Summary
Aqui, descrevemos um método de visualização e quantificação para vasos de membros traseiros murinos usando tomografia computadorizada de micro-raios-X.
Abstract
Os vasos sanguíneos são redes complexas com estruturas semelhantes a árvores, e redes vasculares são essenciais para manter a circulação e a manutenção da função dos órgãos. Esclarecer o mecanismo de formação de vasos sanguíneos é, portanto, extremamente útil para elucidar processos de desenvolvimento e mecanismos patológicos. Os vasos de membros traseiros de Murine são frequentemente usados como modelo para angiogênese fisiológica e patológica. A avaliação é realizada principalmente por meio de um método bidimensional utilizando seções teciduais. No entanto, os métodos de avaliação da morfologia vascular tridimensional (3D) são particularmente limitados. Este artigo introduz um método para visualizar membros traseiros murinos usando tomografia computadorizada (TC). A resina radioativa-opaca é injetada através da aorta descendente, e vasos inteiros são preenchidos com corante. Ao ajustar o tempo da injeção de corante, o preenchimento específico da arterial também é possível, e as amostras podem ser obtidas com qualquer dispositivo ct de raios-X. Este método de contraste fornece uma técnica básica para a avaliação 3D dos vasos sanguíneos murinos nas extremidades inferiores. Além disso, este método pode ser usado para visualizar todos os vasos sanguíneos abaixo do diafragma e avaliar os vasos sanguíneos nos órgãos abdominais.
Introduction
Vasos sanguíneos são redes complexas com estruturas semelhantes a árvores. A angiogênese e a nova formação vascular desempenham papéis essenciais na manutenção da homeostase do órgão1. A angiogênese é regulada para o tratamento de doenças isquêmicas e malignas2. Por isso, é essencial compreender os mecanismos subjacentes da angiogênese. Os vasos de membros traseiros murinos são frequentemente usados como um modelo útil para pesquisas vasculares3; ligação ipsilateral da artéria ilíaca ou femoral é um modelo conhecido de isquemia de membros traseiros usado para avaliar angiogênese e remodelagem vascular em angiogênese fisiológica e patológica4. No entanto, a avaliação da angiogênese é realizada principalmente por coloração de seção, e os métodos para avaliar a morfologia vascular 3D são particularmente limitados.
Em comparação com a coloração da seção, a tomografia permite a visualização 3D. Recentemente, Weyers et al. relataram um protocolo sofisticado adequado para imagens de tomografia computadorizada, permitindo a visualização do sistema circulatório coronário adulto murina5. Modificamos seu método para criar um método de preparação de amostras adequado para imagens de tomografia dos vasos sanguíneos da extremidade inferior6. Aqui, uma resina radio-opaca é injetada através da aorta descendente, e os vasos nas extremidades inferiores são preenchidos com corante. Ao ajustar o tempo da injeção de corante, o preenchimento específico da arterial também é possível, e as amostras podem ser obtidas com qualquer dispositivo de tomografia computadorizada de micro-raios-X. Este método de contraste fornece uma técnica básica para a avaliação 3D dos vasos sanguíneos murinos abaixo do diafragma e nos órgãos abdominais e nas extremidades inferiores.
Protocol
Todos os procedimentos foram realizados de acordo com as diretrizes de cuidados com animais da Universidade de Kumamoto (referência de aprovação nº. M30-040/A2020-105), que está em conformidade com o Guia Nacional de Saúde dos EUA para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório (publicação nº 85-23, revisada em 2011).
1. Preparação
- Prepare o aparelho de perfusão e o tampão vasodilatador (cloridrato papaverina 4 mg/L, 4 g/L; adenosina, 1 g/L; heparina, 1 U/mL em salina tamponada com fosfato (PBS)).
NOTA: O dispositivo de refluxo e os reagentes vasodilatadores são os mesmos relatados por Weyers et al.5. - Conecte o cateter de 22 G, o tubo de extensão de 2 mL e a torneira de três vias (Figura 1A).
NOTA: Ajuste o medidor de acordo com o tamanho do animal. Para camundongos adultos C57BL/6, 22 G é o ideal. - Encha o aparelho de perfusão de pressão com o tampão vasodilatador (Figura 1A).
NOTA: Evite a formação de bolhas para evitar interrupções no enchimento do meio de contraste.
2. Perfusão
- Injete 1 u/g de heparina em PBS na cavidade intraperitoneal 30 min antes da operação.
- Anestesia completamente o rato com isoflurano e eutanásia por deslocamento cervical.
- Após a decapitação, faça uma incisão no esterno e fixe o tórax aberto com pinos.
NOTA: Para evitar vazamentos do contraste, evite ferir o diafragma. - Corte a aorta ascendente e remova o coração.
- Remova o pulmão e exponha a aorta descendente.
NOTA: Não machuque a aorta descendente. - Corte a aorta descendente diagonalmente para expor a seção transversal (Figura 1B).
NOTA: Não retire a aorta; uma seção diagonal é melhor para a inserção do cateter. - Insira o cateter de 22 G na aorta descendente enquanto executa o tampão de vasodilatação.
NOTA: A inserção do cateter durante a execução do tampão de vasodilatação evita a contaminação do ar. - Fixar a raiz do cateter (Figura 1C).
- Faça um nó para evitar vazamentos devido ao fluxo de retorno.
- Perfuse uma solução vasodilatante aquecida (cloridrato papaverina, 4 g/L; adenosina, 1 g/L; heparina, 1 U/mL) por 3 min a uma pressão fixa entre 13 e 15 kPa.
- Perfundir uma solução de 4% de paraformaldeído em (PBS) por 3 min.
NOTA: O sucesso da fixação pode ser confirmado pelo movimento do pé (Figura 1D). - Prepare o meio de contraste pouco antes da perfusão.
NOTA: Ajuste a taxa de diluição de acordo com a amostra; para camundongos adultos, misture a mancha e o diluído em uma proporção de 1:1. - Pare a perfusão e encha o tubo de extensão com 2 mL de meio de contraste diluído (Figura 1E).
NOTA: O meio de contraste deve ser injetado lentamente para evitar ferimentos nos vasos sanguíneos. - Perfunda o meio de contraste a uma pressão fixa entre 13 e 15 kPa.
- Para visualizar artérias, verifique a unha do pé para confirmar se o meio de contraste atingiu a artéria (Figura 1F).
- Para visualizar todos os vasos, verifique a veia cava inferior do diafragma para confirmar a circulação completa do meio de contraste.
NOTA: No início, o contraste contém a solução vasodilatante; portanto, sua circulação adequada é essencial.
- Feche a torneira de três vias e remova o tubo (Figura 1G).
NOTA: Se a torneira de três vias não estiver fechada, o contraste fluirá para trás. - Incubar a amostra durante a noite a 4 °C.
- Remova a pele e fixe-a em solução de formaldeído de 10%.
3. Visualização
NOTA: Os protocolos de visualização diferem dependendo do scanner de tomografia computadorizada. Um scanner de tomografia de raio-X de microfoco foi usado neste protocolo. É necessário otimizar o método de imagem de acordo com cada tomógrafo.
- Fixar a amostra em um tubo de 50 mL contendo PBS.
- Coloque o tubo de amostra sobre a mesa.
- Escaneie a amostra com uma tensão de 50 kV e uma corrente de 600 μA, garantindo uma distância de foco para centro de 75,2 mm.
NOTA: Uma dimensão de 1 voxel foi de 28,7 μm x 28,7 μm x 28,7 μm nesta configuração. - Carregue os dados de imagem adquiridos com o Fiji, uma plataforma de código aberto para análise de imagens biológicas.
- Determine o valor do voxel muscular usando o músculo gastrocnemius.
- Escolha o músculo gastrocnemius usando a ferramenta retângulo .
- Verifique a média e o desvio padrão (SD) do histograma (Analisar | Histograma).
- Defina a densidade do voxel muscular como média + 2SD do músculo gastrocnemius.
- Defina a densidade do voxel muscular como o nível de limiar inferior (imagem | ajustar | Limiar | Definir | nível de limiar inferior).
NOTA: A área vascular e a área óssea permanecem nos dados binarizados após o limite ser definido.
Representative Results
Todos os vasos nas extremidades inferiores podem ser visualizados se este protocolo for corretamente executado (Figura 2A). Em um modelo de isquemia de membros traseiros, a artéria femoral não ligada corre paralelamente à veia femoral (Figura 2B), e uma artéria femoral ligada pode ser confirmada pela interrupção da mídia de contraste (Figura 2C). Os resultados revelaram o desenvolvimento de embarcações colaterais (Figura 2D). A circulação colateral é formada entre as artérias proximal à artéria ligada e a artéria na região da perna inferior e nos lados ventral e dorsal da artéria femoral. A artéria glútea inferior que começa no lado dorsal da pelve e corre no lado lateral da coxa - expande-se robustamente no lado isquêmico.
Os vasos cheios de contraste são preenchidos com o meio de contraste (Figura 2E); a interrupção no contraste indica a mistura de mídia não-contrária (por exemplo, sangue, tampão vasodilatador ou bolhas) ou perfusão insuficiente do contraste (Figura 2F). A vasodilatação e a fixação não funcionariam bem se os vasos sanguíneos tivessem encolhido. Embora a imagem ct só possa visualizar o meio de contraste, é possível visualizar as artérias na superfície do corpo por observação macroscópica ou estereomicroscópica (Figura 2G). Assim, é mais fácil avaliar defeitos utilizando o meio de contraste (Figura 2H).
Figura 1: Esboço do procedimento. (A) Aparelho de perfusão de pressão e o cateter de 22 G conectado através de um tubo de extensão de 2 mL e torneira de três vias. (B) A aorta ascendente é cortada diagonalmente para expor a seção transversal (seta amarela). (C) O cateter foi fixado utilizando dois pinos (setas amarelas). (D) Os membros inferiores fixos estendem-se após a fixação (setas amarelas). (E) Injeção de contraste através da torneira de três vias. A direção de injeção é indicada por uma seta amarela. (F) A unha do membro traseiro é preenchida com o contraste (seta amarela). (G) A torneira é fechada e removida do aparelho de perfusão. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Imagens de vasos. (A) Imagem completa dos ossos e vasos do membro traseiro. (B) Artéria femoral (seta vermelha) e veia (seta azul). (C) Artéria femoral ligada (seta amarela). A periferia é interrompida pela obstrução (linha pontilhada amarela). (D) Vasos colaterais no lado ligatado (setas amarelas). A linha pontilhada amarela representa a artéria femoral interrompida. (E) Uma amostra bem preenchida da artéria safena (seta vermelha) e veia (seta azul). (F) Perfusão inadequada leva à interrupção de vasos saphenos (linha pontilhada amarela). (G) Observação estereoscópica de uma amostra representativa. A artéria femoral direita (seta amarela) é preenchida com meio de contraste. (H) Observação estereómicas de uma amostra falha. A artéria femoral direita (seta amarela) não tem meio de contraste. Barras de escala = 1 mm (B-F), 2 mm (G, H), 10 mm (A). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Discussion
Este relatório introduz um método sofisticado para visualizar vasos sanguíneos na parte inferior do corpo. Existem várias etapas críticas nesse processo: a primeira é a pré-perfusão antes da injeção do meio de contraste. Se o sangue suficiente não for removido, o contraste não encherá o sistema. Além disso, a inclusão de bolhas de ar perturba o enchimento do contraste; assim, o ar no circuito deve ser completamente removido. Além disso, como o meio de contraste não se solidifica imediatamente após a injeção, a amostra não deve ser excessivamente movida.
Este método é útil para avaliar o aumento da formação de vasos sanguíneos e circulação, como a circulação colateral. Por outro lado, como limitação, é difícil avaliar os vasos sanguíneos estreitos, pois é difícil distinguir entre estenose e uma redução artificial no meio de contraste. Além disso, é desafiador avaliar os vasos sanguíneos nos ossos, pois a separação de sangue e osso é difícil.
Um método alternativo para visualização 3D é a imunostaining. Utilizando a técnica de limpeza tecidual, vários métodos estão disponíveis para imagens 3D7. A imunossuagem é vantajosa, pois permite a coloração de proteínas específicas usando anticorpos. Um relatório recente desafia imagens de corpo inteiro baseadas em imunostaining8; no entanto, a imagem baseada em TC não requer qualquer pré-tratamento de limpeza tecidual.
Este método permite a visualização de todos os vasos abaixo do diafragma, incluindo os órgãos abdominais. A angiogênese nos órgãos abdominais tem forte impacto na manutenção da homeostase e no desenvolvimento de doenças9,10. Como este protocolo foi otimizado para a avaliação dos vasos da extremidade inferior, a escoração específica dos órgãos permitiria a visualização de angiogênese associada a qualquer fator, como inflamação ou tumores.
Disclosures
Os autores não têm conflitos de interesse para declarar.
Acknowledgments
Agradecemos a Yasuyo Kimura, Megumi Nagahiro e Saeko Tokunaga pelo excelente suporte técnico em experimentos com animais.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mL syringe | TERUMO | SS-01T | |
| 10% Formalin Solution | Fujifilm-Wako | 068-03841 | |
| 10x phosphate-buffered saline (-) (PBS) | Fujifilm-Wako | 163-25265 | Prepare 1x PBS |
| 22 G catheter (22 G S5 x 1" V(F)) | MEDIKIT | HP2140 | Only catheter is used. |
| 23 G needle | TERUMO | NN-2325R | Use as a pin |
| 4% paraformaldehyde in PBS | Fujifilm-Wako | 163-20145 | |
| 5 mL syringe | |||
| 5-0 Suture with needle | Alfresa Pharma Corporation | ER1205SB45 | |
| Adenosine | Sigma-aldrich | A9251-5G | For vasodilating solution |
| Dumont #55 Forceps | FST | No.11255-20 | |
| Extension tube | TOP | X2-FL50 | |
| Falcon 50 mL tube | CORNING | 352098 | |
| Graefe Forceps | FST | No.11051-10 | |
| Heparin Sodium 5,000 units/5 mL | Mochida Co. Ltd. | 224122458 | |
| Isoflurane | Fujifilm-Wako | 099-06571 | |
| Microfil Injection Compounds | Flow Tech Inc. | MV-117 | Mix liquid MV-Compound (stain) and MV-Diluent 1: 1 |
| Papaverine hydrochloride | Fujifilm | 164-18002 | For vasodilating solution |
| Small Animal Anesthetizer | Muromachi Kikai Co. Ltd. | MK-A100ecoW-ST | |
| Spring Scissors - Angled to Side | FST | No.15006-09 | |
| Surgical Scissors - Sharp-Blunt | FST | No.14001-12 | |
| three-way cock | TERUMO | TS-TR1K | |
| Transfer pipette | SAMCO SCIENTIFIC | SM262-1S | Use for mixing contrast medium |
| X-ray CT scanner | Toshiba IT & Control Systems Corporation | TOSHIBA TOSCANNER 32300 FPD |
References
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- Weyers, J. J., Carlson, D. D., Murry, C. E., Schwartz, S. M., Mahoney, W. M. Retrograde perfusion and filling of mouse coronary vasculature as preparation for micro computed tomography imaging. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (60), e3740 (2012).
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