Summary
פרוטוקול זה נועד לספק מידע הדרכה עבור הפצת כלת של קנאביס סאטיבה L. על ידי יישום מערכות aeroponic. השיטה המתוארת כאן כוללת את כל האספקה והפרוטוקולים הדרושים כדי לשחזר בהצלחה תכונות מורפולוגיות וכימיות רצויות בסוג הקנאביס.
Abstract
פרוטוקול זה מתאר את התקינה של טכניקת התפשטות כלתות יעילה של קנבוס על ידי שימוש במערכות האווירופוניות. גזרי ירי ראשוניים נקטעו משני זני קנבוס, בשם "יין דובדבן" ו "אדום רובין" (17-20% w / w CBD), ששימשו כ'צמח אם '. מבשר עזר (חומצה indole-3-butyric) הוחל כדי לעורר התפתחות השורש בחלק הבסיסי של חתכים excised לפני המיקום במערכת. החתכים הוטעו קלות עם פתרון הערפל התזונתי כל שלושה ימים כדי לספק תמיכה תזונתית שכן הפתרון מכיל את המקרונוטריאנטים החיוניים, כולל חנקן, זרחן ואשלגן. מאגר המים של המערכת האווירופונית שמר על טווח pH בין 5.0-6.0 וטמפרטורת מים בין 20-22 מעלות צלזיוס. משאבת מים צוללת שימשה להעברת מים לחיתוך. חיתוך קצה לירות סופקו עם 24 שעות של אור ליום במשך 10 ימים עד התפתחות השורש התרחשה, שבו חתכים מושרשים הושתלו למטרות מחקר. מערכות aeroponic אלה הוכיחו לייצר תוצאות רצויות עבור התפשטות קנאביס . השיטה המתוארת כאן מקלה על אילוצי זמן פוטנציאליים הנובעים משיטות מסורתיות כדי לאפשר אמצעים יעילים יותר להתפשטות א-מינית של קנאביס.
Introduction
קנאביס סאטיבה ל' הוא צמח פורח שנתי, דיוצ'י, המסווג במשפחה קנבסאיי. קנבינואידים, המיוצרים בעיקר בתוך טריכומים בלוטות הממוקם על השכבה האפידרמית החיצונית של רקמות bract על תפרחות הנשיות1, הופכים לנושא מחקר פופולרי יותר ויותר, בעיקר בשל תכונות מרפא מוכרים בהדרגה שלהם. קנבידיול (CBD) הוא הקנבינואיד השני הבולט ביותר שנמצא בקנביס לאחר Δ9-tetrahydrocannabinol (THC) ומיוחס לשורה של יתרונות רפואיים, כולל תכונות מזיקות2, תכונות נגד התקפים3, תכונות נוגדות דיכאון4, הפחתת הסיכון לסוכרת5, וטיפול בהפרעות שינה שונות6. בשל היתרונות הבריאותיים הרבים הקשורים למטבוליטים של צמח הקנאביס, יש ביקוש גובר לייצור בקנה מידה מסחרי7. כדי לענות על דרישה זו, שיטות הטיפוח משתפרות כל הזמן ומומצאות מחדש כדי לספק ללא הרף חומר צמחי עקבי ואיכותי לתעשיית הקנאביס המתפתחת.
התפשטות של קנאביס ניתן להקל בשתי דרכים: רבייה מינית או א-מינית. דוגמה לרבייה מינית היא האבקת ביצות נקביות עם אבקה מדבנים של זכר וכתוצאה מכך זרע שניתן לנבוט. נביטת זרעים היא שיטת גידול אמינה ששימשה למטרות גידול וטיפוח בה נבחרות תכונות פנוטיפיות רצויות בשורות ההורים כדי לשפר את איכות צמחי הקנאביס הצאצאים, כולל תכונות כגון עמידות לבצורת, עמידות בפני חרקים, תשואה מוגברת ועוצמה מוגברת8 . עם זאת, האבקה צולבת לא מכוונת היא סיכון מובנה בעת ביצוע רבייה מינית, גרימת צאצאים לא רצויים, מה שמוביל לאובדן פוטנציאלי של תכונות רצויות או מבוא של תכונות לא רצויות. דוגמה להאבקה לא מכוונת זו מודגשת על ידי מגדלי קנבוס המקבלים זרעי קנבוס מואבקים עם אבקה המייצרת THC וכתוצאה מכך הפסד כלכלי משמעותי בשל הצמחים שאינם תואמים (>0.3% בסך THC w / w)9. בנוסף, כדי ליצור יבול המורכב מנקבות בלבד, זרע נשי חייב להיזרע במקום זרע לא נשי, אשר יכול להוביל הרמפרודיטיות ותכונות לא רצויות אחרות המובילות לאובדן כלכלי. כדי להתגבר על המגבלה של רבייה מינית של קנאביס, רבייה א-מינית כבר נהוגה באופן נרחב במודלים ייצור מסחרי של תעשיית הקנאביס10.
רבייה א-מינית של קנאביס דורשת רק צמח אחד, המאפשר כפל של גנוטיפ אחד המאפשר ייצור מסחרי של צמחים הנושאים תכונות אגרונומיות ותרופות רצויות. צורה נפוצה של רבייה א-מינית של קנאביס היא לחתוך ולהכניס חלקים קטנים של צמח נקבה לתוך מצע ללא אדמה11 אשר מכוסה על ידי כיפת לחות כדי לגרום להיווצרות שורש. למרות ששיטה זו הוכחה כמוצלחת, חיסרון נפוץ הוא הצטברות של רמת לחות גבוהה (בדרך כלל 80% ומעלה) בתוך הכיפה, ומספקת סביבת צמיחה אידיאלית לפתוגנים פטרייתיים, אשר יכול להיות מזיק לחיתוך חדש, רגיש. צורה נוספת של התפשטות א-מינית היא מיקרו-פרופגציה באמצעות תרבית רקמות, שבה טכניקות סטריליות מאפשרות הפצה של חרקים, חיידקים וחומר צמחי קנאביס ללא וירוסים בחלל מוגבל12. תהליך זה, לעומת זאת, הוא יקר, זמן רב ודורש טכנאי מעבדה מיומנים אשר בדרך כלל אינם נגישים למתקני קנאביס בקנה מידה גדול.
מעט מאוד דוחות מחקר שפורסמו קיימים על התפשטות כלנית של קנאביס. על מנת לספק בסיס להבנת רבייה א-מינית של קנאביס למטרות מחקר וייצור תעשייתי, מחקר זה נועד להדגים את הקלות והנגישות של שימוש במערכות האווירופוניות להפצת כליות של קנאביס. מערכות אווירופוניות אידיאליות להפצה א-מינית של קנאביס, ומספקות בעקביות מים עשירים בחומרים מזינים לחיתוך, גורמות להיווצרות שורשים מוקדמת בזמן, ומאפשרות לצמח להישמר ללא הגבלת זמן במידת הצורך.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. דור של צמח אם להפצת כליות
- בחר צמח אם בריא, נקבה המציג מאפיינים מורפולוגיים וכימיים רצויים ספציפיים לשימוש המיועד שלו.
- אפשר לצמח האם להגיע לגודל המתאים (בערך 25 יורה בוגר) עבור התפשטות כליות (כלומר, חתכים).
- אפשר לצמחים האם להישאר בשלב הצמיחה הצמחית (אור: כהה = 18 h:6 h) כדי לקדם צמיחת לירות להתפשטות עתידית.
2. הקמה והכנה של מערכת האווירופונית
- התחילו בהצבת המכסה על גבי המיכל (38.1 ס"מ x 25.4 ס"מ x 30.48 ס"מ). קודחים את מספר החורים הרצוי במכסה תוך מתן מקום הולם (רצוי 3 ס"מ) בין כל אחד מהם.
- מקם את משאבת המים (שולחן החומרים) במרכז המיכל.
- יוצקים 7-8 ליטר של מים מזוקקים לתוך המיכל, כך זרבובית המשאבה נשאר בערך 2.5 ס"מ מעל קו המים.
הערה: זה מבטיח משאבת מים צוללת (שולחן של חומרים) הוא מסוגל לדחוף מים עם מספיק כוח להתפשט על פני מכסה מיכל. מומלץ למים מזוקקים; עם זאת, מי ברז רגילים עשויים לשמש גם. - יש למקם את הכמות המתאימה של קוביות Rockwool (3.81 ס"מ) (שולחן החומרים) או קוביות מדיה לבחירתכם בכל חריץ. הפעל את המשאבה ואפשר לה לרוץ במשך 24 שעות.
הערה: קוביות Rockwool מועדפות בשל יכולת "עיגון" שלהם על חתכים מושרשים חדשים המסייעים לשמור על צמחים זקופים לאחר ההשתלה.
3. בחירת וקטע צילומים מתאימים
- לאסוף יורה ליד meristem apical באמצעות אזמל מעוקר או מספריים. חתכים הם ~ 10 ס"מ אורך, באופן אידיאלי עם כמה צמתים.
הערה: חותכים את הגבעול בזווית של 45°. חיתוך בזווית של 45° מגדיל את שטח הפנים של החלק הבסיסי של החיתוך, ומאפשר יותר מקום להתפתחות השורש. זה אופציונלי לעשות חריץ קטן (1-2 ס"מ) באמצע החתך של 45° כדי להגדיל עוד יותר את שטח הפנים. - הסר את כל העלווה למעט עלווה נוכחת בשלושת הצמתים העליונים.
- טובלים את החיתוך החדש שנחתך בתמיסת השורש המכילה חומצה indole-3-butyric (IBA) (טבלת חומרים) ~ 2-5 ס"מ למעלה מבסיס הגבעול עבור ~ 5 s.
- הכנס את החיתוך למרכז קוביית Rockwool הממוקמת במערכת האווירופונית.
הערה: עומק החדרת החיתוך הוא להישאר ~ 1-2 ס"מ מתחתית קוביית Rockwool. - לרסס את החתכים unrooted עם פתרון ערפל מיזיני (שולחן החומרים) כל 3 ימים.
- לגדל את החתכים עם 18-24 שעות של אור ליום עם צפיפות שטף פוטון פוטונית (PPFD) של 100 מיקרומול / m2 /s ב 24-29 °C (70-60% לחות יחסית.
4. תחזוקת מערכת האווירופונית ובריאות ההתפשטות
- לחדש את המערכת עם מים ב- pH בין 5.0- 6.0 כל 2-5 ימים.
- ערפל קלות את החתכים (ערפל אחד לכל חיתוך) עם פתרון הערפל התזונתי (שולחן החומרים) כל 3 ימים.
- הוסיפו למאגר 5 מ"ל מכל פתרון מיזיני (טבלת חומרים) כל 3-5 ימים.
הערה: התוספת המזינים גורמת למים להיות חומים ועכורים. - יש להוסיף 15 מ"ל של תמיסת ניקוי האצות והחיידקים המכילה חומצה היפוכלורית (0.028%) לכל 10 ליטר מים כל 5 ימים (טבלת חומרים).
5. השתלת התפשטות
- בחר את החתכים עם שורשים ארוכים, לבנים, סיביים.
הערה: הימנע חתכים עם מערכות שורש חום, חלקלק, קצר כמו זה אינדיקטור לנוכחות של ריקבון שורש ובדרך כלל ייקח יותר זמן כדי להתאקלם המדיום החדש גדל יכול להביא מחלות לא רצויות. - מוציאים בזהירות את קוביית הרוקוול מהמערכת ומתיר את השורשים.
- להשתיל את התפשטות הקנביס לסיר משתלה 4 L מלא בתערובת אדמה מזינה (שולחן החומרים).
הערה: מומלץ להשקות מיד כדי למנוע מהשורשים להתייבש.
6. ניקוי ואחסון של מערכת האווירופונית
- כאשר המערכת כבר לא בשימוש, לשטוף עם מים ולנקות עם 70% אתנול או חומר חיטוי אחר.
- הסר את המסנן ממשאבת המים ולשטוף במים כדי להסיר פסולת.
- ייבשו את המערכת על ידי ניגוב עם מגבות נייר או מטלית רחצה.
- מניחים את המשאבה בתוך האמבטיה עם המכסה ומאחסנים אותה עד להזדקק.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
כדי לאמת את היעילות של המערכת האווירופונית המתוארת, סך של 10 ו 12 צילומים בריאים באורך 14 ס"מ נקטעו מצמחי האם, 'יין דובדבן' ו'אדום רובין', בהתאמה (איור 1A, B). לאחר טבילה במדיה אינדוקציה השורשית, שיבוטים הוכנסו למערכת (איור 2A). הבנייה והתפעול של מערכת האווירופונית מוצגות כדיאגרמה סכמטית באיור 2A.
לאחר יומיים של התאקלמות, כל השיבוטים החלו לפתח שורשים ב-3-7 ימים ושורשים מפותחים באורך מלא של 37 ס"מ לאחר 10-14 ימים במערכת, שהספיקה לשתול בסיר מלא בקרקע (איור 2B,D). איור 3 מציג את האורך הממוצע של הצילומים והשורשים של כל מגוון. אורך הירי ואורך השורש נמדדו לפני המעבר לאדמה. אורך הירי והשורשים הממוצע היה 24.8 ס"מ ± 2.4 ס"מ ו-37.8 ס"מ ± 2.5 ס"מ ל'יין דובדבן' ו-21.4 ס"מ ± 2.1 ס"מ ו-39.7 ס"מ ± 5.9 ס"מ ל'אדום רובין', בהתאמה (איור 3A,B). ההבדלים בין שני הזנים נותחו על ידי ANOVA דו כיווני, ואחריו מבחן החמלה המרובה של טוקי, מראה הבדלים משמעותיים בירי ואורכי השורש בין שני הזנים (n = 10-12, p < 0.05).
איור 1: צמח אם בריא שמייצר ירי מרובה להתפשטות כליות. (A) צמחי אם בוגרים, "יין דובדבן" (מלפנים) ו"אדום רובין" (מאחור) ב -4 חודשים של צמיחה וגטטיבית, המציגים יורה רבים אידיאלי להפצה. (ב) אורך משוער (14 ס"מ) לקטע ירי נכון לשיבוט קנאביס. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: הקמת המערכת האווירופונית להפצת כלות קנאביס. (A) תרשים סכמטי הממחיש את רכיבי המערכת האווירופונית (38.1 ס"מ x 25.4 ס"מ x 30.48 ס"מ). (ב) מערכת האווירופונית תפוסה במלואה על ידי שיבוטי "יין דובדבן". (ג) בתוך המערכת האווירופונית עם שיבוטים המציגים צמיחת שורש. (D) צמיחת שורש בריאה בקוביית Rockwool לאחר 10 ימים במערכת האווירופונית. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: מדידות אורך צילומים ואורך השורש עבור "יין דובדבן" ו"אדום רובין" לאחר 10 ימים במערכת השיבוט האווירופונית. (A) טבלת עמודות וטבלת (B) המייצגת את אורך הצילומים והשורש בשני זני קנבוס. ההבדלים באורכות הירי/שורש בין שני זנים נותחו על ידי ANOVA דו-כיווני, ואחריו מבחן ההשוואות המרובות של טוקי. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
עם הביקוש הגובר לצמחי קנאביס עם תוכן קנבינואידים עקבי, שיטות שונות להפצת כליות נוצלו בתעשיית הקנאביס . ההתפשטות הא-מינית מראה מספר יתרונות על פני שיטות מיניות לייצור בקנה מידה גדול ועקבי. מערכת התפשטות האווירופונית היא גרסה מותאמת של מערכת הידרופונית המשתמשת בערפל מים עשיר בחומרים מזינים כדי לספק התפתחות שורש מהירה. המערכת האווירופונית המתוארת מורכבת משלושה שלבים קריטיים, 1) יצירת צמח 'אמא' קנאביס נשי בריא כמקור גנטי לתכונה פיזית/כימית רצויה, 2) חיתוך יורה (מריסמים אפיים) וטיפול עם מדיה אינדוקציה שורש המכיל את מבשר עזר, IBA, ו 3) הסתגלות של התפשטות בסיר הילדים הרצוי.
מערכת ההפצה האווירופונית מאפשרת ייצור יעיל של שיבוטי קנבוס עם יתרונות ברורים על פני שיטות הפצה שונות. זה כולל 1) זמן וחיסכון בעלויות באמצעות פחות עבודה-גרימת עבודה בריא, היווצרות שורש בוגרת ברגע 5 ימים; 2) הומוגניות גנטית - המאפשרת לייצר שיבוטים זהים גנטית, למעט וריאציות גנטיות כלשהן, כדי להתאים למחקר קנאביס לשחזור וליישומי תעשייה; 3) אחידות בפעולות בקנה מידה גדול; ו-4) פחות פגיעות לפתוגנים מיקרוביאליים - שמירה על רמת לחות נמוכה יחסית בחופה העליונה של צמחים מאשר רמת הלחות שנבנתה בתוך המיכל שבו מתרחשת התפתחות השורש.
למרות המערכת האווירופונית מציעה מספר יתרונות, יש כמה מגבלות שהוצגו כי יש לטפל בזהירות במהלך פרקטיקות. ראשית, כמו כל החומרים המזינים מסופקים הידרופוני, זה יכול להיות מזוהם בקלות עם אצות, פטרייתי, ויראלי (למשל, הופ סמוי וירואיד) פתוגנים המובילים את המום של מערכת השורש אשר מקל באמצעות טיפול קבוע של אנטי מיקרוביאלית / פטרייתי / ויראלי סוכנים(ים). שנית, השימוש הנרחב במפעל חד הורית עלול להיות בעייתי למתקני הייצור. לאחר קו שיבוט גנוטיפ יחיד כצמח היחיד במודל הייצור מוביל לסיכון של אובדן יבול שלם אם גנוטיפ זה רגיש למזיק או פתוגן נתון שנמצא במתקן הטיפוח הזה; לכן, מומלץ לשמור על צמחי אם מרובים משושלות מגוונות המשמשות להפצת שיבוטי ייצור עם מערכת שיבוט האווירופונית הזו כדי להגביל את ההפסד הכלכלי מכל מזיק או פתוגן נתון13. מומלץ לגדל צמח אם רק צמח אם במשך לא יותר מ 6 חודשים לפני שיבוט צמח אם חדשה להשתמש כמקור עתידי עבור שיבוטים הייצור. זה מונע שורשים מגודלים שיכולים להוביל צמחים אמא לא בריאה ושיעורי הצלחה שיבוט נמוך יותר, כמו גם חופות מגודלות שיכולות להכיל מזיקים ופתוגנים, אשר עשויים להיות מועברים שיבוטים מופצים.
המערכת האווירופונית ניתנת להרחבה תעשייתית באופן חסכוני. איור 1 מראה כי לפחות 20 חומרים צמחיים יכולים להיות מאוחסנים במיכל אחד (38.1 ס"מ x 25.4 ס"מ x 30.48 ס"מ). ניתן להרחיב את המערכת בקלות כדי להכיל יותר מ -50 צמחים ליחידה מבלי להגדיל את העלויות על מים, חומרים מזינים וחשמל. היתרונות המתוארים כאן לשיטה הנוכחית מספקים סיבה ליישם את מערכת השיבוט האווירופונית לפרקטיקות תעשייתיות ומעבדות מחקר להפצה יעילה ואחידה של קנאביס.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
למחברים אין ניגודי אינטרסים.
Acknowledgments
מחקר זה נתמך על ידי המכון לחקר הקנאביס באוניברסיטת קולורדו סטייט-פואבלו ומשרד המדע וה- ICT (2021-DD-UP-0379), ובעיר צ'ונצ'און (קנבוס מו"פ ותיעוש, 2020-2021), המחברים גם רוצים להודות לג'סטין הנדרסון ב- Summit CBD על התרומה הנדיבה לזרעי "יין דובדבן".
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1-part Fox Farm | Fox Farm | Soil Mix | |
| 1-part Promix | Promix | Soil Mix | |
| 1-part Roots Organic Original | Auora Innovations | Soil Mix | |
| 1-part Wiggle Worm Earth Worm Castings | UNCO Industries | Soil Mix | |
| Algae and Bacterial Cleaning Solution (Clear Rez) | EZ Clone | SKU#: 225 | 8 fl. Oz. |
| Artificial Lighting | AgroBrite | SKU#: 1399 | T5 324W 4' 6-Tube Fixture with Lamps |
| Cannabis Mother plant 1 (Cherry Wine) | Summit CBD | N/A | Donated material |
| Cannabis Mother Plant 2 (Red Wine) | Trilogene | SKU: 0101RR | |
| Corresponding Plastic Lid | Office Depot | N/A | 38.1 cm x 25.4 cm |
| Drill Bit 1 | Dewalt | DW1586 | 38.1 mm spade drill bit |
| Drill Bit 2 | Dewalt | DW1308 | 3.175 mm drill bit |
| Flora/Bloom (Nutrient Solution)-5 mL | General Hydroponics | SKU#: 726 | 946 mL (1 Quart) 2.43 lbs. (1.1 kg) (Available Phosphate 5.0%, Soluble Potash 4.0%, Magnesium 1.5%, Sulfur 1.0%) |
| FloraGrow (Nutrient Solution)- 5 mL | General Hydroponics | SKU#: 724 | 946 mL (1 Quart) 2.43 lbs. (1.1 kg) ((Total Nitrogen 2.0% (0.25% Ammoniacal Nitrogen, 1.75% Nitrate Nitrogen), Available Phosphate 1.0%, Soluble Potash 6.0%, Magnesium 0.5%)) |
| FloraMicro (Nutrient Solution)- 5 mL | General Hydroponics | SKU#: 759 | 946 mL (1 Quart) 2.43 lbs. (1.1 kg) ((Total Nitrogen 5.0% (0.3% Ammoniacal Nitrogen, 4.7% Nitrate Nitrogen), Soluble Potash 1.0%, Calcium 5.0%, Boron 0.01%, Cobalt 0.0005%, Copper 0.01%, Iron 0.1%, Manganese 0.05%, Molybdenum 0.0008%, Zinc 0.015%)) |
| Horticultural Scissors | Shear Perfection | SKU#: 12620 | Platinum Stainless Steel Bonsai Scissors (2.4") |
| Isopropyl Alcohol | Equate | Walmart # 574133562 | 70% concentration |
| Nutrient Mist Solution (Clonex Mist) | Growth Technology | SKU#: 4889 | 10.14 fl. Oz (300 ml) (Total Nitrogen: 5.9 × 10-4 %, Available Phosphate: 4.0 × 10-4 %, Soluble Potash: 5.0 × 10-4 %) |
| pH Down | General Hydroponics | SKU#: 733 | 946 ml (1 Quart) 2.43 lbs. (1.1 kg) |
| pH Up | General Hydroponics | SKU#: 730 | 946 ml (1 Quart) 2.43 lbs. (1.1 kg) |
| Plastic Container | Office Depot | N/A | 38.1 cm x 25.4 cm x 30.48 cm |
| Power Drill | Dewalt | DCD709B | 20-Volt Max ½” Drill |
| Rockwool Cubes | Grodan | SKU#: 830 | 38.1 mm |
| Rooting Solution (Clonex Rooting Gel) | Growth Technology | SKU#: 939 | 3.4 fl. Oz. (100 ml) (Indolebutyric Acid - 0.31%) |
| Statistic Software (Prism) | GraphPad Inc. | ||
| Submersible Water Pump | ActiveAQUA | SKU: AAPW250 | Model: AAPW250, Voltage 120V, Power 16W |
References
- ElSohly, M. A., Radwan, M. M., Gul, W., Chandra, S., Galal, A.
- Cunetti, L., et al. Chronic pain treatment with cannabidiol in kidney transplant patients in Uruguay. Transplantation Proceedings. 50 (2), 461-464 (2018).
- Hausman-Kedem, M., Menascu, S., Kramer, U. Efficacy of CBD-enriched medical cannabis for treatment of refractory epilepsy in children and adolescents - An observational, longitudinal study. Brain & Development. 40 (7), 544-551 (2018).
- Linge, R., et al. Cannabidiol induces rapid-acting antidepressant-like effects and enhances cortical 5-HT/glutamate neurotransmission: role of 5-HT1A receptors. Neuropharmacology. 103, 16-26 (2016).
- Lehmann, C., et al. Experimental cannabidiol treatment reduces early pancreatic inflammation in type 1 diabetes. Clinical Hemorheology and Microcirculation. 64 (4), 655-662 (2016).
- Shannon, S., Lewis, N., Lee, H., Hughes, S. Cannabidiol in anxiety and sleep: A large case series. The Permanente Journal. 23, 18-41 (2019).
- Russo, E. B. History of cannabis and its preparations in saga, science, and sobriquet. Chemistry & Biodiversity. 4 (8), 1614-1648 (2007).
- Vera, C. L., Hanks, A.
- Deventer, M. V. Hot hemp: How high THC levels can ruin a legal hemp harvest. , Available from: https://www.westword.com/marijuana/hot-hemp-how-high-thc-levels-can-ruin-a-legal-hemp-harvest-9963683 (2018).
- Lata, H., Chandra, S., Techen, N., Khan, I. A., ElSohly, M. A. Assessment of the genetic stability of micropropagated plants of Cannabis sativa by ISSR markers. Planta Medica. 76 (1), 97-100 (2010).
- Caplan, D., Dixon, M., Zheng, Y. Optimal rate of organic fertilizer during the flowering stage for Cannabis grown in two coir-based substrates. HortScience. 52 (12), 1796 (2017).
- Monthony, A. S., Page, S. R., Hesami, M., Jones, A. M. P. The past, present and future of Cannabis sativa tissue culture. Plants (Basel). 10 (1), 185 (2021).
- Clarke, R. C., Merlin, M. D. Cannabis domestication, breeding history, present-day genetic diversity, and future prospects. Critical Reviews in Plant Sciences. 35 (5-6), 293-327 (2016).
