Summary
Ce protocole est conçu pour fournir des informations pédagogiques pour la propagation clonale de Cannabis sativa L. en mettant en œuvre des systèmes aéroponiques. La méthode décrite ici comprend toutes les fournitures et tous les protocoles nécessaires pour reproduire avec succès les propriétés morphologiques et chimiques souhaitables dans le genre Cannabis.
Abstract
Ce protocole décrit la normalisation d’une technique de propagation clonale efficace du chanvre en utilisant des systèmes aéroponiques. Les boutures de pousses primaires ont été excisées de deux variétés de chanvre, nommées « Cherry Wine » et « Red Robin » (17-20% p / p CBD), qui servaient de « plante mère ». Un précurseur de l’auxine (acide indole-3-butyrique) a été appliqué pour stimuler le développement des racines dans la partie basale des boutures excisées avant leur placement dans le système. Les boutures ont été légèrement brumisées avec la solution de brouillard nutritif tous les trois jours pour fournir un soutien nutritionnel car la solution contient les macronutriments essentiels, y compris l’azote, le phosphore et le potassium. Le réservoir d’eau du système aéroponique maintenait une plage de pH comprise entre 5,0 et 6,0 et une température de l’eau comprise entre 20 et 22 °C. Une pompe à eau submersible a été utilisée pour fournir de l’eau aux boutures. Les boutures de la pointe des pousses ont été alimentées avec 24 heures de lumière par jour pendant 10 jours jusqu’à ce que le développement des racines se produise, sur lequel les boutures enracinées ont été transplantées à des fins de recherche. Ces systèmes aéroponiques se sont avérés générer des résultats souhaitables pour la propagation du cannabis . La méthode décrite ici allège les contraintes de temps potentielles qui découlent des méthodes traditionnelles pour permettre un moyen plus efficace de propagation asexuée du cannabis.
Introduction
Cannabis sativa L. est une plante annuelle à fleurs dioïque classée dans la famille des Cannabaceae. Les cannabinoïdes, produits principalement dans les trichomes glandulaires situés sur la couche épidermique externe des tissus bractétiques sur les inflorescences féminines1, deviennent un sujet de recherche de plus en plus populaire, principalement en raison de leurs propriétés médicinales progressivement reconnues. Le cannabidiol (CBD) est le deuxième cannabinoïde le plus important trouvé dans le cannabis après le Δ9-tétrahydrocannabinol (THC) et est attribué à une foule d’avantages médicinaux, y compris les propriétés analgésiques2, les propriétés antiépileptiques3, les propriétés antidépressives4, la réduction du risque de diabète5 et le traitement de divers troubles du sommeil6. En raison de la multitude d’avantages pour la santé associés aux métabolites de la plante de cannabis, il existe une demande croissante pour sa production à l’échelle commerciale7. Pour répondre à cette demande, les méthodes de culture sont constamment améliorées et réinventées pour fournir en permanence du matériel végétal cohérent et de haute qualité à l’industrie émergente du cannabis.
La propagation du cannabis peut être facilitée de deux façons : la reproduction sexuée ou asexuée. Un exemple de reproduction sexuée est la pollinisation d’un ovule femelle avec le pollen de l’étamine d’un mâle, ce qui donne une graine qui peut germer. La germination des graines est une méthode de culture fiable qui a été utilisée à des fins de sélection et de culture où des traits phénotypiques souhaitables sont sélectionnés dans les lignées parentales pour améliorer la qualité de la progéniture Des plantes de cannabis , y compris des caractéristiques telles que la tolérance à la sécheresse, la résistance aux insectes, l’augmentation du rendement et l’augmentation de la puissance8 . Cependant, la pollinisation croisée involontaire est un risque inhérent lors de la reproduction sexuée, provoquant une progéniture indésirable, ce qui entraîne la perte potentielle de traits souhaitables ou l’introduction de traits indésirables. Un exemple de cette pollinisation involontaire est mis en évidence par les producteurs de chanvre recevant des graines de chanvre pollinisées avec du pollen producteur de THC, ce qui entraîne une perte économique importante en raison des plantes non conformes (>0,3% de THC total p / p) 9. De plus, pour générer une culture composée uniquement de femelles, une graine féminisée doit être semée au lieu d’une graine non féminisée, ce qui peut entraîner un hermaphrodisme et d’autres traits indésirables entraînant une perte économique. Pour surmonter la limitation de la reproduction sexuée du cannabis, la reproduction asexuée a été largement pratiquée dans les modèles de production commerciale de l’industrie du cannabis10.
La reproduction asexuée du cannabis ne nécessite qu’une seule plante, ce qui permet la multiplication d’un seul génotype qui permet la production commerciale de plantes portant des caractères agronomiques et pharmaceutiques souhaitables. Une forme courante de reproduction asexuée du cannabis consiste à couper et à insérer de petites portions d’une plante femelle dans un substrat sans sol11 qui est recouvert d’un dôme d’humidité pour induire la formation de racines. Bien que cette méthode se soit avérée efficace, un inconvénient commun est l’accumulation d’un niveau élevé d’humidité (généralement 80% ou plus) à l’intérieur du dôme, offrant un environnement de croissance idéal pour les agents pathogènes fongiques, ce qui peut nuire aux nouvelles boutures sensibles. Une autre forme de propagation asexuée est la micropropagation par culture tissulaire, où des techniques stériles permettent la propagation de matériel végétal de cannabis exempt d’insectes, de microbes et de virus dans un espace limité12. Ce processus, cependant, est coûteux, prend beaucoup de temps et nécessite des techniciens de laboratoire formés qui sont généralement inaccessibles pour les installations de cannabis à grande échelle.
Il existe très peu de rapports de recherche publiés sur la propagation clonale du cannabis. Afin de fournir une base pour la compréhension de la reproduction asexuée du cannabis à des fins de recherche et de production industrielle, cette étude visait à démontrer la facilité et l’accessibilité de l’utilisation de systèmes aéroponiques pour la propagation clonale du cannabis. Les systèmes aéroponiques sont idéaux pour la propagation asexuée du cannabis, fournissant constamment de l’eau riche en nutriments aux boutures, induisant la formation précoce de racines en temps opportun et permettant à une plante d’être maintenue indéfiniment si nécessaire.
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Protocol
1. Génération d’une plante mère pour la multiplication clonale
- Choisissez une plante mère femelle en bonne santé qui présente des caractéristiques morphologiques et chimiques souhaitables spécifiques à son utilisation prévue.
- Permettre à la plante mère d’atteindre la taille appropriée (environ 25 pousses matures) pour la propagation clonale (c.-à-d. boutures).
- Laissez les plantes mères rester au stade de croissance végétative (clair: sombre = 18 h: 6 h) pour favoriser la croissance des pousses pour la propagation future.
2. Construction et préparation du système aéroponique
- Commencez par positionner le couvercle sur le dessus du récipient (38,1 cm x 25,4 cm x 30,48 cm). Percez le nombre de trous souhaité dans le couvercle tout en offrant un espace suffisant (de préférence 3 cm) entre chacun.
- Placez la pompe à eau (Table des matériaux) au centre du récipient.
- Versez 7 à 8 L d’eau distillée dans le récipient afin que la buse de la pompe reste à environ 2,5 cm au-dessus de la ligne de flottaison.
REMARQUE: Cela garantit que la pompe à eau submersible (table des matériaux) est capable de pousser l’eau avec suffisamment de force pour se propager sur le couvercle du conteneur. L’eau distillée est recommandée; cependant, l’eau du robinet régulière peut également être utilisée. - Situez la quantité appropriée de cubes de laine de roche (3,81 cm) (table des matériaux) ou de cubes de média de votre choix dans chaque fente. Allumez la pompe et laissez-la fonctionner pendant 24 h.
REMARQUE: Les cubes de laine de roche sont préférés en raison de leur capacité d’ancrage sur les boutures nouvellement enracinées qui aident à garder les plantes debout après la transplantation.
3. Sélection et excision des pousses appropriées
- Recueillir les pousses près du méristème apical à l’aide d’un scalpel ou d’un ciseau stérilisé. Les boutures mesurent environ 10 cm de long, idéalement avec plusieurs nœuds.
REMARQUE: Coupez la tige à un angle de 45 °. La coupe à un angle de 45° augmente la surface de la partie basale de la coupe, ce qui permet plus d’espace pour le développement des racines. Il est facultatif de faire une petite fente (1-2 cm) au milieu de la coupe à 45 ° pour augmenter encore la surface. - Enlevez tout le feuillage à l’exception du feuillage présent sur les trois nœuds supérieurs.
- Trempez la bouture nouvellement excisée dans la solution d’enracinement contenant de l’acide indole-3-butyrique (IBA) (Table des matériaux) ~ 2-5 cm de la base de la tige pendant ~ 5 s.
- Insérez la découpe au centre d’un cube Rockwool positionné dans le système aéroponique.
REMARQUE: La profondeur d’insertion de coupe doit rester à environ 1-2 cm du fond du cube Rockwool. - Vaporiser les boutures non enracinées avec la solution de brouillard nutritif (Table des matériaux) tous les 3 jours.
- Cultivez les boutures avec 18-24 h de lumière par jour avec une densité de flux de photons photosynthétiques (PPFD) de 100 μmol/m2/s à 24-29 °C et 40-60% d’humidité relative.
4. Maintenance du système aéroponique et santé des propagules
- Reconstituez le système avec de l’eau à un pH compris entre 5,0 et 6,0 tous les 2 à 5 jours.
- Vaporisez légèrement les boutures (un brouillard par coupe) avec la solution de brouillard nutritif (Table des matières) tous les 3 jours.
- Ajouter 5 mL de chaque solution nutritive (table des matières) au réservoir tous les 3 à 5 jours.
REMARQUE: L’ajout de nutriments rend l’eau brune et trouble. - Ajouter 15 mL de la solution nettoyante pour algues et bactéries contenant de l’acide hypochloreux (0,028 %) par 10 L d’eau tous les 5 jours (Tableau des matières).
5. Transplantation de propagules
- Sélectionnez les boutures avec de longues racines blanches et fibreuses.
REMARQUE: Évitez les boutures avec des systèmes racinaires bruns, visqueux et courts, car il s’agit d’un indicateur de la présence de pourriture des racines et prendra généralement plus de temps à s’acclimater au nouveau milieu de culture et peut entraîner des maladies indésirables. - Délogez soigneusement le cube Rockwool du système et démêlez les racines.
- Transplantez les propagules de cannabis dans un pot de pépinière de 4 L rempli d’un mélange de sol nutritif (table des matériaux).
REMARQUE: Il est recommandé d’arroser immédiatement pour éviter que les racines ne se dessèchent.
6. Nettoyage et stockage du système aéroponique
- Lorsque le système n’est plus utilisé, laver à l’eau et nettoyer avec de l’éthanol à 70% ou un autre désinfectant.
- Retirez le filtre de la pompe à eau et rincez à l’eau pour éliminer les débris.
- Séchez le système en l’essuyant avec des serviettes en papier ou un gant de toilette.
- Placez la pompe à l’intérieur de la baignoire avec le couvercle et rangez-la jusqu’à ce qu’elle soit nécessaire.
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Representative Results
Pour valider l’efficacité du système aéroponique décrit, un total de 10 et 12 pousses saines de 14 cm de long ont été excisées des plantes mères, « Cherry Wine » et « Red Robin », respectivement (Figure 1A, B). Après avoir plongé dans un milieu d’induction d’enracinement, les clones ont été placés dans le système (Figure 2A). La construction et le fonctionnement d’un système aéroponique sont représentés sous la forme d’un diagramme schématique à la figure 2A.
Après 2 jours d’acclimatation, tous les clones ont commencé à développer des racines en 3 à 7 jours et des racines complètement développées de 37 cm de long après 10 à 14 jours sur le système, ce qui était suffisant pour être planté dans un pot rempli de terre (Figure 2B, D). La figure 3 montre la longueur moyenne des pousses et des racines de chaque variété. La longueur des pousses et la longueur des racines ont été mesurées avant d’être transférées au sol. La longueur moyenne des pousses et des racines était de 24,8 cm ± 2,4 cm et 37,8 cm ± 2,5 cm pour le « vin de cerise » et 21,4 cm ± 2,1 cm et 39,7 cm ± 5,9 cm pour le « rouge-gorge », respectivement (figure 3A, B). Les différences entre les deux variétés ont été analysées par ANOVA bidirectionnelle, suivie du test de compassions multiples de Tukey, ne montrant aucune différence significative dans la longueur des pousses et des racines entre les deux variétés (n = 10-12, p < 0,05).
Figure 1 : Plante mère en bonne santé qui génère plusieurs pousses pour la propagation clonale. (A) Plantes mères matures, « Cherry Wine » (devant) et « Red Robin » (arrière) à ~ 4 mois de croissance végétative, présentant de nombreuses pousses idéales pour la propagation. (B) Longueur approximative (14 cm) pour une excision de pousse appropriée pour le clonage du cannabis. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Mise en place du système aéroponique pour la propagation clonale du cannabis. (A) Schéma illustrant les composants du système aéroponique (38,1 cm x 25,4 cm x 30,48 cm). (B) Système aéroponique entièrement occupé par des clones de « Cherry Wine ». (C) À l’intérieur du système aéroponique avec des clones présentant une croissance racinaire. (D) Croissance saine des racines dans le cube de laine de roche après 10 jours dans le système aéroponique. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Mesures de la longueur des pousses et des racines pour « Cherry Wine » et « Red Robin » après 10 jours dans le système de clonage aéroponique. (A) Un graphique à barres et (B) un tableau représentant la longueur de la pousse et de la racine dans les deux variétés de chanvre. Les différences de longueur des pousses et des racines entre deux variétés ont été analysées par aNOVA bidirectionnelle, suivie du test de comparaisons multiples de Tukey. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
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Discussion
Avec la demande croissante de plantes de cannabis avec une teneur constante en cannabinoïdes, diverses méthodes de propagation clonale ont été exploitées dans l’industrie du cannabis . La propagation asexuée montre plusieurs avantages par rapport aux méthodes sexuelles pour une production à grande échelle et cohérente. Un système de propagation aéroponique est une version modifiée d’un système hydroponique qui utilise un brouillard d’eau aéré riche en nutriments pour assurer un développement rapide des racines. Le système aéroponique décrit est composé de trois étapes critiques, 1) la génération d’une plante femelle « mère » de cannabis en bonne santé comme source génétique d’un trait physique / chimique souhaité, 2) la coupe des pousses (méristèmes apicaux) et le traitement avec un milieu d’induction racinaire contenant le précurseur de l’auxine, l’IBA, et 3) l’acclimatation de la propagule dans le pot de pépinière souhaité.
Le système de propagation aéroponique permet la production efficace de clones de chanvre avec des avantages évidents par rapport aux différentes méthodes de propagation. Il comprend 1) des économies de temps et d’argent grâce à une formation de racines saines et matures moins propices à la main-d’œuvre dès 5 jours; 2) homogénéité génétique - permettant de produire des clones génétiquement identiques, à l’exclusion de toute variation génétique, pour permettre la recherche reproductible sur le cannabis et les applications de l’industrie; 3) l’uniformité des opérations à grande échelle; et 4) moins de vulnérabilité aux agents pathogènes microbiens - maintenir un niveau d’humidité relativement faible dans la canopée supérieure des plantes que le niveau d’humidité construit à l’intérieur du récipient où se produit le développement des racines.
Bien que le système aéroponique offre un certain nombre d’avantages, il y a quelques limites présentées qui devraient être soigneusement abordées lors des pratiques. Tout d’abord, comme tous les nutriments sont fournis en hydroponie, ils peuvent être facilement contaminés par des agents pathogènes algales, fongiques et viraux (par exemple, le viroïde latent du houblon), ce qui entraîne une malformation du système racinaire qui est atténuée par un traitement régulier des agents antimicrobiens/ fongiques/viraux. Deuxièmement, l’utilisation généralisée d’une plante mère unique peut être problématique pour les installations de production. Le fait d’avoir une seule lignée de clones de génotype comme seule plante dans un modèle de production entraîne un risque de perte de récolte entière si ce génotype est sensible à un organisme nuisible ou à un agent pathogène donné présent dans cette installation de culture; ainsi, il est recommandé de maintenir plusieurs plantes mères de diverses lignées qui sont utilisées pour propager des clones de production avec ce système de clonage aéroponique afin de limiter les pertes économiques d’un ravageur ou d’un agent pathogène donné13. Il est conseillé de ne cultiver végétativement une plante mère que pendant 6 mois au maximum avant de cloner une nouvelle plante mère pour l’utiliser comme future source de clones de production. Cela empêche les racines envahies par la végétation qui peuvent conduire à des plantes mères malsaines et à des taux de réussite de clonage inférieurs, ainsi que les canopées envahies par la végétation qui peuvent abriter des parasites et des agents pathogènes, qui peuvent être transmis aux clones multipliés.
Le système aéroponique est industriellement évolutif de manière rentable. La figure 1 montre qu’au moins 20 matières végétales peuvent être logées dans un seul récipient (38,1 cm x 25,4 cm x 30,48 cm). Le système peut être facilement mis à l’échelle pour contenir plus de 50 plantes par unité sans augmenter les coûts en eau, en nutriments et en électricité. Les avantages décrits ici pour la méthode actuelle fournissent une raison de mettre en œuvre le système de clonage aéroponique dans les pratiques de l’industrie et les laboratoires de recherche pour la propagation rapide et uniforme du cannabis.
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Disclosures
Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts.
Acknowledgments
Cette recherche a été soutenue par l’Institut de recherche sur le cannabis de la Colorado State University-Pueblo et le ministère des Sciences et des TIC (2021-DD-UP-0379), et Chuncheon City (R & D et industrialisation du chanvre, 2020-2021), Les auteurs souhaitent également remercier Justin Henderson à Summit CBD pour le don généreux pour les graines de « Cherry Wine ».
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1-part Fox Farm | Fox Farm | Soil Mix | |
| 1-part Promix | Promix | Soil Mix | |
| 1-part Roots Organic Original | Auora Innovations | Soil Mix | |
| 1-part Wiggle Worm Earth Worm Castings | UNCO Industries | Soil Mix | |
| Algae and Bacterial Cleaning Solution (Clear Rez) | EZ Clone | SKU#: 225 | 8 fl. Oz. |
| Artificial Lighting | AgroBrite | SKU#: 1399 | T5 324W 4' 6-Tube Fixture with Lamps |
| Cannabis Mother plant 1 (Cherry Wine) | Summit CBD | N/A | Donated material |
| Cannabis Mother Plant 2 (Red Wine) | Trilogene | SKU: 0101RR | |
| Corresponding Plastic Lid | Office Depot | N/A | 38.1 cm x 25.4 cm |
| Drill Bit 1 | Dewalt | DW1586 | 38.1 mm spade drill bit |
| Drill Bit 2 | Dewalt | DW1308 | 3.175 mm drill bit |
| Flora/Bloom (Nutrient Solution)-5 mL | General Hydroponics | SKU#: 726 | 946 mL (1 Quart) 2.43 lbs. (1.1 kg) (Available Phosphate 5.0%, Soluble Potash 4.0%, Magnesium 1.5%, Sulfur 1.0%) |
| FloraGrow (Nutrient Solution)- 5 mL | General Hydroponics | SKU#: 724 | 946 mL (1 Quart) 2.43 lbs. (1.1 kg) ((Total Nitrogen 2.0% (0.25% Ammoniacal Nitrogen, 1.75% Nitrate Nitrogen), Available Phosphate 1.0%, Soluble Potash 6.0%, Magnesium 0.5%)) |
| FloraMicro (Nutrient Solution)- 5 mL | General Hydroponics | SKU#: 759 | 946 mL (1 Quart) 2.43 lbs. (1.1 kg) ((Total Nitrogen 5.0% (0.3% Ammoniacal Nitrogen, 4.7% Nitrate Nitrogen), Soluble Potash 1.0%, Calcium 5.0%, Boron 0.01%, Cobalt 0.0005%, Copper 0.01%, Iron 0.1%, Manganese 0.05%, Molybdenum 0.0008%, Zinc 0.015%)) |
| Horticultural Scissors | Shear Perfection | SKU#: 12620 | Platinum Stainless Steel Bonsai Scissors (2.4") |
| Isopropyl Alcohol | Equate | Walmart # 574133562 | 70% concentration |
| Nutrient Mist Solution (Clonex Mist) | Growth Technology | SKU#: 4889 | 10.14 fl. Oz (300 ml) (Total Nitrogen: 5.9 × 10-4 %, Available Phosphate: 4.0 × 10-4 %, Soluble Potash: 5.0 × 10-4 %) |
| pH Down | General Hydroponics | SKU#: 733 | 946 ml (1 Quart) 2.43 lbs. (1.1 kg) |
| pH Up | General Hydroponics | SKU#: 730 | 946 ml (1 Quart) 2.43 lbs. (1.1 kg) |
| Plastic Container | Office Depot | N/A | 38.1 cm x 25.4 cm x 30.48 cm |
| Power Drill | Dewalt | DCD709B | 20-Volt Max ½” Drill |
| Rockwool Cubes | Grodan | SKU#: 830 | 38.1 mm |
| Rooting Solution (Clonex Rooting Gel) | Growth Technology | SKU#: 939 | 3.4 fl. Oz. (100 ml) (Indolebutyric Acid - 0.31%) |
| Statistic Software (Prism) | GraphPad Inc. | ||
| Submersible Water Pump | ActiveAQUA | SKU: AAPW250 | Model: AAPW250, Voltage 120V, Power 16W |
References
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