Summary
Hier beschrijven we een visualisatie- en kwantificeringsmethode voor muizenvaten met behulp van micro-röntgen computertomografie.
Abstract
Bloedvaten zijn complexe netwerken met boomachtige structuren en vasculaire netwerken zijn essentieel voor het behoud van zowel de bloedsomloop als het behoud van de orgaanfunctie. Het verduidelijken van het mechanisme van bloedvatvorming is daarom uiterst nuttig voor het ophelderen van ontwikkelingsprocessen en pathologische mechanismen. Murine achterpootvaten worden vaak gebruikt als een model voor fysiologische en pathologische angiogenese. Evaluatie wordt voornamelijk uitgevoerd via een tweedimensionale methode met behulp van weefselsecties. Methoden voor het evalueren van driedimensionale (3D) vasculaire morfologie zijn echter bijzonder beperkt. Dit artikel introduceert een methode voor het visualiseren van muriene achterpoten met behulp van computertomografie (CT). Stralingsdoorzichtige hars wordt geïnjecteerd door de dalende aorta en hele vaten worden gevuld met kleurstof. Door de tijd van kleurstofinjectie aan te passen, is arteriële specifieke vulling ook mogelijk en kunnen monsters worden verkregen met elk micro-röntgen CT-apparaat. Deze contrastmethode biedt een basistechniek voor de 3D-evaluatie van muizenbloedvaten in de onderste ledematen. Bovendien kan deze methode worden gebruikt om alle bloedvaten onder het middenrif te visualiseren en bloedvaten in de buikorganen te evalueren.
Introduction
Bloedvaten zijn complexe netwerken met boomachtige structuren. Angiogenese en nieuwe vasculaire vorming spelen een essentiële rol bij het behoud van orgaanhomeostase1. Angiogenese wordt gereguleerd voor de behandeling van ischemische en kwaadaardige ziekten2. Het is daarom essentieel om de onderliggende mechanismen van angiogenese te begrijpen. Murine achterpootvaten worden vaak gebruikt als een nuttig model voor vasculair onderzoek3; ipsilaterale ligatie van de iliacale of femorale slagader is een bekend ischemiemodel van de achterpoten dat wordt gebruikt om angiogenese en vasculaire remodellering in fysiologische en pathologische angiogenese te beoordelen4. De evaluatie van angiogenese wordt echter voornamelijk uitgevoerd door sectiekleuring en methoden voor het evalueren van 3D-vasculaire morfologie zijn bijzonder beperkt.
In vergelijking met sectiekleuring maakt CT 3D-visualisatie mogelijk. Onlangs rapporteerden Weyers et al. een geavanceerd protocol dat geschikt is voor CT-beeldvorming, waardoor de visualisatie van de coronaire bloedsomloop van muizen voor volwassenen mogelijk is5. We hebben hun methode aangepast om een monstervoorbereidingsmethode te creëren die geschikt is voor CT-beeldvorming van de bloedvaten van de onderste extremiteit6. Hier wordt een stralingsdoorzichtige hars door de dalende aorta geïnjecteerd en worden bloedvaten in de onderste ledematen gevuld met kleurstof. Door de tijd van kleurstofinjectie aan te passen, is arteriële specifieke vulling ook mogelijk en kunnen monsters worden verkregen met elk micro-röntgen computertomografie-apparaat. Deze contrastmethode biedt een basistechniek voor de 3D-evaluatie van muizenbloedvaten onder het middenrif en in buikorganen en de onderste ledematen.
Protocol
Alle procedures werden uitgevoerd in overeenstemming met de richtlijnen voor dierverzorging van de Kumamoto University (goedkeuringsreferentienummer. M30-040/A2020-105), die voldoen aan de Us National Institutes of Health Guide for the Care and Use of Laboratory Animals (publicatie nr. 85-23, herzien 2011).
1. Voorbereiding
- Bereid het perfusieapparaat en de vaatverwijdende buffer voor (4 mg/l papaverinehydrochloride, 4 g/l; adenosine, 1 g/l; heparine, 1 E/ml in fosfaatgebuufferde zoutoplossing (PBS)).
OPMERKING: Het refluxapparaat en de vaatverwijdende reagentia zijn dezelfde als die gerapporteerd door Weyers et al.5. - Sluit de 22 G-katheter, de verlengbuis van 2 ml en de driewegstopkraan aan (figuur 1A).
OPMERKING: Pas de meter aan op basis van de grootte van het dier. Voor volwassen C57BL/6 muizen is 22 G optimaal. - Vul het drukperfusieapparaat met de vaatverwijdende buffer (figuur 1A).
OPMERKING: Vermijd de vorming van bubbels om verstoring van de vulling van het contrastmedium te voorkomen.
2. Perfusie
- Injecteer 1 U/g heparine in PBS in de intraperitoneale holte 30 minuten voor de operatie.
- Verdoof de muis volledig met isofluraan en euthanaseer het door cervicale dislocatie.
- Maak na onthoofding een middellijnincisie in het borstbeen en bevestig de open thorax met pinnen.
OPMERKING: Om lekkage van het contrast te voorkomen, moet u voorkomen dat het diafragma gewond raakt. - Snijd de opgaande aorta en verwijder het hart.
- Verwijder de long en stel de dalende aorta bloot.
OPMERKING: Verwond de dalende aorta niet. - Snijd de dalende aorta diagonaal om de doorsnede bloot te leggen (figuur 1B).
OPMERKING: Pel de aorta niet af; een diagonaal gedeelte is beter voor het inbrengen van katheters. - Plaats de 22 G-katheter in de dalende aorta terwijl u de vaatverwijdingsbuffer gebruikt.
OPMERKING: Het inbrengen van de katheter tijdens het uitvoeren van de vaatverwijdingsbuffer voorkomt luchtverontreiniging. - Pin de wortel van de katheter (figuur 1C).
- Maak een knoop om lekkage door terugstroming te voorkomen.
- Perfuseer een verwarmde vaatverwijdende oplossing (papaverinehydrochloride, 4 g/L; adenosine, 1 g/L; heparine, 1 U/ml) gedurende 3 minuten bij een vaste druk tussen 13 en 15 kPa.
- Perfuseer een oplossing van 4% paraformaldehyde in (PBS) gedurende 3 min.
OPMERKING: Het succes van fixatie kan worden bevestigd door de beweging van de voet (figuur 1D). - Bereid het contrastmiddel vlak voor de perfusie.
OPMERKING: Pas de verdunningssnelheid aan volgens het monster; voor volwassen muizen, meng de vlek en het verdunningsmiddel in een verhouding van 1: 1. - Stop de perfusie en vul de verlengbuis met 2 ml verdund contrastmedium (figuur 1E).
OPMERKING: Het contrastmiddel moet langzaam worden geïnjecteerd om letsel aan de bloedvaten te voorkomen. - Perfundeer het contrastmedium bij een vaste druk tussen 13 en 15 kPa.
- Om de slagaders te visualiseren, controleert u de teennagel om te bevestigen dat het contrastmiddel de slagader heeft bereikt (figuur 1F).
- Om alle vaten te visualiseren, controleert u de inferieure vena cava van het diafragma om de volledige circulatie van het contrastmiddel te bevestigen.
OPMERKING: In het begin bevat het contrast de vaatverwijdende oplossing; daarom is de juiste circulatie essentieel.
- Sluit de driewegstopkraan en verwijder de buis (figuur 1G).
OPMERKING: Als de driewegstopkraan niet gesloten is, zal het contrast naar achteren stromen. - Incubeer het monster een nacht bij 4 °C.
- Verwijder de huid en bevestig deze in 10% formaldehyde-oplossing.
3. Visualisatie
OPMERKING: Visualisatieprotocollen verschillen afhankelijk van de CT-scanner. In dit protocol werd gebruik gemaakt van een microfocus X-ray CT scanner. Het is noodzakelijk om de beeldvormingsmethode te optimaliseren volgens elke CT-scanner.
- Bevestig het monster in een buis van 50 ml die PBS bevat.
- Leg de monsterbuis op tafel.
- Scan het monster met een spanning van 50 kV en een stroom van 600 μA en zorg voor een focus-tot-center afstand van 75,2 mm.
OPMERKING: Een afmeting van 1 voxel was 28,7 μm x 28,7 μm x 28,7 μm in deze instelling. - Laad de verkregen beeldgegevens met Fiji, een open-source platform voor biologische beeldanalyse.
- Bepaal de spier voxel waarde met behulp van de gastrocnemius spier.
- Kies de gastrocnemius spier met behulp van de rechthoek gereedschap.
- Controleer het gemiddelde en de standaarddeviatie (SD) van het histogram (| analyseren Histogram).
- Definieer de spier voxel dichtheid als gemiddelde + 2SD van de gastrocnemius spier.
- Stel de spiervoxeldichtheid in als het onderste drempelniveau (Afbeelding | pas | Drempel | | instellen lager drempelniveau).
OPMERKING: Het vasculaire gebied en het botgebied blijven in de binarized gegevens nadat de drempel is ingesteld.
Representative Results
Alle vaten in de onderste ledematen kunnen worden gevisualiseerd als dit protocol correct wordt uitgevoerd (figuur 2A). In een ischemiemodel met de achterpoten loopt de niet-geligeerde femorale slagader parallel aan de dijbeenader (figuur 2B) en kan een geligeerde dijbeenslagader worden bevestigd door de onderbreking van contrastmedia (figuur 2C). Uit de resultaten bleek de ontwikkeling van collateral vessels (figuur 2D). Collaterale circulatie wordt gevormd tussen de slagaders proximaal aan de geligeerde slagader en de slagader in het onderbeengebied en aan de ventrale en dorsale zijden van de dijbeenslagader. De inferieure gluteale slagader - beginnend aan de dorsale kant van het bekken en lopend aan de laterale kant van de dij - breidt zich robuust uit aan de ischemische kant.
Met contrast gevulde vaten worden gevuld met het contrastmedium (figuur 2E); verstoring van het contrast duidt op vermenging van niet-conflicthoudende media (bijv. bloed, vaatverwijdende buffer of bellen) of onvoldoende perfusie van het contrast (figuur 2F). Vasodilatatie en fixatie zouden niet goed werken als de bloedvaten zijn gekrompen. Hoewel CT-beeldvorming alleen het contrastmedium kan visualiseren, is het mogelijk om de slagaders op het oppervlak van het lichaam te bekijken door macroscopische of stereomicroscopische observatie (figuur 2G). Het is dus gemakkelijker om defecten te beoordelen met behulp van het contrastmiddel (figuur 2H).
Figuur 1: Overzicht van de procedure. (A) Drukperfusieapparaat en de 22 G-katheter verbonden via een verlengbuis van 2 ml en een driewegstopkraan. (B) De opgaande aorta wordt diagonaal gesneden om de doorsnede bloot te leggen (gele pijl). (C) De katheter werd bevestigd met behulp van twee pinnen (gele pijlen). (D) De vaste onderste ledematen strekken zich uit bij fixatie (gele pijlen). (E) Injectie van contrast door de driewegstopkraan. De injectierichting wordt aangegeven met een gele pijl. (F) De achterpootnagel is gevuld met het contrast (gele pijl). (G) De stopkraan wordt gesloten en uit het perfusieapparaat verwijderd. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Afbeeldingen van schepen. (A) Heel beeld van de botten en vaten van de achterpoten. (B) Femorale slagader (rode pijl) en ader (blauwe pijl). (C) Ligated femorale slagader (gele pijl). De periferie wordt onderbroken door de obstructie (gele stippellijn). D) Collaterale vaten aan de geligeerde zijde (gele pijlen). De gele stippellijn vertegenwoordigt de onderbroken dijbeenslagader. (E) Een goed gevuld monster van de sapheneuze slagader (rode pijl) en ader (blauwe pijl). (F) Onvoldoende perfusie leidt tot onderbreking van sapheneuze vaten (gele stippellijn). G) Stereomicroscopische waarneming van een representatieve steekproef. De rechter dijbeenslagader (gele pijl) is gevuld met contrastmiddel. (H) Stereomicroscoopwaarneming van een mislukt monster. De rechter femurslagader (gele pijl) mist contrastmedium. Schaalbalken = 1 mm (B-F), 2 mm (G, H), 10 mm (A). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Discussion
Dit rapport introduceert een geavanceerde methode om bloedvaten in het onderlichaam te visualiseren. Er zijn verschillende kritieke stappen in dit proces: de eerste is preperfusie vóór de injectie van contrastmiddel. Als er niet genoeg bloed wordt verwijderd, zal het contrast het systeem niet vullen. Bovendien verstoort de opname van luchtbellen de vulling van het contrast; daarom moet de lucht in het circuit volledig worden verwijderd. Bovendien, omdat het contrastmiddel niet onmiddellijk na injectie stolt, mag het monster niet overmatig worden verplaatst.
Deze methode is nuttig om de verhoogde vorming van bloedvaten en circulatie, zoals collaterale circulatie, te evalueren. Omgekeerd is het als beperking moeilijk om vernauwde bloedvaten te evalueren, omdat het moeilijk is om onderscheid te maken tussen stenose en een kunstmatige vermindering van het contrastmiddel. Bovendien is het een uitdaging om bloedvaten in botten te evalueren, omdat de scheiding van bloed en bot moeilijk is.
Een alternatieve methode voor 3D-visualisatie is immunostaining. Met behulp van de weefselverwijderingstechniek zijn verschillende methoden beschikbaar voor 3D-beeldvorming7. Immunostaining is voordelig omdat het de kleuring van specifieke eiwitten met behulp van antilichamen mogelijk maakt. Een recent rapport daagt beeldvorming van het hele lichaam uit op basis van immunostaining8; CT-gebaseerde beeldvorming vereist echter geen weefselzuiverende voorbehandeling.
Deze methode maakt de visualisatie van alle bloedvaten onder het diafragma mogelijk, inclusief de buikorganen. Angiogenese in de buikorganen heeft een sterke invloed op het behoud van homeostase en het ontwikkelen van ziekten9,10. Omdat dit protocol werd geoptimaliseerd voor de evaluatie van de bloedvaten van de onderste ledematen, zou orgaanspecifieke priming de visualisatie van angiogenese mogelijk maken die verband houdt met elke factor, zoals ontsteking of tumoren.
Disclosures
De auteurs hebben geen belangenconflicten te melden.
Acknowledgments
We bedanken Yasuyo Kimura, Megumi Nagahiro en Saeko Tokunaga voor de uitstekende technische ondersteuning bij dierproeven.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mL syringe | TERUMO | SS-01T | |
| 10% Formalin Solution | Fujifilm-Wako | 068-03841 | |
| 10x phosphate-buffered saline (-) (PBS) | Fujifilm-Wako | 163-25265 | Prepare 1x PBS |
| 22 G catheter (22 G S5 x 1" V(F)) | MEDIKIT | HP2140 | Only catheter is used. |
| 23 G needle | TERUMO | NN-2325R | Use as a pin |
| 4% paraformaldehyde in PBS | Fujifilm-Wako | 163-20145 | |
| 5 mL syringe | |||
| 5-0 Suture with needle | Alfresa Pharma Corporation | ER1205SB45 | |
| Adenosine | Sigma-aldrich | A9251-5G | For vasodilating solution |
| Dumont #55 Forceps | FST | No.11255-20 | |
| Extension tube | TOP | X2-FL50 | |
| Falcon 50 mL tube | CORNING | 352098 | |
| Graefe Forceps | FST | No.11051-10 | |
| Heparin Sodium 5,000 units/5 mL | Mochida Co. Ltd. | 224122458 | |
| Isoflurane | Fujifilm-Wako | 099-06571 | |
| Microfil Injection Compounds | Flow Tech Inc. | MV-117 | Mix liquid MV-Compound (stain) and MV-Diluent 1: 1 |
| Papaverine hydrochloride | Fujifilm | 164-18002 | For vasodilating solution |
| Small Animal Anesthetizer | Muromachi Kikai Co. Ltd. | MK-A100ecoW-ST | |
| Spring Scissors - Angled to Side | FST | No.15006-09 | |
| Surgical Scissors - Sharp-Blunt | FST | No.14001-12 | |
| three-way cock | TERUMO | TS-TR1K | |
| Transfer pipette | SAMCO SCIENTIFIC | SM262-1S | Use for mixing contrast medium |
| X-ray CT scanner | Toshiba IT & Control Systems Corporation | TOSHIBA TOSCANNER 32300 FPD |
References
- Folkman, J.
- Folkman, J. Angiogenesis in cancer, vascular, rheumatoid and other disease. Nature Medicine. 1 (1), 27-31 (1995).
- Kochi, T., et al. Characterization of the arterial anatomy of the murine hindlimb: functional role in the design and understanding of ischemia models. PLoS One. 8 (12), 84047 (2013).
- Limbourg, A., et al. Evaluation of postnatal arteriogenesis and angiogenesis in a mouse model of hind-limb ischemia. Nature Protocols. 4 (12), 1737-1746 (2009).
- Weyers, J. J., Carlson, D. D., Murry, C. E., Schwartz, S. M., Mahoney, W. M. Retrograde perfusion and filling of mouse coronary vasculature as preparation for micro computed tomography imaging. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (60), e3740 (2012).
- Arima, Y., et al. Evaluation of collateral source characteristics with 3-dimensional analysis using micro-X-ray computed tomography. Journal of the American Heart Association. 7 (6), 007800 (2018).
- Tian, T., Yang, Z., Li, X. Tissue clearing technique: Recent progress and biomedical applications. Journal of Anatomy. 238 (2), 489-507 (2021).
- Susaki, E. A., et al. Advanced CUBIC protocols for whole-brain and whole-body clearing and imaging. Nature Protocols. 10 (11), 1709-1727 (2015).
- Fernandez, M., et al.
- Li, S., et al. Angiogenesis in pancreatic cancer: current research status and clinical implications. Angiogenesis. 22 (1), 15-36 (2019).
