mitóticas).
    3. Lave as células com 1x PBS, desprende com 1 mL de trippsina quente de 0,25%, desative a trippsina adicionando DMEM quente (5 mL/10 cm2 ) e conte as células com hemocitômetro.
    4. Centrifugar suavemente a solução celular igualando 2,5 x 106 células a 300 x g por 5 min, remover o supernasce completamente e resuspend em 2,5 mL de MiR05 quente (1 x 106 células/mL) (Figura 2A).
    5. Para células de suspensão, conte e remova a solução igual a 2,5 x 106 células, pelota e continue como mencionado na etapa 1.2.4.
    6. Execute o protocolo SUIT para otimização de permeabilização (etapa 1.6), célula ou tecido permeabilizizado (passo 1.5) ou células intactas (etapa 1.7)
      NOTA: Para resultados consistentes, recomenda-se manter a concentração celular constante (por exemplo, 1 x 106 células/mL). Embora a respiração seja independente da densidade celular no respirômetro24, substratos e inibidores estão em concentração comparável ao longo dos experimentos se os números de células forem mantidos constantes.
  3. Preparação de tecido não fibroso (por exemplo, cérebro, fígado) para respirometria de alta resolução
    1. Extite um pedaço homogêneo de tecido, 30-40 mg de peso, ou use todo o órgão (cerebelo do rato neste caso).
      NOTA: Se o tecido não for usado imediatamente, mantenha em 2 mL de MiR05 gelado permitindo a preservação por até 2 h para a maioria dos tecidos. Os tempos individuais de armazenamento de tecidos precisam ser avaliados em séries temporidas.
    2. Borrite o tecido seco com um papel filtro Whatman (cuidado: a matéria de tecido mole tende a grudar).
    3. Coloque a peça de tecido de 30-40 mg em um politetrafluoroetileno de 2 mL resfriado ol politetrafluoroetileno homogeneizador.
    4. Adicione uma quantidade apropriada de MiR05 para obter 20 mg/mL para manter a relação tecido-tampão. Mantenha a quantidade total > 1,5 mL e <2 mL para evitar fluidos insuficientes ou excessivos para permeabilização mecânica adequada.
    5. Insira o pilão, lise o tecido lentamente, retraindo o pilão cuidadosamente, evitando a geração de um vácuo causando danos excessivos no tecido.
    6. Realize 7 traçados no total (1x definidos como um curso para cima e para baixo) até lise (aparente como um líquido turvo sem detritos maiores) (Figura 2B).
      NOTA: O número de derrames para lise apropriada precisa ser testado para cada tecido, avaliando a integridade da membrana mitocondrial externa através da resposta citocromática C (etapa 1.5.11). Tecido conjuntivo de difícil de lise ou partes de vasos podem permanecer.
    7. Decante o tecido líscido em um tubo de centrífuga de 15 mL.
    8. Lave o interior do oleiro com uma quantidade igual de MiR05 usado na etapa de lise (por exemplo, 1,5 mL) e adicione ao tubo de 15 mL agora contendo 3-4 mL de MiR05 a 10 mg/mL de tecido lysate.
    9. Adicione 2 mL de MiR05 simples por câmara para aquecer a 37 °C.
    10. Gire o tubo para distribuição igual antes de pipetar 500 μL (igualando 5 mg) de cada lise por câmara lentamente para minimizar o estresse do frio a 37 °C.
    11. Aguarde >3 minutos para que o conteúdo da câmara aqueça até 37 °C antes de fechar a câmara. Remova o excesso de fluido em cima da rolha (quantidade por câmara após o fechamento: 4 mgs).
    12. Execute o protocolo SUIT para permeabilized padrão (etapa 1.5).
  4. Preparação de tecido fibroso (músculo esquelético, músculo cardíaco) para respirometria de alta resolução
    1. Extrair o tecido duro, remover o tecido conjuntivo e a gordura dos músculos usando fórceps afiados em 2 mL de BIOPS gelado (Tabela 2) sob um microscópio de dissecção.
    2. Separe os feixes de fibra (~4 mg) ao longo do eixo longitudinal com fórceps afiados. Provoque as fibras o suficiente para obter uma estrutura em forma de malha (Figura 2B).
      NOTA: A separação e permeabilização adequada da fibra mecânica é indicada pela perda da mioglobina do pigmento vermelho e pelo aumento da translucência.
    3. Lave e permeabilize o feixe de fibras em saponina (50 μg/mL em BIOPS, preparado fresco) por 20 min a 4 °C (as fibras se tornam translúcidas, indicando permeabilização completa, Figura 2B).
    4. Lave as fibras duas vezes em MiR05 por 5 min por lavagem a 4 °C.
    5. Estaque seque com papel filtro e pese antes de adicionar à câmara cheia de 2,1 mL MiR05.
    6. Introduza rolhas sem fechar totalmente, em seguida, oxigenar as câmaras com 2 mL de O2 puro usando uma seringa de 20 mL e fechar as câmaras torcendo as rolhas em um movimento rotativo. Mantenha a concentração de O2 entre 300-500 μM durante o experimento para evitar a limitação da difusão de oxigênio.
  5. Protocolo para avaliação da respiração de rotina em células ou tecidos
    1. Adicione a amostra à câmara conforme mencionado nas etapas 1.5.2-1.5.3.
    2. Adicione 2,3 mL de suspensão celular MiR05 quente (entrada padrão: 1 x 106 células/mL como na etapa 1.2 ou 2 mg de tecido/mL como na etapa 1.3)
    3. Músculo esquelético e cardíaco (passo 1.4): Adicione ~4 mg de fibras de saponina permeabilized a 2,3 mL pré-equipados de MiR05 quente considerando as etapas 1.4.4-1.4.6
    4. Executar câmaras a 37 °C e uma velocidade de agitação de 700 rpm. Aguarde >3 minutos para permitir que a mídia desgase e feche as câmaras torcendo a rolha em um movimento rotativo. A estabilização do bloco peltier indica atingir a temperatura definida.
    5. (OPCIONAL) Altere a velocidade do agitador para 300 rpm para permitir que as bolhas restantes escapem através do capilar da rolha.
    6. Aspire qualquer excesso de líquido em cima da rolha. Aguarde 10 minutos até que um sinal de fluxo de oxigênio estável seja alcançado com qualquer tipo de amostra para registrar a respiração de rotina/estado 1, Figura 1B).
    7. Para medições de respiração em células permeabilizadas e tecidos, continue com a etapa 1.6. Para células intactas com passo 1.8.
  6. Protocolo para análise de OXPHOS em células ou tecidos permeabilizados
    1. Use amostras de tecido lísticula (permeabilized) ou células permeabilizes adicionando 1 μL de digitonina (8,1 mM de digitalonina em sulfoxida de dimetil (DMSO)) para uma concentração final de 5 μg/mL às células permeabilize. O fluxo cairá e deve estabilizar em >5 min.
      ATENÇÃO: A digitonina é agudamente tóxica para o trato respiratório, em contato com a pele ou quando engolida.
      NOTA: A injeção de todos os produtos químicos é realizada com seringas de vidro de precisão. Use seringas apenas para produtos químicos indicados para evitar contaminação cruzada e lavar completamente na água e etoh após o uso. Seringas bloqueadas podem exigir ultrassônicas em ddH2O quente ou um fio de limpeza para desalojar quaisquer tamancos químicos. Retraia sempre um excedente da respectiva solução de estoque na seringa para evitar a introdução de ar nas câmaras. Inspecione o interior das câmaras para a introdução de ar após cada injeção. Registo cada passo até o fluxo planalto.
    2. Adicione em rápida sucessão: 5 μL de 0,4 M de malato (M) para uma concentração final de 1 mM, 5 μL de piruvato de 2,0 M (P; preparado recentemente), para uma concentração final de 5 mM, 4 μL de 2,5 M de glutamato (G) para uma concentração final de 5 mM.
    3. Após o fluxo anterior nivelado, adicione 5 μL (10 μL para tecido muscular) de 0,5 M difosfato de adenosina (ADP, alíquotas armazenadas a -80 °C) para uma concentração final de 1,25 mM.
      NOTA: Tecidos como músculo podem precisar de uma concentração diferente para alcançar a saturação.
    4. Adicione 5 μL de 4 mM citocromo C (ctil) para uma concentração final de 10 μM.
      NOTA: Opcional para as células avaliarem a qualidade da permeabilização.
    5. Adicione 16 μL de 1,25 M de succinato (S) para uma concentração final de 10 mM. (OPCIONAL) Adicione 3 μL de 0,5 M ADP para uma concentração final de 2 mM para controlar a saturação da concentração de ADP.
    6. Para células e tecido não fibroso, adicione 2 μL de oligomicina de 1 mg/mL (OM) para uma concentração final de 1 μg/mL.
      ATENÇÃO: Todos os inibidores de ETS utilizados são altamente tóxicos.
      NOTA: A oligomicina pode exigir titulação para uma concentração ideal, pois pode reprimir a capacidade de ETS e é omitida para tecido muscular. Reoxigenato aqui quando o tecido muscular é avaliado e se O2 está abaixo de 300 μM.
    7. Titrate FCCP de um estoque de 2 mM, adicione 0,6 μL com etapas subsequentes de 0,2 μL até que nenhum aumento na respiração e respiração seja maximamente desacoplado (teórico: não acoplado).
    8. Adicione 1 μL de 1 mM rotenona (ROT) para uma concentração final de 0,5 μM. Adicione 2 μL de 1 mg/mL de antimicina (AM) para uma concentração final de 1 μg/mL.
    9. Reoxigenar as câmaras para alcançar um nível de oxigênio semelhante (~150 μM) em todas as câmaras, levantando lentamente o êmbolo em movimento de torção.
    10. Adicione 5 μL de 0,8 M ascorbate para uma concentração final de 2 mM imediatamente seguido por 5 μL de 0,2 M N,N,N',N',N'-tetramethyl-p-fenilediamina (TMPD) para uma concentração final de 0,5 mM para avaliar a atividade iv complexa (opcional).
    11. Adicione 5 μL de 4 M de azida para uma concentração final de 10 mM imediatamente quando o pico O2 fluxo for atingido com TMPD. Continue a corrida de >5 min para avaliar a auto-oxidação do TMPD para o cálculo complexo do nível base IV.
    12. Reconta as células para confirmar a contagem de células pré-corrida e continuar com a etapa 1.9.
      NOTA: A digitonina-permeabilização (apenas para células) precisa ser titulada em experimentos experimentais para atingir o fluxo máximo e não afetar a integridade da membrana mitocondrial (ver passo 1.7). Amostras permeabilizadas (especialmente tecido muscular) com aumento de >10% na taxa de respiração após a adição de citocromo c devem ser excluídas de análises posteriores devido a danos na membrana mitocondrial externa. Espera-se um pequeno mergulho no fluxo após a adição de produtos químicos dissolvidos por EtOH.
  7. Protocolo para determinar condições ideais de permeabilização para células
    1. Adicione células conforme descrito nas etapas 1.2 e 1.5.2.
    2. Pegue 10 μL de 10 mg/mL de digitonina e adicione 10 μL de DMSO para diluir para 5 mg/mL.
    3. Adicione 1 μL de rotenona (1 mM de estoque). Adicione 10 μL de succinato (2 mM de estoque) e 5 μL de ADP (estoque de 0,5 M).
    4. Titulação 1 μL de digitonina (2,5 mg por passo) repetidamente até que a respiração não aumente ainda mais e seja máxima.
      NOTA: A diminuição da respiração indica uma concentração excessiva de digitonina.
  8. Protocolo para análise de OXPHOS em células intactas
    1. Após a respiração de rotina (etapa 1.6.1-1.6.6), adicione 2 μL de 0,01 mM de oligomicina para uma concentração final de 10 nM.
    2. Titrate FCCP a partir de 2 mM de estoque, adicione 0,6 μL com etapas subsequentes de 0,2 μL até que nenhum aumento adicional na respiração e respiração seja maximamente desacoplado (teórico: não acoplado)
    3. Adicione 1 μL de rotenona de 1 mM para uma concentração final de 0,5 μM. Adicione 2 μL de 1 mg/mL de antimicina para uma concentração final de 1 μg/mL.
    4. Reoxigenar a câmara ao mesmo nível de oxigênio (~150 μM) levantando lentamente o êmbolo em movimento de torção.
    5. Adicione 5 μL de 0,8 M de ascorbate para concentração final de 2 mM. Adicione imediatamente 5 μL de 0,2 M TMPD para uma concentração final de 0,5 mM para avaliar a atividade iv complexa.
      NOTA: Prepare um lote fresco antes que qualquer conjunto maior de experimentos, pois o TMPD seja propenso à auto-oxidação. A atividade pode diminuir ao longo do tempo quando armazenada a -20 °C.
    6. Adicione 5 μL de 4 M de azida para uma concentração final de 10 mM imediatamente quando o pico O2 fluxo for atingido com TMPD. Continue a execução por >5 min para avaliar a auto-oxidação do TMPD para o cálculo complexo do nível base IV.
    7. Reconte células para confirmar a contagem de células pré-corrida e continuar com a etapa 1.9.
  9. Coleta de amostras pós-escorrida
    1. Colete exatamente 1 mL de suspensão MiR05 de cada câmara (com agitadores ligados) em um tubo de 1,5 mL tubo de 1,5 mL.
    2. Centrifugar a 1000 x g para células permeabilizadas ou a 20.000 x g para lise tecidual. Remova o sobrenante e congele a pelota a -80 °C para processamento adicional (seção 3).
  10. Análise dos protocolos DA SUIT
    1. Analise o fluxo de oxigênio (pmol/s, normalizado para entrada) em cada platô após a adição de um substrato ou inibidor (Figura 1C e Figura 3A). Exporte os valores para uma planilha.
    2. Subtrair o valor residual de consumo de oxigênio (ROX, Figura 1C e Figura 3C) de todos os valores de cada execução experimental. Subtrair a respiração residual de azide do TMPD para obter respiração IV complexa.
    3. Plote os valores absolutos normalizados para entrada celular (Figura 3A, B) ou de tecido (Figura 5A,B). Calcule as razões de controle de fluxo (etapa 1,11) ou normalize-as para entrada de proteína (Figura 3C).
  11. Cálculo da razão de controle de fluxo
    1. Adquira um índice de função respiratória e controle de acoplamento utilizando razões de controle de fluxo (FCR)9,26.
      NOTA: Isso permite avaliar a qualidade mitocondrial intrínseca, independente da quantidade mitocondrial. Além disso, as razões de controle de fluxo (FCR) são comparáveis dentro das mesmas linhas celulares que permitem o controle de qualidade do reagente (as respectivas FCRs são obtidas através dos valores de referência numerados indicados nas Figuras 1B-D e Figura 3C).
    2. Calcule a razão de controle respiratório para o acoplamento de OXPHOS ao LEAK usando a Equação 1.
      Equação 1: FCRADP = 5/6 = Estado 3 / Estado 4
    3. Calcule o FCR para avaliar a respiração dependente de NADH usando a Equação 2
      Equação 2: Estado fcr3 (I) = 3/5 = Estado 3 (I) / Estado 3 (I+II)
    4. Calcule o FCR para avaliar a respiração dependente de succinato usando a Equação 3.
      Equação 3: Estado FCR3 (II) = 8/7 = Spodridão /capacidade de ETS
    5. Calcule o FCR para avaliar acoplado a desacoplamento usando a Equação 4.
      Equação 4: FCRacoplado/desacoplado = 5/7 = Estado 3 (I+II) /Capacidade de ETS
    6. Para testar a integridade da membrana externa mitocondrial, use a Equação 5.
      Equação 5: % dano de membrana externa mitocondrial = 3/4 = Estado 3 (I) / Estado 3 (I) com cyt c

2. Respirometria de alta resolução: Respirômetro à base de microplaco (mHRR)

NOTA: Os experimentos nesta seção do protocolo foram realizados utilizando-se o Analisador de Fluxo Extracelular Seahorse XFe96 (Tabela de Materiais)

  1. Cultura celular
    1. Cultura qualquer tipo de célula. Os adeptos (por exemplo, colágeno, laminina) podem ser usados para facilitar o apego celular. Aqui, as células HEK293 são cultivadas como antes (passo 1.3).
    2. Um dia antes do experimento, desprende as células e transfira-as para uma microplaca designada mHRR 96-well para obter confluência ideal no dia do experimento (80%-100%) (Figura 2C).
      NOTA: Para o mHRR, as densidades de células microplacas são críticas. As propriedades de crescimento individual das linhas de células ou tratamentos que afetam o crescimento precisam ser contabilizadas para garantir confluência comparável no dia do experimento.
  2. Preparação de células para respirometria de alta resolução
    1. Colher e resuspensar as células suficientemente antes da semeadura
      NOTA: Recomenda-se às células de sementes a partir da mesma diluição para réplicas.
    2. Semeadas as células de acordo com as taxas de crescimento de linhas celulares individuais ou propriedades de crescimento em tratamento.
      NOTA: Otimize em uma microplacão padrão de 96 poços e extrapolule a densidade celular para uma microplacão específica de ensaio de 96 poços. Nesta configuração, as células 7 x 104 HEK293 WT foram semeadas por poço de um poço de 96 poços. As primeira e últimas colunas da placa de 96 poços são utilizadas para determinação proteica (Figura 2C). Os quatro poços de canto não devem conter células e são usados para correção experimental de fundo. Idealmente, poços próximos às bordas estão vazios para minimizar o efeito de borda (por exemplo, as células apresentam taxas de crescimento alteradas causadas por efeitos de temperatura) (Figura 2C, D).
  3. Preparação de placas de sensores, carregamento de inibidores
    1. No dia do ensaio, suplementar 38,8 mL de médio com 0,4 mL de glicose de 1 M, 0,4 mL de glutamina de 200 mM e 0,4 mL de 100 mM Na-Pyruato.
      NOTA: a respiração mHRR requer um meio de DMEM não tamponado especializado em pH 7.4. Em geral, 40 mL devem ser suficientes para um experimento com uma microplacão de 96 poços.
    2. Aqueça o ensaio de respiração médio a 37 °C e troque o meio de cultura celular pelo meio de ensaio respiratório lavando duas vezes com 80 μL por poço.
    3. Coloque a placa com as células em uma incubadora de 37 °C sem CO2 por 60 minutos antes do ensaio.
      NOTA: Esta etapa é essencial para desgasar a placa, pois o CO2 pode afetar os resultados respiratórios, e o soro no meio pode produzir bolhas durante o ensaio.
    4. Alíquotas inibidoras pré-aquecedoras para OM, FCCP, ROT e AM a 37 °C e tire a placa do sensor da incubadora.
    5. Diluir OM, FCCP, ROT e AM em 3 mL de médio ensaio para uma concentração final de poço de 1,5 μM, 1,125 μM e 1 μM, respectivamente. Encha em portas separadas conforme indicado na Figura 2E.
      NOTA: Recomenda-se uma pipeta multicanal para encher o cartucho do sensor. Uma vez que o ar pressurizado é usado para injetar compostos, todas as portas devem ser preenchidas com uma quantidade igual de volume líquido sempre que uma porta é preenchida com um composto. ROT e AM podem ser combinados em uma porta. Os inibidores podem ser dissolvidos em EtOH ou DMSO.
    6. Inspecione as portas de injeção e verifique um volume de carregamento uniforme para cada porta.
      NOTA: Todas as portas contêm um orifício na parte inferior para injeção. Deve-se tomar cuidado ao mover a placa do sensor. Bolhas de ar podem ser removidas usando uma agulha.
  4. Protocolo para avaliação de oxigênio em células intactas
    1. Na véspera do ensaio, realize as etapas 2.4.2-2.4.7.
    2. Alíquota de 20 mL da solução calibrante em um tubo cônico de 50 mL.
    3. Abra o Kit de Ensaio de Fluxo Extracelular e remova o conteúdo.
    4. Coloque o cartucho do sensor invertido ao lado da placa de utilidade. Pipeta 200 μL de solução calibrante em cada poço da placa de utilidade.
    5. Coloque o cartucho do sensor na placa do utilitário prestando atenção que todos os sensores estão submersos.
    6. Coloque a placa em uma incubadora de 37 °C sem CO2 durante a noite ou mínima de 12h. Verifique se a umidade dentro da incubadora é suficiente para evitar a evaporação do calibrador.
    7. Ligue o sistema e o computador baseados em microplacos para estar pronto para usar no dia seguinte (a máquina requer um mínimo de 3h para equilibrar até 37 °C antes de realizar um ensaio).
      NOTA: Para estabilidade do sinal, aumente os pontos de medição para 6 em vez de 3 ciclos de medição por estado respiratório. Cada ciclo consiste em 3 min de mistura e 3 min de medição.
    8. No dia do ensaio XF, realize as etapas 2.4.9-2.4.20.
    9. Verifique a confluência da placa de cultura celular, a morfologia das células, e que os poços de fundo estão vazios.
    10. Lave as células com o meio de respiração preparado como mencionado nas etapas 2.4.11-2.4.12.
    11. Remova todos, exceto 20 μL do meio de cultura de cada poço. Remova 55 μL se o meio de cultura tiver 80 μL devido à evaporação durante a noite (aproximadamente 5 μL).
    12. Lave as células duas vezes com 90 μL de meio de ensaio. Por fim, adicione 100 μL de meio de ensaio. O volume final deve ser de 120 μL.
      NOTA: Recomenda-se uma pipeta multicanal para esta etapa para garantir que o mesmo procedimento de lavagem tenha sido aplicado a cada condição experimental (depende da configuração da placa). Ao aspirar, incline a placa para um ângulo de 45° e coloque as pontas da pipeta no canto dos poços para aspiração e injeção de líquidos. É imperativo tomar cuidado durante a lavagem, pois certas células podem facilmente se desprender do fundo da placa de cultura celular.
    13. Coloque a placa em uma incubadora de 37 °C sem CO2 por 60 minutos antes do ensaio.
    14. Recupere a placa do cartucho do sensor hidratado da incubadora sem CO2.
    15. Descarte a solução calibrante antiga e substitua-a por uma solução calibrante fresca, pré-armada a 37 °C.
    16. Preparar inibidores e médio de ensaio (3 mL por inibidor para um total de 12 mL de meio de ensaio) e usar um reservatório de pipeta para o inibidor de carga em portas.
    17. Abra o software e execute um modelo pré-projetado ou novo. Encha o mapa da placa, ajuste as titulações e ciclos de medição e, em seguida, pressione Comece a iniciar a calibração dos sensores ópticos.
    18. Remova a tampa do cartucho carregado e coloque-a no slot que desliza automaticamente para fora da máquina, verificando se as marcas no canto inferior direito da placa se alinham com o triângulo no canto inferior direito da ranhura.
    19. Clique em Continuar a realizar a calibração automática, com duração aproximada de 20 minutos.
    20. Após a calibração, remova a placa de utilidade contendo o calibrante.
    21. Retire a tampa da microplacão contendo as células e coloque a placa no slot quando solicitada pela máquina. Clique em Continuar para iniciar a execução.
  5. Coleta de amostras pós-escorrida
    1. Retire a placa da máquina, remova cuidadosamente a mídia restante do ensaio sem perturbar as células e congele toda a placa a -80 °C para processamento adicional (seção 3).

3. Determinação da proteína utilizando o ensaio de ácido bicinchonínico (ensaio BCA)

  1. Prepare a albumina de soro bovino diluído (BSA) em tampão utilizado para extração de proteínas e compatível com BCA: 2 mg/mL, 1,5 mg/mL, 1 mg/mL, 0,5 mg/mL, 0,25 mg/mL e 0 mg/mL para curva padrão em duplicatas.
  2. Extrair proteínas reutilizando em um tampão de lise apropriado (por exemplo, RIPA) com 20 μL por poço para mHRR ou 100 μL por pelota contida dentro de um tubo de 1,5 mL para cHRR.
  3. Incubar a placa mHRR ou tubo de 1,5 mL contendo lises proteicas por 30 minutos no gelo.
  4. Centrifugar o tubo de 1,5 mL contendo o liseféico a 4 °C a 20.000 x g por 20 min e transfira o supernante resultante para um novo tubo limpo de 1,5 mL.
  5. Use 10 μL por amostra em duplicatas e padrões em uma placa de microtiter. Adicione 200 μL de reagente de trabalho BCA e incubar por >15 min.
  6. Leia a placa em um espectrofotômetro padrão em um comprimento de onda de 562 nm e calcule as concentrações proteicas usando uma curva padrão BSA.
  7. Normalizar os resultados da respiração para a concentração de proteínas.
    NOTA: A normalização da quantidade proteica permite corroborar densidades de semeadura celular ou entrada de peso molhado. As proteínas extraídas são adequadas para a imunoblotação subsequente contra subunidades do ETS, por exemplo, mas não representam totalmente a amostra nativa (por exemplo, perda de locais de fosforilação).

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Representative Results

Aqui, fornecemos protocolos para determinar os bioenergetics mitocondriais em células eucarióticas, tecido não fibroso (por exemplo, cerebelo) e tecido fibroso (por exemplo, músculo esquelético). Para células eucarióticas, hek293 com nocaute projetado por CRISPR de duas proteínas diferentes associadas à tradução mitocondrial resultando em múltiplas (CRISPRKO1) e deficiência oxphos grave/completa (CRISPRKO2) foram medidas com cHRR (Figura 3A-C) ou mHRR (Figura 3A-D).

Para o RR, as células HEK293 foram digitonin-permeabilized, e experimentos de respiração realizados seguindo o protocolo padrão (etapa 1.5-1.6) e foram registrados com sucesso (Figura 3A). CRISPRKO1 mostra prejudicado e CRISPRKO2 não respira em relação ao WT quando normalizado para a quantidade de entrada celular (Figura 3B). A quantidade proteica foi determinada a partir de amostras coletadas (seção 3), e os valores da respiração de rotina foram normalizados em quantidade proteica para calcular valores absolutos e respectivas FCRs (Figura 3C, o significado de cada FCR é detalhado em discussão). Quantidades ótimas de amostra produzem fluxos de 80-160 pmol/s por mL. Idealmente, a quantidade de células ou tecido é suficiente para gerar um fluxo significativo (20 pmol/s para cHRR) para reduzir o ruído de fundo enquanto evita a reoxigenação excessiva durante um experimento. Em baixa respiração (por exemplo, gordura adiposa branca, glóbulos brancos) ou amostras difíceis de obter (por exemplo, linhagens neuronais diferenciadas pelo iPS), fluxos de 20 pmol/s por mL são suficientes em condições ideais de trabalho.

Figure 3
Figura 3: Protocolo padrão representativo o consumo de oxigênio rastreia do cHRR usando células HEK293 com deficiência combinada de OXPHOS. (A) Traços de consumo bruto de oxigênio das células WT HEK293 e células HEK293 com defeitos de tradução mitocondrial mediados pelo CRISPR causando múltiplas deficiências de OXPHOS (CRISPRKO1,2). (B) Traços de consumo de oxigênio normalizados por células sobrepostas a partir de (A). (C) Quantificação normalizada por proteínas de dois experimentos independentes (média e SD) e respectivas FCRs. As comparações entre as condições foram feitas pelo teste de ANOVA e posteriori Tukey ou pelo teste t de um aluno. Significados: **** p < 0,0001; p < 0,001; ** p < 0,01; * p < 0,05. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Em seguida, utilizamos o mHRR com as mesmas células em um protocolo padrão (2.1-2.5), confirmando as deficiências de OXPHOS (Figura 4A). Além disso, os valores de ECAR foram aumentados para deficiência de OXPHOS grave/completa (CRISPRKO2), sugerindo compensação da deficiência de fosforilação oxidativa mitocondrial em células HEK293 com deficiência de tradução mitocondrial específica através do aumento da glicólise resultando na produção de lactato (Figura 4A). A quantidade proteica foi determinada a partir da placa de microwell (seção 3), e os valores obtidos foram normalizados à quantidade proteica (Figura 4B) e quantificados (Figura 4C). Sistemas baseados em microplacos são notórios por alta variação intra-bem. A alta variabilidade entre as réplicas pode ocorrer quando a densidade ideal de semeadura não foi alcançada; as células ficam separadas durante as etapas de lavagem da substituição do meio de cultura celular por técnica de ensaio, ou técnica de pipetação inadequada, como a introdução de bolhas de ar ou aspiração de volumes variados. Os tempos de medição estendidos (6 ciclos de medição) são recomendados com mHRR para permitir a estabilização do fluxo em mídia (Figura 1B e Figura 4A). Os fluxos baixos causam alta variação, e dependendo do tipo celular, o fluxo pode estar muito próximo do ruído de fundo (até 10-15 pmol/s). Células de baixo ressurreenciamento (por exemplo, fibroblastos) ou células excepcionalmente grandes podem produzir fluxo de oxigênio insuficiente acima do nível de ruído de fundo no formato de microplato de 96 poços, mesmo com 90% de confluência. Nesse caso, deve-se considerar o mHRR de 24 poços ou o RR. Mudanças mínimas no fluxo de oxigênio também podem indicar o manuseio defeituoso do carregamento dos inibidores, como portas vazias, incorretas ou cheias variadamente. Recomenda-se o uso de pontas específicas de pipeta que entram suficientemente nas portas durante o carregamento dos produtos químicos para permitir que os produtos químicos cheguem à porta individual (Figura 2E).

Figure 4
Figura 4: Protocolo padrão representativo o consumo de oxigênio rastreia o mHRR usando células HEK293 com deficiência combinada de OXPHOS. (A) Traços de consumo bruto de oxigênio das células WT HEK293 e células HEK293 com defeitos de tradução mitocondrial mediados pelo CRISPR causando múltiplas deficiências de OXPHOS (CRISPRKO1,2). (B) Respectivas taxas de acidificação extracelular (ECAR) a partir de (A). (C) Traços de consumo de oxigênio normalizados por proteínas de células WT HEK293 e células HEK293 com deficiência de tradução mitocondrial mediada pelo CRISPR causando múltiplas deficiências de OXPHOS (CRISPRKO1,2). (D) Quantificação normalizada por proteína de poços (n = 8 por genótipo; média e DD). As comparações entre as condições foram feitas pela ANOVA e pelo teste posteriori Tukey. Significados: **** p < 0,0001; p < 0,001; ** p < 0,01; * p < 0,05. Abreviaturas: veja a Figura 1. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Um exemplo de experimento para preparação de tecidos não fibrosos (passo 1.3 e 1.5-1.6) usando cerebelo de camundongo (Figura 5A) e preparação de tecido fibroso (passo 1.4 e 1.5-1.6) usando músculo esquelético do rato (soleus) é mostrado (Figura 5B). Em geral, a respiração não acoplada não excede a capacidade oxphos em amostras de camundongos. Para o cerebelo do rato, a capacidade de OXPHOS diminuiu ao comparar com a capacidade máxima de ETS. A respiração do LEAK aumentou sob circunstâncias fisiologicamente controladas versus quimicamente induzida (oligomicina). Isso pode ser devido ao fato de que o ADP disponível e endógeno ainda é fosfoilado para ATP, enquanto que com indução química, o vazamento de prótons é máximo, resultando em uma superestimação da respiração de VAZAMENTO. Em contraste com o cerebelo, o soleus foi testado em condições hiperóxicos para evitar limitação de difusão de oxigênio e mostra três vezes maior capacidade oxphos. A respiração dependente de NADH é diferente ao analisar tipos específicos de tecido, com o soleus tendo mais capacidade de respirar através da adição de succinato do que o cerebelo. Ambos os tipos de tecido apresentam ROX mínimo.

Figure 5
Figura 5: Traços representativos do consumo de oxigênio para tecidos não fibrosos (A) e fibrosos (B) para cHRR. (A) Traço de consumo de oxigênio normalizado de tecido molhado do cerebelo do camundongo preparado conforme descrito (passo 1.3). (B) Traço de consumo de oxigênio normalizado pelo tecido molhado do músculo soleus do rato como descrito (passo 1.4). A linha azul mostra seus respectivos pontos de concentração de oxigênio e injeção. Abreviaturas: veja a Figura 1. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Químico Concentração
BSA, livre de ácido graxo 1 g/L
D-sacarose 110 mM
EGTA 0,5 mM
HEPES 20 mM
KH2PO4 10 mM
Ácido lactobiônico 60 mM
MgCl2·6H2O 3 mM
Taurina 20 mM

Tabela 1: Composição miR05 média de respiração mitocondrial ajustada ao pH 7.127.

Químico Concentração
Anidro CaK2EGTA 2,77 mM
Dithiothreitol (DTT) 0,5 mM
Imidazol 20 mM
K2EGTA, anidro 7,23 mM
Hidratar MES 50 mM
MgCl2-6H 2O 6,56 mM
ATP2 5,77 mM
Na2Fosphocreatine 15 mM
Taurina 20 mM

Tabela 2: Composição relaxante e de preservação da biópsia (BIÓPS) ajustada ao pH 7.128.

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Discussion

Tradicionalmente, bioenergetics mitocondriais tem sido estudado com eletrodos de oxigênio do tipo Clark. A falta de resolução e throughput, no entanto, justificava o avanço tecnológico. Até o momento, o O2k (conhecido como cHRR) e o Seahorse XF96 Flux Analyzer (conhecido como mHRR) foram amplamente adotados no campo dos bioenergésicos celulares. Aqui, apresentamos uma coleção compreensível de protocolos para análise do metabolismo de energia celular através da avaliação da respiração mitocondrial usando cHRR ou mHRR, discutimos os principais benefícios de cada dispositivo e fornecemos orientação prática. Os protocolos aqui fornecidos abrangem células de mamíferos, tecidos fibrosos (duros), como músculo esquelético e cardíaco, e tecidos não fibrosos (macios), como cérebro e fígado, e são aplicáveis a tipos semelhantes de material amostral.

Embora ambos os métodos hrr resultem em dados comparáveis para células mamíferas como exemplificados com HEK293 com deficiência múltipla de OXPHOS, princípios gerais de trabalho e configuração técnica dos dispositivos os tornam adequados para diferentes aplicações. A configuração mHRR permite a aquisição automatizada de dados e possui capacidade de alto rendimento com uma configuração multi-bem de 24 ou 96 que exige quantidades mínimas de amostra. No entanto, o baixo volume experimental e a superfície do poço, além do uso de polímeros permeáveis de oxigênio (poliestireno), podem causar alta variação intra-poço (especialmente na configuração da placa de 96 poços), promovendo o uso de poços de ≥6 por condição para resultados reprodutíveis. Em contraste com o sensor de oxigênio polarográfico baseado em rCR, nenhum oxigênio é consumido pelas sondas sensoriais do mHRR, que utiliza a sensação de fosforescência S.A. Como o mHRR é um sistema semi-fechado, o ambiente O2 pode difundir no meio de respiração, expondo a amostra e a sonda ao oxigênio. Quando a sonda do sensor semelhante ao pistão diminui, uma câmara temporariamente selada e isolada é criada para amplificar as mudanças na concentração de O2 e medir o consumo de oxigênio. Posteriormente, um modelo matemático é empregado para calcular com precisão as taxas de consumo de oxigênio, estimando a difusão traseira de O2. No entanto, a desvantagem é que o algoritmo também amplifica o ruído29. A configuração da microplacão utiliza portas e placas especializadas não reutilizáveis que requerem uma densidade ideal de semeadura celular. As sondas do sensor de oxigênio mHRR medem a difusão lateral O2 em três áreas distintas por bem equivalente ao tamanho da sonda (~1 mm); portanto, uma monocamada celular uniformemente distribuída é crucial para determinar taxas precisas de consumo de oxigênio. Se houver lacunas significativas ao observar a distribuição celular, serão computadas taxas incorretas de consumo de oxigênio, resultando em uma alta variância de bems replicados. Levando isso em consideração, o mHRR é semi-automatizado e idealmente adaptável para estudos baseados em células de alto rendimento ou pequenos organismos (por exemplo, C. elegans) com triagens recorrentes.

A configuração de respirômetros cHRR é baseada em um sistema de duas câmaras com medição polarimétrica de oxigênio. No sistema de base fechada, o ambiente O2 não pode difundir no meio de respiração; assim, um declínio na concentração de O2 reflete o consumo de oxigênio da amostra biológica. Como o sensor de oxigênio polarográfico cHRR consome oxigênio, a difusão do O2 livre é essencial, dificultando a minimização do volume da câmara (2 mL, novos dispositivos cHRR 0,5 mL) e exigindo agitação constante para garantir a homogeneidade do meio de respiração. Consequentemente, volumes amostrais maiores são necessários para gerar fluxo de oxigênio suficiente. Devido ao acesso direto às câmaras e à titulação manual, qualquer protocolo de respiração é adaptável e baseado em produtos químicos amplamente disponíveis comercialmente resulta em custos de execução excepcionalmente baixos. Além disso, a operabilidade ad hoc permite adaptar um protocolo SUIT por titulação durante um experimento e é importante em amostras derivadas de pacientes únicas. A automação parcial é viável usando uma microbomba de injeção de titulação, que permite protocolos SUIT programáveis. Embora restrito a duas amostras por dispositivo cHRR, usuários experientes executarão vários dispositivos em paralelo. O benefício da versatilidade do desenvolvimento de ensaios e ambiente de software vem com a necessidade de treinamento mais específico para operar esses dispositivos e manutenção dependente do usuário (por exemplo, calibração de sensores polarográficos de oxigênio) a fim de adquirir dados reprodutíveis. Para aplicações avançadas, módulos adicionais são anexáveis aos dispositivos cHRR para gravar pH, módulo fluorescente para avaliar o potencial da membrana via safranin30, H2O2 via AMPLEX vermelho24 e níveisde cálcio 31.

Ambos os dispositivos requerem mídia de respiração especializada. O mHRR utiliza um meio de crescimento livre de soro comercialmente disponível, evitando o uso de bicarbonato, que desgasses sob condições baixas de CO2 e é essencial se a taxa de acidificação extracelular (ECAR) é de importância. Durante a glicolise, o piruvato é convertido em lactato, que se dissocia em ácido láctico e prótons. Esse aumento da concentração de prótons faz com que o pH diminua, o que é registrado como ECAR. Uma análise mais elaborada do ECAR é possível com o teste de estresse da glicólise. Este ensaio consiste primeiro em adicionar níveis de glicose saturando para medir a taxa glicóltica basal. Após a inibição do complexo de sintetizador ATP com oligomicina, a taxa glicolítico máxima é revelada. O passo final é medir a acidificação não glicóltica injetando 2 desoxi-glicose, o que inibe a glicólise através de vinculação competitiva à hexokinase e isoglucose fosfoglucoseisomerase 32. Outros protocolos baseados em kits disponíveis abrangem glicolise, oxidação de ácidos graxos e oxidação de glutamina. Aqui, usamos o protocolo padrão para medir a respiração basal, respiração ligada a ATP, vazamento de prótons, respiração máxima, capacidade respiratória sobressalente e respiração não mitocondrial (Figura 4A-C). Uma abordagem de utilizar o protocolo de respiração padrão em conjunto com o teste de estresse da glicólise daria uma visão das vias de energia aeróbica e anaeróbica que fornecem uma visão geral da respiração celular.

Bioenergésicos celulares geralmente são acessados em células aderentes com a configuração mHRR de microplacar. Dependente do tipo celular, o revestimento especializado para adesão (por exemplo, poli-D-lisina, gelatina, etc.) pode ser necessário (para células de suspensão) bem como para células frouxamente aderentes, pois podem se desprender da parte inferior dos ciclos de medição do poço33. Em contraste, as medidas de RR requerem agitação constante, permitindo a medição respiratória para qualquer amostra biológica. Para cada dispositivo, é necessária otimização como titulação de inibidores (e substratos) para linhas teciduais e celulares para avaliar a suscetibilidade inibidora (curvas dose-resposta). As concentrações inibidoras devem ser testadas em qualquer modelo experimental para usar as concentrações mais baixas totalmente inibidoras e para evitar inibição inespecífica, bem como contaminação desnecessária da câmara. Geralmente, 0,25 μM rotenona, 0,5 μg / mL oligomicina, 0,5 μg / mL antimicina são suficientes para a maioria das aplicações e quantidades amostrais. Para a reprodutibilidade, prepare drogas de uso único em quantidades suficientes para todos os experimentos planejados (por exemplo, grupos de camundongos) e mantenha a entrada de amostras constante dentro de um tecido ou linha celular específica. Na RHRR, os traços dos inibidores remanescentes nas câmaras alterarão o fluxo sem qualquer indicação ao operador. Particularmente traços de rotenone são difíceis de evitar e requerem lavagem suficiente com uma limpeza de câmara mínima (e rolha), que engloba a lavagem 4x com ddH2O, 2x 70% EtOH (96% pureza suficiente), 1x 100% EtOH, 1x 70% EtOH. Lavar requer girar mexões e manter os passos de EtOH por > 5 minutos cada. Para evitar contaminação bacteriana, 70% de EtOH é mantido em todas as câmaras quando as máquinas não estão em uso. Contaminantes residuais potenciais podem ser extintos pela adição de tecido não uso. Em um experimento mHRR, certos produtos químicos podem interagir com o plástico essencial de uso único34.

Os dados respiratórios obtidos através de um protocolo permeabilizado dão uma visão do ETS, enquanto um protocolo intacto fornece uma visão sobre propriedades mitocondriais, como a eficiência do acoplamento mitocondrial. De fato, propriedades gerais de energia mitocondrial podem dar o mesmo resultado, mas a transferência de elétrons subjacentes entre complexos pode ser alterada. Isso refletiria o metabolismo alterado da energia mitocondrial e requer um protocolo de permeabilização para acessar os complexos respiratórios. Da mesma forma, diferentes tecidos e células apresentam dependência de substrato alterada ao avaliar características respiratórias. Por exemplo, as fibras musculares glicolíticas são conhecidas por depender principalmente do glicerol-3-fosfato para a entrega de energia, enquanto as fibras musculares oxidativas possuem uma capacidade de transferência de elétrons duas vezes maior da oxidação naDH35,36. Na mesma nota, mitocôndrias cardíacas, fígado, tecido adiposo marrom podem utilizar ácidos graxos para sintetizar ATP, e por sua vez, o cérebro pode usar corpos cetona, predominantemente formados pela oxidação de ácidos graxos 36,37,38. Portanto, determinar características mitocondriais requer uma abordagem holística em oposição à respiração padrão dependente da glicose. mHRR geralmente abrange a avaliação de células aderentes intactas, embora a permeabilização seja alcançável (por exemplo, perfringolysina mutante recombinante O que permeabilize seletivamente a membrana celular39). No entanto, esses métodos vêm com maior complexidade devido à limitação de quatro portas de injeção. Em contraste, os tecidos não fibrosos não fibrosos e qualquer tipo de célula geralmente são livres de problemas para a RR. Normalmente, o tecido de ensaio com o mHRR não é viável; no entanto, foram estabelecidas40,41 abordagens usando mitocôndrias isoladas de um tecido.

Importante notar é que a normalização do conteúdo proteico inteiro negligencia quantidades mitocondriais absolutas. A comparação de grupos experimentais sob vários tratamentos pode diferir significativamente (por exemplo, 30 dias ratos alimentados com dieta de alta proteína mostraram um aumento de 2,5 vezes no conteúdo mitocondrial no fígado42), particularmente em tecido suscetível ao acúmulo de lipídio intracelular, como tecido adiposo marrom, fígado e músculo esquelético. Nessas situações, também é recomendado avaliar vários marcadores mitocondriais como uma aproximação para a massa mitocondrial, como a cópia mtDNA número43, a atividade de sinthase citrato10 e as proteínas mitocondriais onipresentes (por exemplo, VDAC1, TOM20). Em combinação, isso permite destilar se uma função respiratória alterada é atribuída à quantidade mitocondrial, qualidade, integridade ou uma combinação disso. Outro método complementar a isso é a implementação de FCRs. FCRs dão insights sobre diferentes estados respiratórios independentes do conteúdo mitocondrial. FcRADP deriva se o LEAK alterado ou OXPHOS alteram a eficiência das mitocôndrias para o ADP fosforilato. Oestado fcr 3 (I) reflete até que ponto a amostra depende do complexo I como comparação com o complexo II. Oestado fcr 3 (II) compara a respiração dependente do succinato com o ETS e fornece um índice de respiração mitocondrial derivado do complexo II. FCRacoplado/desacoplado é uma razão que fornece o controle de acoplamento entre OXPHOS e ETS, com uma razão de 1 sem capacidade respiratória sobressalente. A integridade da membrana externa mitocondrial pode ser avaliada através da adição de citocromo exógeno c. O citocromo c é localizado no espaço intermembrano, onde facilita a transferência de elétrons entre o complexo III e o complexo IV. Se a membrana mitocondrial externa estiver danificada, citocromo c vaza das mitocôndrias, não contribuindo mais para a respiração. A restauração desse desequilíbrio pode ser alcançada através da adição de citocromo exógeno c, consequentemente aumentando a respiração (Figura 1A, D; 5B). A atividade complexa iv é medida individualmente com TMPD após a inibição completa do OXPHOS. O fluxo de base O2 diminuirá à medida que a concentração de O2 cai porque a oxidação do TMPD é dependente da concentração de O2 . Assim, após a avaliação do ROX, todas as câmaras são oxigenadas ao nível de oxigênio igual (150 μM). A regressão linear dos pontos de dados do sinal após a adição de azida pode ser usada para interpolar o fundo químico e O2 dependente do ensaio complexo de atividade IV. Os valores ROX devem ser subtraídos de todos os valores respiratórios para corrigir para o consumo de oxigênio não mitocondrial.

Biologicamente, o ROX no caso de mitocôndrias isoladas pode ser menor do que com células/tecidos permeabilizados ou intactos. Em geral, a respiração residual é causada pela atividade de enzimas oxidase, com células e tecidos com mais substâncias autoxidizáveis do que mitocôndrias isoladas44. Além disso, com estruturas de membrana intracelular ainda intactas, a dificuldade do oxigênio para permear através de membranas celulares aumenta devido à sua carga negativa. Consequentemente, a difusão através de membranas celulares e disponibilidade intracelular de oxigênio podem ser afetadas, resultando em ROX. No entanto, o isolamento das mitocôndrias tem sido demonstrado para interromper a morfologia mitocondrial, aumentar a produção de peróxido de hidrogênio mitocondrial, juntamente com a função respiratória mitocondrial alterada45. Embora o isolamento das mitocôndrias funcionais permita uma normalização específica e possa ser necessário em determinadas condições, o processo de isolamento é demorado, geralmente requer mais material e pode não preservar a heterogeneidade mitocondrial. Por essa razão, abstivemos-nos de incluir o isolamento mitocondrial neste estudo. No entanto, para o músculo esquelético ou cardíaco, o isolamento das mitocôndrias ou do tratamento da saponina das fibras é essencial para as medidas respiratórias. Como os processos autolíticos ocorrem muito rapidamente após a eutanásia, recomenda-se a extração rápida de tecidos e a adesão ao tempo comparável para preparações entre experimentos individuais.

Em nossos experimentos, a avaliação da função respiratória mitocondrial das células mamíferas levou a resultados comparáveis com ambos os dispositivos HRR. No entanto, a respiração basal foi maior para a RHR em comparação com o mHRR. Além de inúmeros aspectos técnicos (volume da câmara, agitação e integração de sinal diferente), razões biológicas como meio de respiração alterado, tempo de colheita celular e células não anexadas causando perda de contato celular poderiam infligir as diferenças observadas. Consequentemente, os protocolos de respiração em geral e concentrações individuais de substrato e inibidor não são intercambiáveis entre sistemas pelas razões apresentadas, que podem ser de natureza técnica (por exemplo, titulação) e geralmente reagentes de ensaios diferentes (por exemplo, mídia respiratória, absorvências químicas de vidro ou polímeros). Para garantir a maior reprodutibilidade, várias considerações e recomendações técnicas abrangem (i) o uso de alíquotas de uso único para minimizar a contaminação cruzada ou ciclos de congelamento, (ii) armazenamento adequado de todos os produtos químicos (por exemplo, ADP a -80 °C para estabilidade prolongada, piruvato preparado fresco e produtos químicos sensíveis à luz no escuro), (iii) reteste regular e rigoroso de produtos químicos para eficácia (por exemplo, alterações de concentração infligidas por evaporação, perda de atividade TMPD induzida pelo armazenamento) e (iv) limpeza extensiva para remover qualquer vestígio químico. Considerações sobre a reprodutibilidade de estudos longitudinais (ao longo de vários anos) exigiriam monitorar o desempenho do dispositivo e garantir a estabilidade dos reagentes ao longo do tempo.

Finalmente, novas tecnologias baseadas em medidas potencialiométricas combinadas (pH) e amperométricas (O2) através de eletrodos à base de óxido de rutênio poderiam catalisar uma mudança de paradigma nas ferramentas atuais, permitindo estudar o metabolismo celular na cultura e in vivo46. Embora os métodos atuais permitam uma avaliação predominantemente ex vivo e in vitro do metabolismo celular, a fluorescência retardada permite a análise in vivo do oxigênio mitocondrial como medida da função mitocondrial47. Da mesma forma, a respirometria baseada em microfluidos mostra-se promissora em maior sensibilidade, exigindo apenas algumas centenas de células48. Enquanto novas metodologias estão no horizonte, até o momento, a respirometria de alta resolução continua sendo o padrão-ouro para avaliar a capacidade de respiração celular para a qual protocolos quintessencial são fornecidos aqui, aplicáveis à maioria das células, tecidos e organismos para estudar a respiração mitocondrial.

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Disclosures

Nenhum conflito de interesses para revelar.

Acknowledgments

Este trabalho foi apoiado por financiamento da Academia da Finlândia (C.B.J), da Fundação Magnus Ehrnroot (C.B.J), e de uma bolsa de doutorado da Integrated Life Sciences Graduate School (R.A.).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2 mL Potter-Elvehjem Glass/PTFE Tissue Grinder/Homogenizer Omni International 07-358029
95% O2, 5% CO2 medical gas mixture Potter for tissue grinding
ADP Sigma A 4386
Antimycin A Sigma A 8674 Chemical
Ascorbate Merck PHR1279-1G Chemical, dissolve in ethanol
BSA (fatty accid free) Sigma A 6003 Chemical
CaCO3 Sigma C 4830 Chemical
Cytochrome c Sigma C 7752 Chemical
Digitonin Sigma D 5628 Chemical
Dithiothreitol Sigma D 0632 Chemical, dissolve in DMSO
D-Sucrose Roth 4621.1 Chemical
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (High glucose) Fisher Scientific 41965-039 Chemical
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (No Glucose) Fisher Scientific A14430-01
EGTA Sigma E 4378
Etomoxir Sigma E1905 Chemical
Falcon 15 ml Conical Centrifuge Tubes Fisher Scientific AM12500 Chemical
Falcon 50 ml Conical Centrifuge Tubes Fisher Scientific AM12501
FCCP Sigma C 2920
Glucose Sigma G7021 Chemical, dissolve in ethanol
Glutamate Sigma G 1626 Chemical
GlutaMax (100x) (200 nM L-alanyl-L-glutamine dipeptide) Fisher Scientific 35050061 Chemical
HEK293 cells ATTC CRL-1573
Hemocytometer Fisher Scientific 0267151B Instrument for cell counting
Hepes Sigma H 7523 Chemical
Imidazole Fluka 56750 Chemical
KCl Merck 1.04936 Chemical
L-carnitine Sigma C0283 Chemical
Malate Sigma M 1000 Chemical
MES hydrate Sigma M8250 Chemical
MgCl2 Sigma M 9272 Chemical
Na2ATP Sigma A 2383 Chemical
Na2Phosphocreatine Sigma P 7936 Chemical
Na-pyruvate (100 mM) (100x) Fisher Scientific 11360070
NEAA (Non-essential amino acids) 100x Fisher Scientific 11140035
Normal FBS (10x) Fisher Scientific 10500064
O2k-Core: Oxygraph-2k Oroboros Instruments 10000-02 High-resolution respirometry instrument
O2k-Titration Set Oroboros Instruments 20820-03 Hamilton syringes for chemical injections
Oligomycin Sigma O 4876 Chemical, dissolve in ethanol
Palmitoylcarnitine Sigma P 4509 Chemical
Penicillin-Streptomycin Fisher Scientific 15140122
Pierce BCA Protein Assay Kit Fisher Scientific 23227
Pyruvate Sigma P 2256 Chemical
RIPA-Buffer Fisher Scientific 89900 Chemical
Rotenone Sigma R 8875 Chemical, dissolve in ethanol
Saponin Sigma S7900 Chemical

Seahorse XF DMEM assay medium pack, pH 7.4
Agilent, Santa Clara, CA		 103680-100
Seahorse XFe96 Extracellular Flux Analyzer
Agilent, Santa Clara, CA		 High-throughput respirometry instrument
Seahorse XFe96 FluxPak
Agilent, Santa Clara, CA
Includes assay plates, cartridges, loading guides for transferring compounds to the assay cartridge, and calibrant solution.
Small scissors Fisher Scientific 08-951-20
Sodium azide Sigma S2002 Chemical
Succinate Sigma S 2378 Chemical
Taurine Sigma T 8691 Chemical
TMPD Sigma T 3134 Chemical
Trypan Blue solution Merck 72-57-1 Chemical
Trypsin 0.25% EDTA Fisher Scientific 25200056
Two thin-edged forceps Fisher Scientific 12-000-122
Uridine stock (500x) Sigma U3750 Chemical

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