Summary
ここでは、マイクロX線コンピュータ断層撮影を用いたマウス後肢血管の可視化と定量方法について述べている。
Abstract
血管は木状の構造を持つ複雑なネットワークであり、循環を維持し臓器機能を維持するためには血管ネットワークが不可欠です。血管形成のメカニズムを明らかにすることは、発達過程や病理学的メカニズムを解明するのに非常に有用である。マウス後肢血管は、生理学的および病理学的血管新生のモデルとしてしばしば使用される。評価は、主に組織切片を用いた2次元法を介して行われる。しかしながら、3次元(3D)血管形態を評価する方法は特に限定される。本論文では、コンピュータ断層撮影(CT)を用いて後肢のマウスを可視化する方法を紹介する。放射線不透明樹脂は、下降大大間を通って注入され、容器全体が染料で満たされます。色素注入の時間を調整することにより、動脈特異的な充填も可能であり、かつ、任意のマイクロX線CT装置で試料を得ることができる。このコントラスト法は、下肢におけるマウス血管の3D評価に関する基本的な手法を提供する。さらに、この方法は、横隔膜下のすべての血管を可視化し、腹部器官の血管を評価するために使用することができる。
Introduction
血管は、木のような構造を持つ複雑なネットワークです。血管新生と新しい血管形成は、臓器恒常性1の維持に不可欠な役割を果たす。血管新生は虚血性および悪性疾患の治療のために調節される2。したがって、血管新生の根本的なメカニズムを理解することが不可欠です。ネズミの後肢血管は、血管研究のための有用なモデルとしてしばしば使用されます3;腸骨または大腿動脈のイプシラショナル結紮は、生理学的および病理学的血管新生4における血管新生および血管再形成を評価するために使用される既知の後肢虚血モデルである。しかし、血管新生の評価は主に切断染色により行われ、かつ3D血管形態を評価する方法は特に限定される。
CTは、セクション染色と比較して、3Dビジュアライゼーションを可能にします。最近、Weyersらの報告は、CTイメージングに適した高度なプロトコルを報告し、マウス成体冠状循環系の可視化を可能にする5。下肢血管のCTイメージングに適したサンプル調製方法を作成する方法を改変しました6.ここでは、放射線不透明樹脂が下降大オルタを通って注入され、下肢の血管は染料で満たされる。色素注入の時間を調整することにより、動脈特異的な充填も可能であり、かつ、任意のマイクロX線コンピュータ断層撮影装置でサンプルを得ることができる。このコントラスト法は、横隔膜下および腹部器官および下肢におけるマウス血管の3D評価に関する基本的な技術を提供する。
Protocol
全ての手続きは熊本大学動物ケアガイドライン(承認参照番号)に従って実施した。M30-040/A2020-105)は、米国国立衛生研究所の実験動物のケアと使用に関するガイド(出版第85-23号、2011年改訂)に準拠しています。
1. 準備
- 灌流装置および血管拡張剤緩衝液(4mg/Lパパベリン塩酸塩、4 g/L;アデノシン、1 g/L;ヘパリン、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)1 U/mL)を準備する。
注:還流装置および血管拡張薬は、Weyersらら5によって報告されたものと同じです。 - 22 G カテーテル、2 mL 延長チューブ、および 3 方向ストップコックを接続します(図 1A)。
注意:動物のサイズに合わせてゲージを調整します。成体C57BL/6マウスの場合、22Gが最適である。 - 血管拡張剤バッファーで圧力灌流装置を充填します(図1A)。
注:泡の形成を避けて、コントラスト媒体の充填の中断を防ぎます。
2. 灌流
- 手術の30分前にPBSに1 U/gヘパリンを注入します。
- イオブルランでマウスを完全に麻酔し、頸部脱臼によって安楽死させる。
- 切断後、胸骨に正中線切開を行い、開いた胸郭をピンで固定します。
注:コントラストの漏れを避けるために、ダイヤフラムを傷つけることは避けてください。 - 上が大大小を切り、心臓を取り除きます。
- 肺を取り除き、下降大起を露出する。
注:下降大大痛を傷つないでください。 - 下り大動脈を斜めに切り、断面を露出します(図1B)。
メモ:大間は剥がさないで下してください。対角断面はカテーテル挿入に適しています。 - 血管拡張バッファーを実行しながら、下降大陸に22 Gカテーテルを挿入します。
注:血管拡張バッファーを実行している間にカテーテルを挿入すると、空気汚染を回避できます。 - カテーテルの根をピン留めします(図1C)。
- 逆流による漏れを防ぐために結び目を作ります。
- 温めた血管拡張溶液(パパベリン塩酸塩、4 g/L;アデノシン、1 g/L;ヘパリン、1 U/mL)を13~15kPaの固定圧で3分間浸透させる。
- 4%パラホルムアルデヒド(PBS)中の溶液を3分間浸透させます。
メモ:固定の成功は足の動きによって確認できます(図1D)。 - 灌流直前にコントラスト培地を用意します。
注:サンプルに応じて希釈速度を調整します。成体マウスの場合、1:1の比率で染色と希釈剤を混ぜます。 - 灌流を停止し、希釈されたコントラスト媒体の2 mLで延長管を充填します(図1E)。
注:造影剤は血管への傷害を避けるためにゆっくりと注入されるべきである。 - 13~15kPaの固定圧でコントラスト媒体を浸透させます。
- 動脈を可視化するには、足の爪を調べて、コントラスト媒体が動脈に到達したことを確認します(図1F)。
- すべての血管を可視化するには、ダイヤフラムの下の大静脈をチェックして、コントラスト媒体の完全な循環を確認します。
注: 最初は、コントラストには血管拡張ソリューションが含まれています。したがって、その適切な循環は不可欠です。
- 3方向のストップコックを閉じ、チューブを取り外します(図1G)。
注: 3 方向ストップコックが閉じていない場合、コントラストは逆方向に流れます。 - サンプルを4°Cで一晩インキュベートする。
- 皮膚を取り除き、10%ホルムアルデヒド溶液に固定します。
3. 可視化
注: 可視化プロトコルは、CTスキャナによって異なります。このプロトコルではマイクロフォーカスX線CTスキャナが使用されました。各CTスキャナに応じて撮像方法を最適化する必要があります。
- PBSを含む50 mLチューブにサンプルを固定します。
- サンプルチューブをテーブルの上に置きます。
- 50kVの電圧と600μAの電流でサンプルをスキャンし、焦点から中心までの距離75.2mmを確保します。
注:1ボクセルの寸法は、この設定で28.7 μm x 28.7 μm x 28.7 μmでした。 - 取得した画像データを、生物学的画像解析のためのオープンソースプラットフォームであるフィジーと一緒にロードします。
- 胃腸筋を用いて筋肉ボクセル値を決定する。
- 長方形ツールを使用して胃食道筋を選択します。
- ヒストグラムからの平均と標準偏差(SD)を確認します(分析|ヒストグラム)。
- 筋肉ボクセル密度を、胃内形成筋の平均+ 2SDとして定義します。
- 筋肉ボクセル密度を下限しきい値レベルに設定します(画像|調整|しきい値||を設定するしきい値レベルを下げる)。
注: しきい値が設定された後も、血管領域と骨領域は二項化データに残ります。
Representative Results
このプロトコルが正しく実行されていれば、下肢のすべての船舶を可視化できます(図2A)。後肢虚血モデルでは、非連結大腿動脈は大腿静脈に平行に走り(図2B)、かつ、造影媒体の中断によって連結された大腿動脈を確認することができる(図2C)。その結果、担保船舶の開発が明らかになった(図2D)。副循環は、下肢領域の合字動脈と動脈に近い動脈と、大腿動脈の腹側および側側に形成される。骨盤の後側の下臀部動脈は、骨盤の側側で始まり、大腿部の側側側で走り、虚血性側に強く広がる。
コントラスト充填容器は、コントラスト媒体で満たされています(図2E)。コントラストの破壊は、非造影媒体(例えば、血液、血管拡張バッファー、または気泡)の混合またはコントラストの不十分な灌流(図2F)を示す。血管拡張と固定は、血管が縮小した場合にうまく機能しません。CTイメージングは造影媒体しか可視化できないが、巨視的または立体的観察(図2G)により身体表面の動脈を見ることができる(図2G)。これにより、コントラスト媒体を用いて欠陥を評価しやすくなる(図2H)。
図1:(A)圧力灌流装置と2mL延長管と三方停止を介して接続された22Gカテーテルの概要。(B) 上り大動脈を斜めに切って、断面(黄色の矢印)を露出させる。(C)カテーテルを2本のピン(黄色の矢印)を用いて固定した。(D) 固定下肢は固定時に伸びる(黄色い矢印)。(E)三方栓を通してコントラストを注入する。射出方向は黄色の矢印で示されます。(F) 後肢の爪はコントラスト(黄色の矢印)で塗りつぶされます。(G)栓コックを閉じて、灌流装置から取り外す。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:血管の画像。 (A) 後肢の骨と血管の全体像。(B)大腿動脈(赤い矢印)と静脈(青い矢印)。(C)結紮大腿動脈(黄色の矢印)。周囲は障害物(黄色の点線)によって中断されます。(D)連結側の担保容器(黄色の矢印)。黄色の点線は、中断された大腿動脈を表す。(E)伏在動脈(赤い矢印)と静脈(青い矢印)の十分に満たされたサンプル。(F)不十分な灌流は、伏線血管(黄色の点線)の中断につながる。(G)代表的試料の立体顕微鏡観察。右大腿動脈(黄色の矢印)は、コントラスト媒体で満たされています。(H) 故障した試料の実体顕微鏡観察。右大腿動脈(黄色の矢印)はコントラスト媒体を欠いている。スケールバー= 1 mm (B-F), 2 mm (G, H), 10 mm (A).この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
Discussion
このレポートでは、下半身の血管を可視化する高度な方法を紹介します。このプロセスには、いくつかの重要なステップがあります:最初は、造影剤の注入前に準備されています。十分な血液が除去されない場合、コントラストはシステムを満たしません。さらに、気泡を含めることでコントラストの充填が妨げになります。したがって、回路内の空気を完全に取り除く必要があります。また、注射直後に造影剤が固化しないため、サンプルを過度に移動してはならない。
この方法は、副循環などの血管および循環の増加の形成を評価するのに有用である。逆に、制限として、狭い血管を評価することは困難であり、造影剤における狭窄と人工的な減少との区別が困難である。また、血液と骨の分離が困難なため、骨の血管を評価することは困難です。
3D可視化の代替方法は免疫染色です。組織クリア技術を使用して、3Dイメージング7のいくつかの方法が利用可能です。免疫染色は、抗体を使用して特定のタンパク質の染色を可能にするので有利である。最近の報告は、免疫染色に基づく全身イメージングに挑戦8;しかし、CTベースのイメージングでは、組織除去前処理は必要ありません。
この方法は、腹部器官を含む横隔膜の下のすべての血管の可視化を可能にする。腹部器官の血管新生は、恒常性維持および疾患の発症に強い影響を及ぼす9,10。このプロトコルは下肢の血管の評価のために最適化されていたので、器官特異的なプライミングは、炎症や腫瘍などの任意の要因に関連する血管新生の視覚化を可能にするであろう。
Disclosures
著者は宣言する利害の対立を持っていません。
Acknowledgments
木村康世、永博めぐみ、徳永佐恵子さんによる動物実験の技術サポートに感謝します。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mL syringe | TERUMO | SS-01T | |
| 10% Formalin Solution | Fujifilm-Wako | 068-03841 | |
| 10x phosphate-buffered saline (-) (PBS) | Fujifilm-Wako | 163-25265 | Prepare 1x PBS |
| 22 G catheter (22 G S5 x 1" V(F)) | MEDIKIT | HP2140 | Only catheter is used. |
| 23 G needle | TERUMO | NN-2325R | Use as a pin |
| 4% paraformaldehyde in PBS | Fujifilm-Wako | 163-20145 | |
| 5 mL syringe | |||
| 5-0 Suture with needle | Alfresa Pharma Corporation | ER1205SB45 | |
| Adenosine | Sigma-aldrich | A9251-5G | For vasodilating solution |
| Dumont #55 Forceps | FST | No.11255-20 | |
| Extension tube | TOP | X2-FL50 | |
| Falcon 50 mL tube | CORNING | 352098 | |
| Graefe Forceps | FST | No.11051-10 | |
| Heparin Sodium 5,000 units/5 mL | Mochida Co. Ltd. | 224122458 | |
| Isoflurane | Fujifilm-Wako | 099-06571 | |
| Microfil Injection Compounds | Flow Tech Inc. | MV-117 | Mix liquid MV-Compound (stain) and MV-Diluent 1: 1 |
| Papaverine hydrochloride | Fujifilm | 164-18002 | For vasodilating solution |
| Small Animal Anesthetizer | Muromachi Kikai Co. Ltd. | MK-A100ecoW-ST | |
| Spring Scissors - Angled to Side | FST | No.15006-09 | |
| Surgical Scissors - Sharp-Blunt | FST | No.14001-12 | |
| three-way cock | TERUMO | TS-TR1K | |
| Transfer pipette | SAMCO SCIENTIFIC | SM262-1S | Use for mixing contrast medium |
| X-ray CT scanner | Toshiba IT & Control Systems Corporation | TOSHIBA TOSCANNER 32300 FPD |
References
- Folkman, J.
- Folkman, J. Angiogenesis in cancer, vascular, rheumatoid and other disease. Nature Medicine. 1 (1), 27-31 (1995).
- Kochi, T., et al. Characterization of the arterial anatomy of the murine hindlimb: functional role in the design and understanding of ischemia models. PLoS One. 8 (12), 84047 (2013).
- Limbourg, A., et al. Evaluation of postnatal arteriogenesis and angiogenesis in a mouse model of hind-limb ischemia. Nature Protocols. 4 (12), 1737-1746 (2009).
- Weyers, J. J., Carlson, D. D., Murry, C. E., Schwartz, S. M., Mahoney, W. M. Retrograde perfusion and filling of mouse coronary vasculature as preparation for micro computed tomography imaging. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (60), e3740 (2012).
- Arima, Y., et al. Evaluation of collateral source characteristics with 3-dimensional analysis using micro-X-ray computed tomography. Journal of the American Heart Association. 7 (6), 007800 (2018).
- Tian, T., Yang, Z., Li, X. Tissue clearing technique: Recent progress and biomedical applications. Journal of Anatomy. 238 (2), 489-507 (2021).
- Susaki, E. A., et al. Advanced CUBIC protocols for whole-brain and whole-body clearing and imaging. Nature Protocols. 10 (11), 1709-1727 (2015).
- Fernandez, M., et al.
- Li, S., et al. Angiogenesis in pancreatic cancer: current research status and clinical implications. Angiogenesis. 22 (1), 15-36 (2019).
