Summary
Qui, descriviamo un metodo di visualizzazione e quantificazione per i vasi murini degli arti posteriori utilizzando la tomografia computerizzata a micro-raggi X.
Abstract
I vasi sanguigni sono reti complesse con strutture simili ad alberi e le reti vascolari sono essenziali per mantenere sia la circolazione che la funzione degli organi. Chiarire il meccanismo di formazione dei vasi sanguigni è quindi estremamente utile per chiarire i processi di sviluppo e i meccanismi patologici. I vasi murini degli arti posteriori sono spesso usati come modello per l'angiogenesi fisiologica e patologica. La valutazione viene eseguita principalmente tramite un metodo bidimensionale utilizzando sezioni di tessuto. Tuttavia, i metodi per valutare la morfologia vascolare tridimensionale (3D) sono particolarmente limitati. Questo documento introduce un metodo per visualizzare gli arti posteriori murini utilizzando la tomografia computerizzata (TC). La resina opaca per radiazioni viene iniettata attraverso l'aorta discendente e interi vasi vengono riempiti di colorante. Regolando il tempo di iniezione del colorante, è anche possibile il riempimento arterioso specifico e i campioni possono essere ottenuti con qualsiasi dispositivo TC a micro-raggi X. Questo metodo di contrasto fornisce una tecnica di base per la valutazione 3D dei vasi sanguigni murini negli arti inferiori. Inoltre, questo metodo può essere utilizzato per visualizzare tutti i vasi sanguigni sotto il diaframma e valutare i vasi sanguigni negli organi addominali.
Introduction
I vasi sanguigni sono reti complesse con strutture simili ad alberi. L'angiogenesi e la nuova formazione vascolare svolgono un ruolo essenziale nel mantenimento dell'omeostasi d'organo1. L'angiogenesi è regolata per il trattamento delle malattie ischemiche e maligne2. È quindi essenziale comprendere i meccanismi alla base dell'angiogenesi. I vasi murini degli arti posteriori sono spesso usati come modello utile per la ricerca vascolare3; la legatura ipsilaterale dell'arteria iliaca o femorale è un noto modello di ischemia degli arti posteriori utilizzato per valutare l'angiogenesi e il rimodellamento vascolare nell'angiogenesi fisiologica e patologica4. Tuttavia, la valutazione dell'angiogenesi viene eseguita principalmente mediante colorazione di sezione e i metodi per valutare la morfologia vascolare 3D sono particolarmente limitati.
Rispetto alla colorazione della sezione, la TC consente la visualizzazione 3D. Recentemente, Weyers et al. hanno riportato un sofisticato protocollo adatto per l'imaging TC, che consente la visualizzazione del sistema circolatorio coronarico adulto murino5. Abbiamo modificato il loro metodo per creare un metodo di preparazione del campione adatto per l'imaging TC dei vasi sanguigni degli arti inferiori6. Qui, una resina opaca per le radiazioni viene iniettata attraverso l'aorta discendente e i vasi negli arti inferiori sono pieni di colorante. Regolando il tempo di iniezione del colorante, è anche possibile il riempimento arterioso specifico e i campioni possono essere ottenuti con qualsiasi dispositivo di tomografia computerizzata a micro-raggi X. Questo metodo di contrasto fornisce una tecnica di base per la valutazione 3D dei vasi sanguigni murini sotto il diaframma e negli organi addominali e negli arti inferiori.
Protocol
Tutte le procedure sono state eseguite in conformità con le linee guida per la cura degli animali dell'Università di Kumamoto (numero di riferimento dell'approvazione. M30-040/A2020-105), conformi alla US National Institutes of Health Guide for the Care and Use of Laboratory Animals (pubblicazione n. 85-23, rivista nel 2011).
1. Preparazione
- Preparare l'apparato di perfusione e il tampone vasodilatatore (4 mg/L di papaverina cloridrato, 4 g/L; adenosina, 1 g/L; eparina, 1 U/mL in soluzione salina tamponata con fosfato (PBS)).
NOTA: Il dispositivo di reflusso e i reagenti vasodilatatori sono gli stessi riportati da Weyers et al.5. - Collegare il catetere da 22 G, il tubo di prolunga da 2 ml e il rubinetto a tre vie (Figura 1A).
NOTA: Regolare il calibro in base alle dimensioni dell'animale. Per i topi adulti C57BL/6, 22 G è ottimale. - Riempire l'apparecchio di perfusione in pressione con il tampone vasodilatatore (Figura 1A).
NOTA: Evitare la formazione di bolle per evitare interruzioni nel riempimento del mezzo di contrasto.
2. Perfusione
- Iniettare 1 U/g di eparina in PBS nella cavità intraperitoneale 30 minuti prima dell'operazione.
- Anestetizzare completamente il topo con isoflurano ed eutanasizzarlo per lussazione cervicale.
- Dopo la decapitazione, fare un'incisione della linea mediana nello sterno e fissare il torace aperto con perni.
NOTA: per evitare perdite del contrasto, evitare di ferire il diaframma. - Tagliare l'aorta ascendente e rimuovere il cuore.
- Rimuovere il polmone ed esporre l'aorta discendente.
NOTA: non ferire l'aorta discendente. - Tagliare l'aorta discendente in diagonale per esporre la sezione trasversale (Figura 1B).
NOTA: Non staccare l'aorta; una sezione diagonale è migliore per l'inserimento del catetere. - Inserire il catetere da 22 G nell'aorta discendente durante l'esecuzione del buffer di vasodilatazione.
NOTA: l'inserimento del catetere durante l'esecuzione del tampone di vasodilatazione evita la contaminazione dell'aria. - Fissare la radice del catetere (Figura 1C).
- Fai un nodo per evitare perdite dovute al riflusso.
- Perfondere una soluzione vasodilatatrice riscaldata (papaverina cloridrato, 4 g/L; adenosina, 1 g/L; eparina, 1 U/mL) per 3 minuti ad una pressione fissa compresa tra 13 e 15 kPa.
- Perfondere una soluzione di paraformaldeide al 4% in (PBS) per 3 min.
NOTA: Il successo della fissazione può essere confermato dal movimento del piede (Figura 1D). - Preparare il mezzo di contrasto poco prima della perfusione.
NOTA: Regolare la velocità di diluizione in base al campione; per i topi adulti, mescolare la macchia e il diluente in un rapporto di 1:1. - Interrompere la perfusione e riempire il tubo di prolunga con 2 mL di mezzo di contrasto diluito (Figura 1E).
NOTA: Il mezzo di contrasto deve essere iniettato lentamente per evitare lesioni ai vasi sanguigni. - Perfondere il mezzo di contrasto a una pressione fissa compresa tra 13 e 15 kPa.
- Per visualizzare le arterie, controllare l'unghia del piede per confermare che il mezzo di contrasto ha raggiunto l'arteria (Figura 1F).
- Per visualizzare tutti i vasi, controllare la vena cava inferiore del diaframma per confermare la completa circolazione del mezzo di contrasto.
NOTA: All'inizio, il contrasto contiene la soluzione vasodilatatrice; quindi, la sua corretta circolazione è essenziale.
- Chiudere il rubinetto a tre vie e rimuovere il tubo (Figura 1G).
NOTA: se il rubinetto a tre vie non è chiuso, il contrasto scorrerà all'indietro. - Incubare il campione durante la notte a 4 °C.
- Rimuovere la pelle e fissarla in soluzione di formaldeide al 10%.
3. Visualizzazione
NOTA: i protocolli di visualizzazione variano a seconda dello scanner CT. In questo protocollo è stato utilizzato uno scanner CT a raggi X microfocus. È necessario ottimizzare il metodo di imaging in base a ciascun scanner CT.
- Fissare il campione in un tubo da 50 ml contenente PBS.
- Posizionare la provetta del campione sul tavolo.
- Scansione del campione con una tensione di 50 kV e una corrente di 600 μA, garantendo una distanza di messa a fuoco al centro di 75,2 mm.
NOTA: una dimensione di 1 voxel era 28,7 μm x 28,7 μm x 28,7 μm in questa impostazione. - Carica i dati delle immagini acquisite con Fiji, una piattaforma open source per l'analisi di immagini biologiche.
- Determinare il valore del voxel muscolare usando il muscolo gastrocnemio.
- Scegli il muscolo gastrocnemio usando lo strumento rettangolo .
- Controllare la deviazione media e standard (SD) dall'istogramma (Analizza | Istogramma).
- Definire la densità del voxel muscolare come media + 2SD del muscolo gastrocnemio.
- Impostare la densità del voxel muscolare come livello di soglia inferiore (Immagine | regolare | Soglia | Imposta | livello di soglia inferiore).
NOTA: l'area vascolare e l'area ossea rimangono nei dati binari dopo aver impostato la soglia.
Representative Results
Tutti i vasi negli arti inferiori possono essere visualizzati se questo protocollo viene eseguito correttamente (Figura 2A). In un modello di ischemia degli arti posteriori, l'arteria femorale non legata corre parallela alla vena femorale (Figura 2B) e un'arteria femorale legata può essere confermata dall'interruzione dei mezzi di contrasto (Figura 2C). I risultati hanno rivelato lo sviluppo di navi collaterali (Figura 2D). La circolazione collaterale si forma tra le arterie prossimali all'arteria legata e l'arteria nella regione inferiore della gamba e sui lati ventrale e dorsale dell'arteria femorale. L'arteria glutea inferiore - che inizia sul lato dorsale del bacino e corre sul lato laterale della coscia - si espande robustamente sul lato ischemico.
I vasi pieni di contrasto sono riempiti con il mezzo di contrasto (Figura 2E); l'interruzione del contrasto indica la miscelazione di mezzi non contrapposti (ad esempio, sangue, tampone vasodilatatore o bolle) o una perfusione insufficiente del contrasto (Figura 2F). La vasodilatazione e la fissazione non funzionerebbero bene se i vasi sanguigni si sono ridotti. Sebbene l'imaging TC possa visualizzare solo il mezzo di contrasto, è possibile visualizzare le arterie sulla superficie del corpo mediante osservazione macroscopica o stereomicroscopica (Figura 2G). Pertanto, è più facile valutare i difetti utilizzando il mezzo di contrasto (Figura 2H).
Figura 1: Schema della procedura. (A) Apparecchio di perfusione a pressione e catetere da 22 G collegati tramite un tubo di prolunga da 2 ml e un rubinetto di arresto a tre vie. (B) L'aorta ascendente viene tagliata diagonalmente per esporre la sezione trasversale (freccia gialla). (C) Il catetere è stato fissato utilizzando due perni (frecce gialle). (D) Gli arti inferiori fissi si estendono al momento della fissazione (frecce gialle). (E) Iniezione di contrasto attraverso il rubinetto a tre vie. La direzione di iniezione è indicata da una freccia gialla. (F) L'unghia dell'arto posteriore è riempita con il contrasto (freccia gialla). G) Il rubinetto è chiuso e rimosso dall'apparecchio di perfusione. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Immagini delle navi. (A) Immagine completa delle ossa e dei vasi degli arti posteriori. (B) Arteria femorale (freccia rossa) e vena (freccia blu). (C) Arteria femorale legata (freccia gialla). La periferia è interrotta dall'ostruzione (linea tratteggiata gialla). (D) Vasi collaterali nel lato legato (frecce gialle). La linea tratteggiata gialla rappresenta l'arteria femorale interrotta. (E) Un campione ben riempito dell'arteria safena (freccia rossa) e della vena (freccia blu). (F) Una perfusione inadeguata porta all'interruzione dei vasi safeni (linea tratteggiata gialla). G) Osservazione stereomicroscopica di un campione rappresentativo. L'arteria femorale destra (freccia gialla) è piena di mezzo di contrasto. (H) Osservazione stereomicroscopica di un campione fallito. L'arteria femorale destra (freccia gialla) manca di mezzo di contrasto. Barre di scala = 1 mm (B-F), 2 mm (G, H), 10 mm (A). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Discussion
Questo rapporto introduce un metodo sofisticato per visualizzare i vasi sanguigni nella parte inferiore del corpo. Ci sono diversi passaggi critici in questo processo: il primo è la preperfusione prima dell'iniezione del mezzo di contrasto. Se non viene rimosso abbastanza sangue, il contrasto non riempirà il sistema. Inoltre, l'inclusione di bolle d'aria disturba il riempimento del contrasto; pertanto, l'aria nel circuito deve essere completamente rimossa. Inoltre, poiché il mezzo di contrasto non si solidifica immediatamente dopo l'iniezione, il campione non deve essere spostato eccessivamente.
Questo metodo è utile per valutare l'aumento della formazione di vasi sanguigni e della circolazione, come la circolazione collaterale. Al contrario, come limitazione, è difficile valutare i vasi sanguigni ristretti, poiché è difficile distinguere tra stenosi e riduzione artificiale del mezzo di contrasto. Inoltre, è difficile valutare i vasi sanguigni nelle ossa, poiché la separazione del sangue e delle ossa è difficile.
Un metodo alternativo per la visualizzazione 3D è l'immunocolorazione. Utilizzando la tecnica di pulizia dei tessuti, sono disponibili diversi metodi per l'imaging 3D7. L'immunocolorazione è vantaggiosa in quanto consente la colorazione di proteine specifiche utilizzando anticorpi. Un recente rapporto sfida l'imaging di tutto il corpo basato sull'immunocolorazione8; tuttavia, l'imaging basato sulla TC non richiede alcun pretrattamento di pulizia dei tessuti.
Questo metodo consente la visualizzazione di tutti i vasi sotto il diaframma, compresi gli organi addominali. L'angiogenesi negli organi addominali ha un forte impatto sul mantenimento dell'omeostasi e sullo sviluppo di malattie9,10. Poiché questo protocollo è stato ottimizzato per la valutazione dei vasi degli arti inferiori, l'innesco organo-specifico consentirebbe la visualizzazione dell'angiogenesi associata a qualsiasi fattore, come l'infiammazione o i tumori.
Disclosures
Gli autori non hanno conflitti di interesse da dichiarare.
Acknowledgments
Ringraziamo Yasuyo Kimura, Megumi Nagahiro e Saeko Tokunaga per l'eccellente supporto tecnico negli esperimenti sugli animali.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mL syringe | TERUMO | SS-01T | |
| 10% Formalin Solution | Fujifilm-Wako | 068-03841 | |
| 10x phosphate-buffered saline (-) (PBS) | Fujifilm-Wako | 163-25265 | Prepare 1x PBS |
| 22 G catheter (22 G S5 x 1" V(F)) | MEDIKIT | HP2140 | Only catheter is used. |
| 23 G needle | TERUMO | NN-2325R | Use as a pin |
| 4% paraformaldehyde in PBS | Fujifilm-Wako | 163-20145 | |
| 5 mL syringe | |||
| 5-0 Suture with needle | Alfresa Pharma Corporation | ER1205SB45 | |
| Adenosine | Sigma-aldrich | A9251-5G | For vasodilating solution |
| Dumont #55 Forceps | FST | No.11255-20 | |
| Extension tube | TOP | X2-FL50 | |
| Falcon 50 mL tube | CORNING | 352098 | |
| Graefe Forceps | FST | No.11051-10 | |
| Heparin Sodium 5,000 units/5 mL | Mochida Co. Ltd. | 224122458 | |
| Isoflurane | Fujifilm-Wako | 099-06571 | |
| Microfil Injection Compounds | Flow Tech Inc. | MV-117 | Mix liquid MV-Compound (stain) and MV-Diluent 1: 1 |
| Papaverine hydrochloride | Fujifilm | 164-18002 | For vasodilating solution |
| Small Animal Anesthetizer | Muromachi Kikai Co. Ltd. | MK-A100ecoW-ST | |
| Spring Scissors - Angled to Side | FST | No.15006-09 | |
| Surgical Scissors - Sharp-Blunt | FST | No.14001-12 | |
| three-way cock | TERUMO | TS-TR1K | |
| Transfer pipette | SAMCO SCIENTIFIC | SM262-1S | Use for mixing contrast medium |
| X-ray CT scanner | Toshiba IT & Control Systems Corporation | TOSHIBA TOSCANNER 32300 FPD |
References
- Folkman, J.
- Folkman, J. Angiogenesis in cancer, vascular, rheumatoid and other disease. Nature Medicine. 1 (1), 27-31 (1995).
- Kochi, T., et al. Characterization of the arterial anatomy of the murine hindlimb: functional role in the design and understanding of ischemia models. PLoS One. 8 (12), 84047 (2013).
- Limbourg, A., et al. Evaluation of postnatal arteriogenesis and angiogenesis in a mouse model of hind-limb ischemia. Nature Protocols. 4 (12), 1737-1746 (2009).
- Weyers, J. J., Carlson, D. D., Murry, C. E., Schwartz, S. M., Mahoney, W. M. Retrograde perfusion and filling of mouse coronary vasculature as preparation for micro computed tomography imaging. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (60), e3740 (2012).
- Arima, Y., et al. Evaluation of collateral source characteristics with 3-dimensional analysis using micro-X-ray computed tomography. Journal of the American Heart Association. 7 (6), 007800 (2018).
- Tian, T., Yang, Z., Li, X. Tissue clearing technique: Recent progress and biomedical applications. Journal of Anatomy. 238 (2), 489-507 (2021).
- Susaki, E. A., et al. Advanced CUBIC protocols for whole-brain and whole-body clearing and imaging. Nature Protocols. 10 (11), 1709-1727 (2015).
- Fernandez, M., et al.
- Li, S., et al. Angiogenesis in pancreatic cancer: current research status and clinical implications. Angiogenesis. 22 (1), 15-36 (2019).
