Summary
在这里，我们描述了使用微X射线计算机断层扫描的小鼠后肢血管的可视化和定量方法。
Abstract
血管是具有树状结构的复杂网络，血管网络对于维持循环和维持器官功能至关重要。因此，澄清血管形成的机制对于阐明发育过程和病理机制非常有用。鼠后肢血管通常用作生理和病理血管生成的模型。评估主要通过使用组织切片的二维方法进行。然而，评估三维（3D）血管形态学的方法尤其有限。本文介绍了一种使用计算机断层扫描（CT）可视化小鼠后肢的方法。通过降主动脉注入辐射不透明的树脂，整个血管充满染料。通过调整染料注射的时间，也可以进行动脉特异性填充，并且可以使用任何微X射线CT设备获得样品。这种造影方法为下肢小鼠血管的3D评估提供了一种基本技术。此外，该方法可用于可视化横膈膜下的所有血管并评估腹部器官中的血管。
Introduction
血管是具有树状结构的复杂网络。血管生成和新的血管形成在维持器官稳态中起着至关重要的作用1。血管生成用于治疗缺血性和恶性疾病2。因此，了解血管生成的潜在机制至关重要。鼠后肢血管通常被用作血管研究的有用模型3;髂动脉或股动脉同侧结扎是一种已知的后肢缺血模型，用于评估生理和病理性血管生成中的血管生成和血管重塑4。然而，血管生成的评估主要通过切片染色进行，评估3D血管形态的方法特别有限。
与切片染色相比，CT 可实现 3D 可视化。最近，Weyers等人报告了一种适用于CT成像的复杂方案，能够可视化小鼠成年冠状动脉循环系统5。我们修改了他们的方法，以创建一种适用于下肢血管CT成像的样品制备方法6。在这里，通过降主动脉注入辐射不透明的树脂，下肢的血管充满染料。通过调整染料注射的时间，还可以进行动脉特异性填充，并且可以使用任何微X射线计算机断层扫描设备获得样品。这种造影方法为横膈膜下方、腹部器官和下肢小鼠血管的3D评估提供了一种基本技术。
Protocol
所有程序均按照熊本大学动物护理指南（批准参考号。）M30-040/A2020-105），符合美国国立卫生研究院《实验动物护理和使用指南》（出版物号85-23，2011年修订）。
1. 准备工作
- 准备灌注设备和血管扩张剂缓冲液（4 mg / L盐酸罂粟碱，4 g / L;腺苷，1 g / L;肝素，1 U / mL磷酸盐缓冲盐水（PBS））。
注：回流装置和血管扩张剂试剂与Weyers等人报道的相同。 - 连接22 G导管，2 mL延长管和三向旋塞阀（图1A）。
注意：根据动物的大小调整仪表。对于成年C57BL / 6小鼠，22 G是最佳的。 - 用血管扩张剂缓冲液填充压力灌注装置（图1A）。
注意：避免形成气泡，以防止造影剂的填充中断。
2. 灌注
- 在手术前30分钟将PBS中的1 U / g肝素注射到腹膜腔内。
- 用异氟醚完全麻醉小鼠，并通过宫颈脱位将其安乐死。
- 斩首后，在胸骨上做一个中线切口，并用销钉固定开放的胸部。
注：为避免对比度泄漏，请避免损坏隔膜。 - 切除升主动脉并切除心脏。
- 切除肺部并暴露降主动脉。
注意：不要损伤降主动脉。 - 对角切开降主动脉以露出横截面（图1B）。
注意：不要剥离主动脉;对角线切口更适合导管插入。 - 在运行血管舒张缓冲液时将22 G导管插入降主动脉。
注意：在运行血管舒张缓冲液时插入导管可避免空气污染。 - 固定导管的根部（图1C）。
- 打个结，防止因回流而漏水。
- 在13至15 kPa之间的固定压力下，将温热的血管扩张溶液（盐酸罂粟碱，4g / L;腺苷，1 g / L;肝素，1 U / mL）灌注3分钟。
- 将4%多聚甲醛溶液（PBS）浸入3分钟。
注意：固定的成功可以通过脚的运动来确认（图1D）。 - 在灌注前准备造影剂。
注：根据样品调整稀释率;对于成年小鼠，以1：1的比例混合染色剂和稀释剂。 - 停止灌注并用2mL稀释的造影剂填充延长管（图1E）。
注意：造影剂应缓慢注射，以避免损伤血管。 - 在13至15 kPa之间的固定压力下灌注造影剂。
- 为了可视化动脉，请检查脚趾甲以确认造影剂已到达动脉（图1F）。
- 要观察所有血管，请检查隔膜的下腔静脉，以确认造影剂的完整循环。
注意：在开始时，造影剂含有血管扩张溶液;因此，它的适当流通至关重要。
- 合上三向旋塞阀并卸下管子（图1G）。
注意：如果三向旋塞阀未闭合，则对比度将向后流动。 - 将样品在4°C孵育过夜。
- 去除皮肤并将其固定在10%甲醛溶液中。
3. 可视化
注：可视化协议因 CT 扫描仪而异。该协议中使用了微焦点X射线CT扫描仪。有必要根据每个CT扫描仪优化成像方法。
- 将样品固定在含有PBS的50 mL管中。
- 将样品管放在桌子上。
- 以 50 kV 的电压和 600 μA 的电流扫描样品，确保聚焦到中心距离为 75.2 mm。
注：在此设置中，1 体素的尺寸为 28.7 μm x 28.7 μm x 28.7 μm。 - 使用斐济加载获取的图像数据，斐济是用于生物图像分析的开源平台。
- 使用腓肠肌确定肌肉体素值。
- 使用 矩形 工具选择腓肠肌。
- 检查直方图的均值和标准差 （SD） （分析|直方图）。
- 将肌肉体素密度定义为腓肠肌的平均值 + 2SD。
- 将肌肉体素密度设置为较低的阈值水平（图像|调整|阈值|设置|较低的阈值级别）。
注意：设置阈值后，血管面积和骨骼面积仍保留在二值化数据中。
Representative Results
如果正确执行该协议，下肢的所有血管都可以可视化（图2A）。在后肢缺血模型中，非结扎股动脉与股静脉平行（图2B），并且可以通过造影剂的中断来确认结扎股动脉（图2C）。结果揭示了附属血管的发展（图2D）。侧支循环在结扎动脉近端的动脉和小腿区域的动脉之间以及股动脉的腹侧和背侧形成。臀下动脉 -从骨盆背侧开始，在大腿外侧运行 - 在缺血侧强劲扩张。
充满造影剂的容器中充满造影剂（图2E）;造影剂的破坏表明非造影剂（例如，血液、血管扩张剂缓冲液或气泡）的混合或造影剂的灌注不足（图2F）。如果血管萎缩，血管舒张和固定将不起作用。虽然CT成像只能可视化造影剂，但可以通过宏观或立体显微镜观察来观察身体表面的动脉（图2G）。因此，使用造影剂更容易评估缺陷（图2H）。
图1：程序概述。 （A）压力灌注装置和22 G导管通过2 mL延长管和三向旋塞阀连接。（B）升主动脉对角线切割以露出横截面（黄色箭头）。（C）使用两根针（黄色箭头）固定导管。（D）固定后下肢伸展（黄色箭头）。（E）通过三向旋塞阀注入造影剂。注射方向由黄色箭头指示。（F）后肢指甲充满对比（黄色箭头）。（G）旋塞阀关闭并从灌注装置中取出。 请点击此处查看此图的放大版本。
图2：船只的图像。 （A）后肢骨骼和血管的整体图像。（B）股动脉（红色箭头）和静脉（蓝色箭头）。（C）股动脉结扎（黄色箭头）。外围被障碍物（黄色虚线）打断。（D）结扎侧的附属血管（黄色箭头）。黄色虚线代表股动脉中断。（E）充盈的隐性动脉（红色箭头）和静脉（蓝色箭头）样本。（F）灌注不足导致隐蔽血管中断（黄色虚线）。（G）代表性样品的立体显微镜观察。右股动脉（黄色箭头）充满造影剂。（H） 对失败样品的体视显微镜观察。右股动脉（黄色箭头）缺乏造影剂。比例尺 = 1 毫米（B-F）、2 毫米（G、H）、10 毫米 （A）。请点击此处查看此图的放大版本。
Discussion
本报告介绍了一种复杂的方法来可视化下半身的血管。在这个过程中有几个关键步骤：首先是在注射造影剂之前进行预灌注。如果没有去除足够的血液，造影剂将无法填充系统。此外，气泡的加入会干扰对比度的填充;因此，必须完全去除回路中的空气。此外，由于造影剂在注射后不会立即凝固，因此不应过度移动样品。
该方法可用于评估血管和循环（如侧支循环）的形成增加。相反，作为限制，很难评估狭窄的血管，因为很难区分狭窄和造影剂中的人为减少。此外，评估骨骼中的血管具有挑战性，因为血液和骨骼的分离很困难。
3D可视化的另一种方法是免疫染色。使用组织清除技术，有几种方法可用于3D成像7。免疫染色是有利的，因为它允许使用抗体对特定蛋白质进行染色。最近的一份报告挑战了基于免疫染色的全身成像8;然而，基于 CT 的影像学检查不需要任何组织清除预处理。
这种方法可以可视化膈肌下方的所有血管，包括腹部器官。腹部器官的血管生成对维持体内平衡和发展疾病有很大影响9，10。由于该协议针对下肢血管的评估进行了优化，因此器官特异性启动将能够可视化与任何因素（例如炎症或肿瘤）相关的血管生成。
Disclosures
作者没有利益冲突要声明。
Acknowledgments
我们感谢Yasuyo Kimura，Megumi Nagahiro和Saeko Tokunaga在动物实验方面的出色技术支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mL syringe | TERUMO | SS-01T | |
| 10% Formalin Solution | Fujifilm-Wako | 068-03841 | |
| 10x phosphate-buffered saline (-) (PBS) | Fujifilm-Wako | 163-25265 | Prepare 1x PBS |
| 22 G catheter (22 G S5 x 1" V(F)) | MEDIKIT | HP2140 | Only catheter is used. |
| 23 G needle | TERUMO | NN-2325R | Use as a pin |
| 4% paraformaldehyde in PBS | Fujifilm-Wako | 163-20145 | |
| 5 mL syringe | |||
| 5-0 Suture with needle | Alfresa Pharma Corporation | ER1205SB45 | |
| Adenosine | Sigma-aldrich | A9251-5G | For vasodilating solution |
| Dumont #55 Forceps | FST | No.11255-20 | |
| Extension tube | TOP | X2-FL50 | |
| Falcon 50 mL tube | CORNING | 352098 | |
| Graefe Forceps | FST | No.11051-10 | |
| Heparin Sodium 5,000 units/5 mL | Mochida Co. Ltd. | 224122458 | |
| Isoflurane | Fujifilm-Wako | 099-06571 | |
| Microfil Injection Compounds | Flow Tech Inc. | MV-117 | Mix liquid MV-Compound (stain) and MV-Diluent 1: 1 |
| Papaverine hydrochloride | Fujifilm | 164-18002 | For vasodilating solution |
| Small Animal Anesthetizer | Muromachi Kikai Co. Ltd. | MK-A100ecoW-ST | |
| Spring Scissors - Angled to Side | FST | No.15006-09 | |
| Surgical Scissors - Sharp-Blunt | FST | No.14001-12 | |
| three-way cock | TERUMO | TS-TR1K | |
| Transfer pipette | SAMCO SCIENTIFIC | SM262-1S | Use for mixing contrast medium |
| X-ray CT scanner | Toshiba IT & Control Systems Corporation | TOSHIBA TOSCANNER 32300 FPD |
References
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