Summary
यहां, हम माइक्रो-एक्स-रे गणना टोमोग्राफी का उपयोग करके मुरीन हिंद-अंग वाहिकाओं के लिए एक विज़ुअलाइज़ेशन और परिमाणीकरण विधि का वर्णन करते हैं।
Abstract
रक्त वाहिकाएं पेड़ जैसी संरचनाओं के साथ जटिल नेटवर्क हैं, और संवहनी नेटवर्क परिसंचरण को बनाए रखने और अंग समारोह को बनाए रखने दोनों के लिए आवश्यक हैं। इसलिए रक्त वाहिका गठन के तंत्र को स्पष्ट करना विकास प्रक्रियाओं और रोग संबंधी तंत्र को स्पष्ट करने के लिए बेहद उपयोगी है। मुरीन हिंद-अंग वाहिकाओं को अक्सर शारीरिक और पैथोलॉजिकल एंजियोजेनेसिस के लिए एक मॉडल के रूप में उपयोग किया जाता है। मूल्यांकन मुख्य रूप से ऊतक वर्गों का उपयोग करके दो-आयामी विधि के माध्यम से किया जाता है। हालांकि, त्रि-आयामी (3 डी) संवहनी आकृति विज्ञान का मूल्यांकन करने के तरीके विशेष रूप से सीमित हैं। यह पेपर गणना टोमोग्राफी (सीटी) का उपयोग करके मुरीन हिंद-अंगों को विज़ुअलाइज़ करने के लिए एक विधि का परिचय देता है। विकिरण-अपारदर्शी राल को अवरोही महाधमनी के माध्यम से इंजेक्ट किया जाता है, और पूरे जहाजों को डाई से भर दिया जाता है। डाई इंजेक्शन के समय को समायोजित करके, धमनी-विशिष्ट भरने भी संभव है, और नमूने किसी भी माइक्रो-एक्स-रे सीटी डिवाइस के साथ प्राप्त किए जा सकते हैं। यह विपरीत विधि निचले छोरों में मुरीन रक्त वाहिकाओं के 3 डी मूल्यांकन के लिए एक बुनियादी तकनीक प्रदान करती है। इसके अलावा, इस विधि का उपयोग डायाफ्राम के नीचे सभी रक्त वाहिकाओं की कल्पना करने और पेट के अंगों में रक्त वाहिकाओं का मूल्यांकन करने के लिए किया जा सकता है।
Introduction
रक्त वाहिकाएं पेड़ जैसी संरचनाओं के साथ जटिल नेटवर्क हैं। एंजियोजेनेसिस और नए संवहनी गठन अंग होमोस्टैसिस 1 के रखरखाव में आवश्यक भूमिका निभाते हैं। एंजियोजेनेसिस को इस्केमिक और घातक रोगों के उपचार के लिए विनियमित किया जाता है2। इसलिए एंजियोजेनेसिस के अंतर्निहित तंत्र को समझना आवश्यक है। मुरीन हिंद-अंग वाहिकाओं को अक्सर संवहनी अनुसंधान के लिए एक उपयोगी मॉडल के रूप में उपयोग किया जाता है3; इलियाक या ऊरु धमनी का ipsilateral बंधाव एक ज्ञात हिंद-अंग ischemia मॉडल शारीरिक और पैथोलॉजिकल एंजियोजेनेसिस में एंजियोजेनेसिस और संवहनी remodeling का आकलन करने के लिए इस्तेमाल किया जाता है4. हालांकि, एंजियोजेनेसिस का मूल्यांकन मुख्य रूप से अनुभाग धुंधला द्वारा किया जाता है, और 3 डी संवहनी आकृति विज्ञान का मूल्यांकन करने के तरीके विशेष रूप से सीमित हैं।
अनुभाग धुंधला के साथ तुलना में, सीटी 3 डी विज़ुअलाइज़ेशन सक्षम बनाता है। हाल ही में, Weyers et al. ने सीटी इमेजिंग के लिए उपयुक्त एक परिष्कृत प्रोटोकॉल की सूचना दी, जिससे मुरीन वयस्क कोरोनरी परिसंचरण प्रणाली 5 के विज़ुअलाइज़ेशन को सक्षम किया जा सके। हमने निचले छोर रक्त वाहिकाओं के सीटी इमेजिंग के लिए उपयुक्त नमूना तैयारी विधि बनाने के लिए उनकी विधि को संशोधित किया। यहां, अवरोही महाधमनी के माध्यम से एक विकिरण-अपारदर्शी राल इंजेक्ट किया जाता है, और निचले छोरों में जहाजों को डाई से भर दिया जाता है। डाई इंजेक्शन के समय को समायोजित करके, धमनी-विशिष्ट भरने भी संभव है, और नमूने किसी भी माइक्रो-एक्स-रे गणना टोमोग्राफी डिवाइस के साथ प्राप्त किए जा सकते हैं। यह विपरीत विधि डायाफ्राम के नीचे और पेट के अंगों और निचले छोरों में मुरीन रक्त वाहिकाओं के 3 डी मूल्यांकन के लिए एक बुनियादी तकनीक प्रदान करती है।
Protocol
सभी प्रक्रियाओं को कुमामोटो विश्वविद्यालय के पशु देखभाल दिशानिर्देशों के अनुसार किया गया था (अनुमोदन संदर्भ सं। M30-040/A2020-105), जो प्रयोगशाला जानवरों की देखभाल और उपयोग के लिए यूएस नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ हेल्थ गाइड (प्रकाशन संख्या 85-23, संशोधित 2011) के अनुरूप है।
1. तैयारी
- परफ्यूजन उपकरण और वैसोडिलेटर बफर तैयार करें (4 मिलीग्राम / एल पैपवेरिन हाइड्रोक्लोराइड, 4 ग्राम / एल; एडेनोसिन, 1 ग्राम / एल; हेपरिन, फॉस्फेट-बफर्ड खारा (पीबीएस) में 1 यू / एमएल)।
नोट: भाटा डिवाइस और vasodilator अभिकर्मकों Weyers et al.5 द्वारा रिपोर्ट किए गए लोगों के रूप में ही कर रहे हैं। - 22 जी कैथेटर, 2 एमएल एक्सटेंशन ट्यूब, और तीन-तरफ़ा स्टॉपकॉक (चित्रा 1 ए) को कनेक्ट करें।
नोट: जानवर के आकार के अनुसार गेज को समायोजित करें। वयस्क C57BL /6 चूहों के लिए, 22 G इष्टतम है। - vasodilator बफर (चित्रा 1A) के साथ दबाव परफ्यूजन उपकरण भरें।
नोट: विपरीत माध्यम को भरने में व्यवधान को रोकने के लिए बुलबुले के गठन से बचें।
2. परफ्यूजन
- ऑपरेशन से 30 मिनट पहले इंट्रापेरिटोनियल गुहा में पीबीएस में 1 यू / जी हेपरिन इंजेक्ट करें।
- पूरी तरह से isoflurane के साथ माउस anesthetize और गर्भाशय ग्रीवा अव्यवस्था द्वारा इसे euthanize.
- विच्छेदन के बाद, उरोस्थि में एक मध्यरेखा चीरा बनाएं और पिन के साथ खुले वक्ष को ठीक करें।
नोट: कंट्रास्ट के रिसाव से बचने के लिए, डायाफ्राम को घायल करने से बचें। - आरोही महाधमनी को काटें और दिल को हटा दें।
- फेफड़े को हटा दें और अवरोही महाधमनी को उजागर करें।
नोट: अवरोही महाधमनी को चोट न पहुंचाएं। - क्रॉस-सेक्शन (चित्रा 1 बी) को उजागर करने के लिए अवरोही महाधमनी को तिरछे काटें।
नोट: महाधमनी को छील न करें; कैथेटर सम्मिलन के लिए एक विकर्ण अनुभाग बेहतर है। - वासोडिलेशन बफर चलाते समय अवरोही महाधमनी में 22 जी कैथेटर डालें।
नोट: वासोडिलेशन बफर चलाते समय कैथेटर का सम्मिलन हवा के संदूषण से बचा जाता है। - कैथेटर की जड़ को पिन करें (चित्रा 1 सी)।
- बैकफ्लो के कारण रिसाव को रोकने के लिए एक गाँठ बनाएं।
- 13 और 15 kPa के बीच एक निश्चित दबाव पर 3 मिनट के लिए एक गर्म वासोडिलेटिंग समाधान (papaverine hydrochloride, 4 g / L; एडेनोसिन, 1 g / L; हेपरिन, 1 U / mL) को परफ्यूज करें।
- 3 मिनट के लिए (पीबीएस) में 4% पैराफॉर्मेल्डिहाइड का एक समाधान परफ्यूज करें।
नोट: निर्धारण की सफलता की पुष्टि पैर के आंदोलन (चित्रा 1 डी) द्वारा की जा सकती है। - परफ्यूजन से ठीक पहले कंट्रास्ट माध्यम तैयार करें।
नोट:: नमूने के अनुसार कमजोर पड़ने की दर को समायोजित करें; वयस्क चूहों के लिए, 1: 1 के अनुपात में दाग और डिलुएंट को मिलाएं। - परफ्यूजन को रोकें और पतले कंट्रास्ट माध्यम (चित्रा 1 ई) के 2 एमएल के साथ विस्तार ट्यूब को भरें।
नोट: रक्त वाहिकाओं को चोट से बचने के लिए इसके विपरीत माध्यम को धीरे-धीरे इंजेक्ट किया जाना चाहिए। - 13 और 15 kPa के बीच एक निश्चित दबाव पर विपरीत माध्यम perfuse.
- धमनियों की कल्पना करने के लिए, यह पुष्टि करने के लिए टोनेल की जांच करें कि इसके विपरीत माध्यम धमनी तक पहुंच गया है (चित्रा 1 एफ)।
- सभी जहाजों की कल्पना करने के लिए, विपरीत माध्यम के पूर्ण परिसंचरण की पुष्टि करने के लिए डायाफ्राम के अवर वेना कावा की जांच करें।
नोट: शुरुआत में, इसके विपरीत vasodilating समाधान शामिल हैं; इसलिए, इसका उचित परिसंचरण आवश्यक है।
- तीन तरह से stopcock बंद करें और ट्यूब (चित्रा 1 जी) को हटा दें।
नोट:: यदि तीन-तरफ़ा stopcock बंद नहीं है, तो कंट्रास्ट पीछे की ओर प्रवाहित होगा। - 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर नमूना इनक्यूबेट करें।
- त्वचा को हटा दें और इसे 10% फॉर्मेल्डिहाइड समाधान में ठीक करें।
3. विज़ुअलाइज़ेशन
नोट:: विज़ुअलाइज़ेशन प्रोटोकॉल CT स्कैनर के आधार पर भिन्न होते हैं। इस प्रोटोकॉल में माइक्रोफोकस एक्स-रे सीटी स्कैनर का उपयोग किया गया था। प्रत्येक सीटी स्कैनर के अनुसार इमेजिंग विधि को अनुकूलित करना आवश्यक है।
- PBS युक्त एक 50 मिलीलीटर ट्यूब में नमूना ठीक करें।
- नमूना ट्यूब को मेज पर रखें।
- 50 केवी के वोल्टेज और 600 μA की एक धारा के साथ नमूने को स्कैन करें, 75.2 मिमी की फोकस-टू-सेंटर दूरी सुनिश्चित करें।
नोट: इस सेटिंग में 1 voxel का एक आयाम 28.7 μm x 28.7 μm x 28.7 μm था। - फिजी के साथ अधिग्रहित छवि डेटा लोड करें, जैविक-छवि विश्लेषण के लिए एक ओपन-सोर्स प्लेटफ़ॉर्म।
- गैस्ट्रोकेनेमियस मांसपेशी का उपयोग करके मांसपेशी वोक्सेल मूल्य निर्धारित करें।
- आयत उपकरण का उपयोग करके gastrocnemius मांसपेशी चुनें।
- हिस्टोग्राम से माध्य और मानक विचलन (एसडी) की जाँच करें (विश्लेषण | हिस्टोग्राम)।
- गैस्ट्रोकेनेमियस मांसपेशी के माध्य + 2SD के रूप में मांसपेशी voxel घनत्व को परिभाषित करें।
- मांसपेशी voxel घनत्व को निचले थ्रेशोल्ड स्तर के रूप में सेट करें (छवि | समायोजित | थ्रेशोल्ड | | सेट करें निचले थ्रेशोल्ड स्तर)।
नोट:: संवहनी क्षेत्र और अस्थि क्षेत्र थ्रेशोल्ड सेट करने के बाद binarized डेटा में रहते हैं।
Representative Results
निचले छोरों में सभी जहाजों को कल्पना की जा सकती है यदि यह प्रोटोकॉल सही ढंग से किया जाता है (चित्रा 2 ए)। एक हिंद-अंग ischemia मॉडल में, गैर-ligated ऊरु धमनी ऊरु शिरा (चित्रा 2 बी) के समानांतर चलता है, और एक ligated ऊरु धमनी विपरीत मीडिया (चित्रा 2 सी) के व्यवधान से पुष्टि की जा सकती है। परिणामों ने संपार्श्विक जहाजों के विकास का खुलासा किया (चित्रा 2 डी)। संपार्श्विक परिसंचरण लिगेटेड धमनी के समीपस्थ धमनियों और निचले पैर के क्षेत्र में धमनी के बीच और ऊरु धमनी के वेंट्रल और पृष्ठीय पक्षों पर बनता है। अवर ग्लूटल धमनी-श्रोणि के पृष्ठीय पक्ष पर शुरू होती है और जांघ के पार्श्व पक्ष पर चल रही है- इस्केमिक पक्ष पर मजबूती से फैलती है।
कंट्रास्ट से भरे जहाजों को कंट्रास्ट माध्यम (चित्रा 2 ई) से भरा जाता है; इसके विपरीत में व्यवधान noncontrast मीडिया (जैसे, रक्त, vasodilator बफर, या बुलबुले) या इसके विपरीत (चित्रा 2F) के अपर्याप्त परफ्यूजन के मिश्रण को इंगित करता है। वासोडिलेशन और फिक्सेशन अच्छी तरह से काम नहीं करेगा यदि रक्त वाहिकाएं सिकुड़ गई हैं। यद्यपि सीटी इमेजिंग केवल विपरीत माध्यम की कल्पना कर सकती है, लेकिन शरीर की सतह पर धमनियों को मैक्रोस्कोपिक या स्टीरियोमाइक्रोस्कोपिक अवलोकन (चित्रा 2 जी) द्वारा देखना संभव है। इस प्रकार, इसके विपरीत माध्यम (चित्रा 2 एच) का उपयोग करके दोषों का आकलन करना आसान है।
चित्र 1: प्रक्रिया की रूपरेखा। (A) दबाव परफ्यूजन उपकरण और 22 G कैथेटर एक 2 mL एक्सटेंशन ट्यूब और तीन-तरफ़ा स्टॉपकॉक के माध्यम से जुड़ा हुआ है। (बी) आरोही महाधमनी को क्रॉस-सेक्शन (पीला तीर) को उजागर करने के लिए तिरछे रूप से काटा जाता है। (सी) कैथेटर को दो पिन (पीले तीर) का उपयोग करके तय किया गया था। (d) स्थिर निचले अंग निर्धारण (पीले तीर) पर विस्तारित होते हैं। (ई) तीन तरह से स्टॉपकॉक के माध्यम से इसके विपरीत का इंजेक्शन। इंजेक्शन की दिशा एक पीले तीर द्वारा इंगित की जाती है। (च) हिंद-अंग नाखून विपरीत (पीला तीर) से भरा होता है। (जी) स्टॉपकॉक को बंद कर दिया जाता है और परफ्यूजन उपकरण से हटा दिया जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्रा 2: जहाजों की छवियां। (ए) हिंद-अंग हड्डियों और वाहिकाओं की पूरी छवि। (बी) ऊरु धमनी (लाल तीर) और शिरा (नीला तीर)। (C) लिगेटेड ऊरु धमनी (पीला तीर)। परिधि बाधा (पीली बिंदीदार रेखा) से बाधित होती है। (डी) लिगेटेड साइड (पीले तीर) में संपार्श्विक वाहिकाएं। पीली बिंदीदार रेखा बाधित ऊरु धमनी का प्रतिनिधित्व करती है। (ई) सेफेनस धमनी (लाल तीर) और शिरा (नीला तीर) का एक अच्छी तरह से भरा हुआ नमूना। (च) अपर्याप्त परफ्यूजन सेफेनस वाहिकाओं (पीली बिंदीदार रेखा) के व्यवधान की ओर जाता है। (छ) एक प्रतिनिधि नमूने का स्टीरियोमाइक्रोबियल अवलोकन। दाएँ ऊरु धमनी (पीला तीर) विपरीत माध्यम से भरा हुआ है। (ज) एक असफल नमूने का स्टीरियोमाइक्रोस्कोप अवलोकन। दाहिने ऊरु धमनी (पीला तीर) में विपरीत माध्यम का अभाव होता है। स्केल बार = 1 मिमी (बी-एफ), 2 मिमी (जी, एच), 10 मिमी (ए)। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
Discussion
यह रिपोर्ट निचले शरीर में रक्त वाहिकाओं की कल्पना करने के लिए एक परिष्कृत विधि का परिचय देती है। इस प्रक्रिया में कई महत्वपूर्ण कदम हैं: पहला विपरीत माध्यम के इंजेक्शन से पहले प्रीपरफ्यूजन है। यदि पर्याप्त रक्त नहीं हटाया जाता है, तो इसके विपरीत सिस्टम को नहीं भरेगा। इसके अतिरिक्त, हवा के बुलबुले को शामिल करने से इसके विपरीत को भरने में बाधा आती है; इस प्रकार, सर्किट में हवा को पूरी तरह से हटा दिया जाना चाहिए। इसके अलावा, क्योंकि इसके विपरीत माध्यम इंजेक्शन के तुरंत बाद ठोस नहीं होता है, इसलिए नमूने को अत्यधिक स्थानांतरित नहीं किया जाना चाहिए।
यह विधि रक्त वाहिकाओं और परिसंचरण के बढ़े हुए गठन का मूल्यांकन करने के लिए उपयोगी है, जैसे कि संपार्श्विक परिसंचरण। इसके विपरीत, एक सीमा के रूप में, संकुचित रक्त वाहिकाओं का मूल्यांकन करना मुश्किल है, क्योंकि स्टेनोसिस और इसके विपरीत माध्यम में कृत्रिम कमी के बीच अंतर करना मुश्किल है। इसके अतिरिक्त, हड्डियों में रक्त वाहिकाओं का मूल्यांकन करना चुनौतीपूर्ण है, क्योंकि रक्त और हड्डी का अलगाव मुश्किल है।
3 डी विज़ुअलाइज़ेशन के लिए एक वैकल्पिक विधि इम्युनोस्टेनिंग है। ऊतक समाशोधन तकनीक का उपयोग करते हुए, 3 डी इमेजिंग 7 के लिए कई तरीके उपलब्ध हैं। Immunostaining लाभप्रद है क्योंकि यह एंटीबॉडी का उपयोग करके विशिष्ट प्रोटीन के दाग की अनुमति देता है। एक हालिया रिपोर्ट इम्युनोस्टेनिंग 8 के आधार पर पूरे शरीर की इमेजिंग को चुनौती देती है; हालांकि, सीटी-आधारित इमेजिंग को किसी भी ऊतक-समाशोधन pretreatment की आवश्यकता नहीं है।
यह विधि पेट के अंगों सहित डायाफ्राम के नीचे सभी वाहिकाओं के विज़ुअलाइज़ेशन को सक्षम बनाती है। पेट के अंगों में एंजियोजेनेसिस होमियोस्टैसिस को बनाए रखने और बीमारियों के विकास पर एक मजबूत प्रभाव डालता है9,10। चूंकि इस प्रोटोकॉल को निचले छोर के जहाजों के मूल्यांकन के लिए अनुकूलित किया गया था, इसलिए अंग-विशिष्ट प्राइमिंग किसी भी कारक से जुड़े एंजियोजेनेसिस के विज़ुअलाइज़ेशन को सक्षम करेगा, जैसे कि सूजन या ट्यूमर।
Disclosures
लेखकों के पास घोषित करने के लिए हितों का कोई संघर्ष नहीं है।
Acknowledgments
हम पशु प्रयोगों में उत्कृष्ट तकनीकी सहायता के लिए यासुयो किमुरा, मेगुमी नागाहिरो और सैको टोकुनागा को धन्यवाद देते हैं।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mL syringe | TERUMO | SS-01T | |
| 10% Formalin Solution | Fujifilm-Wako | 068-03841 | |
| 10x phosphate-buffered saline (-) (PBS) | Fujifilm-Wako | 163-25265 | Prepare 1x PBS |
| 22 G catheter (22 G S5 x 1" V(F)) | MEDIKIT | HP2140 | Only catheter is used. |
| 23 G needle | TERUMO | NN-2325R | Use as a pin |
| 4% paraformaldehyde in PBS | Fujifilm-Wako | 163-20145 | |
| 5 mL syringe | |||
| 5-0 Suture with needle | Alfresa Pharma Corporation | ER1205SB45 | |
| Adenosine | Sigma-aldrich | A9251-5G | For vasodilating solution |
| Dumont #55 Forceps | FST | No.11255-20 | |
| Extension tube | TOP | X2-FL50 | |
| Falcon 50 mL tube | CORNING | 352098 | |
| Graefe Forceps | FST | No.11051-10 | |
| Heparin Sodium 5,000 units/5 mL | Mochida Co. Ltd. | 224122458 | |
| Isoflurane | Fujifilm-Wako | 099-06571 | |
| Microfil Injection Compounds | Flow Tech Inc. | MV-117 | Mix liquid MV-Compound (stain) and MV-Diluent 1: 1 |
| Papaverine hydrochloride | Fujifilm | 164-18002 | For vasodilating solution |
| Small Animal Anesthetizer | Muromachi Kikai Co. Ltd. | MK-A100ecoW-ST | |
| Spring Scissors - Angled to Side | FST | No.15006-09 | |
| Surgical Scissors - Sharp-Blunt | FST | No.14001-12 | |
| three-way cock | TERUMO | TS-TR1K | |
| Transfer pipette | SAMCO SCIENTIFIC | SM262-1S | Use for mixing contrast medium |
| X-ray CT scanner | Toshiba IT & Control Systems Corporation | TOSHIBA TOSCANNER 32300 FPD |
References
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