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Biology

प्राथमिक रोगी-विशिष्ट महाधमनी चिकनी मांसपेशी कोशिकाओं और विट्रो में अर्धमात्रात्मक वास्तविक समय संकुचन माप का अलगाव

Published: February 15, 2022 doi: 10.3791/63122
Automatic Translation
*1,2,3, *1,2, 1,2
1Department of Vascular Surgery, Amsterdam UMC, Vrije Universiteit Amsterdam, 2Department of Physiology, Amsterdam Cardiovascular Sciences, Amsterdam UMC, Vrije Universiteit Amsterdam, 3Laboratory of Experimental Cardiology, Department of Cardiology, Leiden University Medical Center
* These authors contributed equally

Summary

यह पेपर प्राथमिक, रोगी-विशिष्ट मानव महाधमनी चिकनी मांसपेशी कोशिकाओं और त्वचीय फाइब्रोब्लास्ट्स के अलगाव और खेती के लिए एक स्पष्टीकरण संस्कृति-आधारित विधि का वर्णन करता है। इसके अलावा, सेल संकुचन और बाद के विश्लेषण को मापने के लिए एक उपन्यास विधि प्रस्तुत की जाती है, जिसका उपयोग इन कोशिकाओं में रोगी-विशिष्ट अंतरों का अध्ययन करने के लिए किया जा सकता है।

Abstract

चिकनी मांसपेशी कोशिकाएं (एसएमसी) महाधमनी मीडिया में प्रमुख सेल प्रकार हैं। उनकी संकुचनशील मशीनरी महाधमनी में बल के संचरण के लिए महत्वपूर्ण है और वाहिकासंकीर्णन और वासोडिलेशन को नियंत्रित करती है। एसएमसी संकुचनशील उपकरण प्रोटीन के लिए एन्कोडिंग जीन में उत्परिवर्तन महाधमनी रोगों से जुड़े होते हैं, जैसे कि वक्षीय महाधमनी एन्यूरिज्म। विट्रो में एसएमसी संकुचन को मापना चुनौतीपूर्ण है, विशेष रूप से एक उच्च-थ्रूपुट तरीके से, जो रोगी सामग्री की स्क्रीनिंग के लिए आवश्यक है। वर्तमान में उपलब्ध तरीके इस उद्देश्य के लिए उपयुक्त नहीं हैं। यह पेपर इलेक्ट्रिक सेल-सब्सट्रेट प्रतिबाधा संवेदन (ईसीआईएस) पर आधारित एक उपन्यास विधि प्रस्तुत करता है। सबसे पहले, महाधमनी एन्यूरिज्म के अध्ययन के लिए महाधमनी बायोप्सी और रोगी-विशिष्ट मानव प्राथमिक त्वचीय फाइब्रोब्लास्ट्स से रोगी-विशिष्ट मानव प्राथमिक एसएमसी को अलग करने के लिए एक स्पष्टीकरण प्रोटोकॉल का वर्णन किया गया है। अगला, इन कोशिकाओं की संकुचन प्रतिक्रिया को मापने के लिए एक नई संकुचन विधि का एक विस्तृत विवरण दिया गया है, जिसमें बाद के विश्लेषण और विभिन्न समूहों की तुलना के लिए सुझाव शामिल हैं। इस विधि का उपयोग ट्रांसलेशनल (कार्डियोवैस्कुलर) अध्ययन और रोगी और दवा स्क्रीनिंग अध्ययनों के संदर्भ में अनुयायी कोशिकाओं के संकुचन का अध्ययन करने के लिए किया जा सकता है।

Introduction

चिकनी मांसपेशी कोशिकाएं (एसएमसी) महाधमनी औसत दर्जे की परत में प्रमुख सेल प्रकार हैं, जो महाधमनी की सबसे मोटी परत है। दीवार के भीतर, वे रेडियल रूप से उन्मुख हैं और अन्य कार्यों के बीच, वाहिकासंकीर्णन और वासोडिलेशन1 में शामिल हैं। एसएमसी संकुचनशील मशीनरी एक्स्ट्रासेल्युलर मैट्रिक्स2 के साथ कार्यात्मक लिंक के माध्यम से महाधमनी में बल के संचरण में शामिल है। एसएमसी संकुचन तंत्र के प्रोटीन के लिए एन्कोडिंग जीन में उत्परिवर्तन, जैसे कि चिकनी मांसपेशी मायोसिन भारी श्रृंखला (MYH11) और चिकनी मांसपेशी एक्टिन (ACTA2), पारिवारिक वक्षीय महाधमनी एन्यूरिज्म के मामलों से संबंधित हैं, जो महाधमनी 1,2 की संरचनात्मक और कार्यात्मक अखंडता को बनाए रखने में एसएमसी संकुचन की प्रासंगिकता को रेखांकित करते हैं। . इसके अलावा, टीजीएफ सिग्नलिंग मार्ग में उत्परिवर्तन भी महाधमनी एन्यूरिज्म से जुड़े होते हैं, और महाधमनी एन्यूरिज्म पैथोफिजियोलॉजी में उनके प्रभावों का अध्ययन त्वचा फाइब्रोब्लास्ट्स 3 में भी किया जा सकताहै।

विट्रो में एसएमसी संकुचन का उच्च-थ्रूपुट माप चुनौतीपूर्ण है। जैसा कि एसएमसी संकुचन को मनुष्यों में विवो में मापा नहीं जा सकता है, मानव कोशिकाओं पर इन विट्रो एसेस एक व्यवहार्य विकल्प प्रस्तुत करते हैं। इसके अलावा, पशु मॉडल में पेट महाधमनी एन्यूरिज्म (एएए) विकास या तो रासायनिक रूप से प्रेरित होता है, उदाहरण के लिए, इलास्टेज़ परफ्यूजन, या एक विशिष्ट उत्परिवर्तन के कारण होता है। इसलिए, जानवरों के डेटा मनुष्यों में एएए विकास के लिए तुलनीय नहीं हैं, जिसमें ज्यादातर धूम्रपान, उम्र और / या एथेरोस्क्लेरोसिस जैसे मल्टीफैक्टोरियल कारण होते हैं। इन विट्रो एसएमसी संकुचन को अब तक मुख्य रूप से कर्षण बल माइक्रोस्कोपी 4,5, फुरा -2 प्रतिदीप्ति इंट्रासेल्युलर कैल्शियम फ्लक्स6 के परिमाणीकरण, और कोलेजन झुर्रियोंके द्वारा मापा गया है। जबकि कर्षण बल माइक्रोस्कोपी एक एकल सेल द्वारा उत्पन्न बलों में अमूल्य संख्यात्मक अंतर्दृष्टि प्रदान करता है, यह जटिल गणितीय डेटा प्रसंस्करण और एक समय में एक सेल के विश्लेषण के कारण उच्च-थ्रूपुट स्क्रीनिंग के लिए उपयुक्त नहीं है, जिसका अर्थ है कि प्रति दाता कोशिकाओं की प्रतिनिधि संख्या को मापने के लिए यह बहुत समय लेने वाला है। Fura-2 डाई और कोलेजन wrinkling assays संकुचन के सतही निर्धारण की अनुमति देते हैं और एक सटीक संख्यात्मक आउटपुट नहीं देते हैं, जिससे उन्हें रोगी-विशिष्ट मतभेदों को भेदभाव करने के लिए कम उपयुक्त बनाया जाता है। पेट महाधमनी एन्यूरिज्म रोगियों के महाधमनी से व्युत्पन्न कोशिकाओं में बिगड़ा एसएमसी संकुचन पहली बार विट्रो8 में एसएमसी संकुचन को मापने के लिए एक उपन्यास विधि को अनुकूलित करके प्रदर्शित किया गया था। यह इलेक्ट्रिक सेल-सब्सट्रेट प्रतिबाधा संवेदन (ईसीआईएस) विधि को फिर से तैयार करके किया गया था। ECIS एक वास्तविक समय, मध्यम थ्रूपुट परख अनुयायी सेल व्यवहार और संकुचन 9,10,11 जैसे SMC विकास और घाव भरने और माइग्रेशन assays12,13,14 में व्यवहार के परिमाणीकरण के लिए है. सटीक विधि प्रोटोकॉल अनुभाग में वर्णित है। इस अनुकूलित तरीके से, ईसीआईएस का उपयोग उनके समान आकार और आकृति विज्ञान के कारण फाइब्रोब्लास्ट संकुचन का अध्ययन करने के लिए भी किया जा सकता है।

इस पेपर का उद्देश्य ECIS8 का उपयोग करके विट्रो में SMC संकुचन को मापने और नियंत्रण और रोगी SMCs के बीच संकुचन की तुलना करने के लिए विधि का एक stepwise विवरण प्रदान करना है। सबसे पहले, नियंत्रण और रोगी महाधमनी बायोप्सी से प्राथमिक एसएमसी के अलगाव और संवर्धन को समझाया गया है, जिसका उपयोग संकुचन माप के लिए किया जा सकता है। दूसरा, संकुचन माप और विश्लेषण, एसएमसी मार्कर अभिव्यक्ति के सत्यापन के साथ-साथ, वर्णित हैं। इसके अलावा, यह पेपर रोगी-विशिष्ट त्वचीय फाइब्रोब्लास्ट्स के अलगाव के लिए विधि का वर्णन करता है, जिनके संकुचन को एक ही पद्धति का उपयोग करके मापा जा सकता है। इन कोशिकाओं का उपयोग रोगी-विशिष्ट अध्ययनों के लिए किया जा सकता है जो महाधमनी एन्यूरिज्म या अन्य कार्डियोवैस्कुलर पैथोलॉजी15 या एक ट्रांसडिफरेंशिएशन प्रोटोकॉल का उपयोग करके पूर्वानुमानात्मक अध्ययनों पर केंद्रित है जो एन्यूरिज्म सर्जरी16 से पहले संकुचन माप की अनुमति देता है।

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Protocol

नोट: महाधमनी बायोप्सी एम्स्टर्डम विश्वविद्यालय चिकित्सा केंद्रों, VU विश्वविद्यालय चिकित्सा केंद्र, एम्स्टर्डम, Zaans Medisch Centrum, Zaandam और Dijklander अस्पताल, Hoorn, नीदरलैंड में खुले एन्यूरिज्म की मरम्मत के दौरान प्राप्त किए गए थे। नियंत्रण महाधमनी ऊतक गुर्दे के प्रत्यारोपण के लिए काटे गए गुर्दे की धमनी से जुड़े महाधमनी के टुकड़े से प्राप्त किया गया था। केवल 18 वर्ष से अधिक आयु के रोगियों को शामिल किया गया था, और सभी रोगियों ने अध्ययन में भाग लेने के लिए अपनी सूचित सहमति दी थी। सभी सामग्री हेलसिंकी के अर्थोपाय अग्रिम घोषणा और वीयू मेडिकल सेंटर की चिकित्सा नैतिक समिति के संस्थागत दिशानिर्देशों के नियमों के अनुसार एकत्र की गई थी। सभी प्रयोगों और प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल को संस्थागत दिशानिर्देशों के अनुसार किया गया था और वीयू मेडिकल सेंटर की मेडिकल एथिकल कमेटी द्वारा अनुमोदित किया गया था। उपयोग किए गए नियंत्रण और रोगी सेल लाइनों के बारे में पूरी जानकारी के लिए, 8 देखें।

1. महाधमनी बायोप्सी से प्राथमिक मानव एसएमसी को अलग करना

नोट:: एक बाँझ ऊतक संस्कृति लैमिनर प्रवाह हुड के अंतर्गत निम्न चरणों का निष्पादन करें। दस्ताने पहनें और मानव रक्त और मानव ऊतक के नमूनों को संभालते समय मानक एसेप्टिक तकनीकों का उपयोग करें। SMCs 231 मानव संवहनी चिकनी मांसपेशी सेल बेसल मध्यम 100 U / mL पेनिसिलिन, 100 μg / mL streptomycin, और चिकनी मांसपेशी विकास पूरक SMC माध्यम के रूप में जाना जाता है के साथ पूरक में सुसंस्कृत कर रहे हैं।

  1. सर्जिकल संदंश और एक स्केलपेल के दो जोड़े को 70% इथेनॉल में डुबोकर और बाद में उन्हें सूखा पोंछकर निष्फल करें।
  2. एक पेट्री डिश में एसएमसी माध्यम के पिपेट 2 एमएल जिसमें ऊतक विच्छेदन किया जाएगा।
  3. पिपेट दो T25 फ्लास्क में एसएमसी माध्यम के 2.5 मिलीलीटर। फ्लास्क को चारों ओर घुमाएं ताकि माध्यम की छोटी मात्रा पूरी सतह को कवर कर सके।
  4. ठंडे, बाँझ ऊतक हस्तांतरण समाधान ( सामग्री की तालिका देखें) या 0.9% NaCl के साथ एक बाँझ प्लास्टिक ट्यूब में बर्फ पर प्रयोगशाला के लिए ऑपरेटिंग रूम से काटे गए मानव महाधमनी दीवार बायोप्सी का परिवहन करें।
  5. ऊतक संस्कृति हुड के अंदर ऊतक के साथ ट्यूब खोलें। स्टरलाइज़्ड संदंश का उपयोग करके बायोप्सी को ट्यूब से बाहर निकालें और इसे पेट्री डिश (चित्रा 1 ए) में रखें।
  6. नेत्रहीन रूप से बायोप्सी का निरीक्षण करने के लिए तीन महाधमनी परतों, tunica अंतरंग (आंतरिक), मीडिया (मध्य), और adventitia (बाहरी परत) की पहचान करने के लिए। परतों को अलग करने के लिए अंतरंग पक्ष पर एथेरोस्क्लेरोटिक सजीले टुकड़े और एडवेंटियल पक्ष (चित्रा 1 बी) पर पतले संयोजी ऊतक की उपस्थिति की तलाश करें।
  7. मीडिया से SMCs को अलग करने के लिए, अन्य दो परतों को निकालें। पहले अंतरंग पट्टिका पक्ष के साथ ऊतक को रखें (चित्रा 1 बी)। संदंश की दूसरी जोड़ी के साथ ऊतक को नीचे धकेलते हुए संदंश के साथ ऊतक से दूर खींचकर ठोस पट्टिका को हटा दें। पट्टिका की बाद की परतों को तब तक हटा दें जब तक कि गुलाबी, समान औसत दर्जे की परत दिखाई न दे।
  8. ऊतक फ्लिप (चित्रा 1 C)। एक ही प्रक्रिया को दोहराएं, जैसा कि चरण 1.7 में है, adventitial परत (चित्रा 1 D) को खींचकर। आवश्यकतानुसार कई प्रयासों में सभी दृश्यमान भागों को हटाना सुनिश्चित करें, क्योंकि यह परत आसानी से मीडिया से अलग नहीं होगी।
    नोट: यह आवश्यक है कि intimal और adventitial परतों को ठीक से हटा दिया जाए ताकि जितना संभव हो सके एक एसएमसी आबादी को साफ किया जा सके।
  9. एक बार औसत दर्जे की परत को अलग करने के बाद, ऊतक को लगभग 1 मिमी x 1 मिमी x 1 मिमी के क्यूब्स में काट लें। संदंश के साथ मीडिया को दबाएं और स्केलपेल का उपयोग करके ऊतक को एक दिशा में काटें। आगे-पीछे न काटें; नुकसान को कम करने के लिए साफ, यूनिडायरेक्शनल कटौती करें। बायोप्सी के आकार को देखते हुए, जितना संभव हो उतना क्यूब्स बनाने की कोशिश करें (चित्रा 1 ई)।
  10. संदंश का उपयोग करके टी 25 फ्लास्क के ऊपरी तिमाही में ऊतक के टुकड़ों को रखें। प्रति फ्लास्क 10-20 क्यूब्स रखें यदि सामग्री की मात्रा इसकी अनुमति देती है (चित्रा 1 एफ)।
    नोट: संदंश की पसलियों के लिए ऊतक के आसंजन को कम करने के लिए चिकनी संदंश का उपयोग करें और आसानी से फ्लास्क में ऊतक को अलग करें।
  11. एक इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर 5% सीओ 2 पर लगभग 10 दिनों के लिएT25 फ्लास्क में ऊतक क्यूब्स को इनक्यूबेट करें।
    नोट:: पहले सेल outgrowth उस समय के आसपास अपेक्षित है। प्रारंभ में माइग्रेट करने वाली कोशिकाएं सामान्य SMCs से छोटी लग सकती हैं.
  12. एक बार जब सेल वृद्धि देखी जाती है, तो फ्लास्क में 2.5 मिलीलीटर माध्यम जोड़ें, यह सुनिश्चित करें कि उन्हें अलग होने से रोकने के लिए ऊतक के टुकड़ों पर इसे पिपेट न करें।
  13. लगभग 5 और दिनों के बाद, जब ऊतक के टुकड़ों के चारों ओर कोशिकाओं के समूहों को देखा जाता है, तो संस्कृति माध्यम को बदलें। यदि ऊतक के टुकड़े अलग हो जाते हैं, तो उन्हें हटा दें क्योंकि वे फिर से संलग्न नहीं होंगे।
  14. एक बार जब कोशिकाएं 80-90% confluent होती हैं, तो उन्हें T75 फ्लास्क में स्थानांतरित करें और इस प्रारूप में खेती जारी रखें।
    नोट:: एक 1:2 या 1:3 विभाजन अनुपात अनुशंसित है। प्रारंभिक मार्ग पर कोशिकाओं का बैकअप फ्रीज करें। कोशिकाएं आमतौर पर मार्ग 10 तक अपने गुणों को बनाए रखती हैं; बाद के मार्गों का उपयोग प्रयोगों के लिए नहीं किया जाना चाहिए।

2. त्वचा बायोप्सी से प्राथमिक त्वचीय fibroblasts अलग करना

नोट:: एक बाँझ ऊतक संस्कृति लैमिनर प्रवाह हुड के अंतर्गत निम्न चरणों का निष्पादन करें। दस्ताने पहनें और मानव रक्त और मानव ऊतक के नमूनों को संभालते समय मानक एसेप्टिक तकनीकों का उपयोग करें। फाइब्रोब्लास्ट्स बेसल मीडियम में 10% भ्रूण गोजातीय सीरम, 100 यू / एमएल पेनिसिलिन और 100 μg / mL स्ट्रेप्टोमाइसिन के साथ पूरक में सुसंस्कृत होते हैं, जिन्हें फाइब्रोब्लास्ट माध्यम के रूप में जाना जाता है।

  1. सर्जिकल संदंश और एक स्केलपेल के दो जोड़े को 70% इथेनॉल में डुबोकर और बाद में उन्हें सूखा पोंछकर निष्फल करें।
  2. एक पेट्री डिश में फाइब्रोब्लास्ट माध्यम के पिपेट 2 एमएल जिसमें ऊतक विच्छेदन किया जाएगा।
  3. पिपेट 2.5 मिलीलीटर फाइब्रोब्लास्ट माध्यम को दो टी 25 फ्लास्क में। फ्लास्क को चारों ओर घुमाएं ताकि माध्यम की छोटी मात्रा पूरी सतह को कवर कर सके।
  4. ठंड, बाँझ ऊतक हस्तांतरण समाधान ( सामग्री की तालिका देखें) या एक बाँझ प्लास्टिक ट्यूब में 0.9% NaCl में बर्फ पर प्रयोगशाला के लिए ऑपरेटिंग रूम से काटे गए त्वचा बायोप्सी परिवहन।
  5. ऊतक संस्कृति हुड के अंदर ऊतक के साथ ट्यूब खोलें। बायोप्सी को निष्फल संदंश का उपयोग करके ट्यूब से बाहर निकालें और इसे पेट्री डिश (चित्रा 2 ए) में रखें।
  6. नेत्रहीन तीन त्वचा परतों, एपिडर्मिस, डर्मिस, और चमड़े के नीचे वसा की पहचान करने के लिए बायोप्सी का निरीक्षण करें। एपिडर्मिस की पहचान करने के लिए, कभी-कभी दृश्यमान बालों के साथ, एक पहचानने योग्य त्वचा की सतह की तलाश करें। विपरीत पक्ष पर, चमड़े के नीचे वसा की तलाश करें, जो अक्सर पीला और पतला होता है। एपिडर्मिस और चमड़े के नीचे की वसा के बीच की परत को डर्मिस के रूप में पहचानें- व्यवहार्य फाइब्रोब्लास्ट का स्रोत (चित्रा 2 बी)।
  7. डर्मिस से फाइब्रोब्लास्ट को अलग करने के लिए, अन्य दो परतों को हटा दें और ऊतक को अपनी तरफ रखें ताकि सभी तीन परतें दिखाई दें।
    नोट: महाधमनी ऊतक के विपरीत, त्वचा की परतों को एक दूसरे से अलग नहीं किया जा सकता है; इसलिए, उन्हें काटा जाना चाहिए। ऊतक भी अधिक रबड़ है, जिससे इसे काटना अधिक कठिन हो जाता है। एक तेज scalpel का उपयोग करें।
  8. संदंश के साथ ऊतक को नीचे रखें। एपिडर्मिस और डर्मिस के बीच की सीमा के समानांतर में कटौती करें। पूरे एपिडर्मिस को काट लें। एक साफ लाइन में कटौती करने की कोशिश करें और ऊतक क्षति से बचने के लिए आगे और पीछे न जाएं।
  9. ऊतक फ्लिप करें। चरण 2.8 के रूप में एक ही प्रक्रिया को दोहराएँ; इस बार, चमड़े के नीचे वसा के साथ सीमा के समानांतर डर्मिस के भीतर कटौती।
  10. एक बार जब डर्मिस अलग हो जाता है, तो ऊतक को क्यूब्स में लगभग 1 x 1 x 1 मिमी3 में काट लें। संदंश के साथ ऊतक को नीचे दबाएं और स्केलपेल का उपयोग करके ऊतक को एक दिशा में काट लें। आगे-पीछे न काटें; नुकसान को कम करने के लिए साफ, यूनिडायरेक्शनल कटौती करें। बायोप्सी के आकार को देखते हुए, जितना संभव हो उतना क्यूब्स बनाने की कोशिश करें (चित्रा 2 सी)।
  11. संदंश का उपयोग करके टी 25 फ्लास्क के ऊपरी तिमाही में ऊतक के टुकड़ों को रखें। प्रति फ्लास्क 10-20 क्यूब्स रखें यदि सामग्री की मात्रा इसकी अनुमति देती है (चित्रा 2 डी)।
    नोट: संदंश की पसलियों के लिए ऊतक के आसंजन को कम करने के लिए चिकनी संदंश का उपयोग करें और आसानी से फ्लास्क में ऊतक को अलग करें।
  12. एक इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर 5% सीओ 2 पर लगभग 10 दिनों के लिएT25 फ्लास्क में ऊतक क्यूब्स को इनक्यूबेट करें।
    नोट:: पहले सेल outgrowth तो चारों ओर अपेक्षित है। शुरू में माइग्रेट करने वाली कोशिकाएं सामान्य फाइब्रोब्लास्ट की तुलना में छोटी लग सकती हैं।
  13. एक बार जब सेल वृद्धि देखी जाती है, तो फ्लास्क में 2.5 मिलीलीटर माध्यम जोड़ें, यह सुनिश्चित करें कि उन्हें अलग होने से रोकने के लिए ऊतक के टुकड़ों पर इसे पिपेट न करें।
  14. लगभग 5 और दिनों के बाद, जब ऊतक के टुकड़ों के चारों ओर कोशिकाओं के समूहों को देखा जा सकता है, तो संस्कृति माध्यम को बदलें। यदि ऊतक के टुकड़े अलग हो जाते हैं, तो उन्हें हटा दें क्योंकि वे फिर से संलग्न नहीं होंगे।
  15. एक बार जब कोशिकाएं 80-90% confluent होती हैं, तो उन्हें T75 फ्लास्क में स्थानांतरित करें और इस प्रारूप में खेती जारी रखें।
    नोट:: एक 1:2 या 1:3 विभाजन अनुपात अनुशंसित है। प्रारंभिक मार्ग पर कोशिकाओं का बैकअप फ्रीज करें। कोशिकाएं आमतौर पर मार्ग 10 तक अपने गुणों को बनाए रखती हैं; बाद के मार्गों का उपयोग प्रयोगों के लिए नहीं किया जाना चाहिए।

3. मापने के संकुचन (उदाहरण SMCs)

  1. एक 96w10e ECIS सरणी तैयार करें (देखें चित्रा 3A आवर्धित इलेक्ट्रोड और इलेक्ट्रोड पर seeded कोशिकाओं के साथ सरणी की एक प्रतिनिधि छवि के लिए).
    नोट:: एक बाँझ ऊतक संस्कृति लैमिनर प्रवाह हुड के अंतर्गत निम्न चरणों का निष्पादन करें।
    1. कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए 10 mM L-cysteine प्रति अच्छी तरह से 200 μL के साथ एक बाँझ 96w10e सरणी कोट।
    2. थाली को दो बार बाँझ पानी से धोएं। ढक्कन थोड़ा खुला के साथ ऊतक संस्कृति हुड में रात भर प्लेट सूखने दें।
      नोट: एल-सिस्टीन के साथ प्लेट को कोटिंग करना केवल पहली बार प्लेट का उपयोग करते समय आवश्यक है।
    3. अगले दिन, यूवी-स्टरलाइज़ प्लेट और ढक्कन 30 मिनट के लिए। ढक्कन को ऊपर की ओर घुमाएं ताकि अंदर का नसबंदी हो जाए। एक बार प्लेट को निष्फल कर दिया जाता है, तो प्रवाह हुड के बाहर प्लेट को न खोलें।
  2. ECIS सरणी पर सीडिंग कक्ष
    1. प्रीवार्म 30 मिनट के लिए पानी के स्नान में 1% बाँझ जिलेटिन समाधान।
      नोट: समाधान फ्रिज में संग्रहीत किया जाता है और ठोस हो सकता है, जिससे पिपेट करना मुश्किल हो जाता है।
    2. इसके बाद, कुओं को प्रति अच्छी तरह से 1% जिलेटिन समाधान के 100 μL के साथ कोट करें और प्लेट को कम से कम 1 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
    3. कुओं से जिलेटिन एस्पिरेट करें।
    4. एक स्वचालित सेल काउंटर का उपयोग करके कोशिकाओं की गणना करें और एसएमसी माध्यम के 200 μL में 30,000 कोशिकाओं / अच्छी तरह से सीडिंग घनत्व पर तीन प्रतियों में एसएमसी को बीज दें।
    5. सेल संस्कृति इनक्यूबेटर में ECIS 96-अच्छी तरह से धारक में SMCs के साथ प्लेट रखें। प्रोग्राम खोलने और सेटअप बटन दबाने के लिए ECIS एप्लाइड बायोफिज़िक्स सॉफ़्टवेयर पर डबल-क्लिक करें।
    6. जांचें कि क्या सभी इलेक्ट्रोड का धारक के साथ संपर्क है (हरा; लाल यदि कोई कनेक्शन नहीं है) बाएं निचले पैनल में वेल कॉन्फ़िगरेशन लेबल किया गया है। यदि इलेक्ट्रोड ठीक से जुड़े नहीं हैं, तो माप शुरू करने से पहले धारक में प्लेट को समायोजित करें।
    7. सरणी प्रकार क्लिक करके एक ही पैनल में प्लेट प्रकार (96-अच्छी तरह से सरणी) का चयन करें।
    8. दाएँ ऊपरी पैनल डेटा संग्रह सेटअप में, एकल आवृत्ति पर क्लिक करें और प्रतिबाधा मान को 4000 हर्ट्ज और अंतराल को 8 सेकंड में परिवर्तित करें।
    9. माप प्रारंभ करने के लिए प्रारंभ बटन क्लिक करें. एक नए पैनल को खोलने के लिए प्रतीक्षा करें, जहां ECIS फ़ाइल सहेजी जा सकती है।
    10. कोशिकाओं को संलग्न करने और 48 घंटे के लिए एक मोनोलेयर स्थापित करने की अनुमति दें।
      नोट:: अनुलग्नक और इलेक्ट्रोड पर कक्षों का प्रसार एक आधार रेखा प्रतिरोध मान उत्पन्न (चित्रा 3B)।
  3. संकुचन को प्रेरित करने के लिए कोशिकाओं की उत्तेजना
    1. कैल्शियम आयोनोफोर, आयनोमाइसिन के 10 μg / mL के साथ कोशिकाओं को उत्तेजित करके एसएमसी संकुचन को प्रेरित करें।
      नोट: Ionomycin extracellular Ca2+ की आमद को प्रेरित करेगा, संकुचनशील कैस्केड को सक्रिय करेगा; गैर-उत्तेजित और उत्तेजित अनुबंधित कोशिकाओं की प्रतिनिधि छवियों के लिए चित्रा 4A देखें।
    2. 10 मिलीग्राम / एमएल का स्टॉक समाधान बनाने के लिए डाइमिथाइलसल्फोक्साइड के 100 μL में 1 मिलीग्राम आयोनोमाइसिन पाउडर को पतला करें, और -20 डिग्री सेल्सियस पर 10 μL ऐलीकोट स्टोर करें। उपयोग करने से पहले, कोशिकाओं में जोड़े जाने वाले कार्य समाधान को तैयार करने के लिए एसएमसी माध्यम में आयनोमाइसिन समाधान 1: 10 को पतला करें।
    3. सेल उत्तेजना का प्रदर्शन करें जबकि सरणी अभी भी सेल संस्कृति इनक्यूबेटर के अंदर सरणी धारक में है और इलेक्ट्रोड सिस्टम से जुड़े हुए हैं।
      1. कोशिकाओं को उत्तेजित करने के लिए, ढक्कन को हटा दें और इसे इनक्यूबेटर के अंदर एक बाँझ सतह पर रखें। दो पिपेट्स तैयार करें, 2 μL और 150 μL पर सेट करें।
      2. उत्तेजना शुरू करने से पहले, सॉफ़्टवेयर में मार्क दबाएं और एक टिप्पणी रखें।
        नोट: यह डेटा का विश्लेषण करते समय उत्तेजना के सटीक समय को ढूंढना आसान बना देगा।
      3. आयोनोमाइसिन के पिपेट 2 μL प्रत्येक में जितनी जल्दी हो सके समाधान काम कर रहे हैं। एक बार जब सभी कोशिकाओं को उत्तेजित कर दिया जाता है, तो दूसरे पिपेट का उपयोग करके कुओं में माध्यम को मिलाएं।
        नोट: तेजी से प्रभाव के कारण, विभिन्न सेल लाइनों और स्थितियों के बीच युक्तियों को बदलने के लिए आवश्यक नहीं है। उत्तेजक और मिश्रण करते समय जल्दी से काम करें क्योंकि आयनोमाइसिन का तीव्र प्रभाव पड़ता है। एक पूर्ण प्लेट को उत्तेजित करते समय, एक बार में अधिकतम 3 कॉलम को उत्तेजित करें। प्रत्येक उत्तेजना के बाद, कम से कम 30 मिनट तक प्रतीक्षा करें जब तक कि अगली उत्तेजना न हो जाए ताकि कोशिकाओं को तापमान से ठीक नहीं किया जा सके और इनक्यूबेटर दरवाजा खोलने के कारण सीओ2 परिवर्तन हो सके।
      4. उत्तेजना के बाद सीधे, प्रेस मार्क फिर से एक टिप्पणी है कि उत्तेजना किया जाता है जोड़ने के लिए.
    4. उत्तेजना प्रयोग को समाप्त करना
      1. आयोनोमाइसिन उत्तेजना के बाद लगभग 5 मिनट के लिए प्रतिबाधा मूल्यों को रिकॉर्ड करें। समाप्त दबाकर रिकॉर्डिंग समाप्त करें.
      2. ईसीआईएस सरणियों को तीन बार तक पुन: उपयोग करें: बाँझ पानी से दो बार कुओं को धोएं, और ट्रिप्सिन या इसी तरह के अभिकर्मक के साथ 2-3 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर प्लेट को इनक्यूबेट करें। चरण 3.1.2 और 3.1.3 को दोहराएँ।
  4. डेटा निर्यात करना
    1. डेटा निर्यात करने के लिए, फ़ाइल | क्लिक करें डेटा | निर्यात करें Excel (चयनित) के लिए. फ़ाइल को सहेजने के लिए किसी फ़ोल्डर का चयन करें.
    2. जब प्रोग्राम पत्रकों को संयोजित या अलग करने के लिए कहता है, तो अलग करें क्लिक करें.
  5. संकुचनशील आउटपुट का विश्लेषण करना
    1. संकुचनशील प्रतिक्रिया की गणना करने के लिए, निम्नलिखित समीकरण (1) का उपयोग करें, जहां सी संकुचन को इंगित करता है (बेसलाइन की तुलना में परिवर्तन के % में व्यक्त), प्रीस्टिमुलेशन (पीआरएस) आयनोमाइसिन उत्तेजना से ठीक पहले प्रतिरोध मूल्य (Ω में व्यक्त) को इंगित करता है और पोस्ट-उत्तेजना (पीओएस) उत्तेजना को समाप्त करने के 2 मिनट बाद प्रतिरोध (Ω में व्यक्त) को इंगित करता है।
      Equation 1 (1)
      नोट: जैसा कि समीकरण (1) में दिखाया गया है, किसी भी संलग्न कक्षों (290 Ω का मान) के बिना संस्कृति माध्यम से अच्छी तरह से भरे हुए प्रतिबाधा मान को अंतिम गणना में सभी परिणामों से घटाया जाता है। प्रत्येक प्रयोग में तीन प्रतियों में संकुचनशील प्रतिक्रियाओं को मापने और किसी भी अंतर-और अंतर-प्रयोगात्मक भिन्नता के लिए खाते के लिए एक ही सेल लाइन के साथ तीन स्वतंत्र प्रयोग करने की सिफारिश की जाती है।
    2. एक बार जब तीन स्वतंत्र प्रयोग किए जाते हैं, तो मानक विचलन (एसडी) सहित तीन मापों के औसत की गणना करके डेटा को एक साथ समूहीकृत करें।
  6. विभिन्न समूहों की तुलना करना
    1. सामान्य संकुचन की सीमा को परिभाषित करने और बाद के विशिष्ट शोध प्रश्नों की जांच करने के लिए, "सामान्य संकुचन" को परिभाषित करने के लिए नियंत्रण समूह का उपयोग करें और इसकी तुलना रोगियों या उपचार समूहों की संकुचनशील प्रतिक्रिया से करें।
    2. पूरे नियंत्रण समूह के माध्य और SD की गणना करें, अर्थात्, सभी कक्ष रेखाओं के लिए अंतिम मानों का, जैसा कि चरण 3.5.2 में वर्णित है.
    3. इस श्रेणी के बाहर आने वाले अन्य समूह में कक्षों की पहचान करने के लिए माध्य ± 2SD की श्रेणी का उपयोग करें, यह दर्शाता है कि उनके पास एक परिवर्तित संकुचनशील प्रतिक्रिया है.
      नोट: परिवर्तित संकुचनशील प्रतिक्रिया के पीछे तंत्र विशिष्ट अनुसंधान प्रश्नों के अधीन है और सेल- और स्थिति-निर्भर है और इस प्रोटोकॉल में चर्चा नहीं की जाएगी।

4. एसएमसी विशिष्ट मार्करों की उपस्थिति का पता लगाना

  1. आरएनए पृथक्करण
    1. बीज एक ही रोगी-विशिष्ट सेल लाइनों 6-अच्छी तरह से प्लेटों में संकुचन माप के लिए इस्तेमाल किया, एक अच्छी तरह से प्रति सेल लाइन. एक स्वचालित सेल काउंटर का उपयोग करके कोशिकाओं की गणना करें और एसएमसी माध्यम में 200,000 कोशिकाओं / अच्छी तरह से सीडिंग घनत्व पर कोशिकाओं को बीज दें और उन्हें रात भर संलग्न करने की अनुमति दें।
    2. बाँझ पीबीएस के साथ कोशिकाओं को एक बार धो लें।
    3. कोशिकाओं को लाइस करें और निर्माता के निर्देशों के अनुसार कोशिकाओं को अलग करें।
  2. cDNA संश्लेषण
    1. एक रिवर्स प्रतिलेखन प्रतिक्रिया मिश्रण के 20 μL में cDNA संश्लेषण प्रदर्शन। निर्माता द्वारा प्रदान किए गए निर्देशों के अनुसार कुल पृथक आरएनए की सांद्रता को पतला करें।
  3. qPCR
    1. एसएमसी मार्कर जीन की जीन अभिव्यक्ति को मापें, उदाहरण के लिए, ACTA2, CNN1, SMTN, और TAGLN यह पुष्टि करने के लिए कि पृथक कोशिकाएं वास्तव में SMCs हैं और SMC मार्करों का पता लगाती हैं। संकुचनशील आउटपुट के साथ परिणामों के सहसंबंध के लिए जाँच करें।
    2. डेटा को सामान्य बनाने के लिए कम से कम दो हाउसकीपिंग जीन का उपयोग करें, उदाहरण के लिए, YWHAZ और TBP।
      नोट:: qPCR रन और विश्लेषण विभिन्न PCR मशीनों और संगत सॉफ़्टवेयर का उपयोग कर किया जा सकता है, जो इस बात पर निर्भर करता है कि प्रयोगशाला में क्या उपलब्ध और अनुकूलित है। प्राइमर अनुक्रमों के लिए पूरक तालिका S1 देखें.

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Representative Results

इस विधि की पुनरुत्पादकता का परीक्षण करने के लिए, विधि को पहले केवल नियंत्रण SMCs का उपयोग करके मान्य किया गया था। Interexperimental माप reproducibility निर्धारित करने के लिए, सभी शामिल नियंत्रण और रोगी सेल लाइनों के दो स्वतंत्र माप एक Bland-Altman साजिश (चित्रा 3B) के रूप में प्लॉट किए गए थे। प्लॉट ने प्रदर्शित किया कि यह विधि एक बाहरी सेल लाइन को छोड़कर, आत्मविश्वास अंतराल के बाहर परिवर्तनशीलता नहीं दिखाती है। इसके अलावा, इन परिणामों ने प्रदर्शित किया कि एक ही प्रयोग के भीतर दो कुओं को सीड किया गया और एक साथ उत्तेजित किया गया व्यावहारिक रूप से एक ही संकुचनशील प्रतिक्रिया वक्र (चित्रा 4 सी) दिखाता है। यह सत्यापित करने के लिए कि क्या दिखाया गया प्रतिक्रिया संकुचन है और आयोनोमाइसिन उत्तेजना के कारण आसमाटिक तनाव नहीं है, माध्यम को उत्तेजना के बाद बदल दिया गया था, और कोशिकाओं के व्यवहार को दर्ज किया गया था। इससे पता चलता है कि उत्तेजित कोशिकाओं ने इलेक्ट्रोड पर फिर से फैलना शुरू कर दिया (चित्रा 4 डी)।

इस उपन्यास विधि के पहले आवेदन के रूप में, स्वस्थ, गैर-फैलाहुआ महाधमनी (एन = 6) और पेट महाधमनी एन्यूरिज्म (एएए) रोगियों (एन = 21) से व्युत्पन्न एसएमसी में संकुचनशील प्रतिक्रिया; चित्रा 5A) मापा गया था, जैसा कि पहलेदिखाया गया था 8. नियंत्रण समूह की औसत प्रतिक्रिया 61% (46-77%) थी, औसत प्रतिक्रिया की तुलना में, रोगी समूह का 52% (15-75%), था। मान काफी अलग नहीं थे, और रोगी समूह में एक उच्च परिवर्तनशीलता देखी गई थी। विधि की नवीनता के कारण, नियंत्रण समूह का उपयोग "सामान्य" संकुचन को निर्धारित करने के लिए किया गया था। चित्रा 5B नियंत्रण समूह के माध्य और ± 2SD श्रेणी को दर्शाता है और इस श्रेणी का उपयोग उन चार रोगियों की पहचान करने के लिए कैसे किया जाता है जिनके पास "सामान्य" मानों की तुलना में कम संकुचन मान हैं। बिगड़ा हुआ संकुचन के कारण का निर्धारण एक अलग यांत्रिक अध्ययन का उद्देश्य है। यह निर्धारित करने के लिए एक पश्चिमी बॉट विश्लेषण किया गया था कि क्या एसएमसी प्रयोग के लिए उपयोग किया जाता है, एसएमसी संकुचनशील मार्करों को व्यक्त करता है। पश्चिमी धब्बा विश्लेषण (चित्रा 6 ए) और बाद के परिमाणीकरण (चित्रा 6 बी) पुष्टि करते हैं कि कोशिकाएं एसएमसी मार्करों को व्यक्त करती हैं। समूहों में मार्कर अभिव्यक्ति चर थी और संकुचनशील आउटपुट के साथ सहसंबंधित नहीं थी। SMC की proliferative क्षमता निर्धारित करने के लिए, Ki67 के लिए qPCR किया गया था (चित्रा 6C)। Ki67 अभिव्यक्ति सभी कोशिकाओं में पता लगाने योग्य था, लेकिन संकुचनशील आउटपुट के साथ सहसंबंधित नहीं था।

Figure 1
चित्रा 1: महाधमनी एएए ऊतक से एसएमसी अलगाव। (ए) महाधमनी ऊतक से एसएमसी अलगाव के लिए आवश्यक सामग्री: एक पेट्री डिश में महाधमनी ऊतक, एसएमसी माध्यम, एसएमसी माध्यम से भरे दो टी 25 फ्लास्क, स्केलपेल, और सर्जिकल संदंश के दो जोड़े। (बी) एथेरोस्क्लेरोटिक सजीले टुकड़े दिखाते हुए महाधमनी की दीवार का अंतरंग पक्ष। (c) महाधमनी दीवार की Adventitial परत. (d) संदंश के साथ खींचकर ट्यूनिका मीडिया और ट्यूनिका एडवेंटिया का पृथक्करण। (ई) ट्यूनिका मीडिया को अलग करने के बाद, संदंश और स्केलपेल का उपयोग करके ऊतक को छोटे टुकड़ों में काट दिया जाता है। (एफ) टी 25 फ्लास्क में रखे गए ऊतक के टुकड़े। संक्षेप: AAA = पेट महाधमनी धमनीविस्फार; SMC = चिकनी मांसपेशी कोशिका। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्र 2: त्वचीय ऊतक से फाइब्रोब्लास्ट अलगाव। (ए) त्वचीय ऊतक से फाइब्रोब्लास्ट अलगाव के लिए आवश्यक सामग्री: पेट्री डिश में त्वचीय ऊतक, फाइब्रोब्लास्ट माध्यम, फाइब्रोब्लास्ट माध्यम, फाइब्रोब्लास्ट माध्यम से भरे दो टी 25 फ्लास्क, स्केलपेल, और सर्जिकल संदंश के दो जोड़े। (बी) त्वचा बायोप्सी ऊपरी तरफ चमड़े के नीचे वसा दिखा रहा है। (सी) डर्मिस को अलग करने के बाद, संदंश और स्केलपेल का उपयोग करके ऊतक को छोटे टुकड़ों में काट दिया जाता है। (डी) टी 25 फ्लास्क में रखे गए ऊतक के टुकड़े। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: ECIS प्लेट सेटअप और महाधमनी SMC संकुचन का ग्राफिक प्रतिनिधित्व. (A) बाएँ; एक 96-अच्छी तरह से ECIS प्लेट. मध्य; ECIS प्लेट के एक कुएं का आवर्धन, कुएं के नीचे दस इलेक्ट्रोड दिखा रहा है। सही; ECIS प्लेट पर seeded SMCs की प्रकाश सूक्ष्मदर्शी छवि; आवर्धन 10x. (B) प्रतिरोध वक्र ECIS द्वारा मापा जाता है, नियंत्रण SMCs के सीडिंग के बाद तीन प्रतियों में। मोटी नीली रेखा तीन प्रतियों के माध्य का प्रतिनिधित्व करती है, और बिंदीदार रेखाएं तीन प्रतियों के एसडी का प्रतिनिधित्व करती हैं। सीडिंग के बाद पहले 4-5 घंटे में, एसएमसी पूरी सतह पर फैल गए, और उच्च प्रतिरोध (~ 1000 Ω) को मापा जाता है। एक बार एक स्थिर एसएमसी मोनोलेयर का गठन होने के बाद, प्रतिरोध समय के साथ लगभग 500 Ω तक कम हो जाता है। इस आंकड़े को 8 से संशोधित किया गया है। संक्षेप: ECIS = इलेक्ट्रिक सेल-सब्सट्रेट प्रतिबाधा संवेदन; एसएमसी = चिकनी मांसपेशी कोशिका; SD = मानक विचलन। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्रा 4: ECIS का उपयोग करके SMC संकुचन को मापना। (A) बाएँ; संकुचन के लिए उत्तेजना से पहले नियंत्रण एसएमसी के एसएमसी मोनोलेयर। सही; संकुचन के लिए उत्तेजना के बाद SMCs को नियंत्रित करें। आवर्धन 10x. (B) दो अलग-अलग संकुचन मापों के बीच अंतर-प्रयोगात्मक माप पुनरुत्पादन का प्रदर्शन करने वाला अंतर प्लॉट। बिंदीदार रेखाएं 95% आत्मविश्वास अंतराल का प्रतिनिधित्व करती हैं, और मोटी औसत दर्जे की रेखा दो अंतर-प्रयोगात्मक मापों के माध्य का प्रतिनिधित्व करती है। प्रत्येक डेटा बिंदु नियंत्रण और रोगियों के पूरे डेटासेट के दो स्वतंत्र मापों के माध्य से विचलन का प्रतिनिधित्व करता है (बैंगनी ●; n = 27)। (ग) ईसीआईएस संकुचन मापों की अंतराक्षीय पुनरुत्पादकता। नियंत्रण एसएमसी द्वारा उत्पन्न प्रतिरोध वक्र दो कुओं में बीज। ऊर्ध्वाधर बिंदीदार रेखा उत्तेजना को चिह्नित करती है। (d) संकुचन की उत्तेजना के बाद सेल वसूली। मोटी नीली रेखा एक unstimulated नियंत्रण SMC के प्रतिरोध मूल्य का प्रतिनिधित्व करता है। बिंदीदार नीली रेखा ऊर्ध्वाधर बिंदीदार काली रेखा द्वारा चिह्नित उत्तेजना के बाद, एक ही नियंत्रण एसएमसी लाइन के प्रतिरोध मूल्य का प्रतिनिधित्व करती है। लगभग 1 घंटे के बाद उत्तेजना (मोटी ऊर्ध्वाधर बिंदीदार काली रेखा), दोनों स्थितियों में माध्यम को उत्तेजना को हटाने के लिए ताज़ा किया गया था, और कोशिकाओं की वसूली को एक और 3.5 घंटे के लिए ट्रैक किया गया था। प्रतिरोध मूल्यों को उत्तेजना के बाद कोशिकाओं के व्यवहार की निगरानी करने के लिए पूर्व-उत्तेजना के मूल्यों के लिए सामान्यीकृत किया गया था। इस आंकड़े को 8 से संशोधित किया गया है। संक्षेप: ECIS = इलेक्ट्रिक सेल-सब्सट्रेट प्रतिबाधा संवेदन; SMC = चिकनी मांसपेशी कोशिका। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 5
चित्रा 5: नियंत्रण में एसएमसी संकुचन और आयनोमाइसिन उत्तेजना पर एएए रोगियों के एसएमसी। (ए) नियंत्रण की माध्य संकुचनशील प्रतिक्रिया (ब्लू ●; एन = 6) और एएए रोगी (लाल ●; एन = 21) कई प्रयोगों से व्युत्पन्न आयोनोमाइसिन उत्तेजना पर एसएमसी। (बी) नियंत्रण की माध्य संकुचन प्रतिक्रिया (नीला ●; एन = 6), सामान्य अनुबंध (लाल ●; एन = 15), और कम अनुबंध (लाल ●; एन = 6) एएए रोगियों के एसएमसी कई प्रयोगों से व्युत्पन्न। संकुचन को उत्तेजना से पहले बेसलाइन मूल्य की तुलना में कमी के प्रतिशत में व्यक्त किया जाता है। क्षैतिज काली रेखा नियंत्रण SMCs की माध्य संकुचनशील प्रतिक्रिया को दर्शाती है। बिंदीदार क्षैतिज रेखाएँ नियंत्रण समूह के माध्य के ऊपर और नीचे दो SDs को चिह्नित करती हैं. कम अनुबंधित समूह को नियंत्रण समूह के माध्य से नीचे दो एसडी से कम संकुचन के रूप में परिभाषित किया गया है। बॉक्सप्लॉट को रेंज के साथ माध्यिका के रूप में दिखाया गया है। इस आंकड़े को 8 से संशोधित किया गया है। संक्षेप: एएए = पेट महाधमनी एन्यूरिज्म; ECIS = इलेक्ट्रिक सेल-सब्सट्रेट प्रतिबाधा संवेदन; एसएमसी = चिकनी मांसपेशी कोशिका; SD = मानक विचलन। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 6
चित्रा 6: SMC मार्कर अभिव्यक्ति. नियंत्रण के एसएमसी में एसएमसी संकुचनशील और प्रोलिफेरेटिव मार्करों का विश्लेषण किया गया था (Π; n = 6), सामान्य अनुबंध, (●; n = 15), और कम अनुबंध (π; n = 6)। (ए) संकुचन प्रयोगों के लिए उपयोग किए जाने वाले एसएमसी का पश्चिमी धब्बा विश्लेषण। एएसएमए, कैल्पोनिन और एसएम 22 को परिमाणित किया गया था, और ट्यूबुलिन का उपयोग लोडिंग नियंत्रण के रूप में किया गया था। (बी) (ए) में दर्शाए गए पश्चिमी धब्बे का परिमाणीकरण। (C) Ki67 प्रसार मार्कर का qPCR विश्लेषण। इस आंकड़े को 8 से संशोधित किया गया है। संक्षेप: SMC = चिकनी मांसपेशी कोशिका; aSMA = अल्फा चिकनी मांसपेशी Actin; qPCR = मात्रात्मक PCR। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक तालिका S1: प्राइमर अनुक्रम. आगे और रिवर्स qPCR विश्लेषित हाउसकीपिंग और एसएमसी मार्कर जीन के प्राइमर अनुक्रमों. इस तालिका को 8 से संशोधित किया गया है। संक्षेप: SMC = चिकनी मांसपेशी कोशिका; qPCR = मात्रात्मक PCR। इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए कृपया यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

यह पेपर प्रतिबाधा और सतह के कब्जे में परिवर्तन के आधार पर विट्रो में एसएमसी संकुचन को मापने के लिए एक विधि प्रस्तुत करता है। सबसे पहले, रोगी-विशिष्ट प्राथमिक मानव एसएमसी और त्वचा फाइब्रोब्लास्ट के अलगाव, खेती और विस्तार का वर्णन किया गया है, इसके बाद संकुचन माप के लिए उनका उपयोग कैसे किया जाए।

अध्ययन की एक सीमा एक स्पष्टीकरण प्रोटोकॉल के माध्यम से कोशिकाओं को प्राप्त करने से संबंधित है। बायोप्सी से फैलने वाली कोशिकाओं में विवो में मूल ऊतक की तुलना में अलग-अलग गुण हो सकते हैं। इसके अतिरिक्त, यहां प्रस्तुत स्पष्टीकरण प्रोटोकॉल अभिनव नहीं हैं, लेकिन इस मामले में, संकुचन माप के लिए रोगी-विशिष्ट महाधमनी एन्यूरिज्म सामग्री से एक पूर्ण वर्कफ़्लो प्रस्तुत करने के लिए शामिल हैं। विट्रो में कोशिकाओं को संवर्धित करना भी प्रणालीगत कारकों और विभिन्न सब्सट्रेट कठोरता की कमी के कारण उनके कुछ गुणों को प्रभावित कर सकता है। यह SMC मार्कर अभिव्यक्ति में परिवर्तनशीलता के लिए खाता हो सकता है। विश्वसनीय फाइब्रोब्लास्ट मार्करों की अनुपस्थिति के कारण, फाइब्रोब्लास्ट आमतौर पर अन्य कोशिकाओं की तुलना में मार्करों की अनुपस्थिति के आधार पर प्रतिष्ठित होते हैं। इस प्रकार हमने इस प्रोटोकॉल के साथ अलग किए गए फाइब्रोब्लास्ट्स की विशेषता नहीं की है। एक और सीमा यह है कि सतह के कारक के रूप में संकुचन को मापना कुछ हद तक अप्रत्यक्ष रहता है। संभावित परिणाम यह है कि आउटपुट हजारों कोशिकाओं वाले पूरे कुएं की प्रतिक्रिया के औसत से आता है। इस प्रकार, यह निर्धारित नहीं किया जा सकता है कि क्या सभी कोशिकाएं कम अनुबंध करती हैं या क्या ऐसी कोशिकाएं हैं जो औसत को कम करती हैं।

एसएमसी संकुचन का अध्ययन पहले विभिन्न तकनीकों का उपयोग करके किया गया था। कर्षण बल माइक्रोस्कोपी 4 की तुलना में,ECIS के कई फायदे हैं, मुख्य रूप से, उच्च थ्रूपुट और समय दक्षता। जैसा कि सीमाओं में कहा गया है, ट्रेडऑफ यह है कि संकुचन माप अप्रत्यक्ष रूप से प्राप्त किए जाते हैं, जिससे ईसीआईएस को बड़ी संख्या में सेल लाइनों और समूहों की स्क्रीनिंग के लिए अधिक उपयुक्त बनाया जाता है और अधिक गहराई से एकल-सेल यंत्रवत अध्ययनों के लिए कर्षण बल को मापने के लिए अधिक उपयुक्त बनाया जाता है। कैल्शियम ग्रेडिएंट6 को पहले संकुचन के संकेतकों के रूप में उपयोग किया गया था; ECIS एक अधिक विश्वसनीय संकुचन माप प्रदान करता है क्योंकि यह सेल के लोकोमोशन को मापता है। जेल5 के अंदर बीजित कोशिकाओं के संकुचन के कारण कोलेजन झुर्रियों की छवियों का परिमाणीकरण ईसीआईएस के समान बीज कोशिकाओं की पूरी आबादी का औसत प्रदान करता है। हालांकि, ईसीआईएस के माध्यम से प्राप्त माप कहीं अधिक सटीक हैं और अवलोकन के पूरे पाठ्यक्रम के दौरान वास्तविक समय की निगरानी प्रदान करते हैं, जिससे उन्हें काफी अधिक जानकारीपूर्ण बना दिया जाता है।

अंत में, यह पेपर ईसीआईएस सिस्टम के लिए एक उपन्यास आवेदन का वर्णन करता है, जिसका उपयोग अनुयायी कोशिकाओं के संकुचन को मापने के लिए किया जा सकता है, जैसे कि एसएमसी और फाइब्रोब्लास्ट। इस विधि का उपयोग समय पर और कुशल फैशन में कई सेल लाइनों का अध्ययन करने के लिए किया जा सकता है, जिससे यह रोगी या दवा स्क्रीनिंग के लिए उपयुक्त हो जाता है। महाधमनी एन्यूरिज्म पर शोध के अनुरूप, इस विधि का उपयोग अन्य हृदय संबंधी विकारों जैसे विच्छेदन और एथेरोस्क्लेरोसिस वाले रोगियों के एसएमसी को स्क्रीन करने के लिए भी किया जा सकता है।

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Disclosures

लेखकों के पास घोषित करने के लिए हितों का कोई संघर्ष नहीं है।

Acknowledgments

हम कृतज्ञतापूर्वक तारा वैन Merrienboer, अल्बर्ट वैन Wijk, Jolanda वैन डेर Velden, जन डी Blankensteijn, लैन ट्रान, पीटर एल Hordijk, PAREL-AAA टीम, और एम्स्टर्डम UMC के सभी संवहनी सर्जन, Zaans Medisch Centrum, और Dijklander अस्पताल इस अध्ययन के लिए सामग्री और समर्थन प्रदान करने के लिए स्वीकार करना चाहते हैं।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
96-well Array Applied Biophysics 96W10idf PET Array used to measure contraction in the ECIS setup
Custodiol Dr. Franz Höhler Chemie GmbH RVG 12801 Solution used to transfer tissue in from surgery room to laboratorium
Dimethyl sulfoxide Sigma-Aldrich 472301 Solution used to dilute ionomycin
Fetal Bovine Serum Gibco 26140079 Addition to cell culture medium
Ham's F-10 Nutrient Mix Gibco 11550043 Medium used to culture skin fibroblasts
Human Vascular Smooth Muscle Cell Basal Medium (formerly ''Medium 231'') Gibco M231500 Medium used to culture smooth muscle cells
Invitrogen countess II Thermo Fisher Scientific AMQAX1000 Automated cell counter
Ionomycin calcium salt from Streptomyces conglobatus Sigma-Aldrich I0634-1MG Compound used for contraction stimulation
NaCl 0.9% Fresenius Kabi B230561 Solution used to transfer tissue in from surgery room to laboratorium
Penicillin-Streptomycin Gibco 15140122 Antibiotics used for cell culture medium
Phospathe buffered saline Gibco 10010023 Used to wash cells
Quick-RNA Miniprep Kit Zymo Research R1055 Kit used for RNA isolation
Smooth Muscle Growth Supplement (SMGS) Gibco S00725 Supplement which is added to smooth muscle cell culture medium
SuperScript VILO cDNA Synthesis Kit Thermo Fisher Scientific 11754250 Kit used for cDNA synthesis
SYBR Green PCR Master Mix Thermo Fisher Scientific 4309155 Reagent for qPCR
Trypsin-EDTA Gibco 15400-054 Used to trypsinize cells
ZTheta Applied Biophysics ZTheta ECIS instrument used for contraction measurements

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References

  1. Milewicz, D. M., et al. Genetic basis of thoracic aortic aneurysms and dissections: focus on smooth muscle cell contractile dysfunction. Annual Review of Genomics and Human Genetics. 9, 283-302 (2008).
  2. Milewicz, D. M., et al. Altered smooth muscle cell force generation as a driver of thoracic aortic aneurysms and dissections. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 37 (1), 26-34 (2017).
  3. Groeneveld, M. E., et al. Betaglycan (TGFBR3) up-regulation correlates with increased TGF-β signaling in Marfan patient fibroblasts in vitro. Cardiovascular Pathology. 32, 44-49 (2018).
  4. Chen, J., Li, H., SundarRaj, N., Wang, J. H. C. Alpha-smooth muscle actin expression enhances cell traction force. Cell Motility and the Cytoskeleton. 64 (4), 248-257 (2007).
  5. Peyton, S. R., Putnam, A. J. Extracellular matrix rigidity governs smooth muscle cell motility in a biphasic fashion. Journal of Cellular Physiology. 204 (1), 198-209 (2005).
  6. Williams, D. A., Fogarty, K. E., Tsien, R. Y., Fay, F. S. Calcium gradients in single smooth muscle cells revealed by the digital imaging microscope using Fura-2. Nature. 318 (6046), 558-561 (1985).
  7. Wu, D., et al. NLRP3 (nucleotide oligomerization domain-like receptor family, pyrin domain containing 3)-caspase-1 inflammasome degrades contractile proteins: implications for aortic biomechanical dysfunction and aneurysm and dissection formation. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 37 (4), 694-706 (2017).
  8. Bogunovic, N., et al. Impaired smooth muscle cell contractility as a novel concept of abdominal aortic aneurysm pathophysiology. Scientific Reports. 9 (1), 1-14 (2019).
  9. Hurst, V., Goldberg, P. L., Minnear, F. L., Heimark, R. L., Vincent, P. A. Rearrangement of adherens junctions by transforming growth factor-β1: role of contraction. American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 276 (4), 582-595 (1999).
  10. Hu, N., et al. Comparison between ECIS and LAPS for establishing a cardiomyocyte-based biosensor. Sensors and Actuators B: Chemical. 185, 238-244 (2013).
  11. Peters, M. F., Lamore, S. D., Guo, L., Scott, C. W., Kolaja, K. L. Human stem cell-derived cardiomyocytes in cellular impedance assays: bringing cardiotoxicity screening to the front line. Cardiovascular Toxicology. 15 (2), 127-139 (2015).
  12. Zhang, S., Yang, Y., Kone, B. C., Allen, J. C., Kahn, A. M. Insulin-stimulated cyclic guanosine monophosphate inhibits vascular smooth muscle cell migration by inhibiting Ca/calmodulin-dependent protein kinase II. Circulation. 107 (11), 1539-1544 (2003).
  13. Halterman, J. A., Kwon, H. M., Zargham, R., Bortz, P. D. S., Wamhoff, B. R. Nuclear factor of activated T cells 5 regulates vascular smooth muscle cell phenotypic modulation. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 31 (10), 2287-2296 (2011).
  14. Bass, H. M., Beard, R. S., Cha, B. J., Yuan, S. Y., Nelson, P. R. Thrombomodulin induces a quiescent phenotype and inhibits migration in vascular smooth muscle cells in vitro. Annals of Vascular Surgery. 30, 149-156 (2016).
  15. Burger, J., et al. Molecular phenotyping and functional assessment of smooth muscle like-cells with pathogenic variants in aneurysm genes ACTA2, MYH11, SMAD3 and FBN1. Human Molecular Genetics. , (2021).
  16. Yeung, K. K., et al. Transdifferentiation of human dermal fibroblasts to smooth muscle-like cells to study the effect of MYH11 and ACTA2 mutations in aortic aneurysms. Human Mutation. 38 (4), 439-450 (2017).

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जीव विज्ञान मुद्दा 180 चिकनी मांसपेशी सेल महाधमनी धमनीविस्फार संकुचन translational इन विट्रो संकुचन परख रोगी विशिष्ट प्राथमिक सेल अलगाव
प्राथमिक रोगी-विशिष्ट महाधमनी चिकनी मांसपेशी कोशिकाओं और <em>विट्रो में</em> अर्धमात्रात्मक वास्तविक समय संकुचन माप का अलगाव
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Bogunovic, N., Rombouts, K. B., Yeung, K. K. Isolation of Primary Patient-specific Aortic Smooth Muscle Cells and Semiquantitative Real-time Contraction Measurements In Vitro. J. Vis. Exp. (180), e63122, doi:10.3791/63122 (2022).

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