Summary
Her beskriver vi en visualiserings- og kvantifiseringsmetode for murin bak-lemfartøy ved hjelp av mikro-røntgen beregnet tomografi.
Abstract
Blodkar er komplekse nettverk med trelignende strukturer, og vaskulære nettverk er avgjørende for å opprettholde både sirkulasjon og opprettholde organfunksjon. Avklaring av mekanismen for blodkardannelse er derfor ekstremt nyttig for å belyse utviklingsprosesser og patologiske mekanismer. Murine hind-limb kar brukes ofte som modell for fysiologisk og patologisk angiogenese. Evaluering utføres hovedsakelig via en todimensjonal metode ved hjelp av vevsseksjoner. Metoder for evaluering av tredimensjonal (3D) vaskulær morfologi er imidlertid spesielt begrenset. Dette papiret introduserer en metode for visualisering av murin bakre lemmer ved hjelp av beregnet tomografi (CT). Strålings-ugjennomsiktig harpiks injiseres gjennom den synkende aorta, og hele fartøy er fylt med fargestoff. Ved å justere tidspunktet for fargeinjeksjon er arteriell-spesifikk fylling også mulig, og prøver kan oppnås med hvilken som helst mikro-røntgen CT-enhet. Denne kontrastmetoden gir en grunnleggende teknikk for 3D-evaluering av murinblodkar i nedre ekstremiteter. Videre kan denne metoden brukes til å visualisere alle blodkar under membranen og evaluere blodkar i bukorganene.
Introduction
Blodkar er komplekse nettverk med trelignende strukturer. Angiogenese og ny vaskulær formasjon spiller viktige roller i vedlikehold av organ homeostase1. Angiogenese er regulert for behandling av iskemiske og ondartede sykdommer2. Det er derfor viktig å forstå de underliggende mekanismene for angiogenese. Murine hind-limb fartøy brukes ofte som en nyttig modell for vaskulær forskning3; ipsilateral ligation av iliac eller femoral arterie er en kjent hind-limb iskemi modell som brukes til å vurdere angiogenese og vaskulær ombygging i fysiologisk og patologisk angiogenese4. Evalueringen av angiogenese utføres imidlertid hovedsakelig ved seksjonsfarging, og metoder for evaluering av 3D vaskulær morfologi er spesielt begrenset.
Sammenlignet med seksjonsfarging muliggjør CT 3D-visualisering. Nylig rapporterte Weyers et al. en sofistikert protokoll egnet for CT-avbildning, noe som muliggjør visualisering av murin voksen koronar sirkulasjonssystem5. Vi modifiserte metoden deres for å lage en prøveprepareringsmetode som er egnet for CT-avbildning av blodårene med lavere ekstremitet6. Her injiseres en strålings-ugjennomsiktig harpiks gjennom den synkende aorta, og fartøy i nedre ekstremiteter er fylt med fargestoff. Ved å justere tidspunktet for fargeinjeksjon er arteriespesifikk fylling også mulig, og prøver kan oppnås med en hvilken som helst mikro-røntgen beregnet tomografienhet. Denne kontrastmetoden gir en grunnleggende teknikk for 3D-evaluering av murinblodkar under membranen og i bukorganer og nedre ekstremiteter.
Protocol
Alle prosedyrer ble utført i samsvar med Kumamoto University dyrepleieretningslinjer (godkjenningsreferansenr. M30-040/A2020-105), som er i samsvar med US National Institutes of Health Guide for care and use of Laboratory Animals (publisering nr. 85-23, revidert 2011).
1. Forberedelse
- Klargjør perfusjonsapparatet og vasodilatorbufferen (4 mg/L papaverinhydroklorid, 4 g/l; adenosin, 1 g/l; heparin, 1 U/ml i fosfatbufret saltvann (PBS)).
MERK: Refluksenheten og vasodilatorreagensene er de samme som de som er rapportert av Weyers et al.5. - Koble til 22 G-kateteret, 2 ml forlengelsesrøret og treveis stoppekran (figur 1A).
MERK: Juster måleren i henhold til dyrets størrelse. For voksne C57BL/6-mus er 22 G optimal. - Fyll trykkperfusjonsapparatet med vasodilatorbufferen (figur 1A).
MERK: Unngå dannelse av bobler for å forhindre forstyrrelser i fyllingen av kontrastmediet.
2. Perfusjon
- Injiser 1 U/g heparin i PBS i intraperitonealhulen 30 min før operasjonen.
- Fullstendig bedøve musen med isofluran og euthanize det ved cervical dislokasjon.
- Etter halshugging, lag et midtlinje snitt i brystbenet og fest den åpne thoraxen med pinner.
MERK: For å unngå lekkasje av kontrasten, unngå å skade membranen. - Klipp stigende aorta og fjern hjertet.
- Fjern lungen og eksponer den synkende aorta.
MERK: Ikke skade den synkende aortaen. - Klipp den synkende aorta diagonalt for å eksponere tverrsnittet (figur 1B).
MERK: Ikke skrell av aorta; en diagonal seksjon er bedre for kateterinnsetting. - Sett 22 G-kateteret inn i den synkende aortaen mens du kjører vasodilasjonsbufferen.
MERK: Innsetting av kateteret under kjøring av vasodilasjonsbufferen unngår luftforurensning. - Fest roten på kateteret (figur 1C).
- Lag en knute for å forhindre lekkasje på grunn av tilbakestrømning.
- Perfuse en oppvarmet vasodilateringsløsning (papaverinhydroklorid, 4 g/l; adenosin, 1 g/l; heparin, 1 U/ml) i 3 min ved fast trykk mellom 13 og 15 kPa.
- Perfuse en løsning på 4% paraformaldehyd i (PBS) i 3 min.
MERK: Suksessen med fiksering kan bekreftes ved fotens bevegelse (figur 1D). - Forbered kontrastmediet like før perfusjon.
MERK: Juster fortynningshastigheten i henhold til prøven; For voksne mus blander du flekken og fortynningsmiddelet i forholdet 1:1. - Stopp perfusjonen og fyll forlengelsesrøret med 2 ml fortynnet kontrastmedium (figur 1E).
MERK: Kontrastmediet skal injiseres sakte for å unngå skade på blodårene. - Perfuse kontrastmediet ved et fast trykk mellom 13 og 15 kPa.
- For å visualisere arterier, kontroller tåneglen for å bekrefte at kontrastmediet har nådd arterien (figur 1F).
- For å visualisere alle fartøy, kontroller den dårligere vena cava av membranen for å bekrefte fullstendig sirkulasjon av kontrastmediet.
MERK: I begynnelsen inneholder kontrasten vasodileringsløsningen; Derfor er riktig sirkulasjon viktig.
- Lukk den treveis stoppekranen og fjern røret (figur 1G).
MERK: Hvis den treveis stoppekranen ikke er lukket, vil kontrasten strømme bakover. - Inkuber prøven over natten ved 4 °C.
- Fjern huden og fest den i 10% formaldehydoppløsning.
3. Visualisering
MERK: Visualiseringsprotokoller varierer avhengig av CT-skanneren. En microfocus X-ray CT-skanner ble brukt i denne protokollen. Det er nødvendig å optimalisere avbildningsmetoden i henhold til hver CT-skanner.
- Fest prøven i et 50 ml rør som inneholder PBS.
- Plasser prøverøret på bordet.
- Skann prøven med en spenning på 50 kV og en strøm på 600 μA, noe som sikrer en fokus-til-senter-avstand på 75,2 mm.
MERK: En dimensjon på 1 voxel var 28,7 μm x 28,7 μm x 28,7 μm i denne innstillingen. - Last inn de oppkjøpte bildedataene med Fiji, en åpen kildekode-plattform for biologisk bildeanalyse.
- Bestem muskelvokkelverdien ved hjelp av gastrocnemius-muskelen.
- Velg gastrocnemius muskelen ved hjelp av rektangel verktøyet.
- Kontroller gjennomsnitts- og standardavviket (SD) fra histogrammet (Analyser | Histogram).
- Definer muskel voxel tetthet som gjennomsnitt + 2SD av gastrocnemius muskelen.
- Angi muskelvokseltettheten som lavere terskelnivå (bilde | justere | Terskelverdi | Angi | lavere terskelnivå).
MERK: Det vaskulære området og benområdet forblir i de binariserte dataene etter at terskelen er angitt.
Representative Results
Alle fartøy i nedre ekstremiteter kan visualiseres hvis denne protokollen utføres riktig (figur 2A). I en bak-lem iskemi modell, den ikke-ligaterte lårarterien går parallelt med lårbenet (figur 2B), og en ligated femoral arterie kan bekreftes ved avbrudd av kontrastmedier (Figur 2C). Resultatene viste utviklingen av sikkerhetsfartøy (figur 2D). Collateral sirkulasjon dannes mellom arteriene proksimal til ligated arterien og arterien i underbenet regionen og på ventrale og dorsale sider av lårarterien. Den dårligere gluteal arterie-begynnelsen på dorsalsiden av bekkenet og kjører på sidesiden av låret- ekspanderer robust på den iskemiske siden.
Kontrastfylte kar er fylt med kontrastmediet (figur 2E); forstyrrelser i kontrasten indikerer blanding av ikke-kontrastmedier (f.eks. blod, vasodilatorbuffer eller bobler) eller utilstrekkelig perfusjon av kontrasten (figur 2F). Vasodilatasjon og fiksering ville ikke fungere bra hvis blodkarene har krympet. Selv om CT-avbildning bare kan visualisere kontrastmediet, er det mulig å se arteriene på overflaten av kroppen ved makroskopisk eller stereomikroskopisk observasjon (figur 2G). Dermed er det lettere å vurdere feil ved hjelp av kontrastmediet (figur 2H).
Figur 1: Omriss av prosedyren. (A) Trykkperfusjonsapparat og 22 G-kateteret som er koblet til via et 2 ml forlengelsesrør og en treveis stoppekran. (B) Den stigende aorta er kuttet diagonalt for å eksponere tverrsnittet (gul pil). (C) Kateteret ble festet med to pinner (gule piler). (D) De faste underekstremitetene strekker seg etter fiksering (gule piler). (E) Injeksjon av kontrast gjennom treveis stoppekran. Injeksjonsretningen indikeres med en gul pil. (F) Bakre lem spiker er fylt med kontrasten (gul pil). (G) Stoppekranen er lukket og fjernet fra perfusjonsapparatet. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Bilder av fartøy. (A) Hele bildet av bakbenet bein og kar. (B) Lårarterie (rød pil) og vene (blå pil). (C) Ligated lårarterie (gul pil). Periferien avbrytes av hindringen (gul prikket linje). (D) Sikkerhetsfartøy i den ligaterte siden (gule piler). Den gule stiplede linjen representerer den avbrutte lårarterien. (E) En velfylt prøve av saphenous arterien (rød pil) og vene (blå pil). (F) Utilstrekkelig perfusjon fører til avbrudd av saphenous kar (gul prikket linje). (G) Stereomikroskopisk observasjon av et representativt utvalg. Høyre lårarterie (gul pil) er fylt med kontrastmedium. (H) Stereomikroskopobservasjon av en mislykket prøve. Høyre lårarterie (gul pil) mangler kontrastmedium. Skalastenger = 1 mm (B-F), 2 mm (G, H), 10 mm (A). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Discussion
Denne rapporten introduserer en sofistikert metode for å visualisere blodkar i underkroppen. Det er flere kritiske trinn i denne prosessen: den første er preperfusjon før injeksjon av kontrastmedium. Hvis nok blod ikke fjernes, vil kontrasten ikke fylle systemet. I tillegg forstyrrer inkluderingen av luftbobler fyllingen av kontrasten; Dermed må luften i kretsen fjernes helt. Videre, fordi kontrastmediet ikke størkner umiddelbart etter injeksjon, bør prøven ikke flyttes for mye.
Denne metoden er nyttig for å evaluere den økte dannelsen av blodkar og sirkulasjon, for eksempel sikkerhetssirkulasjon. Omvendt, som en begrensning, er det vanskelig å evaluere innsnevrede blodkar, da det er vanskelig å skille mellom stenose og en kunstig reduksjon i kontrastmediet. I tillegg er det utfordrende å evaluere blodkar i bein, da separasjon av blod og bein er vanskelig.
En alternativ metode for 3D-visualisering er immunstaining. Ved hjelp av vevsryddingsteknikken er flere metoder tilgjengelige for 3D-avbildning7. Immunostaining er fordelaktig, da det tillater farging av spesifikke proteiner ved hjelp av antistoffer. En fersk rapport utfordrer avbildning av hele kroppen basert på immunstaining8; CT-basert avbildning krever imidlertid ingen vevsryddingsforbehandling.
Denne metoden muliggjør visualisering av alle kar under membranen, inkludert bukorganene. Angiogenese i bukorganene har en sterk innvirkning på å opprettholde homeostase og utvikle sykdommer9,10. Ettersom denne protokollen ble optimalisert for evaluering av nedre ekstremitetsbeholdere, ville organspesifikk grunning muliggjøre visualisering av angiogenese forbundet med enhver faktor, for eksempel betennelse eller svulster.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter å erklære.
Acknowledgments
Vi takker Yasuyo Kimura, Megumi Nagahiro og Saeko Tokunaga for utmerket teknisk støtte i dyreforsøk.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mL syringe | TERUMO | SS-01T | |
| 10% Formalin Solution | Fujifilm-Wako | 068-03841 | |
| 10x phosphate-buffered saline (-) (PBS) | Fujifilm-Wako | 163-25265 | Prepare 1x PBS |
| 22 G catheter (22 G S5 x 1" V(F)) | MEDIKIT | HP2140 | Only catheter is used. |
| 23 G needle | TERUMO | NN-2325R | Use as a pin |
| 4% paraformaldehyde in PBS | Fujifilm-Wako | 163-20145 | |
| 5 mL syringe | |||
| 5-0 Suture with needle | Alfresa Pharma Corporation | ER1205SB45 | |
| Adenosine | Sigma-aldrich | A9251-5G | For vasodilating solution |
| Dumont #55 Forceps | FST | No.11255-20 | |
| Extension tube | TOP | X2-FL50 | |
| Falcon 50 mL tube | CORNING | 352098 | |
| Graefe Forceps | FST | No.11051-10 | |
| Heparin Sodium 5,000 units/5 mL | Mochida Co. Ltd. | 224122458 | |
| Isoflurane | Fujifilm-Wako | 099-06571 | |
| Microfil Injection Compounds | Flow Tech Inc. | MV-117 | Mix liquid MV-Compound (stain) and MV-Diluent 1: 1 |
| Papaverine hydrochloride | Fujifilm | 164-18002 | For vasodilating solution |
| Small Animal Anesthetizer | Muromachi Kikai Co. Ltd. | MK-A100ecoW-ST | |
| Spring Scissors - Angled to Side | FST | No.15006-09 | |
| Surgical Scissors - Sharp-Blunt | FST | No.14001-12 | |
| three-way cock | TERUMO | TS-TR1K | |
| Transfer pipette | SAMCO SCIENTIFIC | SM262-1S | Use for mixing contrast medium |
| X-ray CT scanner | Toshiba IT & Control Systems Corporation | TOSHIBA TOSCANNER 32300 FPD |
References
- Folkman, J.
- Folkman, J. Angiogenesis in cancer, vascular, rheumatoid and other disease. Nature Medicine. 1 (1), 27-31 (1995).
- Kochi, T., et al. Characterization of the arterial anatomy of the murine hindlimb: functional role in the design and understanding of ischemia models. PLoS One. 8 (12), 84047 (2013).
- Limbourg, A., et al. Evaluation of postnatal arteriogenesis and angiogenesis in a mouse model of hind-limb ischemia. Nature Protocols. 4 (12), 1737-1746 (2009).
- Weyers, J. J., Carlson, D. D., Murry, C. E., Schwartz, S. M., Mahoney, W. M. Retrograde perfusion and filling of mouse coronary vasculature as preparation for micro computed tomography imaging. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (60), e3740 (2012).
- Arima, Y., et al. Evaluation of collateral source characteristics with 3-dimensional analysis using micro-X-ray computed tomography. Journal of the American Heart Association. 7 (6), 007800 (2018).
- Tian, T., Yang, Z., Li, X. Tissue clearing technique: Recent progress and biomedical applications. Journal of Anatomy. 238 (2), 489-507 (2021).
- Susaki, E. A., et al. Advanced CUBIC protocols for whole-brain and whole-body clearing and imaging. Nature Protocols. 10 (11), 1709-1727 (2015).
- Fernandez, M., et al.
- Li, S., et al. Angiogenesis in pancreatic cancer: current research status and clinical implications. Angiogenesis. 22 (1), 15-36 (2019).
