Summary
Her præsenterer vi en protokol til at opdage neutralisering epitoper på antigen-displaying virus-lignende partikler (VIP'er). Immunprecipitation af human immundefektvirus (HIV)-afledte VLPs udføres ved hjælp af konvolutglycoproteinerspecifikke monoklonale antistoffer koblet til protein G-konjugerede magnetiske perler. Tilfangetagne VLPs udsættes efterfølgende for SDS-PAGE og Western blot-analyse, der anvender viralt kerneprotein Gag-specifikke antistoffer.
Abstract
Den virus-lignende partikel (VLP) fange assay er en immunprecipitation metode, almindeligvis kendt som en 'pull-down assay', der anvendes til at rense og isolere antigen-displaying VLPs. Overflade antigen-specifikke antistoffer er koblet til, og dermed immobiliseret på en solid og uopløselig matrix såsom perler. På grund af deres høje affinitet til målet antigen, disse antistoffer kan fange VIP'er dekoreret med cognate antigen forankret i membranen kuvert af VIP'er. Denne protokol beskriver bindingen af antigenspecifikke antistoffer mod protein A- eller G-konjugeret magnetiske perler. I vores undersøgelse undersøges human immundefektvirus (HIV)-afledte VLPs dannet af det gruppespecifikke antigen (Gag) virale kerneprækursorprotein p55 Gag og viser konvolutglycoproteiner (Env) af HIV. VLPs er fanget ved hjælp af bredt neutraliserende antistoffer (bNAbs) rettet mod neutralisering-følsomme epitoper i Env. VLP-opsamlingsanalysen, der er skitseret her, repræsenterer en følsom og let at udføre metode til at påvise, at (i) VLPs er dekoreret med det respektive målantigen, (ii) overfladeantigen bevarede sin strukturelle integritet, som det fremgår af den epitopspecifikke binding af bNAbs, der anvendes i analysen, og iii) VLPs strukturelle integritet afsløret ved påvisning af Gag-proteiner i en efterfølgende vestlig blotanalyse. Derfor letter udnyttelsen af bNAbs til immunprecipitation en forudsigelse af, om VLP-vacciner vil være i stand til at fremkalde et neutraliserende B-cellerespons hos vaccinerede mennesker. Vi forventer, at denne protokol vil give andre forskere en værdifuld og ligetil eksperimentel tilgang til at undersøge potentielle VLP-baserede vacciner.
Introduction
Viruslignende partikler (VLPs) ligner den oprindelige viruspartikelstruktur, mens de mangler det virale genom, hvilket giver en høj sikkerhedsprofil1,2. VLPs repræsenterer en individuel klasse af vacciner, der i stigende grad udvikles på grund af deres høje immunogenicitet3,4,5,6,7. Dette er især tilfældet for membran-indhyllede VIP'er, der giver mulighed for visning af ikke kun homologe viral overfladeantigener, men også heterologe antigener som tumorantigener8,9,10. Figur 1 giver et eksemplarisk overblik over strukturen af en indhyllet antigen-dekoreret VLP. Under udviklingsprocessen af VLP-baserede vacciner er analyser uundværlige, hvilket gør det muligt at analysere det respektive målantigen, der vises på VLP-overfladen. Sådanne analyser bør være medvirkende til at belyse sammensætningen af en partikelvaccine: (i) Er VLPs dekoreret med det respektive overfladeantigen? ii) Har overfladeantigen bevaret sin oprindelige struktur, som det fremgår af epitopgenkendelse af neutraliserende antistoffer (bNAbs) og iii) kan VLPs strukturelle integritet bekræftes på grund af påvisning af VLP-formationen af virusprotein?
Figur 1: Skematisk illustration af en membrankonvoluterede VLP. VIP'er er dannet af umodne forløber Gag kerneproteiner og omgivet af en lipidmembran afledt af værtscellen. Antigener, f.eks kuvert glycoproteiner, er indarbejdet i lipidmembranen og vises på overfladen af VLP (til højre). Antigenspecifikke antistoffer genkender antigen. Til venstre vises en skaldet VLP uden antigendekoration. Klik her for at se en større version af dette tal.
Især VLPs dannet af viral gruppe-specifikke antigen (Gag) kerne prækursor protein p55 af human immundefekt virus type 1 (HIV-1) foretrækkes stilladser for antigen display i vaccine udvikling som talrige antistoffer, og ELISA kits er tilgængelige, muliggør kvantificering af disse VLPs11,12. HIV-1 kuvert glycoproteiner (Env), nemlig transmembran protein gp41 (gp41-TM) og den opløselige overflade enhed gp120 (gp120-SU), der danner heterodimers, er indarbejdet i membranen kuvert af partikler og er afgørende mål antigener til udvikling af vacciner mod hiv-infektion13,14,15 . Visning af neutraliseringsfølsomme epitoper i disse målantigener er en forudsætning for at fremkalde et bredt neutraliserende antistofrespons hos vacciner. Udover en T-cellerespons rettet mod Gag-proteinerne betragtes dette som en vigtig korrelering af beskyttelse mod hiv-infektion16. Derfor, og ved design og produktion af VIP'er dekoreret med mål antigen kandidater, den efterfølgende analyse af kvaliteten af de viste antigener udgør et kritisk skridt i processen med vaccine udvikling.
Immunprecipitation (IP) er en meget anvendt teknik til påvisning af protein-protein interaktioner og rensning af proteinkomplekser i lille skala17. Barret et al. første gang rapporteret om udviklingen i IP i 1960, men denne metode er blevet konstant yderligere forbedret. IP gør det muligt at fange og isolere et målantigen (bytte) fra en opløsning ved at anvende et antigenspecifikt antistof (agn), der er immobiliseret ved kobling til perler18,19. I denne protokol demonstrerer vi en variation af den klassiske IP-applikation ved hjælp af membrankonvoluterede p55 Gag-dannede VIP'er som bytte og bNAbs, der genkender neutraliseringsfølsomme epitoper i konvolutproteinerne, der vises på overfladen af VIP'erne som agnproteiner. Den vellykkede anvendelse af denne VLP capture assay letter forudsigelsen af, om de testede antigen-positive VLPs vil være i stand til at fremkalde en neutraliserende B-cellerespons hos vaccinerede mennesker. Sådanne immunogene egenskaber af VLP-baserede vaccinekandidater påvises ofte i små dyremodeller20,21,22.
For at vurdere kvaliteten af den nyudviklede VLP-vaccinekandidat er VLP-opsamlingsanalyser med succes blevet anvendt5,23,24. Antallet af offentliggjorte metoder er dog begrænset. Den VLP capture assay præsenteret her starter med immobilisering af Env-specifikke bNAbs på protein G-konjugerede perler, som binder sig til Fc-regionen af pattedyr-afledte antistoffer. Typiske matricer til immobilisering af det foretrukne antistof er agarose eller magnetiske perler. Men magnetiske perler er gunstige for high-throughput applikationer25. I det næste trin, VLPs viser målet antigen er fanget af bNAb-belagt perler. De dannede immunkomplekser bestående af Env-positive VIP'er og immobiliserede bNAbs beriges let ved hjælp af en magnet. De isolerede immunkomplekser er eluted i det sidste trin. Efterfølgende kan VLPs være biokemisk karakteriseret. Her udførte vi vestlig blot-analyse, der anvender p55 Gag virale kerneproteinspecifikke antistoffer for at vise, at det udfældede mål Env-antigener ikke kun husede de neutraliseringsfølsomme epitoper, men blev også vist på Gag-dannede VIP'er. Desuden øger påvisning af den virale kerne Gag proteiner følsomheden af fangst assay, da Gag proteiner er mere rigelige end Env i en VLP. I HIV-1 er Env-proteiner kun til stede ved et enkelt- eller tocifret nummer26, mens mere end 3.500 Gag-molekyler udgør kernen i en partikel27.
Sammenlignet med andre teknikker til undersøgelse af protein-protein interaktioner28,29, VLP capture assay giver en alternativ metode til forskningslaboratorier ikke har adgang til dyre analytiske instrumenter. For eksempel kan transmissionselektronmikroskopisk analyse (TEM), overfladeplasmon resonansspektroskopi (SPR) og nanopartiklersporingsanalyse (NTA) være omkostningskrævende. Fangst assay præsenteret her giver også mulighed for senere underkastelse af fanget antigen-positive VLP prøver til yderligere protein karakterisering, f.eks beskæftiger gel elektroforese, immunblotting, elektronmikroskopi, og massespektrometri (MS), henholdsvis. I betragtning af at den oprindelige struktur af målet antigen er bevaret under VLP fange assay, også udførelsen af en indfødt SIDE og efterfølgende immunblæser teknikker kan udnyttes.
VLP capture assay repræsenterer en nem at bruge og følsom metode til at undersøge udsmykningen af VLPs med mål antigener udsætter neutralisering-følsomme epitoper, og dermed deres nytte som fremtidige vaccine kandidater.
Protocol
1. Prøveforberedelse
- Seed VLP producent suspension cellelinjer stammer fra 293-F celler, der udtrykker HIV strukturelle gener gag alene eller i samråd med env 30 på en lav celletæthed på 0,5 x 106 celler pr mL i 293-F Expression Medium.
- Lad dem udvide i 3-4 dage ved 37 °C og 8% CO2 i en shaker inkubator rotation med en bane på 5 cm og 135 runder i minuttet (rpm).
- Pjece producentcellerne ved centrifugering ved 100 x g i 5 min. Filtrer det afklarede supernatant for at fjerne restceller og celleaffald ved hjælp af 0,45 μm polyvinylidenfluen fluorid (PVDF) membransprøjtefiltre for at opnå cellefri cellekultur supernatant (CFSN).
BEMÆRK: Protokollen kan sættes på pause her. CFSN kan opbevares natten over ved 4 °C. - Brug enten CFSN direkte til eksperimentet eller pille-VLPs fra 35 mL CFSN, der anvender ultracentrifugering (112.700 x g, 4 °C, 1,5 timer).
- Ved ultracentrifugering skal supernatanten kasseres og suspendere VLP-pellets i 200 μL på 15% (w/v) trehaloseopløsning pr. centrifugerør.
BEMÆRK: VLP-pellet er ofte ikke synlig for det blotte øje. Protokollen kan sættes på pause her. VLPs kan opbevares ved -80 °C. - Forud for VLP-opsamlingsanalysen bestemmes de virale kerneproteinkoncentrationer i VLP-indeholder prøver ved hjælp af en ELISA. Dette trin er vigtigt at standardisere capture assay input.
2. VLP capture assay
BEMÆRK: En oversigt over arbejdsprocessen er afbildet i figur 2.
- Afbryd de magnetiske perler ved enten at pipetter op og ned eller blande på en rotator ved 50 omdr./min.
- I mellemtiden forberede antistofopløsningen, der indeholder bNAbs. Brug 10 μg af hver bNAb i 200 μL antistofbinding og vaskebuffer (se Materialetabel) pr. reaktion.
BEMÆRK: Antistofmængderne kan variere afhængigt af affiniteten af bNAb- og antigendekorationstætheden på de anvendte VLPs. - Brug 50 μL af den magnetiske perleopløsning (se Materialetabel) pr. reaktion, og overfør perlerne til et 1,5 mL reaktionsrør. Placer rørene på den magnetiske adskillelse rack.
BEMÆRK: Alternativt kan en stærk enkelt magnet bruges til hvert rør til at adskille perlerne fra supernatanten. - Vent et par minutter, indtil perlerne samles ved rørvæggen for at sikre, at alle perler samles. Fjern supernatanten.
- Magneten fjernes, og perlerne suspenderes i 200 μL af bNAb-opløsningen, der er fremstillet i trin 2.2. Inkuber i 30 min til 3 timer blanding på en rotator ved 50 rpm ved stuetemperatur.
- Placer reaktionsrørene i det magnetiske separationsstativ igen, vent og fjern supernatanten.
- Fjern rørene fra magneten og vask perlerne ved at genoplive i 200 μL antistofbinding og vaskebuffer.
- Gentag trin 2.4. Fjern så meget vaskebuffer som muligt.
- Føj prøverne til de perlebundne bNAb'er.
BEMÆRK: VLP-indgangen til opsamlingsanalysen ved hjælp af HIV-afledte partikler skal være mindst 15 ng viralt kerneprotein pr. reaktion. VLP-mængderne kan variere afhængigt af bNAb'ens affinitet og antigendekorationstætheden på de anvendte VLPs. - Hvis den prøvevolumen, der blev tilføjet i trin 2.9, er under 1 mL, skal du tilføje PBS for at justere prøvevolumenet til 1 mL. Afbryd perlerne forsigtigt ved at pipetter.
- Inkuber prøver og perler i 2,5 timer på en rotator ved stuetemperatur. Sørg for, at perlerne forbliver i suspension, og opløsningen blandes grundigt under inkubation.
- Placer rørene på magneten og fjern supernatanten.
- Vask de magnetiske perler ved at suspendere dem i 200 μL vaskebuffer (se Materialetabel). Gentag vasketrinnet tre gange.
- Afhæng perlerne i 100 μL vaskebuffer, og affjedringen overføres til et rent (varmebestandigt) reaktionsrør.
- Placer røret på den magnetiske adskillelse rack (se Tabel af materialer) og fjerne supernatant helt.
- Forberedelse af denaturerede SDS-PAGE prøver efter trin 2.16.1-2.16.2 eller ikke-denaturerede prøver ved at undvige VIP'erne fra de magnetiske perler efter trin 2.16.3-2.16.5.
- For at forberede denaturerede SDS-PAGE-prøver skal perlerne suspenderes i 20-80 μL laemmlibuffer (0,8 μL Laemmli buffer pr. 1 ng p55 Gag-analyseinput) og inkuberes ved 95 °C i 5 min.
- Fortsæt direkte med SDS-PAGE, eller opbevar prøverne ved -20 °C.
FORSIGTIG: Laemmli buffer indeholder 2-mercaptoethanol og natrium dodecyl sulfat. Brug beskyttelseshandsker og øjenbeskyttelse. Undgå kontakt med hud, øjne og tøj. Inhaler ikke dampe. Arbejd i et godt ventileret rum, f.eks.
BEMÆRK: Protokollen kan sættes på pause her. - Alternativt kan du udføre et ikke-denaturerende elutionstrin for at opnå VIP'er med konserveret indfødt proteinstruktur.
- Der tilsættes 25 μL elutionbuffer (ofte forsynet med perlerne) til de magnetiske perler og inkuberes i 2-5 min ved stuetemperatur.
- Fjern perlerne og overfør eluatet til et rent rør. Eluatet anvendes til efterfølgende analyser, eller opbevar den ved 4 °C.
BEMÆRK: Protokollen kan sættes på pause her.
3. Analyse af tilfangetagne VLP-prøver
BEMÆRK: Til analyse af de tilfangetagne VIP'er skal du foretage en SDS-PAGE og efterfølgende vestlig blot-analyse31,32.
- Placer prøverørene på det magnetiske rack for at adskille perlerne fra opløsningen.
- 10 μL af hver prøve i gelens individuelle brønde.
BEMÆRK: I denne protokol blev virale p55 Gag-kerneproteiner opdaget ved at anvende polyklonale kaninantistoffer rettet mod HIV Gag og sekundær polyklonal kylling anti-kanin IgG kombineret med peberrod peroxidase (HRP) antistoffer. Virale kerneproteiner blev visualiseret ved hjælp af chemiluminescensdetektering.
Figur 2: Skematisk illustration af de vigtigste trin i VLP-opsamlingsanalysen ved hjælp af cellefrie supernatanter. (1) VLP-opsamlingsanalysen starter med bindingen af HIV-1 bNAbs til protein G-koblede magnetiske perler. I mellemtiden fremstilles VLP-opløsningen med en defineret p55-koncentration. Den cellefri kultur supernatant består af en blanding af p55 Gag VIP'er, værtscelleproteiner og nukleinsyrer. (2) De magnetiske perler, der er koblet til bNAbs, og VLP-opløsningen overføres til et 1,5 mL-reaktionsrør efterfulgt af inkubation under rotation. (3) Antigen-displaying VLPs er fanget af bNAbs-belagt perler. Adskillelse af disse immunkomplekser fra værtscelle-afledte forurenende stoffer udføres i et magnetfelt. (4) Supernatanten fjernes ved pipettering, og perlerne vaskes tre gange for at fjerne ubundne VLPs. (5) I næste trin tilsættes reduktion af proteinbelastningsbufferen til immunkomplekserne bestående af magnetiske perler belagt med bNAbs og fangede VIP'er. (6) Kogning af prøven tager afstand fra bNAbs og målantigen fra de magnetiske perler og lysis VLPs. (7) Magnetiske perler adskilles fra opløsningen i et magnetfelt. (8) Proteinprøverne udsættes for SDS-PAGE. (9) Vestlige blot-analyse udføres for at opdage virale p55 Gag kerneproteiner. Klik her for at se en større version af dette tal.
Representative Results
Figur 3 viser et repræsentativt resultat af VLPs, der først blev fanget fra henholdsvis CFSN- og VLP-pellets ved hjælp af bNAbs og efterfølgende underkastes vestlig blotanalyse til at detektere virale kerneproteiner. De perler, der anvendes til opsamling assay blev belagt med tre forskellige bNAbs rettet mod neutralisering-følsomme epitoper af Env glycoproteiner og isotype antistoffer tjener som negative kontroller, henholdsvis. Ved hjælp af isotypeantistoffer-coatede perler, ingen Gag proteiner kunne påvises i prøver, der indeholder Env-negative (skaldede VLPs) eller Env-viser VLPs beskæftiger vestlige blot-analyse. Dette viste, at den uspecifikke binding af VIP'er til perler belagt med humane antistoffer ikke mægle VLP fangst. Skaldede VLPs var heller ikke bundet af bNAbs-coatede perler, og derfor igen, ingen Gag proteiner kunne påvises. I modsætning hertil fangede alle tre bNAbs VLPs, der viste Env-proteiner (Env VLPs), og derfor blev Gag-proteiner efterfølgende let opdaget. Som synlig i figur 3 kan opsamlingsanalysen anvendes til at analysere målantigen, der viser VLPs i henholdsvis CFSN og pelleted VLP-prøver.
Figur 3: Påvisning af neutraliseringsfølsomme epitoper i HIV-1-konvolutglycoproteiner, der vises på p55 Gag-dannede VIP'er ved hjælp af bredt neutraliserende antistoffer. Repræsentative resultater af vestlige blot-analyse ved hjælp af viral Gag kerne protein-specifikke antistoffer efter at have udført en VLP capture assay beskæftiger tre forskellige bredt neutraliserende antistoffer (bNAb 1, bNAb 2, og bnAb 3) rettet mod epitoper inden for HIV-1 kuvert glycoproteiner (Env). Isotype humane antistoffer samlet fra human sera tjente som negativ kontrol. Cellekultur supernatants blev høstet fra suspension celle kulturer producerer VIP'er med Env proteiner (Env VLPs) og skaldede VLPs (Env-negative), henholdsvis, samt fra naive celler ikke udtrykke nogen virale proteiner (mock). Både supernatants fra den skaldede VLP producent celle kultur samt fra mock celle kultur tjente som negative kontroller. Supernatants blev befriet fra forurenende celler ved hjælp af lavhastighed centrifugering og efterfølgende filtrering for at opnå cellefri supernatanter (CFSN) til analyse. Ved immunprecipitation blev vestlig blotanalyse udført ved hjælp af polyklonale kaninantistoffer rettet mod Gag og sekundære anti-kanin IgG-HRP konjugates. Den tilsyneladende molekylvægt i kilodaltons (kDa) som synlig fra molekylvægtmarkøren (MW) er afbildet til venstre. Pilene angiver det fundne prækursorprotein p55 Gag. (A) For hver prøve blev CFSN indeholdende 100 ng Gag-protein anvendt på opsamlingsanalysen for at standardisere inputmængden af VLPs. B) VLP-pellets blev fremstillet ved ultracentrifugering af CFSN. Pellets indeholdende 100 ng Gag protein blev anvendt til opsamling assay ved hjælp af isotype antistoffer og bNAb 3. Prøver til bNAb 1 og bNAb 2 indeholdt kun 25 ng gag. Klik her for at se en større version af dette tal.
Discussion
Forud for VLP-opsamlingsanalysen evalueres dannelsen af VIP'er og udtrykket af målantigen i VLP-producentcellelinjerne. Instrumentale metoder er flowcytometrisk analyse af antigens celleoverfladeudtryk samt antigen- og viral kerneproteinspecifik ELISA af CFSN og pelleterede VLPs.
Kritiske trin i VLP capture assay er belægningen af perlerne med fange antistoffer - her bNAbs - og den efterfølgende fangst af antigen-positive VIP'er af antistof-coatede perler. Vellykket belægning af perlerne med antistoffer afhænger af valget af det konjugerede immunoglobulin (Ig)-bindende protein. Donorarterne samt antistoffernes Ig-klasse afgør, om protein G- eller protein A-konjugerede perler er at foretrække. For de fleste arter og Ig klasser, protein G er ligand valg33. Som et alternativ til protein A /G-konjugerede perler, streptavidin perler til belægning med biotinylerede antistoffer er tilgængelige. Perler kan også være kovalent kombineret med antistoffer.
Opsamlingen af VLPs af antistofbelagte perler afhænger af grundig blanding, tilstrækkelig inkubationstid, antigen overflod og affinitet af fangeantistoffet. Det er vores erfaring, at en grundig blanding af de antistofbelagte perler med VLP-prøverne bedst opnås ved udnyttelse af mængder >500 μL i 1,5 mL rør under rotation i mindst 2 timer ved stuetemperatur eller 4 °C. En anden potentiel forhindring er den for lave mængde VIP'er i stikprøven. For antistoffer, der binder målantigen stærkt, tilførslen af VLP helt ned til 15 ng Gag-protein giver normalt mulighed for let påviselige mængder af de virale kerneproteiner, der anvender vestlig blot-analyse. Antistoffer med lav affinitet kræver dog højere inputmængder, f.eks. 100 ng Gag-protein, for at opnå afgørende resultater (figur 3, bNAb 3).
Nogle overfladeantigener er tilbøjelige til proteaseforringelse. Her anbefaler vi tilsætning af proteasehæmmere til VLP-prøverne og inkubationen ved 4 °C. Ikke-specifik vedhæftning af værtscelleproteiner og VIP'er til de perlebundne antistoffer observeres sjældent og bør udelukkes ved at anvende passende negative kontroller, som vi her viste ved hjælp af mock og skaldede VLP-prøver og isotypekontrolantistoffer. Strategier til reduktion af ikke-specifik binding omfatter udvidede vasketrin og tilsætning af kasein i vaskebufferen34. Desuden kan opsamlingsanalysen også forbedres ved at bestemme det optimale forhold mellem antistof og VLP-mængden, der viser antigen.
I det sidste trin af VLP capture assay, beskriver vi udløsning af immunkomplekser fra perlerne ved kogning i at reducere Laemmli buffer. I løbet af dette trin adskilles VIP'erne, og opsamlingsantistofferne og målantigener adskilles fra perlerne. Især skal donorarten af det primære antistof, der anvendes i den efterfølgende vestlige blot-analyse, afvige fra donoren af capture antistoffet for at undgå utilsigtet påvisning af tilfangetagelsesantistoffet fra de sekundære antidonor IgG HRP-konjugerede antistoffer.
VLP capture assay præsenteret her giver en nem at bruge og følsom metode til at opdage neutralisering-følsomme epitoper i strukturelle intakte mål antigener vises på VLP overflader. Opsamlingsanalysen muliggør dog ikke direkte kvantificering af epitopen. ELISA, der udføres med bNAbs, er afgørende til dette formål og bør gennemføres parallelt, især hvis undersøgte VIP'er er beregnet til at blive anvendt i prækliniske undersøgelser, der anvender dyremodeller35. Dette er afgørende, da mængden af antigen direkte kan korrelere med elicitation af et neutraliserende antistofrespons hos immuniserede dyr, som vist for porcine circovirus type 2 (PCV2) vacciner36.
En ideel vaccine bør resultere i elicitation af bNAbs rettet mod de neutraliseringsfølsomme epitoper på virionoverfladen. Analysen af disse epitoper, især med henvisning til deres fulde strukturelle integritet på partikelvaccineoverfladen, er afgørende for at identificere potentielle vaccinekandidater. Dette er ikke kun tilfældet for hiv-afledte VLPs, men også for mange andre VLP-vacciner under udvikling37. Fremtrædende VLP-baserede vacciner er f.eks. afledt af ikke-indhyllede eller capsid forældrevirus såsom human papillomavirus (HPV). I modsætning til HIV-1 partikler, som kun dannes af et strukturelt kerneprotein, nemlig p55 Gag, og indhyllet af membranen, der stammer fra VLP-producentcellen, består HPV-partikler kun af et eller to strukturelle kerneproteiner38,39. Ligeledes og som præsenteret her for indhyllede VLPs, VLP capture assay kan også være gældende for påvisning af neutralisering-følsomme epitoper af ikke-indhyllede VLPs.
Som et alternativ til opsamlingsanalysen kan VLP-prøverne direkte underkastes native PAGE efterfulgt af vestlig blotanalyse ved hjælp af bNAbs og passende sekundære antistoffer koblet til HRP40. Men og til analyse af HIV Env-dekoreret VLPs, denne analyse er mindre følsom, da kun et lavt antal antigen proteiner pr VLP kan forventes. I modsætning hertil letter opsamlingsanalysen påvisning af de kerneproteiner, der er rigelige med store mængder pr. VLP, for hiv-afledte VLPs udgør mere end 3.500 Gag-proteiner en VLP27. Dette giver mulighed for den meget følsomme indirekte påvisning af epitoper i Env, der vises selv ved lave tætheder på VIP'er.
Antallet af veletablerede metoder til at undersøge neutraliseringsfølsomme epitoper i overfladeantigener af VIP'er er begrænset. Mærkning af antigener, der vises på VLPs, er mulig med epitopspecifikke antistof-fluorophore konjugates og efterfølgende påvisning ved nanopartiklersporingsanalyse (NTA), der muliggør detektion og kvantificering af VLPs. Denne metode er også blevet udviklet og optimeret til exosomer, der præsenterer celleoverflademarkører41. Også overflade plasmon resonans (SPR) spektroskopi giver mulighed for analyse af interaktioner mellem ukonkret neutraliserende antistoffer og cognate epitoper præsenteret på VIP'er. Selvom VLPs ikke er egnede til analyse af højere gennemløb, kan de også mærkes med bNAbs koblet til guldpartikler og efterfølgende transmissionselektronmikroskopisk (TEM)-undersøgelse42.
Konklusionen er, at VLP-opsamlingsanalysen giver nogle betydelige fordele: i) Vurdering af den neutraliseringsfølsomme epitopes strukturelle integritet på VLP'ernes overflade, ii) følsom og indirekte påvisning af antigener, selv når de vises ved lave tætheder på VLPs, og iii) metoden kræver ikke omkostningskrævende analyseudstyr.
Disclosures
Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen interessekonflikt.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af et tilskud fra det tyske forbundsministerium for uddannelse og forskning, finansieringsprogram Forschung en Fachhochschulen, kontraktnumrene 13FH767IA6 og 13FH242PX6 til JS. Figur 1 og 2 blev oprettet med BioRender.com.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL reaction tubes | Eppendorf | ||
| 10x PBS | gibco | 70011044 | |
| 4%–15% Mini-PROTEAN TGX stain-free protein gels | BioRad | 4568085 | |
| Antibodies (bnAbs) | Polymun Scientic | ||
| Isotype control antibody | invitrogen (Thermo Fisher Scientific) | 02-7102 | |
| Chemidoc XRS+ imaging system | BioRad | 1708265 | |
| Chicken anti-rabbit IgG HRP-coupled | Life technologies | A15987 | 1:5000 in TBS-T + 2 % (w/v) powdered milk |
| Dynabeads Protein G Immunoprecipitation Kit | invitrogen (Thermo Fisher Scientific) | 10007D | includes buffers and washing solutions |
| FreeStyle 293-F cells | invitrogen (Thermo Fisher Scientific) | R790-07 | |
| FreeStyle 293 Expression Medium | invitrogen (Thermo Fisher Scientific) | 12338026 | |
| Gel blotting papers | Whatman | GB005 | |
| Glycine | Carl Roth | 0079 | blotting buffer |
| Magnetic separation rack | New England Biolabs | S1509S | for 12 x 1.5 mL or 6 x 1.5 mL tubes |
| Methanol | Carl Roth | 4627 | blotting buffer |
| Mini-PROTEAN Tetra Cell electrophoresis system | BioRad | ||
| Optima XE-90 ultracentrifuge | Beckman Coulter | ||
| PageRuler prestained protein ladder | Thermo Scientific | 26616 | |
| Polyvinylidene fluoride (PVDF) syringe filters, 0.45 µm | Carl Roth | KC89.1 | |
| Powdered milk | Carl Roth | T145 | blocking buffer |
| PVDF transfermembrane, 0.45 µm | Carl Roth | T830.1 | |
| QuickTiter HIV p24 ELISA | Cell Biolabs | VPK-108-H | |
| Rabbit polyclonal to HIV1 p55 + p24 + p17 | abcam | ab63917 | 1:2000 in TBS-T + 2 % (w/v) powdered milk |
| Rotator | Heidolph | REAX2 | |
| ROTI Load 1 (laemmli buffer) | Carl Roth | K929.1 | 4x concentrated reducing protein gel loading buffer |
| ROTIPHORESE 10x SDS-PAGE | Carl Roth | 3060 | |
| Sodium chloride | Carl Roth | 3957 | TBS-T buffer |
| SuperSignal West Pico PLUS chemiluminescent substrate | Thermo Scientific | 34579 | |
| SW28 rotor | Beckman Coulter | ||
| Thermomixer | Cel Media | basic | |
| Trans-Blot Turbo | BioRad | ||
| Trehalose dihydrate | Carl Roth | 8897.2 | |
| TRIS | Carl Roth | 5429 | blotting buffer |
| TRIS hydrochloride | Carl Roth | 9090 | TBS-T buffer |
| Tween-20 | Carl Roth | 9127 | TBS-T buffer |
| Ultra Clear centrifuge tubes | Beckman Coulter | 344058 |
References
- Roldão, A., Mellado, M. C. M., Castilho, L. R., Carrondo, M. J. T., Alves, P. M.
- Noad, R., Roy, P.
- Qian, C., et al. Recent progress on the versatility of virus-like particles. Vaccines. 8 (1), 139 (2020).
- Zabel, F., Kündig, T. M., Bachmann, M. F. Virus-induced humoral immunity: On how B cell responses are initiated. Current Opinion in Virology. 3 (3), 357-362 (2013).
- Garg, H., Mehmetoglu-Gurbuz, T., Joshi, A. Virus Like Particles (VLP) as multivalent vaccine candidate against Chikungunya, Japanese Encephalitis, Yellow Fever and Zika Virus. Scientific Reports. 10 (1), 4017 (2020).
- Hodgins, B., Pillet, S., Landry, N., Ward, B. J. A plant-derived VLP influenza vaccine elicits a balanced immune response even in very old mice with co-morbidities. PLoS ONE. 14 (1), 0210009 (2019).
- Lai, C. C., et al. Process development for pandemic influenza VLP vaccine production using a baculovirus expression system. Journal of Biological Engineering. 13, 78 (2019).
- Caldeira, J. C., Perrine, M., Pericle, F., Cavallo, F. Virus-like particles as an immunogenic platform for cancer vaccines. Viruses. 12 (5), 488 (2020).
- Nika, L., et al. An HER2-displaying virus-like particle vaccine protects from challenge with mammary carcinoma cells in a mouse model. Vaccines. 7 (2), 41 (2019).
- Mohsen, M. O., Zha, L., Cabral-Miranda, G., Bachmann, M. F. Major findings and recent advances in virus-like particle (VLP)-based vaccines. Seminars in Immunology. 34, 123-132 (2017).
- Fontana, D., Garay, E., Cevera, L., Kratje, R., Prieto, C., Gòdia, F. Chimeric VLPs based on hiv-1 gag and a fusion rabies glycoprotein induce specific antibodies against rabies and foot-and-mouth disease virus. Vaccines. 9 (3), 251 (2021).
- Cervera, L., et al. Production of HIV-1-based virus-like particles for vaccination: achievements and limits. Applied Microbiology and Biotechnology. 103 (18), 7367-7384 (2019).
- Gonelli, C. A., King, H. A. D., Mackenzie, C., Sonza, S., Center, R. J., Purcell, D. F. J. Immunogenicity of HIV-1-based virus-like particles with increased incorporation and stability of membrane-bound env. Vaccines. 9 (3), 1-36 (2021).
- Trkola, A. HIV not as simple as one, two, three. Nature. 568, 321-322 (2019).
- Berman, P. W., et al. Protection of chimpanzees from infection by HIV-1 after vaccination with recombinant glycoprotein gp120 but not gp160. Nature. 345 (6276), 622-625 (1990).
- Barouch, D. H. Challenges in the development of an HIV-1 vaccine. Nature. 455 (7213), 613-619 (2008).
- DeCaprio, J., Kohl, T. O. Immunoprecipitation. Cold Spring Harbor Protocols. 2020 (11), 449-461 (2020).
- Barret, B., Wood, P. A., Volwiler, W. Quantitation of gamma globulins in human serum by immunoprecipitation. Journal of Laboratory and Clinical Medicine. 55, 605-615 (1960).
- Kaboord, B., Perr, M. Isolation of proteins and protein complexes by immunoprecipitation. Methods in Molecular Biology. 424, Clifton, N.J. 349-364 (2008).
- Lee, S. H., Chu, K. B., Kang, H. J., Quan, F. S. Virus-like particles containing multiple antigenic proteins of Toxoplasma gondii induce memory T cell and B cell responses. PLoS ONE. 14 (8), 0220865 (2019).
- Lee, Y. T., et al. Intranasal vaccination with M2e5x virus-like particles induces humoral and cellular immune responses conferring cross-protection against heterosubtypic influenza viruses. PLoS ONE. 13 (1), 0190868 (2018).
- Wang, J., et al. Large-scale manufacture of VP2 VLP vaccine against porcine parvovirus in Escherichia coli with high-density fermentation. Applied Microbiology and Biotechnology. 104 (9), 3847-3857 (2020).
- Swenson, D. L., et al. Generation of Marburg virus-like particles by co-expression of glycoprotein and matrix protein. FEMS Immunology and Medical Microbiology. 40 (1), 27-31 (2004).
- Latham, T., Galarza, J. M. Formation of wild-type and chimeric influenza virus-like particles following simultaneous expression of only four structural proteins. Journal of Virology. 75 (13), 6154-6165 (2001).
- Doyle, J., Ray, M., Ouyang, A., Benton, B., Bell, P. A. Abstract 4877: High throughput proteomic applications using protein A/G magnetic beads. Association for Cancer Research (AACR) 102nd Annual Meeting. 20, 4877 (2011).
- Zhu, P., et al. Electron tomography analysis of envelope glycoprotein trimers on HIV and simian immunodeficiency virus virions. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (26), 15812-15817 (2003).
- Lavado-García, J., Jorge, I., Boix-Besora, A., Vázquez, J., Gòdia, F., Cervera, L. Characterization of HIV-1 virus-like particles and determination of Gag stoichiometry for different production platforms. Biotechnology and Bioengineering. 118 (7), 2660-2675 (2021).
- Miura, K. An overview of current methods to confirm protein-protein interactions. Protein & Peptide Letters. 25 (8), 728-733 (2018).
- Rao, V. S., Srinivas, K., Sujini, G. N., Kumar, G. N. Advances in molecular techniques to study diversity. Plant Biotechnology, Volume 1: Principles, Techniques, and Applications. , 341-365 (2017).
- Rosengarten, J. F., Schatz, S., Wolf, T., Barbe, S., Stitz, J. Components of a HIV-1 vaccine mediate virus-like particle (VLP)-formation and display of envelope proteins exposing broadly neutralizing epitopes. Virology. , 41-48 (2022).
- JoVE, JoVE. Grundlegende Methoden in der Zell- und Molekularbiologie. Separating Protein with SDS-PAGE. JoVE Science Education Database. , Cambridge, MA. (2021).
- Eslami, A., Lujan, J. Western blotting: sample preparation to detection. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (44), e2359 (2010).
- Sheng, S., Kong, F. Separation of antigens and antibodies by immunoaffinity chromatography. Pharmaceutical Biology. 50 (8), 1038-1044 (2012).
- Guzzo, C., et al. Virion incorporation of integrin 47 facilitates HIV-1 infection and intestinal homing. Science Immunology. 2 (11), (2017).
- Wei, M., et al. Bacteria expressed hepatitis E virus capsid proteins maintain virion-like epitopes. Vaccine. 32 (24), 2859-2865 (2014).
- Jin, J., Park, C., Cho, S. H., Chung, J. The level of decoy epitope in PCV2 vaccine affects the neutralizing activity of sera in the immunized animals. Biochemical and Biophysical Research Communications. 496 (3), 846-851 (2018).
- Zhang, X., et al. Lessons learned from successful human vaccines: Delineating key epitopes by dissecting the capsid proteins. Human Vaccines and Immunotherapeutics. 11 (5), 1277-1292 (2015).
- DiGiuseppe, S., Bienkowska-Haba, M., Guion, L. G. M., Keiffer, T. R., Sapp, M. Human papillomavirus major capsid protein L1 remains associated with the incoming viral genome throughout the entry process. Journal of Virology. 91 (16), 00537 (2017).
- Wang, J. W., Roden, R. B. S.
- Binley, J. M., et al. Profiling the specificity of neutralizing antibodies in a large panel of plasmas from patients chronically infected with human immunodeficiency virus type 1 subtypes B and C. Journal of Virology. 82 (23), 11651-11668 (2008).
- Thane, K. E., Davis, A. M., Hoffman, A. M. Improved methods for fluorescent labeling and detection of single extracellular vesicles using nanoparticle tracking analysis. Scientific Reports. 9 (1), 12295 (2019).
- Mulder, A. M., et al. Toolbox for non-intrusive structural and functional analysis of recombinant VLP based vaccines: A case study with hepatitis B vaccine. PLoS ONE. 7 (4), 0033235 (2012).
