Summary
Detta protokoll är utformat för att ge instruktionsinformation för klonurvalet för spridning av Cannabis sativa L. genom att implementera aeroponiska system. Metoden som beskrivs här innehåller alla nödvändiga förnödenheter och protokoll för att framgångsrikt reproducera önskvärda morfologiska och kemiska egenskaper i släktet Cannabis.
Abstract
Detta protokoll beskriver standardiseringen av en effektiv klonurvalet för förökning teknik av hampa genom att använda aeroponic system. Primära skottsticklingar strukits från två hampasorter, som heter "Cherry Wine" och "Red Robin" (17-20% w / w CBD), som fungerade som "moderväxt". En auxin föregångare (indol-3-butyric syra) tillämpades för att stimulera rot utveckling i den basala delen av de strukna sticklingar före placering i systemet. Sticklingar dimmades lätt med näringsdimmalösningen var tredje dag för att ge näringsstöd eftersom lösningen innehåller de väsentliga makronäringsämnena, inklusive kväve, fosfor och kalium. Den aeroponiska systemvattenbehållaren höll ett pH-intervall mellan 5,0-6,0 och en vattentemperatur mellan 20-22 °C. En dränkbar vattenpump användes för att leverera vatten till sticklingarna. Skottspetssticklingarna försågs med 24 h ljus per dag i 10 dagar tills rotutveckling inträffade, på vilka de rotade sticklingarna transplanterades för forskningsändamål. Dessa aeroponiska system har visat sig generera önskvärda resultat för cannabis förökning. Metoden som beskrivs här lindrar potentiella tidsbegränsningar som uppstår från traditionella metoder för att möjliggöra ett effektivare sätt för asexuell förökning av Cannabis.
Introduction
Cannabis sativa L. är en årlig, dioecious, blommande växt klassificerad i familjen Cannabaceae. Cannabinoider, som huvudsakligen produceras inom glandulära trichomes som ligger på det yttre epidermala lagret av bract vävnader på kvinnliga blomställningar1, blir ett alltmer populärt forskningsämne, främst på grund av deras gradvis erkända medicinska egenskaper. Cannabidiol (CBD) är den näst mest framträdande cannabinoiden som finns i Cannabis efter Δ9-tetrahydrocannabinol (THC) och tillskrivs en mängd medicinska fördelar, inklusive smärtstillande egenskaper2, anti-beslag egenskaper3, antidepressiva egenskaper4, minska risken för diabetes5 och behandla olika sömnstörningar6. På grund av de många hälsofördelarna i samband med metaboliterna i Cannabis-växten finns det en växande efterfrågan på dess kommersiella produktion7. För att möta denna efterfrågan förbättras och återuppfinnas odlingsmetoderna ständigt för att kontinuerligt leverera konsekvent, högkvalitativt växtmaterial till den framväxande cannabisindustrin.
Spridningen av Cannabis kan underlättas på två sätt: sexuell eller asexuell reproduktion. Ett exempel på sexuell reproduktion är pollinering av en kvinnlig äggloss med pollen från en mans ståndare vilket resulterar i ett frö som kan gro. Fröspiring är en tillförlitlig odlingsmetod som har använts för avels- och odlingsändamål där önskvärda fenotypiska egenskaper väljs i föräldralinjer för att förbättra kvaliteten på avkomman Cannabisplantor, inklusive egenskaper som torktolerans, insektsresistens, ökat utbyte och ökad styrka8 . Oavsiktlig korsbestämning är dock en inneboende risk när man utför sexuell reproduktion, vilket orsakar oönskade avkommor, vilket leder till potentiell förlust av önskvärda egenskaper eller en introduktion av oönskade egenskaper. Ett exempel på denna oavsiktliga pollinering lyfts fram av hampaodlare som får hampafrön pollinerade med THC-producerande pollen som resulterar i betydande ekonomiska förluster på grund av de växter som inte uppfyller kraven (>0,3% totalt THC w/w)9. Dessutom, för att generera en gröda som består av endast honor, måste ett feminiserat frö sås istället för ett icke-feminiserat frö, vilket kan leda till hermafrodidism och andra oönskade egenskaper som leder till ekonomisk förlust. För att övervinna begränsningen av sexuell reproduktion av cannabis har asexuell reproduktion praktiserats i stor utsträckning i kommersiella produktionsmodeller av Cannabisindustrin10.
Asexuell reproduktion av Cannabis kräver endast en enda växt, vilket möjliggör multiplikation av en enda genotyp som möjliggör kommersiell produktion av växter som bär önskvärda agronomiska och farmaceutiska egenskaper. En vanlig form av asexuell Cannabis reproduktion är att skära och sätta in små delar av en kvinnlig växt i ett jordlöst substrat11 som täcks av en fuktighetskupol för att inducera rotbildning. Även om denna metod har visat sig framgångsrik, är en vanlig nackdel ackumuleringen av en hög luftfuktighet (vanligtvis 80% eller högre) inuti kupolen, vilket ger en idealisk tillväxtmiljö för svamppatogener, vilket kan vara skadligt för nya, känsliga sticklingar. En annan form av asexuell förökning är mikropropagation med hjälp av vävnadskultur, där sterila tekniker möjliggör förökning av insekts-, mikrob- och virusfritt cannabisväxtmaterial i begränsat utrymme12. Denna process är dock dyr, tidskrävande och kräver utbildade laboratorietekniker som i allmänhet är otillgängliga för storskaliga Cannabis-anläggningar .
Mycket få publicerade forskningsrapporter finns om klonurvalet för cannabis. För att ge en grund för förståelsen av asexuell reproduktion av cannabis för forskningsändamål och industriell produktion syftade denna studie till att visa hur lätt och tillgänglig användningen av aeroponiska system för klonurnisk spridning av cannabis. Aeroponiska system är idealiska för asexuell förökning av Cannabis, konsekvent levererar näringsrikt vatten till sticklingarna, inducerar tidig rotbildning i rätt tid och gör det möjligt att upprätthålla en växt på obestämd tid om det behövs.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Generering av moderväxt för klonururred förökning
- Välj en hälsosam, kvinnlig moderväxt som uppvisar önskvärda morfologiska och kemiska egenskaper som är specifika för dess avsedda användning.
- Låt moderplantan nå lämplig storlek (ungefär 25 mogna skott) för klonurutbredning (dvs. sticklingar).
- Låt moderplantorna stanna kvar i det vegetativa tillväxtstadiet (ljus: mörk = 18 h:6 h) för att främja skotttillväxt för framtida förökning.
2. Konstruktion och beredning av aeroponiska system
- Börja med att placera locket ovanpå behållaren (38,1 cm x 25,4 cm x 30,48 cm). Borra det önskade antalet hål i locket samtidigt som du ger tillräckligt med utrymme (helst 3 cm) mellan varje.
- Placera vattenpumpen (Materialtabellen) i mitten av behållaren.
- Häll 7-8 L destillerat vatten i behållaren så att pumpmunstycket förblir ungefär 2,5 cm över vattenlinjen.
OBS: Detta säkerställer att den dränkbara vattenpumpen (Table of Materials) kan trycka vatten med tillräckligt med kraft för att sprida sig över behållarens lock. Destillerat vatten rekommenderas; Vanligt kranvatten kan dock också användas. - Placera lämplig mängd Rockwool-kuber (3,81 cm) (Materialtabell) eller valfria mediekuber i varje fack. Slå på pumpen och låt den gå i 24 timmar.
OBS: Rockwool kuber är att föredra på grund av deras "förankring" förmåga på de nyrotade sticklingarna som hjälper till att hålla växter upprätt efter transplantation.
3. Välja och excising lämpliga skott
- Samla skott nära den apikala meristem med en steriliserad skalpell eller sax. Sticklingar är ~ 10 cm långa, helst med flera noder.
OBS: Skär stammen i 45° vinkel. Skärning i 45° vinkel ökar ytan på skärets basala del, vilket ger mer utrymme för rotutveckling. Det är valfritt att göra en liten slits (1-2 cm) i mitten av 45° skärningen för att ytterligare öka ytan. - Ta bort allt lövverk utom lövverk som finns på de tre översta noderna.
- Doppa den nyligen strukna skärningen i rotlösningen som innehåller indol-3-smörsyra (IBA) (Materialtabell) ~ 2-5 cm upp från stammens botten i ~ 5 s.
- Sätt in skärningen i mitten av en Rockwool-kub placerad i det aeroponiska systemet.
OBS: Skärinfogningsdjupet ska förbli ~1-2 cm från botten av Rockwool-kuben. - Spraya de orotade sticklingarna med näringsdimmalösningen (Table of Materials) var tredje dag.
- Odla sticklingarna med 18-24 h ljus per dag med en fotosyntetisk fotonflödestäthet (PPFD) på 100 μmol/m2/s vid 24-29 °C och 40-60% relativ luftfuktighet.
4. Underhåll av aeroponiska system och propagulehälsa
- Fyll på systemet med vatten med ett pH mellan 5,0- 6,0 var 2-5 dag.
- Dimma sticklingarna lätt (en dimma per skärning) med näringsdimmalösningen (Materialtabell) var tredje dag.
- Tillsätt 5 ml av varje näringslösning (Tabell över material) till behållaren var 3-5 dag.
OBS: Näringstillskottet gör att vattnet blir brunt och grumligt. - Tillsätt 15 ml av alg- och bakterierengöringslösningen som innehåller hypoklorsyra (0,028%) per 10 L vatten var 5: e dag (Materialförteckning).
5. Transplantera propagules
- Välj sticklingar med långa, vita, fibrösa rötter.
OBS: Undvik sticklingar med bruna, slemmiga och korta rotsystem eftersom detta är en indikator för förekomsten av rotröta och tar vanligtvis längre tid att acklimatisera sig till det nya odlingsmediet och kan medföra oönskade sjukdomar. - Lossa försiktigt Rockwool-kuben från systemet och lossa rötterna.
- Transplantera Cannabispropagulan till 4 L plantskolegryta fylld med en näringsrik jordblandning (Materialtabell).
OBS: Vattning rekommenderas omedelbart för att förhindra att rötterna torkar ut.
6. Rengöring och lagring av aeroponiska system
- När systemet inte längre används, tvätta med vatten och rengör med 70% etanol eller annat desinfektionsmedel.
- Ta bort filtret från vattenpumpen och skölj med vatten för att ta bort skräp.
- Torka systemet genom att torka av det med pappershanddukar eller en tvättlapp.
- Placera pumpen inuti badkaret med locket på och förvara den tills den behövs.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
För att validera effektiviteten hos det beskrivna aeroponiska systemet ströks totalt 10 och 12 friska 14 cm långa skott från moderplantorna, "Körsbärsvin" respektive "Rödhake"(figur 1A,B). Efter doppning i rotande induktionsmedier placerades klonerna i systemet (figur 2A). Konstruktion och drift av ett aeroponiskt system visas som ett schematiskt diagram i figur 2A.
Efter 2 dagars acklimatisering började alla kloner utveckla rötter på 3-7 dagar och fullt utvecklade rötter 37 cm långa efter 10-14 dagar på systemet, vilket var tillräckligt för att planteras till en jordfylld kruka (figur 2B,D). Figur 3 visar den genomsnittliga längden på skott och rötter av varje sort. Skottlängden och rotlängden mättes innan de överfördes till jorden. Den genomsnittliga längden på skott och rötter var 24,8 cm ± 2,4 cm och 37,8 cm ± 2,5 cm för "Körsbärsvin" respektive 21,4 cm ± 2,1 cm respektive 39,7 cm ± 5,9 cm för "Red Robin", respektive (figur 3A,B). Skillnaderna mellan de två sorterna analyserades av tvåvägs ANOVA, följt av Tukeys multipla medkänsla test, visar inga betydande skillnader i skott och rotlängder mellan de två sorterna (n = 10-12, p < 0,05).
Figur 1: En frisk moderväxt som genererar flera skott för klonurutbredning. (A) Mogna moderplantor, "Cherry Wine" (fram) och "Red Robin" (rygg) vid ~ 4 månaders vegetativ tillväxt, som uppvisar många skott som är idealiska för förökning. (B) Ungefärlig längd (14 cm) för korrekt skottexcision för kloning Av cannabis. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Figur 2: Upprättande av det aeroponiska systemet för förökning av kloning av cannabis. A) Schematiskt diagram som illustrerar komponenterna i det aeroponiska systemet (38,1 cm x 25,4 cm x 30,48 cm). B) Aeroponiskt system som fullt upptas av kloner av körsbärsvin. (C) Inuti det aeroponiska systemet med kloner som uppvisar rottillväxt. (D) Hälsosam rottillväxt i Rockwool kub efter 10 dagar i det aeroponiska systemet. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Figur 3: Fotografering och rotlängdsmätningar för "Cherry Wine" och "Red Robin" efter 10 dagar i det aeroponiska kloningssystemet. A) En stapelgraf och B-tabell som representerar längden på skott och rot i de två hampasorterna. Skillnaderna i skott/rotlängder mellan två sorter analyserades av tvåvägs ANOVA, följt av Tukeys multipla jämförelsetest. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Med den ökande efterfrågan på cannabisväxter med konsekvent cannabinoidinnehåll har olika klonurdjursmetoder utnyttjats i cannabisindustrin . Den asexuella förökningen visar flera fördelar jämfört med sexuella metoder för storskalig, konsekvent produktion. Ett aeroponiskt förökningssystem är en modifierad version av ett hydroponiskt system som använder en luftad näringsrik vattendimma för att ge snabb rotutveckling. Det beskrivna aeroponiska systemet består av tre kritiska steg, 1) genererar en hälsosam kvinnlig Cannabis "moder" växt som en genetisk källa för en önskad fysisk / kemisk egenskap, 2) skära skott (apikala meristems) och behandla med rotinduktionsmedier som innehåller auxin föregångare, IBA, och 3) acklimatisering av propagule i den önskade plantskolan kruka.
Det aeroponiska förökningssystemet möjliggör effektiv produktion av hampakloner med tydliga fördelar jämfört med olika förökningsmetoder. Det inkluderar 1) tid och kostnadsbesparande genom mindre arbetsinducerande hälsosam, mogen rotbildning så snart som 5 dagar; 2) Genetisk homogenitet - göra det möjligt att producera genetiskt identiska kloner, med undantag för eventuella genetiska variationer, för att tillgodose reproducerbar cannabisforskning och industritillämpningar. 3) Enhetlighet i storskaliga verksamheter. och 4) mindre sårbarhet för mikrobiella patogener - upprätthålla en relativt låg luftfuktighet i växternas övre baldakin än fuktighetsnivån som byggs inuti behållaren där rotutveckling sker.
Även om det aeroponiska systemet erbjuder ett antal fördelar, finns det några begränsningar som presenteras som bör behandlas noggrant under praxis. För det första, eftersom alla näringsämnen tillhandahålls hydroponiskt, kan det lätt förorenas med alg-, svamp- och virala patogener (t.ex. hop latent viroid) som leder till missbildning av rotsystemet som mildras genom regelbunden behandling av anti-mikrobiella/ svamp/ virala medel. För det andra kan den utbredda användningen av en enda moderfabrik vara problematisk för produktionsanläggningar. Att ha en enda klonlinje av genotyp som den enda växten i en produktionsmodell leder till en risk för hel skördeförlust om denna genotyp är mottaglig för ett visst växtsort eller en viss patogen som finns i odlingsanläggningen. Det rekommenderas därför att flera moderplantor bibehålls från olika härstamningar som används för att föröka produktionskloner med detta aeroponiska kloningssystem för att begränsa ekonomisk förlust från ett visst skadedjur eller patogen13. Det rekommenderas att endast vegetativt odla en moderväxt i högst 6 månader innan man klonar en ny moderväxt att använda som framtida källa för produktionskloner. Detta förhindrar övervuxna rötter som kan leda till ohälsosamma moderplantor och lägre kloningsframgångsgrader, liksom övervuxna canopies som kan hysa skadedjur och patogener, som kan överföras till de förökade klonerna.
Det aeroponiska systemet är industriellt skalbart på ett kostnadseffektivt sätt. Figur 1 visar att minst 20 växtmaterial kan inhysas i en enda behållare (38,1 cm x 25,4 cm x 30,48 cm). Systemet kan enkelt skalas upp för att rymma mer än 50 växter per enhet utan att öka kostnaderna för vatten, näringsämnen och el. De fördelar som beskrivs här för den nuvarande metoden ger en anledning att implementera det aeroponiska kloningssystemet i branschpraxis och forskningslaboratorier för tidseffektiv och enhetlig förökning av Cannabis.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inga intressekonflikter.
Acknowledgments
Denna forskning stöddes av Institute of Cannabis Research vid Colorado State University-Pueblo och Ministry of Science and ICT (2021-DD-UP-0379) och Chuncheon city (Hemp R&D och industrialization, 2020-2021), Författarna vill också tacka Justin Henderson på Summit CBD för den generösa donationen för "Cherry Wine" frön.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1-part Fox Farm | Fox Farm | Soil Mix | |
| 1-part Promix | Promix | Soil Mix | |
| 1-part Roots Organic Original | Auora Innovations | Soil Mix | |
| 1-part Wiggle Worm Earth Worm Castings | UNCO Industries | Soil Mix | |
| Algae and Bacterial Cleaning Solution (Clear Rez) | EZ Clone | SKU#: 225 | 8 fl. Oz. |
| Artificial Lighting | AgroBrite | SKU#: 1399 | T5 324W 4' 6-Tube Fixture with Lamps |
| Cannabis Mother plant 1 (Cherry Wine) | Summit CBD | N/A | Donated material |
| Cannabis Mother Plant 2 (Red Wine) | Trilogene | SKU: 0101RR | |
| Corresponding Plastic Lid | Office Depot | N/A | 38.1 cm x 25.4 cm |
| Drill Bit 1 | Dewalt | DW1586 | 38.1 mm spade drill bit |
| Drill Bit 2 | Dewalt | DW1308 | 3.175 mm drill bit |
| Flora/Bloom (Nutrient Solution)-5 mL | General Hydroponics | SKU#: 726 | 946 mL (1 Quart) 2.43 lbs. (1.1 kg) (Available Phosphate 5.0%, Soluble Potash 4.0%, Magnesium 1.5%, Sulfur 1.0%) |
| FloraGrow (Nutrient Solution)- 5 mL | General Hydroponics | SKU#: 724 | 946 mL (1 Quart) 2.43 lbs. (1.1 kg) ((Total Nitrogen 2.0% (0.25% Ammoniacal Nitrogen, 1.75% Nitrate Nitrogen), Available Phosphate 1.0%, Soluble Potash 6.0%, Magnesium 0.5%)) |
| FloraMicro (Nutrient Solution)- 5 mL | General Hydroponics | SKU#: 759 | 946 mL (1 Quart) 2.43 lbs. (1.1 kg) ((Total Nitrogen 5.0% (0.3% Ammoniacal Nitrogen, 4.7% Nitrate Nitrogen), Soluble Potash 1.0%, Calcium 5.0%, Boron 0.01%, Cobalt 0.0005%, Copper 0.01%, Iron 0.1%, Manganese 0.05%, Molybdenum 0.0008%, Zinc 0.015%)) |
| Horticultural Scissors | Shear Perfection | SKU#: 12620 | Platinum Stainless Steel Bonsai Scissors (2.4") |
| Isopropyl Alcohol | Equate | Walmart # 574133562 | 70% concentration |
| Nutrient Mist Solution (Clonex Mist) | Growth Technology | SKU#: 4889 | 10.14 fl. Oz (300 ml) (Total Nitrogen: 5.9 × 10-4 %, Available Phosphate: 4.0 × 10-4 %, Soluble Potash: 5.0 × 10-4 %) |
| pH Down | General Hydroponics | SKU#: 733 | 946 ml (1 Quart) 2.43 lbs. (1.1 kg) |
| pH Up | General Hydroponics | SKU#: 730 | 946 ml (1 Quart) 2.43 lbs. (1.1 kg) |
| Plastic Container | Office Depot | N/A | 38.1 cm x 25.4 cm x 30.48 cm |
| Power Drill | Dewalt | DCD709B | 20-Volt Max ½” Drill |
| Rockwool Cubes | Grodan | SKU#: 830 | 38.1 mm |
| Rooting Solution (Clonex Rooting Gel) | Growth Technology | SKU#: 939 | 3.4 fl. Oz. (100 ml) (Indolebutyric Acid - 0.31%) |
| Statistic Software (Prism) | GraphPad Inc. | ||
| Submersible Water Pump | ActiveAQUA | SKU: AAPW250 | Model: AAPW250, Voltage 120V, Power 16W |
References
- ElSohly, M. A., Radwan, M. M., Gul, W., Chandra, S., Galal, A.
- Cunetti, L., et al. Chronic pain treatment with cannabidiol in kidney transplant patients in Uruguay. Transplantation Proceedings. 50 (2), 461-464 (2018).
- Hausman-Kedem, M., Menascu, S., Kramer, U. Efficacy of CBD-enriched medical cannabis for treatment of refractory epilepsy in children and adolescents - An observational, longitudinal study. Brain & Development. 40 (7), 544-551 (2018).
- Linge, R., et al. Cannabidiol induces rapid-acting antidepressant-like effects and enhances cortical 5-HT/glutamate neurotransmission: role of 5-HT1A receptors. Neuropharmacology. 103, 16-26 (2016).
- Lehmann, C., et al. Experimental cannabidiol treatment reduces early pancreatic inflammation in type 1 diabetes. Clinical Hemorheology and Microcirculation. 64 (4), 655-662 (2016).
- Shannon, S., Lewis, N., Lee, H., Hughes, S. Cannabidiol in anxiety and sleep: A large case series. The Permanente Journal. 23, 18-41 (2019).
- Russo, E. B. History of cannabis and its preparations in saga, science, and sobriquet. Chemistry & Biodiversity. 4 (8), 1614-1648 (2007).
- Vera, C. L., Hanks, A.
- Deventer, M. V. Hot hemp: How high THC levels can ruin a legal hemp harvest. , Available from: https://www.westword.com/marijuana/hot-hemp-how-high-thc-levels-can-ruin-a-legal-hemp-harvest-9963683 (2018).
- Lata, H., Chandra, S., Techen, N., Khan, I. A., ElSohly, M. A. Assessment of the genetic stability of micropropagated plants of Cannabis sativa by ISSR markers. Planta Medica. 76 (1), 97-100 (2010).
- Caplan, D., Dixon, M., Zheng, Y. Optimal rate of organic fertilizer during the flowering stage for Cannabis grown in two coir-based substrates. HortScience. 52 (12), 1796 (2017).
- Monthony, A. S., Page, S. R., Hesami, M., Jones, A. M. P. The past, present and future of Cannabis sativa tissue culture. Plants (Basel). 10 (1), 185 (2021).
- Clarke, R. C., Merlin, M. D. Cannabis domestication, breeding history, present-day genetic diversity, and future prospects. Critical Reviews in Plant Sciences. 35 (5-6), 293-327 (2016).
