Summary
Her beskriver vi en visualiserings- og kvantificeringsmetode for murine bagbenskar ved hjælp af mikro-røntgen computertomografi.
Abstract
Blodkar er komplekse netværk med trælignende strukturer, og vaskulære netværk er afgørende for at opretholde både omsætning og opretholde organfunktion. Afklaring af mekanismen for blodkardannelse er derfor yderst nyttig til belyselse af udviklingsprocesser og patologiske mekanismer. Murine bagbenskar bruges ofte som model for fysiologisk og patologisk angiogenese. Evaluering udføres hovedsageligt via en todimensionel metode ved hjælp af vævssektioner. Metoder til evaluering af tredimensionel (3D) vaskulær morfologi er dog særligt begrænsede. Dette papir introducerer en metode til visualisering af murin bagben ved hjælp af computertomografi (CT). Stråling-uigennemsigtig harpiks injiceres gennem den faldende aorta, og hele fartøjer er fyldt med farvestof. Ved at justere tidspunktet for farvestof injektion, arteriel-specifikke påfyldning er også muligt, og prøver kan opnås med enhver mikro-X-ray CT-enhed. Denne kontrast metode giver en grundlæggende teknik til 3D-evaluering af murin blodkar i de nedre ekstremiteter. Desuden kan denne metode bruges til at visualisere alle blodkar under mellemgulvet og evaluere blodkar i maveorganerne.
Introduction
Blodkar er komplekse netværk med trælignende strukturer. Angiogenese og ny vaskulær dannelse spiller afgørende roller i vedligeholdelsen af orgel homøostase1. Angiogenese er reguleret til behandling af iskæmiske og ondartede sygdomme2. Det er derfor vigtigt at forstå de underliggende mekanismer i angiogenese. Murine bagbenskar bruges ofte som en nyttig model for vaskulær forskning3; ipsilateral ligation af iliac eller lårpulsåren er en kendt bagbenskæmi model, der anvendes til at vurdere angiogenese og vaskulær remodeling i fysiologiske og patologiske angiogenese4. Men evalueringen af angiogenese udføres hovedsageligt ved sektionsfarvning, og metoder til evaluering af 3D vaskulær morfologi er særligt begrænsede.
Sammenlignet med sektionsfarvning muliggør CT 3D-visualisering. For nylig rapporterede Weyers et al. en sofistikeret protokol egnet til CT-billeddannelse, der muliggør visualisering af murin voksen koronar kredsløbssystem5. Vi ændrede deres metode til at skabe en prøveforberedelsesmetode, der er egnet til CT-billeddannelse af de nedre ekstremitet blodkar6. Her injiceres en strålings uigennemsigtig harpiks gennem den faldende aorta, og fartøjer i de nedre ekstremiteter er fyldt med farvestof. Ved at justere tidspunktet for farvestof injektion, arteriel-specifikke påfyldning er også muligt, og prøver kan opnås med enhver mikro-X-ray computertomografi enhed. Denne kontrast metode giver en grundlæggende teknik til 3D-evaluering af murin blodkar under mellemgulvet og i maveorganer og de nedre ekstremiteter.
Protocol
Alle procedurer blev udført i overensstemmelse med Kumamoto Universitys retningslinjer for dyrepleje (godkendelsesreference nr. M30-040/A2020-105), som er i overensstemmelse med US National Institutes of Health Guide for the Care and Use of Laboratory Animals (offentliggørelse nr. 85-23, revideret 2011).
1. Forberedelse
- Perfusionsapparatet og vasodilatorbufferen (4 mg/L papaverinhydrochlorid, 4 g/L; adenosin, 1 g/L; heparin, 1 U/ml i fosfatbuffered saltvand (PBS)).
BEMÆRK: Reagenserne til refluks og vasodilator er de samme som dem, der rapporteres af Weyers et al.5. - Tilslut 22 G kateter, 2 mL forlængerrør og tre-vejs stophane (Figur 1A).
BEMÆRK: Juster måleren i henhold til dyrets størrelse. For voksne C57BL/6 mus er 22 G optimalt. - Fyld trykperfusionsapparatet med vasodilatorbufferen (figur 1A).
BEMÆRK: Undgå dannelse af bobler for at forhindre forstyrrelser i påfyldningen af kontrastmediet.
2. Perfusion
- Indsprøjt 1 U/g heparin i PBS i intraperitoneal hulrum 30 min før operationen.
- Helt bedøve musen med isoflurane og aflive det ved cervikal dislokation.
- Efter halshugning skal du lave et midterforsnit i brystbenet og fastgøre den åbne brystkasse med stifter.
BEMÆRK: For at undgå lækage af kontrasten skal du undgå at skade mellemgulvet. - Skær den opstigende aorta og fjern hjertet.
- Fjern lungen og eksponere den faldende aorta.
BEMÆRK: Den faldende aorta må ikke skades. - Skær den faldende aorta diagonalt for at eksponere tværsnit (figur 1B).
BEMÆRK: Skræl ikke aortaen af. en diagonal sektion er bedre til kateter indsættelse. - Sæt 22 G kateteret i den faldende aorta, mens du kører vasodilationsbufferen.
BEMÆRK: Isætning af kateteret under drift af vasodilationsbufferen undgås luftforurening. - Pin roden af kateteret (Figur 1C).
- Lav en knude for at forhindre lækage på grund af tilbageløb.
- Gennemsigt en opvarmet vasodilaterende opløsning (papaverinhydrochlorid, 4 g/L; adenosin, 1 g/L; heparin, 1 U/ml) i 3 min ved et fast tryk mellem 13 og 15 kPa.
- Gennemsy en opløsning på 4% paraformaldehyd i (PBS) i 3 min.
BEMÆRK: Fikseringens succes kan bekræftes af fodens bevægelse (Figur 1D). - Forbered kontrastmediet lige før perfusion.
BEMÆRK: Fortyndingshastigheden justeres i henhold til prøven. for voksne mus blandes pletten og fortyndingsvandet i et forhold på 1:1. - Stop perfusionen, og fyld forlængerrøret med 2 mL fortyndet kontrastmedium (figur 1E).
BEMÆRK: Kontrastmediet skal injiceres langsomt for at undgå skader på blodkarrene. - Gennemgå kontrastmediet ved et fast tryk mellem 13 og 15 kPa.
- For at visualisere arterierne skal du kontrollere tåneglen for at bekræfte, at kontrastmediet har nået arterien (Figur 1F).
- For at visualisere alle fartøjer skal du kontrollere membranens ringere vena cava for at bekræfte kontrastmediets fuldstændige cirkulation.
BEMÆRK: I begyndelsen indeholder kontrasten vasodilaterende opløsning; derfor er dens korrekte cirkulation afgørende.
- Luk den tre-vejs stophane og fjern røret (Figur 1G).
BEMÆRK: Hvis den trevejs stophane ikke er lukket, vil kontrasten flyde baglæns. - Prøven inkuberes natten over ved 4 °C.
- Fjern huden og fastgør den i 10% formaldehydopløsning.
3. Visualisering
BEMÆRK: Visualiseringsprotokollerne varierer afhængigt af CT-scanneren. En mikrofokus X-ray CT-scanner blev brugt i denne protokol. Det er nødvendigt at optimere billeddannelsesmetoden i henhold til hver CT-scanner.
- Prøven fastgøres i et 50 mL rør, der indeholder PBS.
- Læg prøverøret på bordet.
- Scan prøven med en spænding på 50 kV og en strøm på 600 μA, hvilket sikrer en fokus-til-center afstand på 75,2 mm.
BEMÆRK: En dimension på 1 voxel var 28,7 μm x 28,7 μm x 28,7 μm i denne indstilling. - Indlæs de erhvervede billeddata med Fiji, en open source-platform til biologisk billedanalyse.
- Bestem muskel voxel værdi ved hjælp af gastrocnemius muskel.
- Vælg gastrocnemiusmusklen ved hjælp af rektangelværktøjet .
- Kontroller middel- og standardafvigelsen (SD) fra histogrammet (Analyze | Histogram).
- Definer muskel voxel tæthed som middel + 2SD af gastrocnemius muskel.
- Indstil muskel voxeltætheden som det lavere tærskelniveau (Billede | justere | Tærskel | Angiv | lavere tærskelniveau).
BEMÆRK: Det vaskulære område og knogleområdet forbliver i de binariserede data, efter at tærsklen er indstillet.
Representative Results
Alle fartøjer i de nedre ekstremiteter kan visualiseres, hvis denne protokol udføres korrekt (figur 2A). I en bagbens iskæmi model, den ikke-ligated lårpulsåren løber parallelt med lårbenet vene (Figur 2B), og en ligated lårpulsåre kan bekræftes ved afbrydelse af kontrast medier (Figur 2C). Resultaterne afslørede udviklingen af sikkerhedsfartøjer (figur 2D). Sikkerhedsstillelse omsætning dannes mellem arterierne proksimale til ligated arterie og arterien i underbenet regionen og på ventrale og dorsale sider af lårpulsåren. Den ringere gluteal arterie-begyndelsen på dorsal side af bækkenet og kører på den laterale side af låret-udvider robust på den iskæmiske side.
Kontrastfyldte fartøjer er fyldt med kontrastmediet (figur 2E); forstyrrelse i kontrasten indikerer blanding af ikke-konstantmedier (f.eks. blod, vasodilatorbuffer eller bobler) eller utilstrækkelig perfusion af kontrasten (figur 2F). Vasodilatation og fiksering ville ikke fungere godt, hvis blodkarrene er skrumpet ind. Selvom CT-billeddannelse kun kan visualisere kontrastmediet, er det muligt at se arterierne på overfladen af kroppen ved makroskopisk eller stereomikroskopisk observation (Figur 2G). Det er således lettere at vurdere fejl ved hjælp af kontrastmediet (Figur 2H).
Figur 1: Omrids af proceduren. (A) Trykperfusionsapparat og 22 G kateter tilsluttet via et 2 mL forlængerrør og trevejs stophane. (B) Den stigende aorta skæres diagonalt for at eksponere tværsnit (gul pil). (C) Kateteret blev fastgjort ved hjælp af to ben (gule pile). (D) De faste underekstremiteter strækker sig ved fiksering (gule pile). (E) Injektion af kontrast gennem den tre-vejs stophane. Injektionsretningen er angivet med en gul pil. (F) Bagbenssømmet er fyldt med kontrasten (gul pil). (G) Stophanen lukkes og fjernes fra perfusionsapparatet. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Billeder af fartøjer. (A) Hele billedet af bagbenbenene og karrene. (B) Lårpulsåren (rød pil) og vene (blå pil). (C) Ligated lårpulsåre (gul pil). Periferien afbrydes af obstruktionen (gul prikket linje). (D) Sikkerhedsfartøjer i ligated side (gule pile). Den gule stiplede linje repræsenterer den afbrudte lårpulsåre. (E) En velfyldt prøve af den saphenous arterie (rød pil) og vene (blå pil). (F) Utilstrækkelig perfusion fører til afbrydelse af saphenous fartøjer (gul prikket linje). G) Stereomikroskopisk observation af en repræsentativ prøve. Den højre lårpulsåre (gul pil) er fyldt med kontrast medium. H) Stereomikroskopobservation af en fejlbehæftet prøve. Den højre lårpulsåre (gul pil) mangler kontrast medium. Skalastænger = 1 mm (B-F), 2 mm (G, H), 10 mm (A). Klik her for at se en større version af dette tal.
Discussion
Denne rapport introducerer en sofistikeret metode til at visualisere blodkar i underkroppen. Der er flere kritiske trin i denne proces: den første er preperfusion før injektion af kontrast medium. Hvis nok blod ikke fjernes, vil kontrasten ikke fylde systemet. Derudover forstyrrer inddragelsen af luftbobler fyldet af kontrasten; luften i kredsløbet skal derfor fjernes helt. Da kontrastmediet ikke størkner umiddelbart efter injektionen, bør prøven desuden ikke flyttes for meget.
Denne metode er nyttig til at evaluere den øgede dannelse af blodkar og omsætning, såsom sikkerhedsstillelse omsætning. Omvendt er det som en begrænsning vanskeligt at vurdere indsnævrede blodkar, da det er vanskeligt at skelne mellem stenose og en kunstig reduktion i kontrastmediet. Derudover er det udfordrende at evaluere blodkar i knogler, da adskillelsen af blod og knogler er vanskelig.
En alternativ metode til 3D-visualisering er immunstaining. Ved hjælp af vævsrydningsteknikken er flere metoder tilgængelige til 3D-billeddannelse7. Immunstaining er fordelagtigt, da det tillader farvning af specifikke proteiner ved hjælp af antistoffer. En nylig rapport udfordrer billeddannelse i hele kroppen baseret på immunstaining8; CT-baseret billeddannelse kræver dog ingen vævsklaringsforbehandling.
Denne metode muliggør visualisering af alle fartøjer under mellemgulvet, herunder maveorganerne. Angiogenese i maveorganerne har en stærk indvirkning på opretholdelsen af homøostase og udvikling af sygdomme9,10. Da denne protokol blev optimeret til evaluering af de nedre ekstremitetsbeholdere, ville organspecifik priming muliggøre visualisering af angiogenese forbundet med enhver faktor, såsom betændelse eller tumorer.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter at erklære.
Acknowledgments
Vi takker Yasuyo Kimura, Megumi Nagahiro og Saeko Tokunaga for den fremragende tekniske støtte i dyreforsøg.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mL syringe | TERUMO | SS-01T | |
| 10% Formalin Solution | Fujifilm-Wako | 068-03841 | |
| 10x phosphate-buffered saline (-) (PBS) | Fujifilm-Wako | 163-25265 | Prepare 1x PBS |
| 22 G catheter (22 G S5 x 1" V(F)) | MEDIKIT | HP2140 | Only catheter is used. |
| 23 G needle | TERUMO | NN-2325R | Use as a pin |
| 4% paraformaldehyde in PBS | Fujifilm-Wako | 163-20145 | |
| 5 mL syringe | |||
| 5-0 Suture with needle | Alfresa Pharma Corporation | ER1205SB45 | |
| Adenosine | Sigma-aldrich | A9251-5G | For vasodilating solution |
| Dumont #55 Forceps | FST | No.11255-20 | |
| Extension tube | TOP | X2-FL50 | |
| Falcon 50 mL tube | CORNING | 352098 | |
| Graefe Forceps | FST | No.11051-10 | |
| Heparin Sodium 5,000 units/5 mL | Mochida Co. Ltd. | 224122458 | |
| Isoflurane | Fujifilm-Wako | 099-06571 | |
| Microfil Injection Compounds | Flow Tech Inc. | MV-117 | Mix liquid MV-Compound (stain) and MV-Diluent 1: 1 |
| Papaverine hydrochloride | Fujifilm | 164-18002 | For vasodilating solution |
| Small Animal Anesthetizer | Muromachi Kikai Co. Ltd. | MK-A100ecoW-ST | |
| Spring Scissors - Angled to Side | FST | No.15006-09 | |
| Surgical Scissors - Sharp-Blunt | FST | No.14001-12 | |
| three-way cock | TERUMO | TS-TR1K | |
| Transfer pipette | SAMCO SCIENTIFIC | SM262-1S | Use for mixing contrast medium |
| X-ray CT scanner | Toshiba IT & Control Systems Corporation | TOSHIBA TOSCANNER 32300 FPD |
References
- Folkman, J.
- Folkman, J. Angiogenesis in cancer, vascular, rheumatoid and other disease. Nature Medicine. 1 (1), 27-31 (1995).
- Kochi, T., et al. Characterization of the arterial anatomy of the murine hindlimb: functional role in the design and understanding of ischemia models. PLoS One. 8 (12), 84047 (2013).
- Limbourg, A., et al. Evaluation of postnatal arteriogenesis and angiogenesis in a mouse model of hind-limb ischemia. Nature Protocols. 4 (12), 1737-1746 (2009).
- Weyers, J. J., Carlson, D. D., Murry, C. E., Schwartz, S. M., Mahoney, W. M. Retrograde perfusion and filling of mouse coronary vasculature as preparation for micro computed tomography imaging. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (60), e3740 (2012).
- Arima, Y., et al. Evaluation of collateral source characteristics with 3-dimensional analysis using micro-X-ray computed tomography. Journal of the American Heart Association. 7 (6), 007800 (2018).
- Tian, T., Yang, Z., Li, X. Tissue clearing technique: Recent progress and biomedical applications. Journal of Anatomy. 238 (2), 489-507 (2021).
- Susaki, E. A., et al. Advanced CUBIC protocols for whole-brain and whole-body clearing and imaging. Nature Protocols. 10 (11), 1709-1727 (2015).
- Fernandez, M., et al.
- Li, S., et al. Angiogenesis in pancreatic cancer: current research status and clinical implications. Angiogenesis. 22 (1), 15-36 (2019).
