Summary
이 프로토콜은 에어로포닉 시스템을 구현하여 대마초 사티 바이 A L.의 복제 전파에 대한 교육 정보를 제공하도록 설계되었습니다. 여기에 설명 된 방법은 성공적으로 속 대마초에서 바람직한 형태학적 및 화학 적 특성을 재현하기 위해 필요한 모든 공급 및 프로토콜을 포함한다.
Abstract
이 프로토콜은 에어로포닉 시스템을 활용하여 대마의 효율적인 복제 전파 기술의 표준화를 설명합니다. 1차 촬영 절단은 '체리 와인'과 '레드 로빈'(17-20%w/w CBD)이라는 이름의 두 대마 품종에서 제외되었으며, 이는 '어머니 식물'로 사용되었습니다. 보조 전구체(indole-3-butyric acid)는 시스템에 배치되기 전에 절제된 절단의 기저 부에서 루트 개발을 자극하기 위해 적용되었다. 절삭은 질소, 인 및 칼륨을 포함한 필수 다량 영양소를 함유하고 있기 때문에 영양 지원을 제공하기 위해 3일마다 영양 미스트 용액으로 가볍게 미스트되었습니다. 에어로포닉 시스템 물 저수지는 5.0-6.0 사이의 pH 범위와 20-22 °C 사이의 수온을 유지했다. 잠수정 워터 펌프는 절단에 물을 전달하는 데 사용되었다. 촬영 팁 절단은 뿌리 발달이 발생할 때까지 10 일 동안 하루에 24 시간의 빛을 제공했으며, 뿌리 절단은 연구 목적으로 이식되었습니다. 이러한 에어로포닉 시스템은 대마초 전파에 대한 바람직한 결과를 생성하는 것으로 입증되었습니다. 여기에 설명 된 방법은 대마초의 무성 전파에 대한 보다 효율적인 수단을 허용하는 전통적인 방법에서 발생하는 잠재적 인 시간 제약을 완화합니다.
Introduction
대마초 사티바 L. 가족 칸나비세아에 분류 된 연간, 디오이시, 꽃 식물입니다. 칸 나비 노이드, 여성 꽃에 브랙트 조직의 외부 표피 층에 위치한 선 트리홈 내에서 주로 생산1, 점점 더 인기있는 연구 주제되고있다, 주로 때문에 그들의 점진적으로 인식 약용 속성. 칸 나비 디올 (CBD)은 Δ9-tetrahydrocannabinol (THC) 후 대마초에서 발견 되는 두 번째로 가장 눈에 띄는 칸 나비 노이드이며 진통 특성2, 발작 방지 속성3, 항우울제 속성4, 당뇨병의 위험을 감소시키고 다양한 수면 장애 6을 치료하는 등 의약 적 이점에 기인한다. 때문에 대마초 공장의 대사 산물과 관련된 의료 혜택의 무리로, 상업 규모의 생산에 대한 수요가 증가하고있다7. 이러한 수요를 충족하기 위해 재배 방법은 지속적으로 개선되고 신흥 대마초 산업에 일관되고 고품질의 식물 재료를 지속적으로 공급하기 위해 재창조되고 있습니다.
대마초의 전파는 두 가지 방법으로 촉진 될 수있다 : 성적 또는 무성 생식. 성적 번식의 예는 발아 될 수있는 씨앗의 결과로 남성의 stamen에서 꽃가루로 여성 배란을 수분하는 것입니다. 종자 발아는 가뭄 내성, 곤충 저항, 수율 증가 및 효능 증가와 같은 특성을 포함하여 자손 대마초 식물의 품질을 향상시키기 위해 부모 라인에서 바람직한 표현 특성을 선택하여 사육 및 재배 목적으로 사용되어 온 신뢰할 수있는 재배 방법입니다8 . 그러나 의도하지 않은 교차 수분은 성적 번식을 수행 할 때 본질적인 위험이며 바람직하지 않은 자손을 일으켜 바람직한 특성의 잠재적 손실이나 원치 않는 특성의 도입으로 이어집니다. 이러한 의도하지 않은 수분의 예는 THC-생산 꽃가루로 수분된 대마 씨를 받는 대마 재배자가 부적합 식물(>0.3%의 총 THC w/w)9로 인해 상당한 경제적 손실을 초래하는 것으로 강조된다. 또한 여성으로만 구성된 작물을 생성하려면 여성화 된 씨앗대신 여성화 된 씨앗을 파종해야하며, 이는 hermaphroditism 및 경제적 손실로 이어지는 다른 바람직하지 않은 특성으로 이어질 수 있습니다. 대마초의 성적 번식의 한계를 극복하기 위해, 무성 생식은 널리 대마초 산업의 상업 생산 모델에서 실행되고있다10.
대마초의 무성 재생은 바람직한 농업 및 제약 특성을 운반하는 식물의 상업적 생산을 허용하는 단일 유전자형의 곱셈을 허용하는 단일 식물을 필요로한다. 무성 대마초 재생의 일반적인 형태는 절단하고 뿌리 형성을 유도하는 습도 돔에 의해 덮여 토양없는 기판에 여성 식물의 작은 부분을 삽입하는 것입니다. 이 방법이 성공을 입증했지만, 일반적인 단점은 돔 내부에 높은 수준의 습도 (일반적으로 80 % 이상)의 축적이며, 새롭고 민감한 절단에 해로울 수있는 곰팡이 병원균에 이상적인 성장 환경을 제공합니다. 무성 전파의 또 다른 형태는 조직 배양을 이용한 미세 전파로, 멸균 기술은 제한된 공간에서 곤충, 미생물 및 바이러스가 없는 대마초 식물 물질의 전파를 허용합니다12. 그러나 이 과정은 비용이 많이 들고 시간이 많이 소요되며 대규모 대마초 시설에 일반적으로 접근 할 수없는 숙련 된 실험실 기술자가 필요합니다.
대마초의 복제 전파에 게시 된 연구 보고서는 거의 없습니다. 연구 목적과 산업 생산을위한 대마초의 무성 생식의 이해를위한 기초를 제공하기 위해,이 연구는 대마초의 복제 전파를위한 에어로 포닉 시스템을 사용하는 용이성과 접근성을 입증하는 것을 목표로. Aeroponic 시스템은 대마초의 무성 전파에 이상적입니다, 지속적으로 절단에 영양이 풍부한 물을 공급, 적시에 초기 뿌리 형성을 유도, 필요한 경우 무기한 유지 될 식물을 허용.
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Protocol
1. 복제 전파를 위한 모성 식물의 생성
- 의도한 용도에 맞는 바람직한 형태학적 및 화학적 특성을 나타내는 건강한 여성 어머니 식물을 선택하십시오.
- 모성 식물이 복제 전파(즉, 절단)에 적합한 크기(약 25개의 성숙한 싹)에 도달할 수 있도록 허용합니다.
- 어머니 식물이 식물 성장 단계 (빛 : 어두운 = 18 h:6 h)에 남아 미래의 전파를위한 촬영 성장을 촉진 할 수 있습니다.
2. 에어로포닉 시스템의 건설 및 준비
- 먼저 뚜껑을 용기 위에 배치하여(38.1cm x 25.4cm x 30.48 cm). 각각의 적절한 공간(바람직하게는 3cm)을 제공하면서 원하는 수의 구멍을 뚜껑에 드릴링합니다.
- 용기의 중앙에 물 펌프(재료 표)를 배치합니다.
- 펌프 노즐이 수로 위 약 2.5cm까지 유지되도록 7-8 L의 증류수를 용기에 붓습니다.
참고: 이것은 잠수정 워터 펌프(재료 테이블)가 용기 뚜껑을 가로질러 퍼질 수 있는 충분한 힘으로 물을 밀어낼 수 있도록 합니다. 증류수를 권장합니다. 그러나 일반 수돗물도 사용될 수 있습니다. - 각 슬롯에 선택한 록울 큐브(3.81cm) 또는 미디어 큐브의 적당량을 배치합니다. 펌프를 켜고 24시간 동안 실행되도록 합니다.
참고: Rockwool 큐브는 이식 후 식물을 똑바로 유지하는 데 도움이되는 새로 뿌리를 둔 절단에 대한 "앵커링"능력으로 인해 선호됩니다.
3. 적절한 촬영 선택 및 절제
- 멸균 된 메스 또는 가위를 사용하여 정물 메리 스템 근처에서 촬영을 수집합니다. 절단은 길이가 ~10cm이며 여러 노드가 이상적입니다.
참고: 줄기를 45° 각도로 자른다. 45° 각도로 절단하면 절단기의 기저 부분의 표면적을 증가시켜 뿌리 개발을 위한 더 많은 공간을 확보할 수 있습니다. 45° 절단 된 중간에 작은 슬릿 (1-2cm)을 만들어 표면적을 더욱 증가시키는 것이 선택 사항입니다. - 상위 3개 노드에 있는 단풍을 제외한 모든 단풍을 제거합니다.
- 새로 절제된 절단을 인돌-3-부티르산(IBA)(재료표)을 포함하는 뿌리용액에 담그면 ~5s의 줄기 기저에서 ~2-5cm 위로 올려보세요.
- 에어로포닉 시스템에 위치한 Rockwool 큐브의 중앙에 절단을 삽입합니다.
참고: 절삭 삽입 깊이는 Rockwool 큐브의 바닥에서 ~ 1-2cm를 유지하는 것입니다. - 3일마다 영양 미스트 용액(재료 표)으로 뿌리 뽑지 않은 절단을 스프레이합니다.
- 24-29°C및 40-60%의 상대 습도에서 100 μmol/m2/s의 광합성 광자 플럭스 밀도(PPFD)로 하루에 18-24h의 빛으로 커팅을 성장시다.
4. 에어로포닉 시스템 유지 보수 및 프로파굴 건강
- 2-5일마다 5.0-6.0 사이의 pH로 시스템을 보충합니다.
- 3일마다 영양 미스트 용액(재료 표)으로 커팅(절단당 하나의 안개)을 가볍게 미스트합니다.
- 3-5일마다 각 영양소 용액(재료 표)을 5mL를 저수지에 넣습니다.
참고: 영양 첨가로 인해 물이 갈색이고 어두워지게 됩니다. - 5일마다 10L의 물당 고압산(0.028%)을 함유한 조류 및 박테리아 세정용15mL을 추가합니다(재료의 표).
5. 프로파굴스 이식
- 길고 흰색의 섬유질 뿌리로 절단을 선택합니다.
참고: 갈색, 끈적끈적한, 짧은 뿌리 시스템으로 절단을 피하는 것은 뿌리 부패의 존재를 나타내는 지표이며 일반적으로 새로운 성장하는 매체에 적응하는 데 시간이 오래 걸리며 원치 않는 질병을 가져올 수 있기 때문에. - 조심스럽게 시스템에서 록울 큐브를 빼내고 뿌리를 풀고 있습니다.
- 영양가 있는 토양 믹스(재료표)로 채워진 4L 보육냄비에 대마초 프로파고를 이식합니다.
참고: 뿌리가 건조되는 것을 방지하기 위해 즉시 물을 받는 것이 좋습니다.
6. 에어로포닉 시스템의 청소 및 보관
- 시스템이 더 이상 사용되지 않는 경우 물로 씻고 70 % 에탄올 또는 다른 소독제로 청소하십시오.
- 물 펌프에서 필터를 제거하고 이물질을 제거하기 위해 물로 헹구는.
- 종이 타월이나 수건으로 닦아 시스템을 건조시다.
- 펌프를 욕조 안에 뚜껑을 닫고 필요할 때까지 보관합니다.
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Representative Results
설명된 에어로포닉 시스템의 효율성을 검증하기 위해, 모성 식물인 '체리 와인'과 '레드 로빈'에서 총 10~ 12cm의 건강한 14cm 길이의 촬영이 각각 소비되었다(그림 1A, B). 유도 매체를 뿌리 뽑은 후 클론을 시스템에 배치하였다(그림 2A). 에어로포닉 시스템의 시공 및 작동은 도 2A에서 회로도다이어그램으로 표시됩니다.
2일 간의 적응 후, 모든 클론은 3-7일 만에 뿌리를 개발하기 시작했고, 10-14일 후 37cm의 뿌리를 완전히 개발하여 토양이 채워진 냄비에 심기에 충분했다(도 2B,D). 그림 3은 각 품종의 평균 촬영 길이와 뿌리를 나타낸다. 촬영 길이와 루트 길이는 토양으로 이송하기 전에 측정되었다. 평균 촬영 길이는 24.8cm ± 2.4cm, 37.8cm ± '체리 와인'의 경우 2.5cm, '체리 와인'의 경우 2.4cm ±, ± 2.1cm, ± 39.7cm였다(그림 3A,B). 두 품종의 차이는 양방향 ANOVA에 의해 분석되었고, 투키의 여러 연민 테스트에 이어 두 품종(n = 10-12, p < 0.05)의 촬영 및 루트 길이에 큰 차이가 없음을 보여 주었다.
그림 1: 복제 전파를 위해 여러 번 싹을 생성하는 건강한 모성 식물입니다. (A) 성숙한 어머니 식물, "체리 와인"(앞) 및 "레드 로빈"(뒤로)은 ~ 4개월의 식물 성장을 통해 전파에 이상적인 수많은 촬영을 선보이고 있습니다. (B) 대마초 복제에 대한 적절한 촬영 절제를위한 대략적인 길이 (14cm ). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2 : 대마초 복제 전파를위한 에어로 포닉 시스템의 설립. (A) 에어로포닉 시스템의 구성 요소를 보여주는 회로도(38.1cm x 25.4 cm x 30.48 cm). (B) "체리 와인" 클론이 완전히 점유한 에어로포닉 시스템. (C) 뿌리 성장을 나타내는 클론이있는 에어로포닉 시스템 내부. (D) 에어로포닉 시스템에서 10일 후 록울 큐브의 건강한 뿌리 성장. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 에어로포닉 복제 시스템에서 10일 후에 "체리 와인"과 "레드 로빈"에 대한 촬영 및 루트 길이 측정. (A) 두 대마 품종의 촬영 및 뿌리 길이를 나타내는 막대 그래프 및 (B) 테이블. 두 품종 간의 촬영/루트 길이의 차이는 양방향 ANOVA로 분석되었으며 Tukey의 여러 비교 테스트가 뒤따랐습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
일관된 카나비노이드 콘텐츠와 대마초 식물에 대한 수요가 증가함에 따라 대마초 산업에서 다양한 복제 전파 방법이 악용되었습니다. 무성 전파는 대규모, 일관된 생산을위한 성적 방법에 비해 몇 가지 장점을 보여줍니다. 에어로포닉 전파 시스템은 급속한 뿌리 개발을 제공하기 위해 양분이 풍부한 물 미스트를 활용하는 수경 시스템의 수정된 버전입니다. 설명된 에어로포닉 시스템은 3개의 중요한 단계로 구성되며, 1) 건강한 여성 대마초 '어머니' 식물을 원하는 물리적/화학적 특성에 대한 유전적 원천으로 생성하고, 2) 절단 촬영(apical meristems) 및 원하는 냄비에 대한 보조 전구체, IBA 및 3)의 보조 전구체를 포함하는 뿌리 유도 매체로 치료한다.
에어로포닉 전파 시스템은 다른 전파 방법에 비해 명확한 이점을 가진 대마 클론의 효율적인 생산을 허용합니다. 그것은 포함 1) 적은 노동 유도 건강 한 통해 시간 및 비용 절감, 성숙 한 루트 형성 즉시 5 일; 2) 유전 균질성 - 재현 대마초 연구 및 산업 응용 프로그램을 수용하기 위해 유전 적 변이를 제외하고 유전적으로 동일한 클론을 생성 할 수 있습니다. 3) 대규모 작업의 균일성; 및 4) 미생물 병원체에 대한 취약성이 적다 - 뿌리 발달이 발생하는 용기 내부에 내장 된 습도 수준보다 식물의 상부 캐노피에서 습도의 상대적으로 낮은 수준을 유지.
에어로포닉 시스템은 여러 가지 장점을 제공하지만, 연습 중에 신중하게 해결해야 하는 몇 가지 제한 사항이 있습니다. 첫째, 모든 영양소가 수경적으로 제공됨에 따라 항균/곰팡이/바이러스 제제의 정기적인 치료를 통해 완화되는 뿌리 시스템의 기형으로 이어지는 조류, 곰팡이 및 바이러스성(예를 들어, 홉 잠복 비로이드) 병원균으로 쉽게 오염될 수 있다. 둘째, 미혼모 공장의 광범위한 사용은 생산 시설에 문제가 될 수 있습니다. 단일 유전자형 클론 라인을 생산 모델에서 유일한 식물로 갖는 것은 그 유전자형이 그 재배 시설에 존재하는 주어진 해충 또는 병원체에 취약하다면 전체 작물 손실의 위험에 이르게; 따라서, 주어진 해충 또는 병원체13로부터경제적 손실을 제한하기 위해 이 에어로포닉 복제 시스템으로 생산 클론을 전파하는 데 사용되는 다양한 혈통으로부터 여러 모성 식물을 유지하는 것이 좋습니다. 생산 클론의 미래 원천으로 사용할 새로운 어머니 공장을 복제하기 전에 6 개월 이상 식물을 식물적으로 재배하는 것이 좋습니다. 이것은 건강에 해로운 어머니 식물및 낮은 복제 성공률로 이끌어 낼 수 있는 자란 뿌리, 뿐만 아니라 전파된 클론에 전달될 수 있는 해충과 병원체를 품을 수 있는 자란 캐노피를 방지합니다.
에어로포닉 시스템은 비용 효율적인 방식으로 산업적으로 확장 가능합니다. 도 1 은 적어도 20개의 식물 재료가 단일 용기(38.1cm x 25.4cm x 30.48cm)에 보관될 수 있음을 나타낸다. 이 시스템은 물, 영양분 및 전기 비용을 증가하지 않고도 단위당 50개 이상의 식물을 보유하도록 쉽게 확장할 수 있습니다. 현재 방법에 대해 여기에 설명 된 장점은 대마초의 시간 효율적이고 균일 한 전파를위한 산업 관행 및 연구 실험실에 에어로포닉 복제 시스템을 구현하는 이유를 제공합니다.
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Disclosures
저자는 이해상충이 없습니다.
Acknowledgments
이 연구는 콜로라도 주립 대학 - 푸에블로와 과학 ICT (2021-DD-UP-0379)와 춘천 시 (대마 R&D 및 산업화, 2020-2021)의 대마초 연구 연구소에 의해 지원되었으며, 저자는 또한 "체리 와인"씨앗에 대한 관대 한 기부에 대한 정상 회의 CBD에서 저스틴 헨더슨에게 감사드립니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1-part Fox Farm | Fox Farm | Soil Mix | |
| 1-part Promix | Promix | Soil Mix | |
| 1-part Roots Organic Original | Auora Innovations | Soil Mix | |
| 1-part Wiggle Worm Earth Worm Castings | UNCO Industries | Soil Mix | |
| Algae and Bacterial Cleaning Solution (Clear Rez) | EZ Clone | SKU#: 225 | 8 fl. Oz. |
| Artificial Lighting | AgroBrite | SKU#: 1399 | T5 324W 4' 6-Tube Fixture with Lamps |
| Cannabis Mother plant 1 (Cherry Wine) | Summit CBD | N/A | Donated material |
| Cannabis Mother Plant 2 (Red Wine) | Trilogene | SKU: 0101RR | |
| Corresponding Plastic Lid | Office Depot | N/A | 38.1 cm x 25.4 cm |
| Drill Bit 1 | Dewalt | DW1586 | 38.1 mm spade drill bit |
| Drill Bit 2 | Dewalt | DW1308 | 3.175 mm drill bit |
| Flora/Bloom (Nutrient Solution)-5 mL | General Hydroponics | SKU#: 726 | 946 mL (1 Quart) 2.43 lbs. (1.1 kg) (Available Phosphate 5.0%, Soluble Potash 4.0%, Magnesium 1.5%, Sulfur 1.0%) |
| FloraGrow (Nutrient Solution)- 5 mL | General Hydroponics | SKU#: 724 | 946 mL (1 Quart) 2.43 lbs. (1.1 kg) ((Total Nitrogen 2.0% (0.25% Ammoniacal Nitrogen, 1.75% Nitrate Nitrogen), Available Phosphate 1.0%, Soluble Potash 6.0%, Magnesium 0.5%)) |
| FloraMicro (Nutrient Solution)- 5 mL | General Hydroponics | SKU#: 759 | 946 mL (1 Quart) 2.43 lbs. (1.1 kg) ((Total Nitrogen 5.0% (0.3% Ammoniacal Nitrogen, 4.7% Nitrate Nitrogen), Soluble Potash 1.0%, Calcium 5.0%, Boron 0.01%, Cobalt 0.0005%, Copper 0.01%, Iron 0.1%, Manganese 0.05%, Molybdenum 0.0008%, Zinc 0.015%)) |
| Horticultural Scissors | Shear Perfection | SKU#: 12620 | Platinum Stainless Steel Bonsai Scissors (2.4") |
| Isopropyl Alcohol | Equate | Walmart # 574133562 | 70% concentration |
| Nutrient Mist Solution (Clonex Mist) | Growth Technology | SKU#: 4889 | 10.14 fl. Oz (300 ml) (Total Nitrogen: 5.9 × 10-4 %, Available Phosphate: 4.0 × 10-4 %, Soluble Potash: 5.0 × 10-4 %) |
| pH Down | General Hydroponics | SKU#: 733 | 946 ml (1 Quart) 2.43 lbs. (1.1 kg) |
| pH Up | General Hydroponics | SKU#: 730 | 946 ml (1 Quart) 2.43 lbs. (1.1 kg) |
| Plastic Container | Office Depot | N/A | 38.1 cm x 25.4 cm x 30.48 cm |
| Power Drill | Dewalt | DCD709B | 20-Volt Max ½” Drill |
| Rockwool Cubes | Grodan | SKU#: 830 | 38.1 mm |
| Rooting Solution (Clonex Rooting Gel) | Growth Technology | SKU#: 939 | 3.4 fl. Oz. (100 ml) (Indolebutyric Acid - 0.31%) |
| Statistic Software (Prism) | GraphPad Inc. | ||
| Submersible Water Pump | ActiveAQUA | SKU: AAPW250 | Model: AAPW250, Voltage 120V, Power 16W |
References
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