Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Respirometry ברזולוציה גבוהה להערכת ביו-אנרגיה בתאים וברקמות באמצעות מדים מבוססי תאים ולוחות

Published: October 26, 2021 doi: 10.3791/63000
Automatic Translation
1, 1
1Department of Biochemistry and Developmental Biology, Faculty of Medicine, University of Helsinki

Summary

הערכת זרחון חמצוני באמצעות מד נשימה ברזולוציה גבוהה הפכה לחלק בלתי נפרד מהניתוח הפונקציונלי של מיטוכונדריה ומטבוליזם של אנרגיה תאית. כאן אנו מציגים פרוטוקולים לניתוח חילוף החומרים של אנרגיה תאית באמצעות מדים מבוססי תאים ומיקרו-פלטות ברזולוציה גבוהה ודנים ביתרונות העיקריים של כל מכשיר.

Abstract

נשימה ברזולוציה גבוהה (HRR) מאפשרת ניטור של זרחון חמצוני בזמן אמת לניתוח מצבי אנרגיה תאיים בודדים ולהערכת קומפלקסים נשימתיים באמצעות פרוטוקולים מגוונים של טיטרציה מעכבי מצע-לא-מעכבי-קופלר (SUIT). כאן מודגם השימוש בשני מכשירי נשימה ברזולוציה גבוהה, ומוצג אוסף בסיסי של פרוטוקולים החלים על ניתוח תאים בתרבית, סיבי שרירי שלד ולב, ורקמות רכות כגון המוח והכבד. פרוטוקולים לתאים ורקמות בתרבית מסופקים עבור מד נשימה מבוסס תא ותאים בתרבית עבור מד נשימה מבוסס מיקרו-פלטה, שניהם מקיפים פרוטוקולי נשימה סטנדרטיים. למטרות השוואה, תאי HEK293 המהונדסים על ידי קריספר, החסרים בתרגום המיטוכונדריה הגורמים למחסור רב במערכת הנשימה, משמשים בשני המכשירים כדי להדגים פגמים תאיים בנשימה. שני ה-respirometers מאפשרים מדידה מקיפה של הנשימה התאית, כאשר היתרונות הטכניים וההתאמה שלהם תלויים בשאלת המחקר ובמודל הנחקר.

Introduction

המיטוכונדריה ממלאת את אספקת האנרגיה העיקרית ומהווה אברון ממודר התורם לתהליכים ביו-אנרגטיים ומטבוליים תאיים חיוניים כגון אנאבוליזם של נוקלאוטידים, ליפידים וחומצות אמינו, ביוגנזה של צבירי ברזל-גופרית והם מעורבים באיתות כגון מוות מבוקר של תאים 1,2,3 . ביו-אנרגיה מיטוכונדריאלית באמצעות זרחון חמצוני תורמת כמעט לכל התהליכים התאיים בתוך התא, וכתוצאה מכך, תפקודים מיטוכונדריאליים ממקור ראשוני או משני קשורים לספקטרום רחב של תנאי מחלה 4,5. תפקוד לקוי של המיטוכונדריה לא רק כרוך בשינויים במבנה או בצפיפות המיטוכונדרית אלא גם באיכות ובוויסות של מערכת הנשימה6. אלמנט איכותי זה מקיף בקרת מצע, מאפייני צימוד, שינויים לאחר התרגום, דינמיקה של כריסטה וסופר-קומפלקסים נשימתיים 7,8. לכן, ניתוח מדויק של ביו-אנרגיה מיטוכונדריאלית עבור גישות ניסיוניות ואבחון להערכת חילוף החומרים האנרגטי של התא חשוב בבריאות ובמחלות.

זרחון חמצוני מיטוכונדריאלי (OXPHOS) הוא רצף של תגובות בתוך מערכת הנשימה או מערכת העברת אלקטרונים (ETS) ליצירת אנרגיה תאית באמצעות אדנוזין טריפוספט (ATP)9. הצעד הרב-אנזימטי לרתום אנרגיה מזרימת אלקטרונים דרך קומפלקסים I ו-II ל-IV מורכב יוצר שיפוע פרוטונים אלקטרוכימי על פני הממברנה המיטוכונדרית הפנימית, המשמשת לאחר מכן לזרחון של אדנוזין דיפוספט (ADP) ל-ATP באמצעות V מורכב (F1 F 1FO ATP synthase) (איור 1A).

ראשית, נשאים של שני אלקטרונים נוצרים במהלך המחזור הטריקרבוקסילי (TCA), הגליקוליזה וחמצון הפירובט: ניקוטיןמיד אדנין דינוקלאוטיד (NADH) ודיהידרופלבין אדנין דינוקלאוטיד (FADH2). NADH מתחמצן בקומפלקס I (NADH dehydrogenase), שבמהלכו שני אלקטרונים מועברים לקו-אנזים Q (קינון מצטמצם לקינול), בעוד פרוטונים נשאבים לתוך החלל הבין-מימי (IMS). שנית, קומפלקס II (סוקסינט דהידרוגנאז) מחמצן את FADH2 ומזין את האלקטרונים לקו-אנזים Q מבלי לשאוב פרוטונים. שלישית, בקומפלקס III (Cytochrome c oxidoreductase), אלקטרונים מקו-אנזים Q מועברים לציטוכרום c בעוד פרוטונים נשאבים לתוך ה-IMS. רביעית, ציטוכרום c מעביר את האלקטרונים ל-IV מורכב (Cytochrome c oxidase), הקומפלקס הסופי לשאיבת פרוטונים, וכאשר חמצן מתפקד כמקבל אלקטרונים להטמעת פרוטונים, ובסופו של דבר יוצר מים. זהו חמצן זה כי המיטוכונדריה צורכת אשר ניתן למדוד על ידי אוקסיגרף. לבסוף, הפרוטונים הנוצרים מקומפלקס I, קומפלקס III ו- IV מורכב משמשים לסיבוב V מרוכב, ובכך יוצרים ATP9.

חשוב לציין, העברת אלקטרונים מתרחשת לא רק באופן ליניארי, המסומן אחרת כשרשרת הובלת האלקטרונים. במקום זאת, ניתן להעביר אלקטרונים למאגר הקו-אנזים Q דרך מספר מסלולי נשימה ולהקל על זרימת אלקטרונים מתכנסת. NADH-substrates ו succinate, למשל, יכולים להיכנס דרך קומפלקס I ו- II מורכב, בהתאמה. ניתן לתרום אלקטרונים מחמצון חומצות שומן באמצעות קומפלקס פלבופרוטאין המעביר אלקטרונים. ואכן, ניתוח מקיף של OXPHOS דורש גישה הוליסטית עם מצעי דלק מתאימים (איור 1A).

Figure 1
איור 1: זרחון חמצוני מיטוכונדריאלי ופרוטוקולים ספציפיים של מצע ומעכבים. כל המבנים הם מ- PDB. האיורים מתארים רק מצעים ומעכבים המתוארים במחקר זה). (B) עקבות דגימה של שטף חמצן בתאי HEK293 שלמים באמצעות פרוטוקול סטנדרטי במכשיר mHRR. (C) עקבות דגימה של שטף חמצן בתאי HEK293 שלמים באמצעות פרוטוקול סטנדרטי בהתקן cHRR. (D) עקבות דגימה של שטף חמצן בפיברובלסטים אנושיים מחלחלים מתורם בריא עם פרוטוקול SUIT המתאים. קיצורים: 1 = נשימה שגרתית של תאים שלמים; 2 = מדינה 2; 3 = מדינה 3(I); 4 = מדינה 3(I) עם cytC; 5 = מדינה 3 (I+II); 6 = דליפה(OM); 7 = קיבולת ETS; 8 = S(ROT); 9 = ROX; 10 = TMPD; 11 = Az. ROT = רוטנון, AM = אנטימיצין, ATP = אדנוזין טריפוספט, Az = Azide, OM = אוליגומיצין, FCCP = קרבוניל ציאניד p-טריפלואורו-מתוקסיפניל-הידרזון; Asc = Ascorbate, TMPD = N,N,N,N′,N′-tetramethyl-p-phenylenediamine, Succ = Succinate, M = מלאט, P = פירובט, ADP = אדנוזין דיפוספט, NAD = ניקוטינמיד אדנין דינוקלאוטיד, IMS = מרחב אינטרממברנה, FAD = פלווין אדנין דינוקלאוטיד. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

ניתוח של יכולת OXPHOS מיטוכונדריאלית באמצעות HRR הפך לשיטה ביוכימית אינסטרומנטלית בעלת ערך אבחוני לא רק עבור פגמים מיטוכונדריאליים ראשוניים10,11 אלא מתרחב לכל תחומי הביולוגיה האחרים כגון סרטן והזדקנות12. HRR מאפשר לקבוע את הנשימה התאית על ידי ניתוח של יכולת OXPHOS המיטוכונדרית, אשר משקפת ישירות מחסור מורכב נשימתי מיטוכונדריאלי בודד או משולב, ובעקיפין קשורה לתפקוד לקוי של התאים ושינוי בחילוף החומרים של האנרגיה9. מבחינה מתודולוגית, מדידות נשימה מבוצעות באמצעות תאים, רקמה או מיטוכונדריה מבודדת 11,13,14, כאשר החומר הקפוא מתאים רק באופן חלקיל-15,16. רקמה קפואה הוכחה כבעלת ETS שלם עם יציבות סופר-קומפלקס15. לפיכך, בניגוד למתווכים מסורתיים של TCA, המצעים המתאימים מוזנים ישירות לתוך ה- ETS. עם זאת, הצימוד בין הסינתזה של ETS לסינתזה של ATP הולך לאיבוד כאשר שלמות הממברנה נפגעת באמצעות נזקי הקפאה (היווצרות גבישי קרח).

ניסויי הנשימה נערכים בדרך כלל בטמפרטורה פיזיולוגית של 37 מעלות צלזיוס עבור אנדותרמים בתאים או רקמה שאינם מחלחלים או חודרים. בעוד הראשון רואה את ההקשר המטבולי הציטוזולי, האחרון מספק את התרומה האנרגטית של קומפלקסים OXPHOS בודדים ואת ה- ATPase באמצעות הוספת מצעים ספציפיים (ומעכבים). הרצף והשונות של מצעים ומעכבים הובילו לפיתוח מערך מגוון של פרוטוקולי SUIT17 ומבחנים18 כדי לענות על שאלות מדעיות שונות של תפקוד OXPHOS (שנסקרו תחת12). הפרוטוקול הבסיסי של הנשימה התאית מעריך ארבעה מצבים שונים: א) נשימה שגרתית - הנשימה במדיית הנשימה המתאימה ללא כל תוספת של מצעים או מעכבים הצורכים מצעים אך אנדוגניים. מצב זה יכול לחשוף OXPHOS כללי או פגמי נשימה הנגרמים משנית הנגרמים, למשל, על ידי פרופילי מטבוליטים שהשתנו. לאחר מכן, התוספת של מעכב ATPase אוליגומיצין חושפת את החדירות של הממברנה המיטוכונדרית הפנימית לפרוטונים, המוגדרים כ- ii) נשימת דליפה. טיטרציה עוקבת של פרוטונופור כגון קרבוניל ציאניד p-trifluoro-מתוקסיפניל-הידרזון (FCCP) מאפשרת לקבוע את המצב שבו קיבולת ETS היא מקסימלית במצב מעגל פרוטון פתוח-טרנס-ממברני, המוגדר כ- iii) נשימה לא משותפת. חשוב לציין, מצב לא מגובש יכול להתרחש גם על ידי התערבויות ניסיוניות באמצעות נזק מכני מוגזם לממברנות המיטוכונדריה. לעומת זאת, המצב הלא מצומד מתייחס לאי-שיתוף פעולה נשימתי על ידי מנגנון פנימי הנשלט מבחינה פיזיולוגית. לבסוף, עיכוב מלא של ETS על ידי הוספת אנטימיצין מעכב III מורכב ומעכב I מורכב רוטנון קובע את צריכת החמצן השיורית (ROX) מתהליכים שאינם צורכים חמצן מיטוכונדריאלי (איור 1A-C).

ביו-אנרגיה מיטוכונדריאלית מורכבת מחמישה מצבי נשימה נפרדים19,20. הנשימה של מצב 1 היא ללא כל מצעים נוספים או ADP, למעט מה שזמין באופן אנדוגני. לאחר הוספת ADP, אך עדיין, אין מצעים, מושגת הנשימה של המדינה 2. כאשר מוסיפים מצעים, המאפשרים העברת אלקטרונים וסינתזת ATP, מגיעים למצב 3 הנשימה. במצב זה, ניתן להגדיר את יכולת ה-OXPHOS בריכוזים רוויים של ADP, פוספט אנאורגני, חמצן, NADH ומצעים הקשורים לסוקסינט. ניתן להגדיר את הנשימה של מצב 4 או נשימה של דליפה כמצב ללא ADP או סינתזות ATP מעוכבות כימית תוך שימוש במצעים מספיקים. לבסוף, כאשר כל החמצן מתרוקן (אנוקסי) בסביבה של תא סגור, נצפתה נשימה במצב 5.

קיימות מספר שיטות להערכת מצבי אנרגיה תאית14 עם שני מכשירים השולטים בהערכה הנוכחית בזמן אמת של OXPHOS באמצעות ניתוח של צריכת חמצן, הנמדדת כפונקציה של הירידה בחמצן לאורך זמן במערכת סגורה עם ישימות שונה התלויה במודל הניסוי ובשאלת המחקר: מד הנשימה ברזולוציה גבוהה של Oroboros 2k ומנתח השטף החוץ-תאי של סוסון הים XF. שני המכשירים מתעדים את שיעורי צריכת החמצן כירידה בפיקומולים (pmol) של חמצן (O2) לשנייה כערך מוחלט בתוך החדר או באר המיקרו-פלטה. צריכת החמצן הספציפית לכל מסה מתקבלת על ידי נורמליזציה של צריכת החמצן המתאימה במתכון חיץ ספציפי למספר תאים (מיליונים), משקל רקמה (מ"ג) או כמות חלבון.

O2k (מכשירי אורובורוס) היא מערכת סגורה בעלת שני תאים המצוידת בחיישן חמצן פולרוגרפי (מקוצר כ-respirometer מבוסס תא ברזולוציה גבוהה: cHRR). כל תא ניסוי מכיל 2 מ"ל של נוזל אשר נשמר הומוגני על ידי מערבלים מגנטיים. חיישן החמצן הפולארוגרפי משתמש בגישה אמפרומטרית למדידת החמצן: הוא מכיל קתודה מוזהבת, אנודה כסף/כסף כלוריד, ובין לבין תמיסת KCI היוצרת תא אלקטרוכימי שעליו מופעל מתח (0.8 וולט). חמצן ממדיום הבדיקה מתפזר דרך קרום אתילן פרופילן פלואור של 25 מיקרומטר (O2-חדיר) ועובר הפחתה בקתודה, ומייצר מי חמצן. באנודה, כסף מחומצן על ידי מי חמצן, ומייצר זרם חשמלי. זרם חשמלי זה (אמפר) קשור באופן ליניארי ללחץ החמצן החלקי. הלחץ החלקי של החמצן ומקדם מסיסות החמצן של מדיום הבדיקה משמשים לחישוב ריכוז החמצן. מכיוון שלחץ חלקי של חמצן תלוי בטמפרטורה ניסיונית ומדידות פולארוגרפיות רגישות לטמפרטורה, תנודות בטמפרטורה זקוקות לוויסות מדויק (±0.002 מעלות צלזיוס) על ידי בלוק חימום פלטייה. ניתן לשלוט בטמפרטורה בטווח של 4 °C (4 °F) ו- 47 °C (74 °F).

מנתח השטף החוץ-תאי של סוסון הים XF (Agilent) הוא מערכת מבוססת צלחת עם פורמט מיקרו-פלטה של 24 או 96 בארות שבה שלוש אלקטרודות פלואורסצנטיות מודדות את צריכת החמצן לאורך זמן בכל באר (מקוצרת כ-respirometer מבוסס מיקרו-פלטה ברזולוציה גבוהה: mHRR). לכל היותר ארבע יציאות במחסנית הבדיקה זמינות להזרקה אוטומטית במהלך הבדיקה. בדיקה מכילה מספר מחזורים, שלכל אחד מהם שלושה שלבים: 1) ערבוב, 2) המתנה ו-3) מדידה. במהלך שלב המדידה, בדיקות החיישן מורדות לתוך המיקרו-לוחית ויוצרות תא סגור באופן זמני המכיל נפח של 7-10 מיקרול' למדידת האור הנפלט. אור זה נפלט על ידי פלואורופורים משובצי פולימר על קצה גשושיות החיישן, אשר חשים את O2 בהתבסס על מרווה זרחנית. עוצמת האות הפלואורסצנטי פרופורציונלית ל-O2 ומושפעת מטמפרטורת החיישן ומתווך הבדיקה. לכן, הערכת חמצן מדויקת דורשת גישה יחסית עם רקע היטב ללא כל דגימה. שחזור ריכוז החמצן מתרחש במהלך שלב הערבוב כאשר החיישן נע מעלה ומטה כדי לערבב את הנפח מעל התא הזמני. כל מחזור מחשב קצב צריכת חמצן אחד. ניתן לשלוט בטמפרטורה בטווח של 16 מעלות צלזיוס ו-42 מעלות צלזיוס.

HRR הוא תקן הזהב להערכת ביו-אנרגיה תאית במחלות ראשוניות הקשורות למיטוכונדריה ובחילוף חומרים תאי כללי. במחקר זה, פרוטוקולים בסיסיים עבור HRR מסופקים כדי להעריך את תפקוד OXPHOS בתאים וברקמות.

Figure 2
איור 2: זרימת עבודה להכנה של תאים ורקמות ל-cHRR, והכנת תאים לנשימה של mHRR. (A) חלוקה לרמות של פרוטוקולים שסופקו. (B) תאי יונקים (שלב 1.2): כדור HEK293 השווה ל-3 x 106 תאים (לוח שמאלי). רקמה לא סיבית (שלב 1.3): הכנת מורין המוח הקטן ליזט ב-2 מ"ל קדר טפלון (לוח אמצעי). חדירה של שרירי השלד המושרה על ידי ספונין (שלב 1.4) פאנל ימני) עבור respirometry cHRR. (C) פריסת זריעת מיקרו-פלטה סטנדרטית (שלב 2.4) ובדיקת מפגש לניתוח תאים אאוקריוטים (HEK293) עבור נשימה mHRR. (ד, ה) סכימה של טעינת יציאת הזרקה עבור respirometry mHRR (שלב 2.4). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

כל הניסויים בבעלי חיים מבוצעים בהתאם למועצה הלאומית לבדיקת ניסויים בבעלי חיים ולסוכנות המנהלית הממלכתית האזורית של דרום פינלנד. במחקר זה נעשה שימוש בעכברי C57BL/6JOlaHsd זכרים (בני 4-6 חודשים). הסכמה לשימוש בקווי תאים אנושיים התקבלה מוועדת האתיקה המוסדית של אוניברסיטת הלסינקי.

1. נשימה ברזולוציה גבוהה: מד נשימה מבוסס תא (cHRR)

הערה: הניסויים בחלק זה של הפרוטוקול בוצעו באמצעות Oroboros O2k-Core: Oxygraph-2k (טבלת חומרים)

  1. כיול חיישני חמצן
    1. קדם-הפעלה של מדים ב-37 מעלות צלזיוס ב-2.1 מ"ל של מדיום נשימה מיטוכונדריאלי (MiR05, טבלה 1, מקדם מסיסות: 0.92) למשך >45 דקות ומבצעים כיול חמצן כמתואר21. המשך אם השינוי הבסיסי הוא בתוך ± 4 pmol/s.
      הערה: תנודות גדולות באות הרקע עשויות להצביע על תחזוקה נדרשת של קרום החיישן או עקבות של מעכבים שנותרו בתא מניסויים קודמים. תיקון שטף חמצן ברקע אינסטרומנטלי מומלץ לפני קבוצת ניסויים25.
    2. רשמו ערכי כיול חמצן כדי לנטר את ביצועי קרום החיישן לאורך זמן.
      הערה: הדבר חושף את תפקוד החיישן, את יציבות האות לרעש וכאשר נדרשת תחזוקת ממברנת חיישן. תלוי בלחץ הסביבה, בין 180-200 מיקרומול של חמצן הוא solubilized ב MiR05.
    3. הסר את כל הנוזלים בתא לפני הוספת דגימה כלשהי במדיום הנשימה.
      הערה: הערך את נפח תאי הנשימה כך שיהיה בדיוק 2 מ"ל באופן קבוע.
  2. הכנת תאים לנשימה ברזולוציה גבוהה
    1. תאי תרבית HEK293 במנות בקוטר 10 ס"מ2 במדיום הנשר המהונדס של דולבקו (DMEM) עם גלוקוז גבוה בתוספת 10% סרום בקר עוברי מומת בחום (FBS), גלוטמקס, חומצות אמינו לא חיוניות, ו- Na-Pyruvate22 ואורידין23 לתמיכה בחילוף חומרים פגום של OXPHOS באינקובטור ב-37 מעלות צלזיוס ב-5% CO2.
      הערה: כל סוג של תא אאוקריוטי יכול להיות תרבית. עבור רוב סוגי התאים, גידול צלחת של 10 ס"מ2 מוביל למספיק תאים (בדרך כלל >3 x 106 תאים). בדקו באופן שגרתי אם יש זיהום במיקופלסמה כדי למנוע השפעות על חילוף החומרים והנשימה של התאים.
    2. לגדל תאים ללא יותר מ-90% מפגש (איור 2C).
      הערה: תאים עם מפגש של >90% עשויים להראות השפעות מעכבות תלויות גדילה על הנשימה (אם אינם מסונכרנים או פוסט-מיטוטיים).
    3. לשטוף את התאים עם 1x PBS, לנתק עם 1 מ"ל של 0.25% טריפסין חם, להשבית טריפסין על ידי הוספת DMEM חם (5 מ"ל / 10 ס"מ2 צלחת) ולספור את התאים עם המוציטומטר.
    4. צנטריפוגה עדינה של תמיסת התאים השווה ל-2.5 x 106 תאים ב-300 x גרם למשך 5 דקות, הסר את הסופרנט לחלוטין, ובצע החייאה ב-2.5 מ"ל של MiR05 חם (1 x 106 תאים/מ"ל) (איור 2A).
    5. עבור תאי השעיה, ספרו והסירו תמיסה השווה ל-2.5 x 106 תאים, הוציאו כדור והמשיכו כאמור בשלב 1.2.4.
    6. הפעל פרוטוקול SUIT למיטוב חדירה (שלב 1.6), תא או רקמה מחלחלים (שלב 1.5) או תאים שלמים (שלב 1.7)
      הערה: לקבלת תוצאות עקביות, מומלץ לשמור על ריכוז תאים קבוע (לדוגמה, 1 x 106 תאים/מ"ל). אף על פי שנשימה אינה תלויה בצפיפות התאים במד הנשימה24, המצעים והמעכבים נמצאים בריכוז דומה לאורך כל הניסויים אם מספרי התאים נשמרים קבועים.
  3. הכנת רקמה לא סיבית (למשל, מוח, כבד) לנשימה ברזולוציה גבוהה
    1. לבלות חתיכת רקמה הומוגנית, 30-40 מ"ג במשקל, או להשתמש באיבר כולו (המוח הקטן של העכבר במקרה זה).
      הערה: אם לא נעשה שימוש מיידי ברקמה, יש לשמור על 2 מ"ל של MiR05 קר כקרח המאפשר שימור של עד 2 שעות עבור רוב הרקמות. יש להעריך את זמני האחסון של רקמות בודדות בסדרות זמן.
    2. מכתימים את הרקמה יבשה עם נייר מסנן Whatman (זהירות: חומר רקמה רכה נוטה להידבק).
    3. ממקמים את חתיכת הרקמה של 30-40 מ"ג לתוך פוליטטטרפלואורואתילן קדר Elvehjem הומוגנייזר מקורר בקרח של 2 מ"ל.
    4. הוסיפו כמות מתאימה של MiR05 כדי להשיג 20 מ"ג/מ"ל כדי לשמור על יחס הרקמה למאגר. שמור על הכמות הכוללת >1.5 מ"ל ו- <2 מ"ל כדי למנוע נוזלים לא מספיקים או מוגזמים לחדירה מכנית מתאימה.
    5. מכניסים את המזיק, מכניסים את הרקמה באיטיות על ידי נסיגה של המזיק בזהירות תוך הימנעות מיצירת ואקום הגורמת נזק מוגזם לרקמות.
    6. בצעו 7 פעימות בסך הכל (פי 1 מוגדרות כמכה אחת כלפי מעלה ומטה) עד לשקר (נראה כנוזל עכור ללא פסולת גדולה) (איור 2B).
      הערה: יש לבדוק את מספר השבץ עבור תזה מתאימה עבור כל רקמה על ידי הערכת שלמות הממברנה המיטוכונדרית החיצונית באמצעות תגובת ציטוכרום C (שלב 1.5.11). רקמת חיבור קשה ללייזה או חלקי כלי דם עשויים להישאר.
    7. דחקו את הרקמה השקועה לצינור צנטריפוגה של 15 מ"ל.
    8. שטפו את החלק הפנימי של הקדר עם כמות שווה של MiR05 המשמשת לליזוז שלב (למשל, 1.5 מ"ל) והוסיפו לצינור 15 מ"ל המכיל כעת 3-4 מ"ל של MiR05 ב-10 מ"ג/מ"ל ליזט רקמה.
    9. הוסף 2 מ"ל של MiR05 רגיל לכל תא כדי להתחמם עד 37 °C (74 °F).
    10. סובבו את הצינור לחלוקה שווה לפני שתזרמו 500 μL (שווה ערך ל-5 מ"ג) של כל ליזאט לכל תא באיטיות כדי למזער את הלחץ מהקור ל-37 מעלות צלזיוס.
    11. המתן >3 דקות עד שתכולת החדר תתחמם ל -37 מעלות צלזיוס לפני סגירת החדר. יש להסיר עודפי נוזלים על גבי הפקק (כמות לכל תא לאחר הסגירה: 4 מ"ג).
    12. הפעל את פרוטוקול SUIT עבור permeabilized סטנדרטי (שלב 1.5).
  4. הכנת רקמה סיבית (שרירי השלד, שריר הלב) לנשימה ברזולוציה גבוהה
    1. הוציאו את הרקמה הקשה, הסירו את רקמת החיבור והשומן מהשרירים באמצעות מלקחיים חדים ב-2 מ"ל של BIOPS קרים כקרח (טבלה 2) תחת מיקרוסקופ דיסקציה.
    2. הפרד את צרורות הסיבים (כ-4 מ"ג) לאורך ציר האורך במלקחיים חדים. יש להקניט את הסיבים בצורה מספקת כדי לקבל מבנה דמוי רשת (איור 2B).
      הערה: הפרדת סיבים מכניים נכונה וחדירה מסומנת על ידי אובדן המיוגלובין של הפיגמנט האדום ושקיפות מוגברת.
    3. יש לשטוף ולחלחל את צרור הסיבים בספונין (50 מיקרוגרם/מ"ל ב-BIOPS, מוכן טרי) למשך 20 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס (הסיבים הופכים שקופים, מה שמעיד על חדירה מלאה, איור 2B).
    4. שטפו את הסיבים פעמיים ב-MiR05 למשך 5 דקות לכל שטיפה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
    5. מתייבשים בנייר מסנן ושוקלים לפני שמוסיפים לתא מלא ב-2.1 מ"ל MiR05.
    6. הציגו פקקים ללא סגירה מלאה, ואז חמצנו את התאים ב-2 מ"ל של O2 טהור על ידי שימוש במזרק של 20 מ"ל וסגרו את התאים על ידי סיבוב הפקקים בתנועה מסתובבת. שמור על ריכוז O2 בין 300-500 μM במהלך הניסוי כדי למנוע מגבלת דיפוזיה של חמצן.
  5. פרוטוקול להערכת נשימה שגרתית בתאים או ברקמות
    1. הוסף דגימה לתא כאמור בשלבים 1.5.2-1.5.3.
    2. הוסף 2.3 מ"ל של תרחיף תאי MiR05 חם (קלט סטנדרטי: 1 x 106 תאים /מ"ל כמו בשלב 1.2 או 2 מ"ג של רקמה / מ"ל כמו בשלב 1.3)
    3. שרירי השלד והלב (שלב 1.4): הוסיפו כ-4 מ"ג של סיבים מחוררים של סאפונין ל-2.3 מ"ל של MiR05 חם בחימום מראש, בהתחשב בשלבים 1.4.4-1.4.6
    4. הפעל תאים ב-37 מעלות צלזיוס ומהירות ערבוב של 700 סל"ד. המתן >3 דקות כדי לאפשר למדיה לדגה ולסגור את התאים על ידי סיבוב הפקק בתנועה מסתובבת. ייצוב בלוק פלטייה מציין הגעה לטמפרטורה שנקבעה.
    5. (אופציונלי) שנה את מהירות המערבל ל-300 סל"ד כדי לאפשר לבועות הנותרות לברוח דרך נימי הפקק.
    6. לשאוף כל נוזל עודף על גבי הפקק. המתן במשך 10 דקות עד שיושג אות שטף חמצן יציב עם כל סוג דגימה כדי להקליט נשימה שגרתית/מצב 1, איור 1B).
    7. למדידות נשימה בתאים וברקמות חודרניות, המשך עם שלב 1.6. עבור תאים שלמים עם שלב 1.8.
  6. פרוטוקול לניתוח OXPHOS בתאים או ברקמות חודרניות
    1. השתמש בדגימת רקמה שעברה lysed (permeabilized) או בחלחול תאים על ידי הוספת 1 μL של digitonin (מלאי של 8.1 mM digitonin בדימתיל סולפוקסיד (DMSO)) לריכוז סופי של 5 מיקרוגרם/מ"ל כדי לחדור לתאים. השטף יירד ואמור להתייצב >5 דקות.
      אזהרה: דיגיטטונין רעיל באופן חריף לדרכי הנשימה, במגע עם העור או כאשר הוא נבלע.
      הערה: הזרקה של כל הכימיקלים מתבצעת עם מזרקי זכוכית מדויקים. השתמש במזרקים רק עבור כימיקלים שצוינו כדי למנוע זיהום צולב ולשטוף ביסודיות במים וב- EtOH לאחר השימוש. מזרקים חסומים עשויים לדרוש אולטראסוניזציה ב-ddH2O חם או חוט ניקוי כדי לעקור סתימות כימיות כלשהן. תמיד לסגת עודף של תמיסת המלאי המתאימה לתוך המזרק כדי למנוע החדרת אוויר לתאים. בדוק את החלק הפנימי של התאים להכנסת האוויר לאחר כל זריקה. תעד כל צעד עד שהשטף יתקדם.
    2. הוסיפו רצף מהיר: 5 μL של 0.4 M מלאט (M) לריכוז סופי של 1 mM, 5 μL של 2.0 M pyruvate (P; מוכן טרי), לריכוז סופי של 5 mM, 4 μL של 2.5 M גלוטמט (G) לריכוז סופי של 5 mM.
    3. לאחר רמת השטף הקודמת, הוסיפו 5 μL (10 μL לרקמת שריר) של 0.5 M אדנוזין דיפוספט (ADP, אליקוטים המאוחסנים בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס) לריכוז סופי של 1.25 mM.
      הערה: רקמות כגון שריר עשויות להזדקק לריכוז שונה כדי להגיע לרוויה.
    4. הוסף 5 μL של 4 mM ציטוכרום C (cytC) עבור ריכוז סופי של 10 μM.
      הערה: אופציונלי עבור תאים כדי להעריך את איכות החדירות.
    5. הוסף 16 μL של 1.25 M סוקסינט (S) עבור ריכוז סופי של 10 mM. (אופציונלי) הוסף 3 μL של 0.5 M ADP לריכוז סופי של 2 mM כדי לשלוט ברוויה של ריכוז ADP.
    6. עבור תאים ורקמה שאינה סיבית, יש להוסיף 2 מיקרול"ל של 1 מ"ג/מ"ל אוליגומיצין (OM) לריכוז סופי של 1 מיקרוגרם/מ"ל.
      אזהרה: כל מעכבי ETS שבהם נעשה שימוש הם רעילים ביותר.
      הערה: אוליגומיצין עשוי לדרוש טיטרציה לריכוז אופטימלי מכיוון שהוא יכול להדחיק את יכולת ה-ETS והוא מושמט עבור רקמת שריר. יאוקסיג'נס כאן כאשר רקמת השריר נבדקת ואם O2 הוא מתחת ל 300 μM.
    7. Titrate FCCP ממלאי של 2 mM, הוסף 0.6 μL עם צעדים הבאים של 0.2 μL עד שלא תהיה עלייה בנשימה ובנשימה היא מקסימלית לא מצומדת (תיאורטית: לא מצומדת).
    8. הוסיפו 1 μL של 1 mM רוטנון (ROT) לריכוז סופי של 0.5 μM. הוסיפו 2 μL של מלאי אנטימיצין (AM) של 1 מ"ג/מ"ל לריכוז סופי של 1 מיקרוגרם/מ"ל.
    9. יאוקסיגנס מחדש של התאים כדי להשיג רמת חמצן דומה (~150 מיקרומטר) בכל התאים על ידי הרמת הבוכנה באיטיות בתנועה מתפתלת.
    10. הוסף 5 μL של 0.8 M אסקורבט לריכוז סופי של 2 mM מיד לאחר מכן 5 μL של 0.2 M N,N,N′,N′,N′-tetramethyl-p-phenylenediamine (TMPD) לריכוז סופי של 0.5 mM כדי להעריך פעילות IV מורכבת (אופציונלי).
    11. הוסיפו 5 μL של 4 M azide לריכוז סופי של 10 mM מיד כאשר מגיעים לשיא שטף O2 עם TMPD. המשך את הריצה במשך >5 דקות כדי לבחון חמצון אוטומטי של TMPD לחישוב רמת בסיס IV מורכב.
    12. ספרו מחדש את התאים כדי לאשר את ספירת התאים לפני ההפעלה והמשיכו עם שלב 1.9.
      הערה: דיגיטגונין-פרמביליזציה (עבור תאים בלבד) צריכה להיות מעוותת בניסויים כדי להגיע לשטף מקסימלי ולא להשפיע על שלמות הממברנה המיטוכונדרית (ראה שלב 1.7). דגימות חודרניות (במיוחד רקמת שריר) עם עלייה של >10% בשיעור הנשימה לאחר הוספת ציטוכרום c יש לכלול מניתוח נוסף עקב נזק חיצוני לממברנה המיטוכונדרית. צפויה ירידה קצרה בשטף לאחר הוספת כימיקלים מומסים על ידי EtOH.
  7. פרוטוקול לקביעת תנאי חדירה אופטימליים לתאים
    1. הוסף תאים כמתואר בשלבים 1.2 ו- 1.5.2.
    2. יש ליטול 10 μL של ציר ספריטונין של 10 מ"ג/מ"ל ולהוסיף 10 μL של DMSO כדי לדלל ל-5 מ"ג/מ"ל.
    3. הוסף 1 μL של רוטנון (1 mM מלאי). הוסף 10 μL של סוקסינט (מלאי של 2 mM) ו- 5 μL של ADP (מלאי של 0.5 M).
    4. טיטרט 1 μL של דיגיטונין (2.5 מ"ג לכל צעד) שוב ושוב עד שהנשימה אינה עולה עוד יותר והיא מקסימלית.
      הערה: ירידה בנשימה מצביעה על ריכוז מופרז של דיגיטונין.
  8. פרוטוקול לניתוח OXPHOS בתאים שלמים
    1. לאחר נשימה שגרתית (שלב 1.6.1-1.6.6), הוסיפו 2 μL של 0.01 mM אוליגומיצין לריכוז סופי של 10 ננומטר.
    2. Titrate FCCP ממלאי של 2 mM, הוסף 0.6 μL עם צעדים הבאים של 0.2 μL עד שלא תהיה עלייה נוספת בנשימה והנשימה היא מקסימלית לא מצומדת (תיאורטית: לא מצומדת)
    3. הוסיפו 1 μL של 1 mM רוטנון לריכוז סופי של 0.5 μM. הוסיפו 2 μL של ציר אנטימיצין של 1 מ"ג/מ"ל לריכוז סופי של 1 מיקרוגרם/מ"ל.
    4. יאוקסיגנס מחדש של התא לאותה רמת חמצן (כ-150 מיקרומטר) על ידי הרמת הבוכנה באיטיות בתנועה מתפתלת.
    5. הוסף 5 μL של 0.8 M אסקורבט לריכוז סופי של 2 mM. הוסף מיד 5 μL של 0.2 M TMPD לריכוז סופי של 0.5 mM כדי להעריך פעילות IV מורכבת.
      הערה: הכן אצווה חדשה לפני כל קבוצה גדולה יותר של ניסויים מכיוון ש- TMPD נוטה לחמצון אוטומטי. הפעילות עשויה לרדת עם הזמן כאשר היא מאוחסנת בטמפרטורה של -20 °C (75 °F).
    6. הוסיפו 5 μL של 4 M azide לריכוז סופי של 10 mM מיד כאשר מגיעים לשיא שטף O2 עם TMPD. המשך לרוץ במשך >5 דקות כדי לבחון חמצון אוטומטי של TMPD לחישוב רמת בסיס IV מורכב.
    7. ספר מחדש את התאים כדי לאשר את ספירת התאים לפני ההפעלה והמשך עם שלב 1.9.
  9. אוסף דוגמאות לאחר הרצה
    1. אספו בדיוק 1 מ"ל של מתלי MiR05 מכל תא (עם מערבלים דולקים) לתוך צינור 1.5 מ"ל 1.5 מ"ל צינור 1.5 מ"ל.
    2. צנטריפוגה ב 1000 x g עבור תאים permeabilized או ב 20,000 x g עבור ליזט רקמה. הסר את הסופרנטנט והקפיא את הכדור בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס להמשך עיבוד (סעיף 3).
  10. ניתוח פרוטוקולי SUIT
    1. נתחו את שטף החמצן (pmol/s, מנורמל לקלט) בכל מישור לאחר הוספת מצע או מעכב (איור 1C ואיור 3A). ייצא את הערכים לגיליון אלקטרוני.
    2. הפחת את ערך צריכת החמצן השיורי (ROX, איור 1C ואיור 3C) מכל הערכים של כל ריצת ניסוי. הפחת את ההנשמה השיורית של אזיד מ- TMPD כדי להשיג נשימה IV מורכבת.
    3. התוויית הערכים המוחלטים המנורמלים עבור תא (איור 3A, B) או קלט רקמה (איור 5A,B). חשב את יחסי בקרת השטף (שלב 1.11) או נרמל אותם לקלט חלבון (איור 3C).
  11. חישוב יחס בקרת שטף
    1. לרכוש מדד של תפקוד נשימתי ובקרת צימוד באמצעות יחסי בקרת שטף (FCR)9,26.
      הערה: הדבר מאפשר להעריך את האיכות המיטוכונדרית הפנימית, ללא תלות בכמות המיטוכונדריה. בנוסף, יחסי בקרת שטף (FCR) דומים באותם קווי תאים ומאפשרים בקרת איכות ריאגנטית (FCRs מתאימים מתקבלים באמצעות ערכי הייחוס הממוספרים המצוינים באיור 1B-D ובאיור 3C).
    2. חשב את יחס הבקרה הנשימתית עבור הצימוד של OXPHOS ל- LEAK באמצעות משוואה 1.
      משוואה 1: FCRADP = 5/6 = מצב 3 / מדינה 4
    3. חישוב ה-FCR כדי להעריך את הנשימה התלויה ב-NADH באמצעות משוואה 2
      משוואה 2: מצב FCR3 (I) = 3/5 = מצב 3 (I) / מצב 3 (I+II)
    4. חשב את ה-FCR כדי להעריך את הנשימה התלויה בסוקינט באמצעות משוואה 3.
      משוואה 3: מצב FCR3 (II) = 8/7 = Sריקבון /קיבולת ETS
    5. חשב את ה- FCR כדי להעריך מצומד לבלתי מלוכד באמצעות משוואה 4.
      משוואה 4: FCRמצומד/לא מצומד = 5/7 = מצב 3 (I+II) /קיבולת ETS
    6. כדי לבדוק את שלמות הממברנה החיצונית המיטוכונדרית, השתמש במשוואה 5.
      משוואה 5: % נזק לממברנה החיצונית המיטוכונדרית = 3/4 = מצב 3 (I) / מצב 3 (I) עם ציצי c

2. נשימה ברזולוציה גבוהה: מד נשימה מבוסס מיקרו-פלטה (mHRR)

הערה: הניסויים בחלק זה של הפרוטוקול בוצעו באמצעות מנתח השטף החוץ-תאי של סוסון הים XFe96 (טבלת חומרים)

  1. תרבית תאים
    1. תרבית כל סוג של תא. ניתן להשתמש בחסידים (למשל, קולגן, למינין) כדי להקל על חיבור התאים. כאן, תאי HEK293 עוברים תרבית כמו קודם (שלב 1.3).
    2. יום לפני הניסוי, נתקו את התאים והעבירו אותם למיקרו-פלטה ייעודית של mHRR 96-well כדי להשיג מפגש אידיאלי ביום הניסוי (80%-100%) (איור 2C).
      הערה: עבור mHRR, צפיפות תאי מיקרו-פלטה היא קריטית. יש לקחת בחשבון תכונות גדילה אינדיבידואליות של קווי תאים או טיפולים המשפיעים על הגדילה כדי להבטיח מפגש דומה ביום הניסוי.
  2. הכנת תאים לנשימה ברזולוציה גבוהה
    1. לקצור ולהחזיר את התאים מספיק לפני הזריעה
      הערה: מומלץ לזרוע תאים מאותו דילול עבור שכפולים.
    2. זרעו את התאים על פי קצבי גדילה של קווי תאים בודדים או תכונות גדילה תחת טיפול.
      הערה: בצעו אופטימיזציה על לוח מיקרו-לוח סטנדרטי של 96 בארות והוסיפו אקסטרפולציה של צפיפות התא למיקרו-לוחית ספציפית לבדיקה של 96 בארות. בהגדרה זו, 7 x 104 תאי HEK293 WT נזרעו לכל באר של באר 96. העמודות הראשונות והאחרונות של הצלחת בת 96 הבאר משמשות לקביעת חלבונים (איור 2C). ארבע הבארות הפינתיות אינן אמורות להכיל תאים כלשהם ומשמשות לתיקון רקע ניסיוני. באופן אידיאלי, בארות הקרובות לקצוות ריקות כדי למזער את אפקט הקצה (לדוגמה, תאים מראים קצבי גדילה משתנים הנגרמים על-ידי השפעות טמפרטורה) (איור 2C, D).
  3. הכנת לוחות חיישנים, העמסת מעכבים
    1. ביום הבדיקה, תוסף 38.8 מ"ל של בינוני עם 0.4 מ"ל של 1 M גלוקוז, 0.4 מ"ל של 200 mM גלוטמין, ו 0.4 מ"ל של 100 mM Na-Pyruvate.
      הערה: נשימה mHRR דורשת מדיום DMEM מיוחד שאינו מאוחסן במאגר ב- pH 7.4. באופן כללי, 40 מ"ל אמורים להספיק לניסוי אחד עם מיקרו-פלטה אחת של 96 בארות.
    2. מחממים את מדיום בדיקת הנשימה ל-37 מעלות צלזיוס ומחליפים את מדיום תרביות התאים במדיום בדיקת הנשימה על ידי שטיפה פעמיים עם 80 μL לבאר.
    3. הגדר את הצלחת עם התאים באינקובטור של 37 °C ללא CO2 במשך 60 דקות לפני הבדיקה.
      הערה: שלב זה חיוני כדי לדגה את הצלחת מכיוון ש- CO2 יכול להשפיע על תוצאות הנשימה, וסרום במדיום יכול לייצר בועות במהלך הבדיקה.
    4. מעכבי טרום-נחילה עבור OM, FCCP, ROT ו-AM עד 37 מעלות צלזיוס והוציאו את צלחת החיישן מהאינקובטור.
    5. דילול OM, FCCP, ROT ו-AM ב-3 מ"ל של מדיום בדיקה עד לריכוז באר סופי של 1.5 מיקרומטר, 1.125 מיקרומטר ו-1 מיקרומטר, בהתאמה. מלאו ליציאות נפרדות כפי שמצוין באיור 2E.
      הערה: פיפטה רב-ערוצית מומלצת למילוי מחסנית החיישן. מכיוון שאוויר בלחץ משמש להזרקת תרכובות, יש למלא את כל היציאות בכמות שווה של נפח נוזלי בכל פעם שיציאה מתמלאת בתרכובת. ניתן לשלב את ROT ו- AM ביציאה אחת. ניתן להמיס מעכבים ב- EtOH או ב- DMSO.
    6. בדוק את יציאות ההזרקה ואמת נפח טעינה אחיד עבור כל יציאה.
      הערה: כל היציאות מכילות חור בתחתית להזרקה. יש לנקוט משנה זהירות בעת הזזת צלחת החיישן. ניתן להסיר בועות אוויר באמצעות מחט.
  4. פרוטוקול להערכת חמצן בתאים שלמים
    1. ביום שלפני הבדיקה, בצע שלבים 2.4.2-2.4.7.
    2. Aliquot 20 מ"ל של תמיסת calibrant לתוך צינור חרוטי 50 מ"ל.
    3. פתח את ערכת בדיקת השטף החוץ-סלולרית והסר את התוכן.
    4. הנח את מחסנית החיישן הפוכה ליד לוחית השירות. פיפטה 200 μL של תמיסת קליברנט לתוך כל באר של לוח השירות.
    5. חבר את מחסנית החיישן ללוח השירות ושים לב שכל החיישנים שקועים.
    6. הגדר את הצלחת לחממה של 37 °C ללא CO2 למשך הלילה או מינימום של 12 שעות. ודא שהלחות בתוך האינקובטור מספיקה כדי למנוע אידוי של הקליברנט.
    7. הפעל את המערכת והמחשב המבוססים על מיקרו-לוחיות כדי להיות מוכנים לשימוש למחרת (המכונה דורשת מינימום של 3 שעות כדי לשיווי משקל ל-37 מעלות צלזיוס לפני ביצוע בדיקה).
      הערה: ליציבות האות, הגדל את נקודות המדידה ל- 6 במקום 3 מחזורי מדידה לכל מצב נשימה. כל מחזור מורכב מ-3 דקות של ערבוב ו-3 דקות של מדידה.
    8. ביום בדיקת XF, בצע שלבים 2.4.9-2.4.20.
    9. ודא את המפגש של לוח תרבית התאים, את המורפולוגיה של התאים, וכי בארות הרקע ריקות.
    10. לשטוף את התאים עם מדיום הנשימה מוכן כאמור בשלבים 2.4.11-2.4.12.
    11. הסר את כל מדיום התרבות מלבד 20 μL מכל באר. הסר 55 μL אם מדיום התרבית היה 80 μL עקב אידוי במהלך הלילה (כ 5 μL).
    12. לשטוף תאים פעמיים עם 90 μL של מדיום בדיקה. לבסוף, הוסף 100 μL של מדיום הבדיקה. עוצמת הקול הסופית צריכה להיות 120 μL.
      הערה: פיפטה רב-ערוצית מומלצת לשלב זה כדי להבטיח שאותו הליך שטיפה הוחל על כל מצב ניסיוני (תלוי בהגדרת הצלחת). בעת השאיפה, הטו את הצלחת לזווית של 45° והניחו את קצות הפיפטה בפינת הבארות לשאיפה והזרקה של נוזלים. זה הכרחי כדי לטפל במהלך הכביסה כמו תאים מסוימים עשויים בקלות להתנתק מתחתית צלחת תרבית התא.
    13. הגדר את הצלחת באינקובטור של 37 °C ללא CO2 במשך 60 דקות לפני הבדיקה.
    14. שלף את לוחית מחסנית החיישן המיובשת מהאינקובטור ללא CO2.
    15. השליכו את תמיסת הקליברנט הישנה והחליפו אותה בתמיסת קליברנט טרייה, שתוכננה מראש ל-37 מעלות צלזיוס.
    16. מכינים מעכבים ומדיום בדיקה (3 מ"ל לכל מעכב בסך הכל 12 מ"ל של מדיום בדיקה) ומשתמשים במאגר פיפטה להעמסה של המעכב ליציאות.
    17. פתח את התוכנה והפעל תבנית מעוצבת מראש או חדשה. מלאו את מפת הצלחת, התאימו את הטיטרציות ואת מחזורי המדידה ולאחר מכן לחצו על 'התחל' כדי להתחיל את כיול החיישנים האופטיים.
    18. הסר את המכסה מהמחסנית הטעונה והנח אותו בחריץ שמחליק באופן אוטומטי אל מחוץ להתקן, תוך וודא שהסימונים בפינה הימנית התחתונה של הלוח מתיישרים עם המשולש בפינה הימנית התחתונה של החריץ.
    19. לחץ על המשך כדי לבצע כיול אוטומטי, שנמשך כ-20 דקות.
    20. לאחר הכיול, הסר את לוחית השירות המכילה את הקליברנט.
    21. הסר את המכסה מהמיקרו-פלטה המכילה את התאים והנח את הצלחת בחריץ כאשר היא מתבקשת על-ידי המכונה. לחץ על המשך כדי להתחיל את הריצה.
  5. אוסף דוגמאות לאחר הרצה
    1. הוציאו את הצלחת מהמכונה, הסירו בזהירות את אמצעי הבדיקה הנותרים מבלי להפריע לתאים והקפיאו את הצלחת כולה בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס להמשך עיבוד (סעיף 3).

3. קביעת חלבון באמצעות בדיקת חומצה ביסינצ'ונינית (בדיקת BCA)

  1. מכינים אלבומין מדולל בסרום בקר (BSA) במאגר המשמש למיצוי חלבונים ותואם ל-BCA: 2 מ"ג/מ"ל, 1.5 מ"ג/מ"ל, 1 מ"ג/מ"ל, 0.5 מ"ג/מ"ל, 0.25 מ"ג/מ"ל ו-0 מ"ג/מ"ל לעקומה סטנדרטית בכפילויות.
  2. הוציאו חלבונים על ידי החייאה חוזרת במאגר ליזיס מתאים (לדוגמה, RIPA) עם 20 μL לבאר עבור mHRR או 100 μL לכל גלולה הכלולה בתוך צינור 1.5 מ"ל עבור cHRR.
  3. דגירה של צלחת mHRR או צינור 1.5 מ"ל המכיל ליזאט חלבון במשך 30 דקות על קרח.
  4. צנטריפוגה צינור 1.5 מ"ל המכיל את החלבון ליזאט ב 4 °C ב 20,000 x g במשך 20 דקות ולהעביר את supernatant וכתוצאה מכך לצינור חדש ונקי 1.5 מ"ל.
  5. השתמש ב- 10 μL לכל דגימה בכפילויות ובתקנים בלוח מיקרוטיטר. הוסף 200 μL של ריאגנט עבודה BCA ודגירה למשך >15 דקות.
  6. קרא את הצלחת בספקטרופוטומטר סטנדרטי באורך גל של 562 ננומטר וחשב את ריכוזי החלבון באמצעות עקומה סטנדרטית BSA.
  7. נרמלו את תוצאות הנשימה לריכוז החלבון.
    הערה: נורמליזציה לכמות החלבון מאפשרת לאשש את צפיפויות הזריעה של התאים או את כניסת המשקל הרטוב. החלבונים המופקים מתאימים לאימונובלוטציה שלאחר מכן נגד תת-יחידות של ETS למשל, אך אינם מייצגים באופן מלא את הדגימה המקורית (למשל, אובדן אתרי זרחון).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

כאן אנו מספקים פרוטוקולים לקביעת הביו-אנרגיה המיטוכונדרית בתאים אאוקריוטים, רקמה לא סיבית (למשל, המוח הקטן) ורקמה סיבית (למשל, שרירי השלד). עבור תאים אאוקריוטים, HEK293 עם נוקאאוט מהונדס קריספר של שני חלבונים שונים הקשורים לתרגום מיטוכונדריאלי וכתוצאה מכך מרובים (CRISPRKO1) ומחסור חמור/שלם ב-OXPHOS (CRISPRKO2) נמדדו באמצעות cHRR (איור 3A-C) או mHRR (איור 3A-D).

עבור cHRR, תאי HEK293 עברו דיגיטגונין-חדיר, וניסויי נשימה בוצעו בעקבות הפרוטוקול הסטנדרטי (שלב 1.5-1.6) ותועדו בהצלחה (איור 3A). CRISPRKO1 מראה פגיעה וקריספרKO2 ללא נשימה בהשוואה ל-WT כאשר הוא מנורמל לכמות הקלט של התא (איור 3B). כמות החלבון נקבעה מדגימות שנאספו (סעיף 3), וערכי הנשימה השגרתית נורמלו לכמות החלבון כדי לחשב ערכים מוחלטים ו-FCRs בהתאמה (איור 3C, המשמעות של כל FCR מפורטת בדיון). כמויות דגימה אופטימליות מייצרות שטפים של 80-160 pmol/s לכל מ"ל. באופן אידיאלי, כמות התאים או הרקמה מספיקה כדי ליצור שטף משמעותי (20 pmol/s עבור cHRR) כדי להפחית את רעשי הרקע תוך התחמקות מחידוש מוגזם במהלך ניסוי. בנשימה נמוכה (למשל, שומן שומן לבן, תאי דם לבנים) או בדגימות שקשה להשיג (למשל, שושלות עצביות מובחנות ל-iPS), שטפים של 20 pmol/s ל-mL מספיקים בתנאי עבודה אידיאליים.

Figure 3
איור 3: עקבות צריכת חמצן בפרוטוקול סטנדרטי מייצג מ-cHRR באמצעות תאי HEK293 עם מחסור משולב ב-OXPHOS. (A) עקבות צריכת חמצן גולמיים של תאי WT HEK293 ותאי HEK293 עם פגמים בתרגום מיטוכונדריאלי בתיווך קריספר הגורמים למחסור מרובים ב-OXPHOS (CRISPRKO1,2). (B) עקבות צריכת חמצן מנורמלים של קלט-תא-על מ-(A). (C) כימות מנורמל של חלבונים של שני ניסויים בלתי תלויים (ממוצע ו-SD) ו-FCR בהתאמה. ההשוואות בין התנאים נעשו על ידי ANOVA ומבחן של פוסטריורי טוקי או מבחן t של סטודנט. משמעויות: **** עמ' < 0.0001; עמ' < 0.001; ** עמ' < 0.01; * עמ' < 0.05. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

לאחר מכן, השתמשנו ב-mHRR עם אותם תאים בפרוטוקול סטנדרטי (2.1-2.5), המאשר את הליקויים ב-OXPHOS (איור 4A). בנוסף, ערכי ECAR הוגדלו עבור מחסור חמור/מלא ב-OXPHOS (CRISPRKO2), מה שמרמז על פיצוי על מחסור בזרחון חמצוני מיטוכונדריאלי בתאי HEK293 עם מחסור ספציפי בתרגום מיטוכונדריאלי באמצעות גליקוליזה מוגברת וכתוצאה מכך ייצור לקטט (איור 4A). כמות החלבון נקבעה מצלחת המיקרווול (סעיף 3), והערכים שהתקבלו נורמלו לכמות החלבון (איור 4B) וכומתו (איור 4C). מערכות מבוססות מיקרו-פלטה ידועות לשמצה בווריאציה תוך-טובה גבוהה. שונות גבוהה בין שכפולים יכולה להתרחש כאשר צפיפות הזריעה האופטימלית לא הושגה; תאים מתנתקים במהלך שלבי הכביסה של החלפת מדיום תרבית התאים במדיום בדיקה, או בטכניקת צנרת לא נכונה כגון הכנסת בועות אוויר או שאיפה בנפחים משתנים. זמני מדידה מורחבים (6 מחזורי מדידה) מומלצים עם mHRR כדי לאפשר ייצוב של השטף במדיה (איור 1B ואיור 4A). שטפים נמוכים גורמים לשונות גבוהה, ותלויים בסוג התא, השטף עשוי להיות קרוב מדי לרעשי רקע (עד 10-15 pmol/s). נשימה נמוכה (למשל, פיברובלסטים) או תאים גדולים במיוחד עשויים לייצר שטף חמצן לא מספיק מעל רמת רעשי הרקע בפורמט של 96 בארות מיקרו-פלטה אפילו ב-90% מפגש. במקרה כזה, יש לשקול את 24 הבאר mHRR או cHRR. שינויים מינימליים בשטף החמצן יכולים גם להצביע על טיפול לקוי בהעמסת המעכבים, כגון יציאות ריקות, שגויות או מלאות בצורה משתנה. מומלץ להשתמש בקצות פיפטה ספציפיים שנכנסים לנמלים בצורה מספקת במהלך העמסת הכימיקלים כדי לאפשר לכימיקלים להגיע ליציאה הבודדת (איור 2E).

Figure 4
איור 4: עקבות צריכת חמצן בפרוטוקול סטנדרטי מייצג מ-mHRR באמצעות תאי HEK293 עם מחסור משולב ב-OXPHOS. (A) עקבות צריכת חמצן גולמית של תאי WT HEK293 ותאי HEK293 עם פגמים בתרגום מיטוכונדריאלי בתיווך קריספר הגורמים למחסור מרובים ב-OXPHOS (CRISPRKO1,2). (B) שיעורי החמצה חוץ-תאיים בהתאמה (ECAR) מ-(A). (C) עקבות צריכת חמצן מנורמלים בחלבון של תאי WT HEK293 ותאי HEK293 עם מחסור בתרגום מיטוכונדריאלי בתיווך קריספר הגורמים למחסור מרובים ב-OXPHOS (CRISPRKO1,2). (D) כימות מנורמל חלבונים של בארות (n = 8 לכל גנוטיפ; ממוצע ו- SD). ההשוואות בין התנאים נעשו על ידי ANOVA ומבחן פוסטריורי טוקי. משמעויות: **** עמ' < 0.0001; עמ' < 0.001; ** עמ' < 0.01; * עמ' < 0.05. קיצורים: ראו איור 1. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

ניסוי לדוגמה להכנת רקמות לא סיביות (שלב 1.3 ו-1.5-1.6) באמצעות המוח הקטן של העכבר (איור 5A) והכנת רקמות סיביות (שלב 1.4 ו-1.5-1.6) באמצעות שרירי שלד של עכבר (soleus) מוצג (איור 5B). באופן כללי, נשימה לא משותפת אינה עולה על קיבולת OXPHOS בדגימות עכברים. עבור המוח הקטן של העכבר, קיבולת OXPHOS ירדה בהשוואה לקיבולת ETS מקסימלית. הנשימה של דליפה גדלה בנסיבות מבוקרות פיזיולוגית לעומת המושרה כימית (אוליגומיצין). זה יכול להיות בשל העובדה כי ADP אנדוגני זמין עדיין phosphorylated ל- ATP, בעוד עם אינדוקציה כימית, דליפת פרוטונים היא מקסימלית, וכתוצאה מכך הערכת יתר של נשימה דליפה. בניגוד למוח הקטן, הסולאוס נבדק בתנאים היפראוקסיים כדי למנוע מגבלת דיפוזיה של חמצן ומראה יכולת OXPHOS גבוהה פי שלושה. נשימה תלוית NADH שונה כאשר מנתחים סוגים ספציפיים של רקמות, כאשר לסולאוס יש יותר יכולת לנשום באמצעות תוספת של סוקסינט מאשר המוח הקטן. שני סוגי הרקמות מראים ROX מינימלי.

Figure 5
איור 5: עקבות מייצגים של צריכת חמצן עבור רקמות שאינן סיביות (A) וסיביות (B) עבור cHRR. (A) עקבות צריכת חמצן מנורמלים של רקמות במשקל רטוב של המוח הקטן של העכבר שהוכנו כמתואר (שלב 1.3). (B) עקבות צריכת חמצן מנורמלים במשקל רטוב-רקמת-רקמה של שריר הסולאוס של העכבר כמתואר (שלב 1.4). הקו הכחול מראה את ריכוז החמצן ואת נקודות ההזרקה המתאימות. קיצורים: ראו איור 1. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

כימי ריכוז
BSA, ללא חומצות שומן 1 גרם/ל'
D-sucrose 110 mM
EGTA 0.5 מ"מ
HEPES 20 mM
KH2PO4 10 mM
חומצה לקטוביונית 60 mM
MgCl2·6H2O 3 מ"מ
טאורין 20 mM

טבלה 1: הנעה מיטוכונדריאלית בינונית הרכב MiR05 מותאם ל- pH 7.127.

כימי ריכוז
CaK2EGTA נטול מים 2.77 מ"מ
Dithiothreitol (DTT) 0.5 מ"מ
אימידזול 20 mM
K2EGTA, נטול מים 7.23 מ"מ
MES hydrate 50 mM
MgCl2-6H 2O 6.56 mM
Na2ATP 5.77 מ"מ
Na2פוספוקריאטין 15 mM
טאורין 20 mM

טבלה 2: הרכב תמיסת הרפיה ושימור ביופסיה (BIOPS) מותאם ל-pH 7.128.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

באופן מסורתי, ביו-אנרגיה מיטוכונדריאלית נחקרה עם אלקטרודות חמצן מסוג קלארק. עם זאת, היעדר פתרון ותפוקה מוצדקים להתקדמות טכנולוגית. עד כה, O2k (המכונה cHRR) ו- Seahorse XF96 Flux Analyzer (המכונה mHRR) אומצו באופן נרחב בתחום הביו-אנרגיה התאית. כאן, אנו מציגים אוסף מובן של פרוטוקולים לניתוח חילוף החומרים של האנרגיה התאית באמצעות הערכה של נשימה מיטוכונדריאלית באמצעות cHRR או mHRR, דנים ביתרונות העיקריים של כל מכשיר ומספקים הדרכה מעשית. הפרוטוקולים המובאים כאן כוללים תאי יונקים, רקמות סיביות (קשות) כגון שרירי השלד והלב, ורקמות לא סיביות (רכות) כגון מוח וכבד, והם חלים על סוגים דומים של חומר מדגם.

בעוד ששתי שיטות ה-HRR מביאות לנתונים דומים עבור תאי יונקים כפי שהם מודגמים ב-HEK293 עם מחסור מרובה ב-OXPHOS, עקרונות העבודה הכלליים וההגדרה הטכנית של המכשירים הופכים אותם למתאימים ליישומים שונים. הגדרת ה-mHRR מאפשרת איסוף נתונים אוטומטי ויש לה יכולת תפוקה גבוהה עם התקנה מרובת בארות של 24 או 96 הדורשת כמויות דגימה מינימליות. עם זאת, נפח הניסוי הנמוך ומשטח הבאר, בנוסף לשימוש בפולימרים חדירים לחמצן (פוליסטירן), עלולים לגרום לשונות תוך-בארית גבוהה (במיוחד במערך צלחת 96 הבאר), מה שמקדם את השימוש בקידוחים ≥6 לכל תנאי לקבלת תוצאות הניתנות לשחזור. בניגוד לחיישן החמצן הפולארוגרפי מבוסס cHRR, אין חמצן נצרך על ידי בדיקות החיישנים של ה-mHRR, המשתמשות בחישת זרחן מרווה O2 . מכיוון שה-mHRR היא מערכת סגורה למחצה, הסביבה O2 יכולה להתפזר לתוך מדיום הנשימה, ולחשוף את הדגימה ואת הגשושית לחמצן. כאשר חיישן דמוי הבוכנה יורד, נוצר תא אטום ומבודד באופן זמני כדי להגביר את השינויים בריכוז O2 ולמדוד את צריכת החמצן. לאחר מכן, נעשה שימוש במודל מתמטי כדי לחשב במדויק את שיעורי צריכת החמצן על ידי הערכת הדיפוזיה האחורית של O2. עם זאת, החיסרון הוא כי האלגוריתם גם מגביר רעש29. הגדרת המיקרו-פלטה משתמשת ביציאות וצלחות מיוחדות שאינן ניתנות לשימוש חוזר, הדורשות צפיפות אופטימלית של זריעת תאים. הבדיקות של חיישן החמצן mHRR מודדות דיפוזיה רוחבית של O2 בשלושה אזורים נפרדים לכל באר המקבילה לגודל הגשושית (~1 מ"מ); לכן, מונו-שכבת תאים המפוזרת באופן אחיד היא חיונית כדי לקבוע שיעורי צריכת חמצן מדויקים. אם קיימים פערים משמעותיים כלשהם בעת התבוננות בהתפלגות התאים, יחושבו שיעורי צריכת חמצן שגויים, וכתוצאה מכך יחושבו שונות גבוהה של שכפולים טובים. אם ניקח זאת בחשבון, mHRR הוא אוטומטי למחצה וניתן להתאמה אידיאלית למחקרים מבוססי תאים בתפוקה גבוהה או מבוססי אורגניזמים קטנים (למשל, C. elegans) עם הקרנות חוזרות.

מערך ה-cHRR respirometers מבוסס על מערכת דו-תאית עם מדידה פולארימטרית של חמצן. במערכת מבוססת הסגורה, הסביבה O2 אינה יכולה להתפזר לתוך מדיום הנשימה; לפיכך, ירידה בריכוז O2 משקפת את צריכת החמצן של הדגימה הביולוגית. מכיוון שחיישן החמצן הקוטבוגרפי cHRR צורך חמצן, דיפוזיה של O2 חופשי היא חיונית, מה שמקשה על צמצום נפח התא (2 מ"ל, מכשירי cHRR חדשים 0.5 מ"ל) ודורש ערבוב מתמיד כדי להבטיח הומוגניות של מדיום הנשימה. כתוצאה מכך, נפחי דגימה גדולים יותר נדרשים כדי לייצר שטף חמצן מספיק. בשל גישה ישירה לתאים וטיטרציה ידנית, כל פרוטוקול נשימה ניתן להתאמה ומבוסס על כימיקלים הזמינים באופן נרחב למסחר וכתוצאה מכך עלויות תפעול נמוכות במיוחד. בנוסף, יכולת פעולה אד-הוק מאפשרת להתאים פרוטוקול SUIT על ידי טיטרציה במהלך ניסוי והיא חשובה בדגימות חד-פעמיות שמקורן בחולה. אוטומציה חלקית אפשרית באמצעות מיקרו-משאבות בהזרקת טיטרציה, המאפשרת פרוטוקולי SUIT ניתנים לתכנות. למרות שהוא מוגבל לשתי דגימות לכל מכשיר cHRR, משתמשים מנוסים מריצים מספר מכשירים במקביל. היתרון של הרבגוניות של פיתוח הבדיקה וסביבת התוכנה מגיע עם הצורך בהדרכה ספציפית יותר להפעלת התקנים אלה ותחזוקה תלוית משתמש (למשל, כיול חיישני חמצן פולארוגרפיים) על מנת להשיג נתונים הניתנים לשחזור. עבור יישומים מתקדמים, מודולים נוספים ניתנים לחיבור להתקני cHRR כדי להקליט pH, מודול פלואורסצנטי לבדיקת פוטנציאל הממברנה באמצעות ספרנין30, H2O2 דרך AMPLEX אדום24, ורמות סידן31.

שני המכשירים דורשים מדיית נשימה מיוחדת. mHRR משתמש במדיום גדילה ללא סרום הזמין באופן מסחרי, תוך הימנעות משימוש בביקרבונט, אשר מתפרק בתנאי CO2 נמוכים והוא חיוני אם יש חשיבות לקצב ההחמצה החוץ-תאית (ECAR). במהלך הגליקוליזה, פירובט מומר לקטט, אשר מתנתק לחומצה לקטית ופרוטונים. ריכוז פרוטונים מוגבר זה גורם לירידה ב-pH, אשר נרשם כ-ECAR. ניתוח משוכלל יותר של ECAR אפשרי עם מבחן הלחץ גליקוליזה. בדיקה זו מורכבת תחילה מהוספת רמות גלוקוז רוויות למדידת קצב הגליקוליטי הבסיסי. לאחר עיכוב של קומפלקס ATP סינתאז עם אוליגומיצין, מתגלה הקצב הגליקוליטי המקסימלי. השלב האחרון הוא למדוד החמצה לא-גליקוליטית על ידי הזרקת 2-דאוקסי-גלוקוז, המעכב את הגליקוליזה באמצעות קשירה תחרותית להקסוקינאז ופוספוגלוקוז איזומראז32. פרוטוקולים אחרים המבוססים על ערכה זמינים כוללים גליקוליזה, חמצון חומצות שומן וחמצון גלוטמין. כאן השתמשנו בפרוטוקול הסטנדרטי כדי למדוד נשימה בסיסית, נשימה המקושרת ל-ATP, דליפת פרוטונים, נשימה מקסימלית, יכולת נשימה רזרבית והנשמה לא מיטוכונדריאלית (איור 4A-C). גישה של שימוש הן בפרוטוקול הנשימה הסטנדרטי בשילוב עם מבחן המאמץ של הגליקוליזה תיתן תובנה לגבי מסלולי אנרגיה אירובית ואנאירובית המספקת סקירה כללית של הנשימה התאית.

בדרך כלל ניגשים לביו-אנרגיה תאית בתאים דביקים עם הגדרת המיקרו-פלטה mHRR. בהתאם לסוג התא, ציפוי מיוחד להדבקה (למשל, פולי-D-ליזין, ג'לטין וכו') עשוי להידרש (עבור תאי תרחיף) וכן עבור תאים הדבקים באופן רופף מכיוון שהם עשויים להתנתק מתחתית מחזורי מדידת הבאר33. לעומת זאת, מדידות cHRR דורשות ערבוב מתמיד, המאפשר מדידה נשימתית עבור כל דגימה ביולוגית. עבור כל מכשיר, נדרשת אופטימיזציה כגון טיטרציה של מעכבים (ומצעים) עבור קווי רקמות ותאים להערכת רגישות מעכבים (עקומות מינון-תגובה). יש לבחון ריכוזי מעכבים בכל מודל ניסיוני כדי להשתמש בריכוזים הנמוכים ביותר המעכבים לחלוטין ולמנוע עיכוב לא ספציפי כמו גם זיהום תאים מיותר. באופן כללי, 0.25 μM רוטנון, 0.5 מיקרוגרם / מ"ל אוליגומיצין, 0.5 מיקרוגרם / מ"ל אנטימיצין מספיקים עבור רוב היישומים וכמויות המדגם. לצורך שכפול, הכינו תרופות חד-פעמיות בכמויות מספיקות לכל הניסויים המתוכננים (למשל, קבוצות עכברים) ושמרו על קלט דגימה קבוע בתוך רקמה או קו תאים מסוים. ב- cHRR, עקבות של מעכבים שנותרו בתאים ישנו את השטף ללא כל אינדיקציה למפעיל. קשה להתחמק מעקבות רוטנון במיוחד ודורשים שטיפה מספקת עם ניקוי מינימלי של תא (ופקק), הכולל שטיפה 4x עם ddH2O, 2x 70% EtOH (96% טוהר מספיק), 1x 100% EtOH, 1x 70% EtOH. כביסה דורשת הפעלת מערבלים ושמירה על שלבי EtOH למשך > 5 דקות כל אחד. כדי למנוע זיהום חיידקי, 70% EtOH נשמר בכל התאים כאשר מכונות אינן בשימוש. זיהומים שיוריים פוטנציאליים יכולים להיות מרווים על ידי תוספת של רקמות לא בשימוש lysate. בניסוי mHRR, כימיקלים מסוימים עשויים לקיים אינטראקציה עם כלי הפלסטיק החד-פעמיים החיוניים34.

נתונים נשימתיים המתקבלים באמצעות פרוטוקול חדיר נותנים תובנה לגבי ETS, בעוד שפרוטוקול שלם מספק תובנה לגבי תכונות מיטוכונדריאליות כגון יעילות צימוד מיטוכונדריאלי. ואכן, תכונות אנרגיה מיטוכונדריאליות כלליות יכולות לתת את אותה תוצאה, אך העברת אלקטרונים בסיסית בין קומפלקסים עשויה להשתנות. זה ישקף את חילוף החומרים של האנרגיה המיטוכונדרית שהשתנה ודורש פרוטוקול חדירה כדי לגשת למתחמי הנשימה. באופן דומה, רקמות ותאים שונים מראים תלות משתנה במצע בעת הערכת מאפיינים נשימתיים. לדוגמה, ידוע כי סיבי שריר גליקוליטיים מסתמכים בעיקר על גליצרול-3-פוספט לצורך אספקת אנרגיה, בעוד שסיבי שריר חמצוניים הם בעלי יכולת העברת אלקטרונים גבוהה פי שניים מחמצון NADH35,36. באותה הערה, מיטוכונדריה לבבית, כבד, רקמת שומן חומה יכולים להשתמש בחומצות שומן כדי לסנתז ATP, ובתורם, המוח יכול להשתמש בגופי קטון, שנוצרו בעיקר על ידי חמצון חומצות שומן 36,37,38. לכן, קביעת המאפיינים המיטוכונדריים דורשת גישה הוליסטית בניגוד לנשימה הסטנדרטית התלויה בגלוקוז. mHRR כולל בדרך כלל הערכת תאים דבקים שלמים, אם כי חדירה היא ברת השגה (למשל, פרפרינגוליזין O רקומביננטי מוטנטי המחלחל באופן סלקטיבי לקרום התא39). עם זאת, שיטות אלה מגיעות עם מורכבות מוגברת בשל המגבלה של ארבע יציאות הזרקה. לעומת זאת, ליזטים של רקמות לא סיביות שנבדקו כהלכה וכל סוג תא הם בדרך כלל ללא בעיות עבור cHRR. בדרך כלל, בדיקת רקמה עם mHRR אינה אפשרית; עם זאת, גישות המשתמשות במיטוכונדריה מבודדת מרקמה נקבעו40,41.

חשוב לציין כי נורמליזציה לתכולת חלבון שלם מזניחה כמויות מיטוכונדריאליות מוחלטות. השוואה בין קבוצות ניסיוניות תחת טיפולים שונים יכולה להיות שונה באופן משמעותי (למשל, 30 יום חולדות שניזונו מתזונה עתירת חלבונים הראו עלייה של פי 2.5 בתכולת המיטוכונדריה בכבד42), במיוחד ברקמות הרגישות להצטברות שומנים תוך-תאיים כגון רקמת שומן חום, כבד ושריר שלד. במצבים אלה, מומלץ גם להעריך מספר סמנים מיטוכונדריאליים כקירוב למסה המיטוכונדרית, כגון עותק mtDNA מספר43, פעילות ציטראט סינתאז10, וחלבונים מיטוכונדריאליים הנמצאים בכל מקום (למשל, VDAC1, TOM20). בשילוב, זה מאפשר לזקק אם שינוי בתפקוד הנשימתי מיוחס לכמות המיטוכונדרית, לאיכות, לשלמות או לשילוב שלהם. שיטה משלימה נוספת לכך היא יישום של FCRs. FCRs נותנים תובנה לגבי מצבי נשימה שונים שאינם תלויים בתוכן המיטוכונדריאלי. FCRADP נגזר אם דליפה שונה או OXPHOS לשנות את היעילות של המיטוכונדריה לזרחן ADP. מצב FCR3 (I) משקף באיזו מידה המדגם תלוי בקומפלקס I כהשוואה לקומפלקס II. מצב FCR3 (II) משווה נשימה תלוית סוקינט עם ETS ומספק מדד לנשימה מיטוכונדריאלית הנגזרת מקומפלקס II. FCRמצומד/לא מצומד הוא יחס המספק את בקרת הצימוד בין OXPHOS ל-ETS, כאשר יחס של 1 לא נותרה לו יכולת נשימה רזרבית. ניתן להעריך את שלמות הממברנה החיצונית המיטוכונדרית באמצעות תוספת של ציטוכרום c אקסוגני. ציטוכרום c הוא מקומי במרחב הבין-ממדי, שם הוא מקל על העברת אלקטרונים בין קומפלקס III לקומפלקס IV. אם הממברנה המיטוכונדרית החיצונית נפגעת, ציטוכרום c דולף החוצה מהמיטוכונדריה, ולא תורם יותר לנשימה. שחזור חוסר האיזון הזה יכול להיות מושג באמצעות תוספת של ציטוכרום c אקסוגני, וכתוצאה מכך להגביר את הנשימה (איור 1A, D; 5B). פעילות IV מורכבת נמדדת בנפרד עם TMPD לאחר עיכוב מלא של OXPHOS. שטף O2 הבסיסי יירד ככל שריכוז O2 יירד מכיוון שחמצון TMPD תלוי בריכוז O2 . לפיכך לאחר הערכת ROX, כל התאים מחומצנים לרמת חמצן שווה (150 מיקרומטר). ניתן להשתמש ברגרסיה ליניארית של נקודות נתונים מאות לאחר תוספת של אזיד כדי לבצע אינטרפולציה של רקע כימי ותלוי O2 של בדיקת פעילות IV מורכבת. יש להפחית ערכי ROX מכל ערכי הנשימה כדי לתקן את צריכת החמצן שאינה מיטוכונדריאלית.

מבחינה ביולוגית, ROX במקרה של מיטוכונדריה מבודדת יכול להיות נמוך יותר מאשר עם תאים /רקמה מחלחלים או שלמים. באופן כללי, נשימה שיורית נגרמת על ידי פעילות של אנזימי אוקסידאז, כאשר לתאים ולרקמות יש יותר חומרים אוטוקסידיים מאשר מיטוכונדריהמבודדת 44. יתר על כן, כאשר מבני הממברנה התוך-תאית עדיין שלמים, הקושי של חמצן לחלחל דרך ממברנות התאים עולה בשל המטען השלילי שלו. כתוצאה מכך, דיפוזיה דרך ממברנות תאיות וזמינות תוך תאית של חמצן עלולה להיות מושפעת, וכתוצאה מכך ROX. עם זאת, הודגם כי בידוד המיטוכונדריה משבש את המורפולוגיה המיטוכונדרית, מגביר את ייצור מי חמצן מי חמצן המיטוכונדריה, יחד עם שינוי בתפקוד הנשימה המיטוכונדריאלי45. בעוד שבידוד של מיטוכונדריה תפקודית מאפשר נורמליזציה ספציפית וייתכן שיידרש בתנאים מסוימים, תהליך הבידוד גוזל זמן רב, בדרך כלל דורש יותר חומר, וייתכן שאינו משמר את ההטרוגניות המיטוכונדרית. מסיבה זו נמנענו מלכלול במחקר זה בידוד מיטוכונדריאלי. עם זאת, עבור שרירי השלד או הלב, בידוד המיטוכונדריה או טיפול בספונין בסיבים חיוני למדידות נשימה. מכיוון שתהליכים אוטוליטיים מתרחשים מהר מאוד לאחר המתת חסד, מומלץ לבצע מיצוי רקמות מהיר ולהקפיד על תזמון דומה להכנות בין ניסויים בודדים.

בניסויים שלנו, הערכה של תפקוד הנשימה המיטוכונדריאלי של תאי יונקים הובילה לתוצאות דומות עם שני מכשירי HRR. עם זאת, הנשימה הבסיסית הייתה גבוהה יותר עבור cHRR בהשוואה ל-mHRR. מלבד היבטים טכניים רבים (נפח תא, ערבוב ושילוב אותות שונה), סיבות ביולוגיות כגון שינוי מדיום הנשימה, תזמון קצירת התאים ותאים שאינם מחוברים הגורמים לאובדן מגע עם התאים עלולים לגרום להבדלים שנצפו. כתוצאה מכך, פרוטוקולי נשימה באופן כללי וריכוזי מצע ומעכבים בודדים אינם ניתנים להחלפה בין מערכות מהסיבות המוצגות, מה שיכול להיות טכני באופיו (למשל, טיטרציה) לבין ריאגנטים שונים באופן כללי (למשל, מדיית נשימה, ספיגות כימיות של זכוכית או פולימרים). כדי להבטיח את יכולת השחזור הגבוהה ביותר, מספר שיקולים טכניים והמלצות כוללים (i) שימוש באליקוטים חד-פעמיים כדי למזער את מחזורי ההפשרה של זיהום צולב או הקפאה, (ii) אחסון מתאים של כל הכימיקלים (למשל, ADP ב-80°C- ליציבות ממושכת, פירובט מוכן כימיקלים טריים ורגישים לאור בחושך), (iii) בדיקה חוזרת קבועה וקפדנית של כימיקלים ליעילות (למשל, שינויי ריכוז הנגרמים על ידי אידוי, אובדן פעילות TMPD המושרה באחסון) ו-(iv) ניקוי נרחב להסרת כל חומר כימי קורט. שיקולים לגבי יכולת השכפול של מחקרי אורך (במשך מספר שנים) ידרשו ניטור של ביצועי המכשיר והבטחת יציבותם של ריאגנטים לאורך זמן.

לבסוף, טכנולוגיה חדשנית המבוססת על מדידות פוטנציומטריות (pH) ואמפרומטריות משולבות (O2) באמצעות אלקטרודות מבוססות תחמוצת רותניום יכולה לזרז שינוי פרדיגמה בכלים הנוכחיים, ולאפשר לחקור את חילוף החומרים התאי בתרבית וב-in vivo46. למרות שהשיטות הנוכחיות מאפשרות בעיקר הערכה של ex vivo ו - in vitro של חילוף החומרים התאי, פלואורסצנציה מושהית מאפשרת ניתוח in vivo של חמצן מיטוכונדריאלי כמדד לתפקוד המיטוכונדריה47. באופן דומה, נשימה מבוססת מיקרופלואידיקה מראה הבטחה ברגישות גבוהה יותר, הדורשת רק כמה מאות תאים48. בעוד שמתודולוגיות חדשות נמצאות באופק, נכון להיום, נשימה ברזולוציה גבוהה נותרה תקן הזהב להערכת יכולת הנשימה התאית שעבורה מסופקים כאן פרוטוקולים מובהקים, החלים על רוב התאים, הרקמות והאורגניזמים כדי לחקור את הנשימה המיטוכונדרית.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

אין ניגוד עניינים לחשוף.

Acknowledgments

עבודה זו נתמכה על ידי מימון מהאקדמיה של פינלנד (C.B.J), קרן מגנוס ארנרוט (C.B.J), ומלגת דוקטורט של בית הספר המשולב למדעי החיים (R.A.).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2 mL Potter-Elvehjem Glass/PTFE Tissue Grinder/Homogenizer Omni International 07-358029
95% O2, 5% CO2 medical gas mixture Potter for tissue grinding
ADP Sigma A 4386
Antimycin A Sigma A 8674 Chemical
Ascorbate Merck PHR1279-1G Chemical, dissolve in ethanol
BSA (fatty accid free) Sigma A 6003 Chemical
CaCO3 Sigma C 4830 Chemical
Cytochrome c Sigma C 7752 Chemical
Digitonin Sigma D 5628 Chemical
Dithiothreitol Sigma D 0632 Chemical, dissolve in DMSO
D-Sucrose Roth 4621.1 Chemical
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (High glucose) Fisher Scientific 41965-039 Chemical
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (No Glucose) Fisher Scientific A14430-01
EGTA Sigma E 4378
Etomoxir Sigma E1905 Chemical
Falcon 15 ml Conical Centrifuge Tubes Fisher Scientific AM12500 Chemical
Falcon 50 ml Conical Centrifuge Tubes Fisher Scientific AM12501
FCCP Sigma C 2920
Glucose Sigma G7021 Chemical, dissolve in ethanol
Glutamate Sigma G 1626 Chemical
GlutaMax (100x) (200 nM L-alanyl-L-glutamine dipeptide) Fisher Scientific 35050061 Chemical
HEK293 cells ATTC CRL-1573
Hemocytometer Fisher Scientific 0267151B Instrument for cell counting
Hepes Sigma H 7523 Chemical
Imidazole Fluka 56750 Chemical
KCl Merck 1.04936 Chemical
L-carnitine Sigma C0283 Chemical
Malate Sigma M 1000 Chemical
MES hydrate Sigma M8250 Chemical
MgCl2 Sigma M 9272 Chemical
Na2ATP Sigma A 2383 Chemical
Na2Phosphocreatine Sigma P 7936 Chemical
Na-pyruvate (100 mM) (100x) Fisher Scientific 11360070
NEAA (Non-essential amino acids) 100x Fisher Scientific 11140035
Normal FBS (10x) Fisher Scientific 10500064
O2k-Core: Oxygraph-2k Oroboros Instruments 10000-02 High-resolution respirometry instrument
O2k-Titration Set Oroboros Instruments 20820-03 Hamilton syringes for chemical injections
Oligomycin Sigma O 4876 Chemical, dissolve in ethanol
Palmitoylcarnitine Sigma P 4509 Chemical
Penicillin-Streptomycin Fisher Scientific 15140122
Pierce BCA Protein Assay Kit Fisher Scientific 23227
Pyruvate Sigma P 2256 Chemical
RIPA-Buffer Fisher Scientific 89900 Chemical
Rotenone Sigma R 8875 Chemical, dissolve in ethanol
Saponin Sigma S7900 Chemical

Seahorse XF DMEM assay medium pack, pH 7.4
Agilent, Santa Clara, CA		 103680-100
Seahorse XFe96 Extracellular Flux Analyzer
Agilent, Santa Clara, CA		 High-throughput respirometry instrument
Seahorse XFe96 FluxPak
Agilent, Santa Clara, CA
Includes assay plates, cartridges, loading guides for transferring compounds to the assay cartridge, and calibrant solution.
Small scissors Fisher Scientific 08-951-20
Sodium azide Sigma S2002 Chemical
Succinate Sigma S 2378 Chemical
Taurine Sigma T 8691 Chemical
TMPD Sigma T 3134 Chemical
Trypan Blue solution Merck 72-57-1 Chemical
Trypsin 0.25% EDTA Fisher Scientific 25200056
Two thin-edged forceps Fisher Scientific 12-000-122
Uridine stock (500x) Sigma U3750 Chemical

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. McBride, H. M., Neuspiel, M., Wasiak, S. Mitochondria: More than just a powerhouse. Current Biology. 16 (14), 551-560 (2006).
  2. Mehta, M. M., Weinberg, S. E., Chandel, N. S. Mitochondrial control of immunity. Beyond ATP. Nature Reviews Immunology. 17 (10), 608-620 (2017).
  3. Spinelli, J. B., Haigis, M. C. The multifaceted contributions of mitochondria to cellular metabolism. Nature Cell Biology. 20 (7), 745-754 (2018).
  4. Gnaiger, E. Capacity of oxidative phosphorylation in human skeletal muscle. New perspectives of mitochondrial physiology. International Journal of Biochemistry and Cell Biology. 41 (10), 1837-1845 (2009).
  5. Gorman, G. S., et al. Mitochondrial diseases. Nature Reviews Disease Primers. 2, 1-23 (2016).
  6. Boushel, R., Gnaiger, E., Schjerling, P., Skovbro, M., Kraunsøe, R., Dela, F. Patients with type 2 diabetes have normal mitochondrial function in skeletal muscle. Diabetologia. 50 (4), 790-796 (2007).
  7. Cogliati, S., et al. Mitochondrial cristae shape determines respiratory chain supercomplexes assembly and respiratory efficiency. Cell. 155 (1), 160-171 (2013).
  8. Kühlbrandt, W. Structure and function of mitochondrial membrane protein complexes. BMC Biology. 13, 1-11 (2015).
  9. Gnaiger, E. Mitochondrial pathways and Respiratory control. An introduction to OXPHOS analysis. Bioenergetics communications. 5th ed. , Steiger Druck GmbH. Axams, Austria. (2020).
  10. Jackson, C. B., et al. Mutations in SDHD lead to autosomal recessive encephalomyopathy and isolated mitochondrial complex II deficiency. Journal of Medical Genetics. 51 (3), 170-175 (2014).
  11. Pesta, D., Gnaiger, E. High-resolution respirometry: OXPHOS protocols for human cells and permeabilized fibers from small biopsies of human muscle. Methods in Molecular Biology. 810, Clifton, N.J. 25-58 (2012).
  12. Horan, M. P., Pichaud, N., Ballard, J. W. O. Review: Quantifying mitochondrial dysfunction in complex diseases of aging. Journals of Gerontology - Series A Biological Sciences and Medical Sciences. 67 (10), 1022-1035 (2012).
  13. Doerrier, C., Garcia-Souza, L. F., Krumschnabel, G., Wohlfarter, Y., Mészáros, A. T., Gnaiger, E. High-resolution fluorespirometry and oxphos protocols for human cells, permeabilized fibers from small biopsies of muscle, and isolated mitochondria. Methods in Molecular Biology. 1782, Clifton, N.J. 31-70 (2018).
  14. Zhang, J., et al. Measuring energy metabolism in cultured cells, including human pluripotent stem cells and differentiated cells. Nature Protocols. 7 (6), 1068-1085 (2012).
  15. García-Roche, M., Casal, A., Carriquiry, M., Radi, R., Quijano, C., Cassina, A. Respiratory analysis of coupled mitochondria in cryopreserved liver biopsies. Redox Biology. 17, 207-212 (2018).
  16. Acin-Perez, R., et al. A novel approach to measure mitochondrial respiration in frozen biological samples. The EMBO Journal. 39 (13), 1-18 (2020).
  17. SUITBrowserWeb. , Available from: http://suitbrowser.oroboros.at/ (2021).
  18. Cell metabolism assay kits. Seahorse assay kits and media. , Available from: https://www.agilent.com/en/product/cell-analysis/real-time-cell-metabolic-analysis/xf-assay-lits-reagents-cell-assay-media (2021).
  19. Chance, B., Williams, G. R. A method for the localization of sites for oxidative phosphorylation. Nature. 176 (4475), 250-254 (1955).
  20. Gnaiger, E., et al. Mitochondrial respiratory states and rates. MitoFit Preprint Arch. , (2019).
  21. Gnaiger, E. O2k-procedures: SOP O2k quality control 1: Polarographic oxygen sensors and accuracy of calibration Section Page. Oroboros. 03 (18), http://wiki.oroboros.at/index.php/MiPNet06.03_POS-Calibration-SOP 1-21 (2020).
  22. Robinson, B. H., Petrova-Benedict, R., Buncic, J. R., Wallace, D. C. Nonviability of cells with oxidative defects in galactose medium: A screening test for affected patient fibroblasts. Biochemical Medicine and Metabolic Biology. 48 (2), 122-126 (1992).
  23. King, M. P., Attardi, G. Human cells lacking mtDNA: Repopulation with exogenous mitochondria by complementation. Science. 246 (4929), 500-503 (1989).
  24. Makrecka-Kuka, M., Krumschnabel, G., Gnaiger, E. High-resolution respirometry for simultaneous measurement of oxygen and hydrogen peroxide fluxes in permeabilized cells, tissue homogenate and isolated mitochondria. Biomolecules. 5 (3), 1319-1338 (2015).
  25. Fasching, M., Gnaiger, E. O2k quality control 2: Instrumental oxygen background correction and accuracy of oxygen flux. Mitochondrial Physiology Network. 14 (06), 1-14 (2016).
  26. Gnaiger, E., Lassnig, B., Kuznetsov, A., Rieger, G., Margreiter, R. Excess capacity of cytochrome c oxidase. Journal of Experimental Biology. 1139, 1129-1139 (1998).
  27. Gnaiger, E., et al. Mitochondria in the Cold. Life in the Cold. , Springer. Berlin, Heidelberg. 431-442 (2000).
  28. Fontana-Ayoub,, Fasching, M., Gnaiger, E. Selected media and chemicals for respirometry with mitochondrial preparations. Mitochondrial Physiology Network. 02 (17), 1-9 (2014).
  29. Gerencser, A. A., et al. Quantitative microplate-based respirometry with correction for oxygen diffusion. Analytical Chemistry. 81 (16), 6868-6878 (2009).
  30. Krumschnabel, G., Eigentler, A., Fasching, M., Gnaiger, E. Use of safranin for the assessment of mitochondrial membrane potential by high-resolution respirometry and fluorometry. Methods in Enzymology. 542, 163-181 (2014).
  31. Nászai, A., Terhes, E., Kaszaki, J., Boros, M., Juhász, L. Ca(2+)N it be measured? Detection of extramitochondrial calcium movement with high-resolution fluorespirometry. Scientific Reports. 9 (1), 1-13 (2019).
  32. Pajak, B., et al. 2-Deoxy-d-Glucose and its analogs: From diagnostic to therapeutic agents. International Journal of Molecular Sciences. 21 (1), 234 (2019).
  33. Mercier-Letondal, P., Marton, C., Godet, Y., Galaine, J. Validation of a method evaluating T cell metabolic potential in compliance with ICH Q2 (R1). Journal of Translational Medicine. 19 (1), 1-15 (2021).
  34. Sauerbeck, A., et al. Analysis of regional brain mitochondrial bioenergetics and susceptibility to mitochondrial inhibition utilizing a microplate based system. Journal of Neuroscience Methods. 198 (1), 36-43 (2011).
  35. Jackman, M. R., Willis, W. T. Characteristics of mitochondria isolated from type I and type IIb skeletal muscle. American Journal of Physiology - Cell Physiology. 270 (2), 673-678 (1996).
  36. Ponsot, E., et al. Mitochondrial tissue specificity of substrates utilization in rat cardiac and skeletal muscles. Journal of Cellular Physiology. 203 (3), 479-486 (2005).
  37. Schönfeld, P., Reiser, G. Why does brain metabolism not favor burning of fatty acids to provide energy-Reflections on disadvantages of the use of free fatty acids as fuel for brain. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 33 (10), 1493-1499 (2013).
  38. Calderon-Dominguez, M., Mir, J. F., Fucho, R., Weber, M., Serra, D., Herrero, L. Fatty acid metabolism and the basis of brown adipose tissue function. Adipocyte. 5 (2), 98-118 (2016).
  39. Divakaruni, A. S., Rogers, G. W., Murphy, A. N. Measuring mitochondrial function in permeabilized cells using the seahorse XF analyzer or a clark-type oxygen electrode. Current Protocols in Toxicology. 2014, 1-16 (2014).
  40. Iuso, A., Repp, B., Biagosch, C., Terrile, C., Prokisch, H. Assessing mitochondrial bioenergetics in isolated mitochondria from various mouse tissues using Seahorse XF96 analyzer. Methods in Molecular Biology. 1567, 217-230 (2017).
  41. Rogers, G. W., et al. High throughput microplate respiratory measurements using minimal quantities of isolated mitochondria. PLoS ONE. 6 (7), 21746 (2011).
  42. Jordá, A., Zaragozá, R., Portolés, M., Báguena-Cervellera, R., Renau-Piqueras, J. Long-term high-protein diet induces biochemical and ultrastructural changes in rat liver mitochondria. Archives of Biochemistry and Biophysics. 265 (2), 241-248 (1988).
  43. Jackson, C. B., Gallati, S., Schaller, A. QPCR-based mitochondrial DNA quantification: Influence of template DNA fragmentation on accuracy. Biochemical and Biophysical Research Communications. 423 (3), 441-447 (2012).
  44. Hirsch, H. M. Tissue autoxidation inhibitors: II. The presence of inhibitor in intact cells; Assay of liver and hepatoma effect on radio-oxidations. Cancer Research. 16 (11), 1076-1082 (1956).
  45. Picard, M., et al. Mitochondrial structure and function are disrupted by standard Isolation methods. PLoS ONE. 6 (3), 18317 (2011).
  46. Tanumihardja, E., Slaats, R. H., Van Der Meer, A. D., Passier, R., Olthuis, W., Van Den Berg, A. Measuring both pH and O2 with a single On-Chip sensor in cultures of human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes to track induced changes in cellular metabolism. ACS Sensors. 6 (1), 267-274 (2021).
  47. Harms, F., Stolker, R. J., Mik, E. Cutaneous respirometry as novel technique to monitor mitochondrial function: A feasibility study in healthy volunteers. PLoS ONE. 11 (7), 159544 (2016).
  48. Levitsky, Y., et al. Micro-respirometry of whole cells and isolated mitochondria. RSC Advances. 9 (57), 33257-33267 (2019).

Tags

ביולוגיה גיליון 176 ביו-אנרגיה מיטוכונדריאלית שרשרת הנשימה מחלה מיטוכונדריאלית זרחון חמצוני מנתח שטף שטף חוץ-תאי HEK293 צריכת חמצן תרגום מיטוכונדריאלי
Respirometry ברזולוציה גבוהה להערכת ביו-אנרגיה בתאים וברקמות באמצעות מדים מבוססי תאים ולוחות
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Awadhpersad, R., Jackson, C. B.… More

Awadhpersad, R., Jackson, C. B. High-Resolution Respirometry to Assess Bioenergetics in Cells and Tissues Using Chamber- and Plate-Based Respirometers. J. Vis. Exp. (176), e63000, doi:10.3791/63000 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter