Summary
Här beskriver vi en visualisering och kvantifieringsmetod för murin hind-limb fartyg med hjälp av mikro-röntgen datortomografi.
Abstract
Blodkärl är komplexa nätverk med trädliknande strukturer, och kärlnätverk är nödvändiga för att upprätthålla både cirkulation och upprätthålla organfunktion. Att klargöra mekanismen för blodkärlsbildning är därför extremt användbart för att klargöra utvecklingsprocesser och patologiska mekanismer. Murine hind-limb fartyg används ofta som en modell för fysiologiska och patologiska angiogenes. Utvärderingen utförs huvudsakligen via en tvådimensionell metod med hjälp av vävnadssektioner. Metoderna för att utvärdera tredimensionell (3D) vaskulär morfologi är dock särskilt begränsade. Detta dokument introducerar en metod för att visualisera murin bakben med hjälp av datortomografi (CT). Strålningsoläsk harts injiceras genom den fallande aortan, och hela kärl är fyllda med färgämne. Genom att justera tidpunkten för färginjektion är arteriell-specifik fyllning också möjlig, och prover kan erhållas med alla mikroröntgen CT-enheter. Denna kontrastmetod ger en grundläggande teknik för 3D-utvärdering av murin blodkärl i de nedre extremiteterna. Dessutom kan denna metod användas för att visualisera alla blodkärl under membranet och utvärdera blodkärl i bukorganen.
Introduction
Blodkärl är komplexa nätverk med trädliknande strukturer. Angiogenes och ny kärlbildning spelar viktiga roller i upprätthållandet av organhomeostas1. Angiogenes regleras för behandling av ischemiska och maligna sjukdomar2. Det är därför viktigt att förstå de underliggande mekanismerna för angiogenes. Murin bakbenskärl används ofta som en användbar modell för kärlforskning3; ligatur av iliaca eller femorala gatan är en känd hind-limb ischemia modell som används för att bedöma angiogenes och vaskulär ombyggnad i fysiologiska och patologiska angiogenesis4. Utvärderingen av angiogenes utförs dock huvudsakligen genom avsnitt färgning, och metoder för att utvärdera 3D vaskulär morfologi är särskilt begränsade.
Jämfört med sektionsfärgning möjliggör CT 3D-visualisering. Nyligen rapporterade Weyers et al. ett sofistikerat protokoll som är lämpligt för CT imaging, vilket möjliggör visualisering av murine vuxna födans cirkulationssystem5. Vi modifierade deras metod för att skapa en provberedningsmetod lämplig för CT-avbildning av de nedre extremiteterna blodkärlen6. Här injiceras ett strålningsoläskharts genom den fallande aortan, och kärlen i de nedre extremiteterna fylls med färgämne. Genom att justera tidpunkten för färginjektion är arteriell-specifik fyllning också möjlig, och prover kan erhållas med alla mikro-röntgen datortomografi enheter. Denna kontrastmetod ger en grundläggande teknik för 3D-utvärdering av murin blodkärl under membranet och i bukorganen och de nedre extremiteterna.
Protocol
Alla ingrepp utfördes i enlighet med Kumamoto Universitys riktlinjer för djurvård (godkännandereferens nr. M30-040/A2020-105), som överensstämmer med US National Institutes of Health Guide for the Care and Use of Laboratory Animals (publikation nr 85-23, reviderad 2011).
1. Förberedelse
- Förbered perfusionsapparaturen och vasodilatatorbufferten (4 mg/L papaverinhydroklorid, 4 g/L; adenosin, 1 g/L; heparin, 1 U/ml i fosfatbuffrad saltlösning (PBS)).
OBS: Refluxanordningen och vasodilatatorreagenserna är desamma som de som rapporteras av Weyers et al.5. - Anslut 22 G-katetern, förlängningsröret på 2 ml och trevägskranen (figur 1A).
OBS: Justera mätaren efter djurets storlek. För vuxna C57BL/6 möss är 22 G optimalt. - Fyll tryckperfusionsapparaten med vasodilatatorbufferten (figur 1A).
OBS: Undvik bildandet av bubblor för att förhindra störningar i fyllningen av kontrastmediet.
2. Perfusion
- Injicera 1 U/g heparin i PBS i intraperitoneal hålighet 30 min före operationen.
- Bedöva musen helt med isofluran och avliva den genom livmoderhalscancer förskjutning.
- Efter halshuggning, gör ett mittlinjesnitt i bröstbenet och fixa den öppna bröstkorgen med stift.
OBS: Undvik att skada membranet för att undvika läckage av kontrasten. - Skär den stigande aortan och ta bort hjärtat.
- Ta bort lungan och exponera den fallande aortan.
OBS: Skada inte den fallande aortan. - Skär den fallande aortan diagonalt för att exponera tvärsnittet (bild 1B).
OBS: Skala inte av aortan; en diagonal sektion är bättre för kateterinsättning. - För in 22 G-katetern i den fallande aortan medan vasodilatationsbufferten körs.
OBS: Om katetern sätts in under körningen av vasodilationsbufferten undviks luftföroreningar. - Fäst kateterns rot (bild 1C).
- Gör en knut för att förhindra läckage på grund av återflöde.
- Perfusera en uppvärmd vasodilateringslösning (papaverinhydroklorid, 4 g/l; adenosin, 1 g/l; heparin, 1 U/ml) i 3 minuter vid ett fast tryck mellan 13 och 15 kPa.
- Perfusera en lösning på 4% paraformaldehyd i (PBS) i 3 min.
OBS: Fixeringens framgång kan bekräftas av fotens rörelse (figur 1D). - Förbered kontrastmediet strax före perfusion.
OBS: Justera utspädningshastigheten enligt provet. för vuxna möss, blanda fläcken och spädningsfärgen i ett förhållande av 1:1. - Stoppa perfusionen och fyll förlängningsröret med 2 ml utspädd kontrastmedium (figur 1E).
OBS: Kontrastmediet bör injiceras långsamt för att undvika skador på blodkärlen. - Perfusera kontrastmediet vid ett fast tryck mellan 13 och 15 kPa.
- För att visualisera artärer, kontrollera tånagelen för att bekräfta att kontrastmediet har nått artären (figur 1F).
- För att visualisera alla kärl, kontrollera den sämre vena cava av membranet för att bekräfta fullständig cirkulation av kontrastmediet.
OBS: I början innehåller kontrasten vasodilaterande lösning; Därför är dess korrekta cirkulation nödvändig.
- Stäng trevägskranen och ta bort röret (bild 1G).
OBS: Om trevägskranen inte är stängd kommer kontrasten att flöda bakåt. - Inkubera provet över natten vid 4 °C.
- Ta bort huden och fixera den i 10% formaldehydlösning.
3. Visualisering
Visualiseringsprotokollen varierar beroende på CT-skannern. En mikrofokus röntgen CT skanner användes i detta protokoll. Det är nödvändigt att optimera avbildningsmetoden enligt varje CT-skanner.
- Fixera provet i ett 50 ml-rör som innehåller PBS.
- Lägg provröret på bordet.
- Skanna provet med en spänning på 50 kV och en ström på 600 μA, vilket säkerställer ett fokus-till-centrum-avstånd på 75,2 mm.
OBS: En dimension på 1 voxel var 28,7 μm x 28,7 μm x 28,7 μm i denna inställning. - Ladda de förvärvade bilddata med Fiji, en öppen källkodsplattform för biologisk bildanalys.
- Bestäm muskel voxel värdet med hjälp av gastrocnemius muskeln.
- Välj gastrocnemiusmuskeln med hjälp av rektangelverktyget .
- Kontrollera medelvärdet och standardavvikelsen (SD) från histogrammet (Analysera | Histogram).
- Definiera muskel voxel densitet som medelvärde + 2SD av gastrocnemius muskeln.
- Ställ in muskel voxel densitet som den lägre tröskelvärdet (Bild | justera | Tröskelvärde | Ange | lägre tröskelvärde).
OBS: Kärlområdet och benområdet finns kvar i binariserade data efter att tröskelvärdet har angetts.
Representative Results
Alla kärl i de nedre extremiteterna kan visualiseras om detta protokoll utförs korrekt (figur 2A). I en bakbens ischemi modell, den icke-ligated femorala gatan löper parallellt med lårbens venen (figur 2B), och en ligated femorala gatan kan bekräftas av avbrott i kontrast media (figur 2C). Resultaten visade utvecklingen av säkerhetsfartyg (figur 2D). Säkerhet cirkulation bildas mellan artärer proximal till den ligated artären och artären i nedre benet regionen och på ventrala och dorsala sidor av lårbens gatan. Den sämre gluteal gatan-början på dorsala sidan av bäckenet och körs på den laterala sidan av låret-expanderar robust på den skandinaviska sidan.
Kontrastfyllda kärl är fyllda med kontrastmediet (figur 2E). Störningar i kontrasten indikerar blandning av icke-kontrast media (t.ex. blod, vasodilatatorbuffert eller bubblor) eller otillräcklig perfusion av kontrasten (figur 2F). Vasodilatation och fixering skulle inte fungera bra om blodkärlen har krympt. Även om CT-avbildning endast kan visualisera kontrastmediet, är det möjligt att se artärerna på kroppens yta genom makroskopisk eller stereomikroskopisk observation (figur 2G). Det är således lättare att bedöma defekter med hjälp av kontrastmediet (figur 2H).
Bild 1: Disposition av proceduren. (A) Tryckperfusionsapparaten och 22 G-katetern som är ansluten via ett 2 ml förlängningsrör och trevägskran. B) Den stigande aortan skärs diagonalt för att exponera tvärsnittet (gul pil). (C) Katetern fixerades med hjälp av två stift (gula pilar). D) De fasta nedre extremiteterna sträcker sig vid fixering (gula pilar). (E) Injektion av kontrast genom trevägskranen. Injektionsriktningen indikeras med en gul pil. (F) Bakbensspiken är fylld med kontrasten (gul pil). (G) Kranen stängs och avlägsnas från perfusionsapparaten. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Figur 2: Bilder på fartyg. A) Hela bilden av bakbenens ben och kärl. B) Lårbensartären (röd pil) och ven (blå pil). C) Ligerad femorala artär (gul pil). Periferin avbryts av obstruktion (gul prickad linje). D) Säkerhetskärl på den ligaerade sidan (gula pilar). Den gula prickade linjen representerar den avbrutna lårbensartären. E) Ett välfyllt prov av den saphenösa artären (röd pil) och ven (blå pil). F) Otillräcklig perfusion leder till avbrott i saphenous fartyg (gul prickad linje). G) Stereomikroskopisk observation av ett representativt prov. Den högra lårbensartären (gul pil) är fylld med kontrastmedium. H) Stereomikroscopeobservation av ett underkänt prov. Den högra lårbensartären (gul pil) saknar kontrastmedium. Skalstänger = 1 mm (B-F), 2 mm (G, H), 10 mm (A). Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Discussion
Denna rapport introducerar en sofistikerad metod för att visualisera blodkärl i underkroppen. Det finns flera kritiska steg i denna process: den första är preperfusion före injektionen av kontrastmedium. Om tillräckligt med blod inte avlägsnas kommer kontrasten inte att fylla systemet. Dessutom stör införandet av luftbubblor fyllningen av kontrasten; Luften i kretsen måste därför avlägsnas helt. Eftersom kontrastmediet inte stelnar omedelbart efter injektionen bör provet inte flyttas i alltför hög utsträckning.
Denna metod är användbar för att utvärdera den ökade bildandet av blodkärl och cirkulation, såsom oavsiktlig cirkulation. Omvänt, som en begränsning, är det svårt att utvärdera smala blodkärl, eftersom det är svårt att skilja mellan stenos och en konstgjord minskning av kontrastmediet. Dessutom är det utmanande att utvärdera blodkärl i ben, eftersom separationen av blod och ben är svår.
En alternativ metod för 3D-visualisering är immunstaining. Med hjälp av vävnadsrensningstekniken finns flera metoder tillgängliga för 3D-avbildning7. Immunostaining är fördelaktigt eftersom det möjliggör färgning av specifika proteiner med hjälp av antikroppar. En färsk rapport utmanar helkroppstomografi baserat på immunostaining8; CT-baserad avbildning kräver dock ingen vävnadsrensning.
Denna metod möjliggör visualisering av alla kärl under membranet, inklusive bukorganen. Angiogenes i bukorganen har en stark inverkan på att upprätthålla homeostas och utveckla sjukdomar9,10. Eftersom detta protokoll optimerades för utvärdering av de nedre extremitetskärlen, skulle organ-specifika priming möjliggöra visualisering av angiogenes associeras med någon faktor, såsom inflammation eller tumörer.
Disclosures
Författarna har inga intressekonflikter att deklarera.
Acknowledgments
Vi tackar Yasuyo Kimura, Megumi Nagahiro och Saeko Tokunaga för det utmärkta tekniska stödet i djurförsök.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mL syringe | TERUMO | SS-01T | |
| 10% Formalin Solution | Fujifilm-Wako | 068-03841 | |
| 10x phosphate-buffered saline (-) (PBS) | Fujifilm-Wako | 163-25265 | Prepare 1x PBS |
| 22 G catheter (22 G S5 x 1" V(F)) | MEDIKIT | HP2140 | Only catheter is used. |
| 23 G needle | TERUMO | NN-2325R | Use as a pin |
| 4% paraformaldehyde in PBS | Fujifilm-Wako | 163-20145 | |
| 5 mL syringe | |||
| 5-0 Suture with needle | Alfresa Pharma Corporation | ER1205SB45 | |
| Adenosine | Sigma-aldrich | A9251-5G | For vasodilating solution |
| Dumont #55 Forceps | FST | No.11255-20 | |
| Extension tube | TOP | X2-FL50 | |
| Falcon 50 mL tube | CORNING | 352098 | |
| Graefe Forceps | FST | No.11051-10 | |
| Heparin Sodium 5,000 units/5 mL | Mochida Co. Ltd. | 224122458 | |
| Isoflurane | Fujifilm-Wako | 099-06571 | |
| Microfil Injection Compounds | Flow Tech Inc. | MV-117 | Mix liquid MV-Compound (stain) and MV-Diluent 1: 1 |
| Papaverine hydrochloride | Fujifilm | 164-18002 | For vasodilating solution |
| Small Animal Anesthetizer | Muromachi Kikai Co. Ltd. | MK-A100ecoW-ST | |
| Spring Scissors - Angled to Side | FST | No.15006-09 | |
| Surgical Scissors - Sharp-Blunt | FST | No.14001-12 | |
| three-way cock | TERUMO | TS-TR1K | |
| Transfer pipette | SAMCO SCIENTIFIC | SM262-1S | Use for mixing contrast medium |
| X-ray CT scanner | Toshiba IT & Control Systems Corporation | TOSHIBA TOSCANNER 32300 FPD |
References
- Folkman, J.
- Folkman, J. Angiogenesis in cancer, vascular, rheumatoid and other disease. Nature Medicine. 1 (1), 27-31 (1995).
- Kochi, T., et al. Characterization of the arterial anatomy of the murine hindlimb: functional role in the design and understanding of ischemia models. PLoS One. 8 (12), 84047 (2013).
- Limbourg, A., et al. Evaluation of postnatal arteriogenesis and angiogenesis in a mouse model of hind-limb ischemia. Nature Protocols. 4 (12), 1737-1746 (2009).
- Weyers, J. J., Carlson, D. D., Murry, C. E., Schwartz, S. M., Mahoney, W. M. Retrograde perfusion and filling of mouse coronary vasculature as preparation for micro computed tomography imaging. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (60), e3740 (2012).
- Arima, Y., et al. Evaluation of collateral source characteristics with 3-dimensional analysis using micro-X-ray computed tomography. Journal of the American Heart Association. 7 (6), 007800 (2018).
- Tian, T., Yang, Z., Li, X. Tissue clearing technique: Recent progress and biomedical applications. Journal of Anatomy. 238 (2), 489-507 (2021).
- Susaki, E. A., et al. Advanced CUBIC protocols for whole-brain and whole-body clearing and imaging. Nature Protocols. 10 (11), 1709-1727 (2015).
- Fernandez, M., et al.
- Li, S., et al. Angiogenesis in pancreatic cancer: current research status and clinical implications. Angiogenesis. 22 (1), 15-36 (2019).
