Summary
该协议旨在通过实施气培系统为 大麻苜蓿 L.的克隆繁殖提供指导信息。这里描述的方法包括成功再现大麻属中理想的形态学和化学性质所需的所有用品和 方案。
Abstract
该协议描述了通过利用气培系统实现大麻有效克隆繁殖技术的标准化。从两个大麻品种中切除了主要的芽插条，命名为"樱桃酒"和"红罗宾"（17-20%w / w CBD），作为"母株"。在放入系统之前，应用生长素前体（吲哚-3-丁酸）来刺激切除插条基部的根系发育。插条每三天用营养雾溶液轻轻喷雾，以提供营养支持，因为溶液含有必需的常量营养素，包括氮，磷和钾。气培系统储水器的pH值范围保持在5.0-6.0之间，水温在20-22°C之间。 使用潜水水泵将水输送到岩屑中。每天为芽尖插条提供24小时的光照，持续10天，直到根部发育发生，在此上移植根部插条用于研究目的。这些气培系统已被证明可以为 大麻 的繁殖产生理想的结果。这里描述的方法减轻了传统方法产生的潜在时间限制，以便为 大麻的无性繁殖提供更有效的手段。
Introduction
大麻 L.是一种一年生的，雌雄异株的开花植物，属于大麻科。大麻素主要在位于雌性花序苞片组织外表皮层的腺体毛状体内产生1，正在成为越来越受欢迎的研究课题，主要是因为它们逐渐认识到药用特性。大麻二酚（CBD）是 大麻 中仅次于Δ9-四氢大麻酚（THC）的第二大最突出的大麻素，具有许多药用益处，包括镇痛特性2，抗癫痫特性3，抗抑郁特性4，降低糖尿病风险5和治疗各种睡眠障碍6。由于 大麻 植物的代谢物具有多种健康益处，因此对其商业规模生产的需求不断增长7。为了满足这一需求，种植方法不断得到改进和重塑，以不断为新兴的 大麻 行业提供一致，高质量的植物材料。
大麻的繁殖可以通过两种方式促进：有性繁殖或无性繁殖。有性繁殖的一个例子是用雄性雄蕊的花粉为雌性胚珠授粉，从而产生可以发芽的种子。种子发芽是一种可靠的栽培方法，已用于育种和栽培目的，其中在亲本系中选择理想的表型性状，以提高后代大麻植物的质量，包括耐旱性状，抗虫性状，增加产量和增加效力等性状8.然而，在进行有性繁殖时，意外的异花授粉是一种固有的风险，导致不良后代，从而导致理想性状的潜在丧失或引入不需要的性状。大麻种植者接受用THC生产花粉授粉的大麻种子，导致由于不合规的植物（>0.3%总THC w / w）而导致的重大经济损失，突出了这种意外授粉的一个例子9。此外，为了生产仅由雌性组成的作物，必须播种女性化的种子而不是非女性化的种子，这可能导致雌雄同体和其他不良特征，从而导致经济损失。为了克服大麻有性繁殖的局限性，无性繁殖已在大麻行业的商业生产模式中广泛实施10。
大麻的无性繁殖只需要一种植物，这允许单一基因型的繁殖，从而允许商业生产具有理想农艺和药物性状的植物。无性大麻繁殖的一种常见形式是将雌性植物的一小部分切割并插入无土基质11中，该基质被湿度圆顶覆盖以诱导根的形成。虽然这种方法已被证明是成功的，但一个共同的缺点是圆顶内积聚了高水平的湿度（通常为80%或更高），为真菌病原体提供了理想的生长环境，这可能对新的敏感插条有害。另一种形式的无性繁殖是使用组织培养的微繁殖，其中无菌技术允许昆虫，微生物和无病毒的大麻植物材料在有限的空间内繁殖12。然而，这个过程是昂贵，耗时的，需要训练有素的实验室技术人员，而大型大麻设施通常无法进入。
关于 大麻克隆繁殖的已发表研究报告很少。为了为理解用于研究目的和工业生产的 大麻 的无性繁殖提供基础，本研究旨在证明采用气培系统进行 大麻克隆繁殖的易用性和可及性。气培系统是 大麻无性繁殖的理想选择，始终如一地为插条提供营养丰富的水，及时诱导早期根系形成，并在需要时允许植物无限期地维持。
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Protocol
1. 生成用于克隆繁殖的母株
- 选择一种健康的雌性母株，该母株表现出与其预期用途特有的理想形态和化学特征。
- 让母株达到适当的大小（大约25个成熟芽）以进行克隆繁殖（即插条）。
- 让母株保持在营养生长阶段（浅色：深色= 18小时：6小时），以促进芽生长以备将来繁殖。
2. 气培系统的建设和制备
- 首先将盖子放在容器顶部（38.1 厘米 x 25.4 厘米 x 30.48 厘米）。在盖子上钻所需数量的孔，同时在每个孔之间提供足够的空间（最好是3厘米）。
- 将水泵（物料表）放置在容器的中心。
- 将7-8升蒸馏水倒入容器中，使泵喷嘴保持在水线上方约2.5厘米处。
注意：这可确保潜水水泵（材料表）能够以足够的力推动水以扩散到容器盖上。建议使用蒸馏水;但是，也可以使用普通的自来水。 - 将适量的岩棉立方体（3.81厘米）（材料表）或所选的培养基立方体放入每个插槽中。打开泵，让它运行24小时。
注意：岩棉立方体是首选，因为它们在新根的插条上具有"锚定"能力，有助于在移植后保持植物直立。
3. 选择和切除合适的芽
- 使用无菌的手术刀或剪刀收集根尖分生组织附近的芽。扦插长度约为10厘米，理想情况下有几个节点。
注意：以 45° 角切割阀杆。以45°角切割会增加切割基部的表面积，为根系发育留出更多空间。在45°切割的中间做一个小切口（1-2厘米）是可选的，以进一步增加表面积。 - 除前三个节点上存在的树叶外，除所有树叶外。
- 将新切除的切口浸入含有吲哚-3-丁酸（IBA）的生根溶液中（材料表），从茎基部向上约2-5厘米约5秒。
- 将切口插入位于气培系统中的岩棉立方体的中心。
注意：切割插入深度应保持在距岩棉立方体底部约1-2厘米的位置。 - 每3天用营养雾溶液（材料表）喷洒未连根的插条。
- 在24-29°C和40-60%相对湿度下，每天用光照18-24小时光照，光合光子通量密度（PPFD）为100μmol/m2/s，每天生长插条。
4. 气培系统维护和繁殖体健康
- 每2-5天用pH值在5.0-6.0之间的水补充系统。
- 每3天用营养雾溶液（材料表）轻轻喷洒插条（每次切割一次雾）。
- 每3-5天向储液罐中加入5 mL每种营养液（材料表）。
注意：营养添加导致水呈棕色和浑浊。 - 每5天每10升水加入15毫升含有次氯酸（0.028%）的藻类和细菌清洁溶液（材料表）。
5. 移植繁殖体
- 选择具有长，白色，纤维状根的插条。
注意：避免使用棕色，粘稠和短根系的插条，因为这是根腐病存在的指标，通常需要更长的时间才能适应新的生长介质，并可能带来不必要的疾病。 - 小心地将岩棉立方体从系统中移开并解开根部。
- 将 大麻 繁殖体移植到充满营养土壤混合物的4L育苗盆中（材料表）。
注意：建议立即浇水，以防止根部变干。
6. 气培系统的清洁和储存
- 当系统不再使用时，用水清洗，并用70%乙醇或其他消毒剂清洁。
- 从水泵上取下过滤器，然后用水冲洗以清除碎屑。
- 用纸巾或毛巾擦拭系统，擦干系统。
- 将泵放在盖上盖子的浴缸内，然后将其存放直至需要为止。
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Representative Results
为了验证所描述的气培系统的效率，分别从母株中切除了10个和12个健康的14厘米长的芽，分别是"樱桃酒"和"红罗宾"（图1A，B）。浸入生根诱导培养基后，将克隆放入系统（图2A）。气培系统的构造和运行如图 2A所示。
适应2天后，所有克隆在3-7天内开始发育根系，并在系统上10-14天后完全发育出37 cm长的根，足以种植到充满土壤的盆中（图2B，D）。 图3显示了每个品种的芽和根的平均长度。在转移到土壤之前测量芽长和根长。"樱桃酒"的芽和根的平均长度分别为24.8厘米±2.4厘米和37.8厘米±2.5厘米，±2.1厘米和39.7厘米±5.9厘米（图3A，B）。采用双向方差分析分析两个品种之间的差异，随后进行Tukey多重同情检验，显示两个品种的芽长和根长无显著差异（n = 10~12，p<0.05）。
图1：一种健康的母株，可产生多个芽以进行克隆繁殖。 （A）成熟的母株，"樱桃酒"（正面）和"红知更鸟"（背面）在约4个月的营养生长，表现出许多适合繁殖的芽。（B）大约长度（14厘米），用于克隆 大麻的适当芽切除。 请点击此处查看此图的放大版本。
图2：建立用于大麻克隆繁殖的气培系统。 （A） 说明气培系统各组成部分的示意图（38.1厘米×25.4厘米×30.48厘米）。（B）气培系统完全被"樱桃酒"克隆体占据。（C）在气培系统内部，克隆表现出根系生长。（D）在气培系统中10天后，岩棉立方体中的根系健康生长。 请点击此处查看此图的放大版本。
图3：在气培克隆系统中10天后，"樱桃酒"和"红罗宾"的芽和根长测量。 （A）条形图和（B）表，代表两个大麻品种的芽和根的长度。采用双向方差分析分析了两个品种的芽/根长度差异，然后进行了Tukey的多重比较检验。 请点击此处查看此图的放大版本。
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Discussion
随着对大麻素含量一致的 大麻 植物的需求不断增加 ，大麻工业 中已经利用了各种克隆繁殖方法。与有性方法相比，无性繁殖显示出大规模，一致生产的几个优点。气培繁殖系统是水培系统的改良版本，利用充气的营养丰富的水雾来提供快速的根部发育。所描述的气培系统由三个关键步骤组成，1）产生健康的雌性 大麻 "母"植物作为所需物理/化学性状的遗传源，2）切割芽（顶端分生组织）并用含有生长素前体IBA的根诱导培养基进行处理，以及3）在所需的育苗盆中适应繁殖物。
气培繁殖系统允许高效生产大麻克隆，与不同的繁殖方法相比具有明显的优势。它包括1）通过减少劳动诱导健康和成熟根部形成的时间和成本，最快5天;2）遗传同质性 - 允许产生遗传上相同的克隆，排除任何遗传变异，以适应可重复的 大麻 研究和行业应用;3）大规模作业的均匀性;4）对微生物病原体的脆弱性较小 - 在植物的上层树冠中保持相对较低的湿度水平，而不是根系发育的容器内部的湿度水平。
尽管气培系统具有许多优点，但在练习过程中应仔细解决一些限制。首先，由于所有营养素都是以水疗法提供的，因此很容易被藻类，真菌和病毒（例如，啤酒花潜伏类病毒）病原体污染，导致根系畸形，通过定期处理抗菌/真菌/病毒剂来减轻。其次，单母植物的广泛使用可能对生产设施造成问题。将单个基因型克隆品系作为生产模型中的唯一植物，如果该基因型容易受到该栽培设施中存在的给定害虫或病原体的影响，则会导致整个作物损失的风险;因此，建议使用这种气培克隆系统维护来自不同谱系的多个母株，用于繁殖生产克隆，以限制任何给定害虫或病原体的经济损失13。建议在克隆新的母株以用作生产克隆的未来来源之前，仅无营养地种植母株不超过6个月。这可以防止过度生长的根系，这些根部可能导致不健康的母株和较低的克隆成功率，以及过度生长的树冠，这些树冠可能藏匿害虫和病原体，这些害虫和病原体可能会传播给繁殖的克隆。
气培系统以经济高效的方式在工业上可扩展。 图1 显示，至少20种植物材料可以装在一个容器中（38.1厘米x 25.4厘米x 30.48厘米）。该系统可以很容易地扩大规模，每单位可容纳50多个植物，而不会增加水，养分和电力成本。这里描述的当前方法的优点为将气培克隆系统实施到行业实践和研究实验室中提供了一个理由，以便及时和均匀地传播 大麻。
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Disclosures
作者没有利益冲突。
Acknowledgments
这项研究得到了科罗拉多州立大学普韦布洛分校大麻研究所和科学与信息通信技术部（2021-DD-UP-0379）和春川市（大麻研发和工业化，2020-2021）的支持，作者还希望感谢Summit CBD的Justin Henderson对"樱桃酒"种子的慷慨捐赠。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1-part Fox Farm | Fox Farm | Soil Mix | |
| 1-part Promix | Promix | Soil Mix | |
| 1-part Roots Organic Original | Auora Innovations | Soil Mix | |
| 1-part Wiggle Worm Earth Worm Castings | UNCO Industries | Soil Mix | |
| Algae and Bacterial Cleaning Solution (Clear Rez) | EZ Clone | SKU#: 225 | 8 fl. Oz. |
| Artificial Lighting | AgroBrite | SKU#: 1399 | T5 324W 4' 6-Tube Fixture with Lamps |
| Cannabis Mother plant 1 (Cherry Wine) | Summit CBD | N/A | Donated material |
| Cannabis Mother Plant 2 (Red Wine) | Trilogene | SKU: 0101RR | |
| Corresponding Plastic Lid | Office Depot | N/A | 38.1 cm x 25.4 cm |
| Drill Bit 1 | Dewalt | DW1586 | 38.1 mm spade drill bit |
| Drill Bit 2 | Dewalt | DW1308 | 3.175 mm drill bit |
| Flora/Bloom (Nutrient Solution)-5 mL | General Hydroponics | SKU#: 726 | 946 mL (1 Quart) 2.43 lbs. (1.1 kg) (Available Phosphate 5.0%, Soluble Potash 4.0%, Magnesium 1.5%, Sulfur 1.0%) |
| FloraGrow (Nutrient Solution)- 5 mL | General Hydroponics | SKU#: 724 | 946 mL (1 Quart) 2.43 lbs. (1.1 kg) ((Total Nitrogen 2.0% (0.25% Ammoniacal Nitrogen, 1.75% Nitrate Nitrogen), Available Phosphate 1.0%, Soluble Potash 6.0%, Magnesium 0.5%)) |
| FloraMicro (Nutrient Solution)- 5 mL | General Hydroponics | SKU#: 759 | 946 mL (1 Quart) 2.43 lbs. (1.1 kg) ((Total Nitrogen 5.0% (0.3% Ammoniacal Nitrogen, 4.7% Nitrate Nitrogen), Soluble Potash 1.0%, Calcium 5.0%, Boron 0.01%, Cobalt 0.0005%, Copper 0.01%, Iron 0.1%, Manganese 0.05%, Molybdenum 0.0008%, Zinc 0.015%)) |
| Horticultural Scissors | Shear Perfection | SKU#: 12620 | Platinum Stainless Steel Bonsai Scissors (2.4") |
| Isopropyl Alcohol | Equate | Walmart # 574133562 | 70% concentration |
| Nutrient Mist Solution (Clonex Mist) | Growth Technology | SKU#: 4889 | 10.14 fl. Oz (300 ml) (Total Nitrogen: 5.9 × 10-4 %, Available Phosphate: 4.0 × 10-4 %, Soluble Potash: 5.0 × 10-4 %) |
| pH Down | General Hydroponics | SKU#: 733 | 946 ml (1 Quart) 2.43 lbs. (1.1 kg) |
| pH Up | General Hydroponics | SKU#: 730 | 946 ml (1 Quart) 2.43 lbs. (1.1 kg) |
| Plastic Container | Office Depot | N/A | 38.1 cm x 25.4 cm x 30.48 cm |
| Power Drill | Dewalt | DCD709B | 20-Volt Max ½” Drill |
| Rockwool Cubes | Grodan | SKU#: 830 | 38.1 mm |
| Rooting Solution (Clonex Rooting Gel) | Growth Technology | SKU#: 939 | 3.4 fl. Oz. (100 ml) (Indolebutyric Acid - 0.31%) |
| Statistic Software (Prism) | GraphPad Inc. | ||
| Submersible Water Pump | ActiveAQUA | SKU: AAPW250 | Model: AAPW250, Voltage 120V, Power 16W |
References
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