Summary
Este protocolo foi projetado para fornecer informações instrucionais para a propagação clonal da Cannabis sativa L. através da implementação de sistemas aeropônicos. O método descrito aqui inclui todos os suprimentos e protocolos necessários para reproduzir com sucesso propriedades morfológicas e químicas desejáveis no gênero Cannabis.
Abstract
Este protocolo descreve a padronização de uma técnica eficiente de propagação clonal do cânhamo utilizando sistemas aeropônicos. As estacas primárias foram extirpadas de duas variedades de cânhamo, denominadas "Cherry Wine" e "Red Robin" (17-20% c/w CBD), que serviram como "planta mãe". Um precursor de auxina (ácido indol-3-butírico) foi aplicado para estimular o desenvolvimento radicular na porção basal dos cortes excisados antes da colocação no sistema. As cortes foram levemente embaçadas com a solução de névoa de nutrientes a cada três dias para fornecer suporte nutricional, pois a solução contém os macronutrientes essenciais, incluindo nitrogênio, fósforo e potássio. O reservatório de água do sistema aeropônico manteve uma faixa de pH entre 5,0-6,0 e uma temperatura de água entre 20-22 °C. Uma bomba de água submersível foi usada para fornecer água para as estacas. As estacas de ponta de ensaio foram fornecidas com 24h de luz por dia durante 10 dias até que ocorreu o desenvolvimento da raiz, sobre o qual as estacas enraizadas foram transplantadas para fins de pesquisa. Estes sistemas aeropônicos provaram gerar resultados desejáveis para a propagação da Cannabis . O método aqui descrito alivia potenciais restrições de tempo que surgem dos métodos tradicionais para permitir um meio mais eficiente para a propagação assexual da Cannabis.
Introduction
Cannabis sativa L. é uma planta anual, dioecious, florido classificada na família Cannabaceae. Os canabinóides, produzidos predominantemente dentro de trichomes glandulares localizados na camada epidérmica externa de tecidos bract em inflorescências femininas1, estão se tornando um tema de pesquisa cada vez mais popular, principalmente devido às suas propriedades medicinais progressivamente reconhecidas. O canabidiol (CBD) é o segundo canabinoide mais proeminente encontrado na Cannabis após Δ9-tetrahidrocanabinol (THC) e é atribuído a uma série de benefícios medicinais, incluindo propriedades analgésicas2, propriedades anticonvulsivas3, propriedades antidepressivos4, reduzindo o risco de diabetes5, e tratando vários distúrbios do sono6. Devido à infinidade de benefícios para a saúde associados aos metabólitos da planta cannabis, há uma demanda crescente por sua produção em escala comercial7. Para atender a essa demanda, os métodos de cultivo estão constantemente sendo aprimorados e reinventados para fornecer continuamente material vegetal consistente e de alta qualidade para a emergente indústria da Cannabis.
A propagação da Cannabis pode ser facilitada de duas formas: reprodução sexual ou assexual. Um exemplo de reprodução sexual é polinizar uma ovula fêmea com pólen da estames masculina resultando em uma semente que pode ser germinada. Germinação de sementes é um método de cultivo confiável que tem sido usado para fins de reprodução e cultivo onde traços fenotípicos desejáveis são selecionados em linhas parentais para melhorar a qualidade das plantas de cannabis da prole, incluindo características como tolerância à seca, resistência a insetos, aumento do rendimento e aumento da potência8 . No entanto, a polinização cruzada não intencional é um risco inerente ao realizar a reprodução sexual, causando descendentes indesejáveis, o que leva à perda potencial de traços desejáveis ou à introdução de traços indesejados. Um exemplo dessa polinização não intencional é destacado pelos produtores de cânhamo que recebem sementes de cânhamo polinizado com pólen produtor de THC, resultando em perda econômica significativa devido às plantas não compatíveis (>0,3% total de THC w/w)9. Além disso, para gerar uma cultura que consiste apenas de fêmeas, uma semente feminizada deve ser semeada em vez de uma semente não feminizada, o que pode levar ao hermafroditismo e outros traços indesejáveis que levam à perda econômica. Para superar a limitação da reprodução sexual da Cannabis, a reprodução assexual tem sido amplamente praticada em modelos de produção comercial da indústria da Cannabis10.
A reprodução assexual da Cannabis requer apenas uma única planta, o que permite a multiplicação de um único genótipo que permite a produção comercial de plantas portadoras de traços agronômicos e farmacêuticos desejáveis. Uma forma comum de reprodução assexual da Cannabis é cortar e inserir pequenas porções de uma planta feminina em um substrato11 sem solo que é coberto por uma cúpula de umidade para induzir a formação de raízes. Embora este método tenha se mostrado bem sucedido, uma desvantagem comum é o acúmulo de um alto nível de umidade (geralmente 80% ou mais) dentro da cúpula, proporcionando um ambiente de crescimento ideal para patógenos fúngicos, que podem ser prejudiciais a novos cortes sensíveis. Outra forma de propagação assexual é a micropropagação utilizando cultura tecidual, onde técnicas estéreis permitem a propagação de material vegetal cannabis livre de insetos e vírus em espaço limitado12. Esse processo, no entanto, é caro, demorado e requer técnicos de laboratório treinados que geralmente são inacessíveis para instalações de Cannabis em larga escala.
Poucos relatórios de pesquisa publicados existem sobre a propagação clonal da Cannabis. Com o objetivo de fornecer uma base para a compreensão da reprodução assexual da Cannabis para fins de pesquisa e produção industrial, este estudo teve como objetivo demonstrar a facilidade e acessibilidade da utilização de sistemas aeropônicos para a propagação clonal da Cannabis. Os sistemas aeropônicos são ideais para a propagação assexual da Cannabis, fornecendo água rica em nutrientes para as estacas, induzindo a formação precoce de raízes em tempo hábil e permitindo que uma planta seja mantida indefinidamente, se necessário.
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Protocol
1. Geração de uma planta mãe para propagação clonal
- Selecione uma planta mãe saudável e feminina que exa exposi de características morfológicas e químicas desejáveis específicas do uso pretendido.
- Permita que a planta mãe atinja o tamanho adequado (cerca de 25 brotos maduros) para propagação clonal (ou seja, cortes).
- Permitir que as plantas-mãe permaneçam no estágio de crescimento vegetativo (luz: escura = 18 h:6 h) para promover o crescimento da filmagem para a propagação futura.
2. Construção e preparação do sistema aeropônico
- Comece posicionando a tampa em cima do recipiente (38,1 cm x 25,4 cm x 30,48 cm). Perfurar o número desejado de orifícios na tampa, proporcionando espaço adequado (preferencialmente 3 cm) entre cada um.
- Posicione a bomba de água (Tabela de Materiais) no centro do recipiente.
- Despeje 7-8 L de água destilada no recipiente para que o bocal da bomba permaneça cerca de 2,5 cm acima da linha d'água.
NOTA: Isso garante que a bomba de água submersível (Tabela de Materiais) seja capaz de empurrar a água com força suficiente para se espalhar pela tampa do recipiente. Recomenda-se água destilada; no entanto, a água da torneira regular também pode ser usada. - Situar a quantidade apropriada de cubos Rockwool (3,81 cm) (Tabela de Materiais) ou cubos de mídia de escolha em cada slot. Ligue a bomba e deixe-a funcionar por 24 h.
NOTA: Os cubos de rockwool são preferidos devido à sua capacidade de "ancoragem" nas estacas recém-enraizadas que ajudam a manter as plantas em pé após o transplante.
3. Selecionar e extirto de fotos apropriadas
- Colete brotos perto do meristem apical usando um bisturi esterilizado ou uma tesoura. As estacas têm ~10 cm de comprimento, idealmente com vários nós.
NOTA: Corte a haste em um ângulo de 45°. Cortar em um ângulo de 45° aumenta a área superficial da porção basal do corte, permitindo mais espaço para o desenvolvimento das raízes. É opcional fazer uma pequena fenda (1-2 cm) no meio do corte de 45° para aumentar ainda mais a área da superfície. - Remova todas as folhagens, exceto folhagens presentes nos três nós superiores.
- Mergulhe o corte recém-extirpado na solução de raiz contendo ácido indol-3-butírico (IBA) (Tabela de Materiais) ~2-5 cm acima da base da haste para ~5 s.
- Insira o corte no centro de um cubo Rockwool posicionado no sistema aeropônico.
NOTA: A profundidade de inserção de corte deve permanecer ~1-2 cm da parte inferior do cubo Rockwool. - Pulverize as estacas não arrancadas com a solução de névoa de nutrientes (Tabela de Materiais) a cada 3 dias.
- Cresça as estacas com 18-24 h de luz por dia com densidade de fluxo de fótons fotossintéticos (PPFD) de 100 μmol/m2/s a 24-29 °C e 40-60% de umidade relativa.
4. Manutenção do sistema aeropônico e saúde propagule
- Reabastecer o sistema com água em pH entre 5,0- 6,0 a cada 2-5 dias.
- Misture levemente as estacas (uma névoa por corte) com a solução de névoa de nutrientes (Tabela de Materiais) a cada 3 dias.
- Adicione 5 mL de cada solução de nutrientes (Tabela de Materiais) ao reservatório a cada 3-5 dias.
NOTA: A adição de nutrientes faz com que a água seja marrom e turva. - Adicione 15 mL da solução de limpeza de algas e bactérias contendo ácido hipocloro (0,028%) por 10 L de água a cada 5 dias (Tabela de Materiais).
5. Propagules transplantados
- Selecione as estacas com raízes longas, brancas e fibrosas.
NOTA: Evite estacas com sistemas radiculares marrons, viscosos e curtos, pois este é um indicador para a presença de podridão radicular e geralmente levará mais tempo para se adaptar ao novo meio em crescimento e pode trazer doenças indesejadas. - Desaloja cuidadosamente o cubo Rockwool do sistema e desembaraça as raízes.
- Transplante de cannabis propagules para 4 L pote de berçário preenchido com uma mistura nutritiva de solo (Tabela de Materiais).
NOTA: A rega imediata é recomendada para evitar que as raízes sequem.
6. Limpeza e armazenamento de sistema aeropônico
- Quando o sistema não estiver mais em uso, lave com água e limpe com 70% de etanol ou outro desinfetante.
- Retire o filtro da bomba de água e enxágue com água para remover os detritos.
- Seque o sistema limpando-o com toalhas de papel ou uma toalha de banho.
- Coloque a bomba dentro da banheira com a tampa ligada e guarde-a até que seja necessária.
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Representative Results
Para validar a eficiência do sistema aeropônico descrito, um total de 10 e 12 brotos saudáveis de 14 cm de comprimento foram extirpados das plantas-mãe, 'Cherry Wine' e 'Red Robin', respectivamente (Figura 1A,B). Depois de mergulhar em mídia de indução de raiz, os clones foram colocados no sistema (Figura 2A). A construção e operação de um sistema aeropônico é mostrada como um diagrama esquemático na Figura 2A.
Após 2 dias de aclimatação, todos os clones começaram a desenvolver raízes em 3-7 dias e desenvolveram raízes de 37 cm de comprimento após 10-14 dias no sistema, o que foi suficiente para ser plantado em um pote cheio de solo (Figura 2B,D). A Figura 3 mostra o comprimento médio das filmagens e raízes de cada variedade. O comprimento do tiro e o comprimento da raiz foram medidos antes da transferência para o solo. O comprimento médio de brotos e raízes foi de 24,8 cm ± 2,4 cm e 37,8 cm ± 2,5 cm para 'Cherry Wine' e 21,4 cm ± 2,1 cm e 39,7 cm ± 5,9 cm para 'Red Robin', respectivamente (Figura 3A,B). As diferenças entre as duas variedades foram analisadas pela ANOVA bidirecional, seguida pelo teste de múltiplas compaixãos de Tukey, não mostrando diferenças significativas nos comprimentos de tiro e raiz entre as duas variedades (n = 10-12, p < 0,05).
Figura 1: Uma planta mãe saudável que gera múltiplos brotos para propagação clonal. (A) Plantas mãe maduras, "Cherry Wine" (frente) e "Red Robin" (costas) com ~4 meses de crescimento vegetativo, exibindo inúmeras filmagens ideais para propagação. (B) Comprimento aproximado (14 cm) para excisão adequada para clonagem de Cannabis. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Estabelecimento do sistema aeropônico para propagação clonal da Cannabis. (A) Diagrama esquemático ilustrando os componentes do sistema aeropônico (38,1 cm x 25,4 cm x 30,48 cm). (B) Sistema aeropônico totalmente ocupado por clones "Cherry Wine". (C) Dentro do sistema aeropônico com clones exibindo crescimento radicular. (D) Crescimento saudável das raízes no cubo Rockwool após 10 dias no sistema aeropônico. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Medidas de ensaio e comprimento de raiz para "Cherry Wine" e "Red Robin" após 10 dias no sistema de clonagem aeropônica. (A) Uma tabela de gráfico de barras e (B) representando o comprimento da filmagem e da raiz nas duas variedades de cânhamo. As diferenças nos comprimentos de tiro/raiz entre duas variedades foram analisadas por ANOVA bidirecional, seguida pelo teste de múltiplas comparações de Tukey. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Com a crescente demanda por plantas de Cannabis com conteúdo consistente de canabinoides, vários métodos de propagação clonal têm sido explorados na indústria da Cannabis . A propagação assexual mostra várias vantagens sobre os métodos sexuais para uma produção consistente em larga escala. Um sistema de propagação aeropônica é uma versão modificada de um sistema hidropônico que utiliza uma névoa de água rica em nutrientes aeradas para proporcionar um rápido desenvolvimento radicular. O sistema aeropônico descrito é composto por três passos críticos, 1) gerando uma planta "mãe" da cannabis feminina saudável como fonte genética para um traço físico/químico desejado, 2) brotos de corte (meristems apical) e tratamento com mídia de indução radicular contendo o precursor da auxina, IBA e 3) aclimatação do propagule no pote de berçário desejado.
O sistema de propagação aeropônica permite a produção eficiente de clones de cânhamo com claras vantagens sobre diferentes métodos de propagação. Inclui 1) tempo e economia de custos através de uma formação radicular saudável e madura menos indutor de mão-de-obra, logo em 5 dias; 2) homogeneidade genética - permitindo produzir clones geneticamente idênticos, excluindo quaisquer variações genéticas, para acomodar pesquisas reprodutíveis de Cannabis e aplicações industriais; 3) uniformidade em operações de grande escala; e 4) menos vulnerabilidade aos patógenos microbianos - mantendo um nível relativamente baixo de umidade no dossel superior das plantas do que o nível de umidade construído dentro do recipiente onde ocorre o desenvolvimento radicular.
Embora o sistema aeropônico ofereça uma série de vantagens, existem algumas limitações apresentadas que devem ser cuidadosamente abordadas durante as práticas. Em primeiro lugar, como todos os nutrientes são fornecidos hidroponicamente, ele pode ser facilmente contaminado com patógenos algas, fúngicos e virais (por exemplo, viróide latente de lúpulo) levando à malformação do sistema radicular que é mitigado através do tratamento regular de agentes antimicrobários/fúngicos/virais. Em segundo lugar, o uso generalizado de uma planta mãe solteira pode ser problemático para as instalações de produção. Ter uma única linha de clones genótipos como a única planta em um modelo de produção leva a um risco de perda total da cultura se esse genótipo estiver suscetível a uma determinada praga ou patógeno que esteja presente naquela instalação de cultivo; assim, recomenda-se manter múltiplas plantas-mãe de diversas linhagens que são utilizadas para propagar clones de produção com este sistema de clonagem aeropônica para limitar a perda econômica de qualquer praga ou patógeno13. É aconselhável cultivar apenas vegetativamente uma planta mãe por não mais de 6 meses antes de clonar uma nova planta-mãe para usar como fonte futura para clones de produção. Isso evita raízes supercultivadas que podem levar a plantas-mãe insalubres e menores taxas de sucesso de clonagem, bem como copas crescidas que podem abrigar pragas e patógenos, que podem ser transmitidos para os clones propagados.
O sistema aeropônico é industrialmente escalável de forma econômica. A Figura 1 mostra que pelo menos 20 materiais vegetais podem ser alojados em um único recipiente (38,1 cm x 25,4 cm x 30,48 cm). O sistema pode ser prontamente dimensionado para abrigar mais de 50 plantas por unidade sem aumentar os custos com água, nutrientes e eletricidade. As vantagens descritas aqui para o método atual fornecem uma razão para implementar o sistema de clonagem aeropônica em práticas industriais e laboratórios de pesquisa para a propagação de cannabis com eficiência temporal e uniforme.
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Disclosures
Os autores não têm conflitos de interesse.
Acknowledgments
Esta pesquisa foi apoiada pelo Instituto de Pesquisa da Cannabis da Universidade do Estado do Colorado-Pueblo e do Ministério da Ciência e TIC (2021-DD-UP-0379), e pela cidade de Chuncheon (Hemp P&D e industrialização, 2020-2021), os autores também desejam agradecer Justin Henderson no Summit CBD pela generosa doação para sementes de "Cherry Wine".
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1-part Fox Farm | Fox Farm | Soil Mix | |
| 1-part Promix | Promix | Soil Mix | |
| 1-part Roots Organic Original | Auora Innovations | Soil Mix | |
| 1-part Wiggle Worm Earth Worm Castings | UNCO Industries | Soil Mix | |
| Algae and Bacterial Cleaning Solution (Clear Rez) | EZ Clone | SKU#: 225 | 8 fl. Oz. |
| Artificial Lighting | AgroBrite | SKU#: 1399 | T5 324W 4' 6-Tube Fixture with Lamps |
| Cannabis Mother plant 1 (Cherry Wine) | Summit CBD | N/A | Donated material |
| Cannabis Mother Plant 2 (Red Wine) | Trilogene | SKU: 0101RR | |
| Corresponding Plastic Lid | Office Depot | N/A | 38.1 cm x 25.4 cm |
| Drill Bit 1 | Dewalt | DW1586 | 38.1 mm spade drill bit |
| Drill Bit 2 | Dewalt | DW1308 | 3.175 mm drill bit |
| Flora/Bloom (Nutrient Solution)-5 mL | General Hydroponics | SKU#: 726 | 946 mL (1 Quart) 2.43 lbs. (1.1 kg) (Available Phosphate 5.0%, Soluble Potash 4.0%, Magnesium 1.5%, Sulfur 1.0%) |
| FloraGrow (Nutrient Solution)- 5 mL | General Hydroponics | SKU#: 724 | 946 mL (1 Quart) 2.43 lbs. (1.1 kg) ((Total Nitrogen 2.0% (0.25% Ammoniacal Nitrogen, 1.75% Nitrate Nitrogen), Available Phosphate 1.0%, Soluble Potash 6.0%, Magnesium 0.5%)) |
| FloraMicro (Nutrient Solution)- 5 mL | General Hydroponics | SKU#: 759 | 946 mL (1 Quart) 2.43 lbs. (1.1 kg) ((Total Nitrogen 5.0% (0.3% Ammoniacal Nitrogen, 4.7% Nitrate Nitrogen), Soluble Potash 1.0%, Calcium 5.0%, Boron 0.01%, Cobalt 0.0005%, Copper 0.01%, Iron 0.1%, Manganese 0.05%, Molybdenum 0.0008%, Zinc 0.015%)) |
| Horticultural Scissors | Shear Perfection | SKU#: 12620 | Platinum Stainless Steel Bonsai Scissors (2.4") |
| Isopropyl Alcohol | Equate | Walmart # 574133562 | 70% concentration |
| Nutrient Mist Solution (Clonex Mist) | Growth Technology | SKU#: 4889 | 10.14 fl. Oz (300 ml) (Total Nitrogen: 5.9 × 10-4 %, Available Phosphate: 4.0 × 10-4 %, Soluble Potash: 5.0 × 10-4 %) |
| pH Down | General Hydroponics | SKU#: 733 | 946 ml (1 Quart) 2.43 lbs. (1.1 kg) |
| pH Up | General Hydroponics | SKU#: 730 | 946 ml (1 Quart) 2.43 lbs. (1.1 kg) |
| Plastic Container | Office Depot | N/A | 38.1 cm x 25.4 cm x 30.48 cm |
| Power Drill | Dewalt | DCD709B | 20-Volt Max ½” Drill |
| Rockwool Cubes | Grodan | SKU#: 830 | 38.1 mm |
| Rooting Solution (Clonex Rooting Gel) | Growth Technology | SKU#: 939 | 3.4 fl. Oz. (100 ml) (Indolebutyric Acid - 0.31%) |
| Statistic Software (Prism) | GraphPad Inc. | ||
| Submersible Water Pump | ActiveAQUA | SKU: AAPW250 | Model: AAPW250, Voltage 120V, Power 16W |
References
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