Summary
هنا ، نصف طريقة التصور والقياس الكمي لأوعية الأطراف الخلفية الفئرانية باستخدام التصوير المقطعي المحوسب بالأشعة السينية الدقيقة.
Abstract
الأوعية الدموية هي شبكات معقدة ذات هياكل تشبه الأشجار ، وشبكات الأوعية الدموية ضرورية للحفاظ على كل من الدورة الدموية والحفاظ على وظيفة الأعضاء. وبالتالي فإن توضيح آلية تكوين الأوعية الدموية مفيد للغاية لتوضيح العمليات التنموية والآليات المرضية. غالبا ما تستخدم أوعية الأطراف الخلفية الفئرانية كنموذج لتكوين الأوعية الفسيولوجية والمرضية. يتم إجراء التقييم بشكل أساسي عن طريق طريقة ثنائية الأبعاد باستخدام أقسام الأنسجة. ومع ذلك ، فإن طرق تقييم مورفولوجيا الأوعية الدموية ثلاثية الأبعاد (3D) محدودة بشكل خاص. تقدم هذه الورقة طريقة لتصور الأطراف الخلفية الفئرانية باستخدام التصوير المقطعي المحوسب (CT). يتم حقن الراتنج غير الشفاف إشعاعيا من خلال الشريان الأورطي الهابط ، وتمتلئ الأوعية بأكملها بالصبغة. من خلال ضبط وقت حقن الصبغة ، يمكن أيضا ملء خاص بالشرايين ، ويمكن الحصول على عينات باستخدام أي جهاز تصوير مقطعي بالأشعة السينية الدقيقة. توفر طريقة التباين هذه تقنية أساسية لتقييم 3D للأوعية الدموية الفئرانية في الأطراف السفلية. علاوة على ذلك ، يمكن استخدام هذه الطريقة لتصور جميع الأوعية الدموية أسفل الحجاب الحاجز وتقييم الأوعية الدموية في أعضاء البطن.
Introduction
الأوعية الدموية هي شبكات معقدة ذات هياكل تشبه الأشجار. يلعب تكوين الأوعية الدموية وتكوين الأوعية الدموية الجديدة أدوارا أساسية في الحفاظ على توازن الأعضاء1. يتم تنظيم تولد الأوعية الدموية لعلاج الأمراض الإقفارية والخبيثة2. لذلك من الضروري فهم الآليات الكامنة وراء تولد الأوعية. غالبا ما تستخدم أوعية الأطراف الخلفية الفئرانية كنموذج مفيد لأبحاث الأوعية الدموية3. الربط الجانبي للشريان الحرقفي أو الفخذي هو نموذج معروف لنقص تروية الأطراف الخلفية يستخدم لتقييم تكوين الأوعية الدموية وإعادة تشكيل الأوعية الدموية في تكوين الأوعية الفسيولوجية والمرضية4. ومع ذلك ، يتم إجراء تقييم تولد الأوعية الدموية بشكل رئيسي عن طريق تلطيخ القسم ، وطرق تقييم مورفولوجيا الأوعية الدموية 3D محدودة بشكل خاص.
بالمقارنة مع تلطيخ القسم ، يتيح التصوير المقطعي المحوسب تصور 3D. في الآونة الأخيرة ، أبلغ Weyers et al. عن بروتوكول متطور مناسب للتصوير المقطعي المحوسب ، مما يتيح تصور نظام الدورة الدموية التاجية للبالغين الفئران5. قمنا بتعديل طريقتهم لإنشاء طريقة لإعداد العينات مناسبة للتصوير المقطعي المحوسب للأوعية الدموية في الأطراف السفلية6. هنا ، يتم حقن راتنج معتم إشعاعيا من خلال الشريان الأورطي الهابط ، وتمتلئ الأوعية في الأطراف السفلية بالصبغة. من خلال ضبط وقت حقن الصبغة ، يمكن أيضا ملء خاص بالشرايين ، ويمكن الحصول على عينات باستخدام أي جهاز تصوير مقطعي محوسب بالأشعة السينية الدقيقة. توفر طريقة التباين هذه تقنية أساسية لتقييم 3D للأوعية الدموية الفئرانية أسفل الحجاب الحاجز وفي أعضاء البطن والأطراف السفلية.
Protocol
تم تنفيذ جميع الإجراءات وفقا للمبادئ التوجيهية لرعاية الحيوانات بجامعة كوماموتو (مرجع الموافقة رقم. M30-040/A2020-105)، التي تتوافق مع دليل المعاهد الوطنية الأمريكية للصحة لرعاية واستخدام المختبر (المنشور رقم 85-23، المنقح 2011).
1. التحضير
- تحضير جهاز التروية والمخزن المؤقت لموسع الأوعية الدموية (4 ملغم / لتر بابافيرين هيدروكلوريد ، 4 جم / لتر ؛ الأدينوزين ، 1 جم / لتر ؛ الهيبارين ، 1 U / مل في محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS)).
ملاحظة: جهاز الارتجاع وكواشف موسع الأوعية هي نفسها التي أبلغ عنها Weyers et al.5. - قم بتوصيل القسطرة 22 جم وأنبوب التمديد سعة 2 مل ومحطة التوقف ثلاثية الاتجاهات (الشكل 1A).
ملاحظة: اضبط المقياس وفقا لحجم الحيوان. بالنسبة للفئران البالغة C57BL/6 ، فإن 22 جم هو الأمثل. - املأ جهاز تروية الضغط بالمخزن المؤقت لموسع الأوعية الدموية (الشكل 1A).
ملاحظة: تجنب تكوين الفقاعات لمنع الاضطراب في ملء وسط التباين.
2. التروية
- حقن 1 U / g الهيبارين في PBS في تجويف الصفاق قبل 30 دقيقة من العملية.
- تخدير الفأر تماما مع isoflurane والقتل الرحيم عن طريق خلع عنق الرحم.
- بعد قطع الرأس ، قم بعمل شق خط الوسط في القص وقم بإصلاح الصدر المفتوح بالدبابيس.
ملاحظة: لتجنب تسرب التباين، تجنب إصابة الحجاب الحاجز. - قطع الشريان الأورطي الصاعد وإزالة القلب.
- إزالة الرئة وفضح الشريان الأورطي الهابط.
ملاحظة: لا تجرح الشريان الأورطي الهابط. - اقطع الشريان الأورطي التنازلي قطريا لكشف المقطع العرضي (الشكل 1B).
ملاحظة: لا تقشر الشريان الأورطي. القسم القطري أفضل لإدخال القسطرة. - أدخل القسطرة 22 جم في الشريان الأورطي الهابط أثناء تشغيل المخزن المؤقت لتوسيع الأوعية.
ملاحظة: يؤدي إدخال القسطرة أثناء تشغيل المخزن المؤقت لتوسيع الأوعية إلى تجنب تلوث الهواء. - دبوس جذر القسطرة (الشكل 1C).
- جعل عقدة لمنع التسرب بسبب التدفق العكسي.
- قم بدمج محلول موسع للأوعية الدموية الدافئ (بابافيرين هيدروكلوريد ، 4 جم / لتر ؛ أدينوزين ، 1 جم / لتر ؛ هيبارين ، 1 U / مل) لمدة 3 دقائق عند ضغط ثابت بين 13 و 15 كيلو باسكال.
- ضع محلول 4٪ من بارافورمالدهيد في (PBS) لمدة 3 دقائق.
ملاحظة: يمكن تأكيد نجاح التثبيت من خلال حركة القدم (الشكل 1D). - قم بإعداد وسط التباين قبل التروية مباشرة.
ملاحظة: ضبط معدل التخفيف وفقا للعينة. بالنسبة للفئران البالغة ، امزج البقعة والمخففة بنسبة 1: 1. - أوقف التروية واملأ أنبوب التمديد ب 2 مل من وسط التباين المخفف (الشكل 1E).
ملاحظة: يجب حقن وسط التباين ببطء لتجنب إصابة الأوعية الدموية. - قم بدمج وسط التباين عند ضغط ثابت يتراوح بين 13 و 15 كيلو باسكال.
- لتصور الشرايين، تحقق من ظفر القدم للتأكد من أن وسط التباين قد وصل إلى الشريان (الشكل 1F).
- لتصور جميع الأوعية ، تحقق من الوريد الأجوف السفلي للحجاب الحاجز لتأكيد الدوران الكامل لوسط التباين.
ملاحظة: في البداية ، يحتوي التباين على محلول توسع الأوعية. وبالتالي ، فإن تداولها السليم أمر ضروري.
- أغلق محطة التوقف الثلاثية الاتجاه وقم بإزالة الأنبوب (الشكل 1G).
ملاحظة: إذا لم يتم إغلاق الإيقاف ثلاثي الاتجاهات، فسوف يتدفق التباين للخلف. - احتضان العينة بين عشية وضحاها عند 4 درجات مئوية.
- إزالة الجلد وإصلاحه في محلول الفورمالديهايد 10 ٪.
3. التصور
ملاحظة: تختلف بروتوكولات التصور وفقا للماسح الضوئي المقطعي المحوسب. تم استخدام ماسح الأشعة السينية بالأشعة السينية microfocus في هذا البروتوكول. من الضروري تحسين طريقة التصوير وفقا لكل ماسح ضوئي بالأشعة المقطعية.
- قم بإصلاح العينة في أنبوب سعة 50 مل يحتوي على PBS.
- ضع أنبوب العينة على الطاولة.
- امسح العينة بجهد 50 كيلو فولت وتيار 600 ميكرو أمبير ، مما يضمن مسافة تركيز إلى مركز تبلغ 75.2 مم.
ملاحظة: كان البعد 1 فوكسل 28.7 ميكرومتر × 28.7 ميكرومتر × 28.7 ميكرومتر في هذا الإعداد. - قم بتحميل بيانات الصور التي تم الحصول عليها باستخدام فيجي ، وهي منصة مفتوحة المصدر لتحليل الصور البيولوجية.
- حدد قيمة فوكسل العضلات باستخدام عضلة gastrocnemius.
- اختر عضلة gastrocnemius باستخدام أداة المستطيل .
- تحقق من المتوسط الحسابي والانحراف المعياري (SD) من الرسم البياني (تحليل | الرسم البياني).
- حدد كثافة فوكسل العضلات على أنها متوسط + 2SD من عضلة gastrocnemius.
- اضبط كثافة فوكسل العضلات على أنها مستوى العتبة الأدنى (الصورة | ضبط | | العتبة تعيين | مستوى عتبة أقل).
ملاحظة: تبقى منطقة الأوعية الدموية ومنطقة العظام في البيانات الثنائية بعد تعيين العتبة.
Representative Results
يمكن تصور جميع الأوعية في الأطراف السفلية إذا تم تنفيذ هذا البروتوكول بشكل صحيح (الشكل 2A). في نموذج نقص تروية الأطراف الخلفية، يسير الشريان الفخذي غير المربوط بالتوازي مع الوريد الفخذي (الشكل 2 ب)، ويمكن تأكيد الشريان الفخذي المربوط عن طريق انقطاع وسائط التباين (الشكل 2 ج). وكشفت النتائج عن تطور السفن الجانبية (الشكل 2 دال). تتشكل الدورة الدموية الجانبية بين الشرايين القريبة من الشريان المربوط والشريان في منطقة أسفل الساق وعلى الجانبين البطني والظهري للشريان الفخذي. الشريان الألوي السفلي - الذي يبدأ على الجانب الظهري من الحوض ويمتد على الجانب الجانبي من الفخذ - يتوسع بقوة على الجانب الإقفاري.
تمتلئ الأوعية المملوءة بالتباين بوسط التباين (الشكل 2E) ؛ يشير الاضطراب في التباين إلى اختلاط الوسائط غير المتناقضة (على سبيل المثال ، الدم أو المخزن المؤقت لموسع الأوعية الدموية أو الفقاعات) أو عدم كفاية تروية التباين (الشكل 2F). لن يعمل توسع الأوعية وتثبيتها بشكل جيد إذا تقلصت الأوعية الدموية. على الرغم من أن التصوير المقطعي المحوسب لا يمكنه تصور سوى وسط التباين ، إلا أنه من الممكن رؤية الشرايين على سطح الجسم عن طريق المراقبة المجهرية أو المجهرية المجسمة (الشكل 2G). وبالتالي ، من الأسهل تقييم العيوب باستخدام وسيط التباين (الشكل 2H).
الشكل 1: الخطوط العريضة للإجراء. (أ) جهاز تروية الضغط والقسطرة 22 G متصلة عبر أنبوب تمديد سعة 2 مل و stopcock ثلاثي الاتجاهات. (ب) يتم قطع الشريان الأورطي الصاعد قطريا لكشف المقطع العرضي (السهم الأصفر). (ج) تم تثبيت القسطرة باستخدام دبابيس (أسهم صفراء). (د) تمتد الأطراف السفلية الثابتة عند التثبيت (الأسهم الصفراء). (ه) حقن التباين من خلال الإيقاف الثلاثي الاتجاه. يشار إلى اتجاه الحقن بواسطة سهم أصفر. (و) يمتلئ مسمار الطرف الخلفي بالتباين (السهم الأصفر). (ز) يتم إغلاق الحاجز وإزالته من جهاز التروية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 2: صور السفن. (أ) صورة كاملة لعظام الأطراف الخلفية والأوعية. (ب) الشريان الفخذي (السهم الأحمر) والوريد (السهم الأزرق). (ج) الشريان الفخذي المربوط (السهم الأصفر). يقاطع المحيط بسبب الانسداد (الخط الأصفر المنقط). (د) الأوعية الجانبية في الجانب المربوط (الأسهم الصفراء). يمثل الخط الأصفر المنقط الشريان الفخذي المتقطع. (ه) عينة مملوءة جيدا من الشريان الصافن (السهم الأحمر) والوريد (السهم الأزرق). (و) يؤدي عدم كفاية التروية إلى انقطاع الأوعية الصافنية (الخط الأصفر المنقط). (ز) الملاحظة المجهرية المجسمة لعينة تمثيلية. يمتلئ الشريان الفخذي الأيمن (السهم الأصفر) بوسط تباين. (ح) الملاحظة المجهرية المجسمة لعينة فاشلة. يفتقر الشريان الفخذي الأيمن (السهم الأصفر) إلى وسط التباين. قضبان المقياس = 1 مم (B-F) ، 2 مم (G ، H) ، 10 مم (A). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
Discussion
يقدم هذا التقرير طريقة متطورة لتصور الأوعية الدموية في الجزء السفلي من الجسم. هناك العديد من الخطوات الحاسمة في هذه العملية: الأولى هي الانصهار المسبق قبل حقن وسط التباين. إذا لم تتم إزالة ما يكفي من الدم ، فلن يملأ التباين النظام. بالإضافة إلى ذلك ، فإن إدراج فقاعات الهواء يزعج ملء التباين ؛ وبالتالي ، يجب إزالة الهواء الموجود في الدائرة بالكامل. علاوة على ذلك ، نظرا لأن وسط التباين لا يتصلب مباشرة بعد الحقن ، فلا ينبغي نقل العينة بشكل مفرط.
هذه الطريقة مفيدة لتقييم زيادة تكوين الأوعية الدموية والدورة الدموية ، مثل الدورة الدموية الجانبية. على العكس من ذلك ، كقيد ، من الصعب تقييم الأوعية الدموية الضيقة ، حيث أن التمييز بين التضيق والتخفيض الاصطناعي في وسط التباين أمر صعب. بالإضافة إلى ذلك ، من الصعب تقييم الأوعية الدموية في العظام ، حيث أن فصل الدم والعظام أمر صعب.
طريقة بديلة للتصور 3D هي التلطيخ المناعي. باستخدام تقنية إزالة الأنسجة ، تتوفر عدة طرق للتصوير ثلاثي الأبعاد7. التلطيخ المناعي مفيد لأنه يسمح بتلطيخ بروتينات معينة باستخدام الأجسام المضادة. ويتحدى تقرير صدر مؤخرا التصوير لكامل الجسم استنادا إلى التلطيخ المناعي8؛ ومع ذلك ، لا يتطلب التصوير القائم على التصوير المقطعي المحوسب أي معالجة مسبقة لإزالة الأنسجة.
تتيح هذه الطريقة تصور جميع الأوعية الموجودة أسفل الحجاب الحاجز ، بما في ذلك أعضاء البطن. تولد الأوعية الدموية في أعضاء البطن له تأثير قوي على الحفاظ على التوازن وتطوير الأمراض9,10. نظرا لأن هذا البروتوكول قد تم تحسينه لتقييم أوعية الأطراف السفلية ، فإن التحضير الخاص بالأعضاء سيمكن من تصور تكوين الأوعية المرتبط بأي عامل ، مثل الالتهاب أو الأورام.
Disclosures
وليس لدى صاحبي البلاغ أي تضارب في المصالح ليعلنا.
Acknowledgments
نشكر ياسويو كيمورا وميغومي ناغاهيرو وسايكو توكوناغا على الدعم الفني الممتاز في التجارب على الحيوانات.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mL syringe | TERUMO | SS-01T | |
| 10% Formalin Solution | Fujifilm-Wako | 068-03841 | |
| 10x phosphate-buffered saline (-) (PBS) | Fujifilm-Wako | 163-25265 | Prepare 1x PBS |
| 22 G catheter (22 G S5 x 1" V(F)) | MEDIKIT | HP2140 | Only catheter is used. |
| 23 G needle | TERUMO | NN-2325R | Use as a pin |
| 4% paraformaldehyde in PBS | Fujifilm-Wako | 163-20145 | |
| 5 mL syringe | |||
| 5-0 Suture with needle | Alfresa Pharma Corporation | ER1205SB45 | |
| Adenosine | Sigma-aldrich | A9251-5G | For vasodilating solution |
| Dumont #55 Forceps | FST | No.11255-20 | |
| Extension tube | TOP | X2-FL50 | |
| Falcon 50 mL tube | CORNING | 352098 | |
| Graefe Forceps | FST | No.11051-10 | |
| Heparin Sodium 5,000 units/5 mL | Mochida Co. Ltd. | 224122458 | |
| Isoflurane | Fujifilm-Wako | 099-06571 | |
| Microfil Injection Compounds | Flow Tech Inc. | MV-117 | Mix liquid MV-Compound (stain) and MV-Diluent 1: 1 |
| Papaverine hydrochloride | Fujifilm | 164-18002 | For vasodilating solution |
| Small Animal Anesthetizer | Muromachi Kikai Co. Ltd. | MK-A100ecoW-ST | |
| Spring Scissors - Angled to Side | FST | No.15006-09 | |
| Surgical Scissors - Sharp-Blunt | FST | No.14001-12 | |
| three-way cock | TERUMO | TS-TR1K | |
| Transfer pipette | SAMCO SCIENTIFIC | SM262-1S | Use for mixing contrast medium |
| X-ray CT scanner | Toshiba IT & Control Systems Corporation | TOSHIBA TOSCANNER 32300 FPD |
References
- Folkman, J.
- Folkman, J. Angiogenesis in cancer, vascular, rheumatoid and other disease. Nature Medicine. 1 (1), 27-31 (1995).
- Kochi, T., et al. Characterization of the arterial anatomy of the murine hindlimb: functional role in the design and understanding of ischemia models. PLoS One. 8 (12), 84047 (2013).
- Limbourg, A., et al. Evaluation of postnatal arteriogenesis and angiogenesis in a mouse model of hind-limb ischemia. Nature Protocols. 4 (12), 1737-1746 (2009).
- Weyers, J. J., Carlson, D. D., Murry, C. E., Schwartz, S. M., Mahoney, W. M. Retrograde perfusion and filling of mouse coronary vasculature as preparation for micro computed tomography imaging. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (60), e3740 (2012).
- Arima, Y., et al. Evaluation of collateral source characteristics with 3-dimensional analysis using micro-X-ray computed tomography. Journal of the American Heart Association. 7 (6), 007800 (2018).
- Tian, T., Yang, Z., Li, X. Tissue clearing technique: Recent progress and biomedical applications. Journal of Anatomy. 238 (2), 489-507 (2021).
- Susaki, E. A., et al. Advanced CUBIC protocols for whole-brain and whole-body clearing and imaging. Nature Protocols. 10 (11), 1709-1727 (2015).
- Fernandez, M., et al.
- Li, S., et al. Angiogenesis in pancreatic cancer: current research status and clinical implications. Angiogenesis. 22 (1), 15-36 (2019).
