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Immunology and Infection

एंटीजन में न्यूट्रलाइजेशन-संवेदनशील एपिटोप का पता लगाना वायरस की तरह कण (वीएलपी) पर प्रदर्शित- एक कैप्चर परख का उपयोग करके आधारित टीके

Published: February 10, 2022 doi: 10.3791/63137
Automatic Translation
*1,2, *1,2, 1
1Research Group Pharmaceutical Biotechnology, TH Köln - University of Applied Sciences, 2Institute of Technical Chemistry, Leibniz University Hannover
* These authors contributed equally

Summary

यहां, हम एंटीजन-डिस्प्लेिंग वायरस जैसे कणों (वीएलपी) पर न्यूट्रलाइजेशन एपिटोप का पता लगाने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं। मानव इम्यूनोडेफिशिएंसी वायरस (एचआईवी) -व्युत्पन्न वीएलपी का इम्यूनोप्रिसिपिटेशन प्रोटीन जी-संयुग्मित चुंबकीय मोतियों के साथ युग्मित लिफाफा ग्लाइकोप्रोटीन-विशिष्ट मोनोक्लोनल एंटीबॉडी का उपयोग करके किया जाता है। कैप्चर किए गए वीएलपी को बाद में एसडीएस-पेज और पश्चिमी धब्बा-विश्लेषण के अधीन किया जाता है जो वायरल कोर प्रोटीन गैग-विशिष्ट एंटीबॉडी को नियोजित करता है।

Abstract

वायरस की तरह कण (VLP) कैप्चर परख एक immunoprecipitation विधि है, जिसे आमतौर पर एंटीजन-डिस्प्लेिंग VLPs को शुद्ध और अलग करने के लिए उपयोग की जाने वाली 'पुल-डाउन परख' के रूप में जाना जाता है। सतह एंटीजन-विशिष्ट एंटीबॉडी को युग्मित किया जाता है, और इस प्रकार मोतियों जैसे ठोस और अघुलनशील मैट्रिक्स पर स्थिर किया जाता है। लक्ष्य एंटीजन के लिए उनकी उच्च आत्मीयता के कारण, ये एंटीबॉडी वीएलपी के झिल्ली लिफाफे में लंगर डाले गए संज्ञानात्मक एंटीजन के साथ सजाए गए वीएलपी को कैप्चर कर सकते हैं। यह प्रोटोकॉल प्रोटीन ए- या जी-संयुग्मित चुंबकीय मोतियों के लिए एंटीजन-विशिष्ट एंटीबॉडी के बंधन का वर्णन करता है। हमारे अध्ययन में, मानव इम्यूनोडेफिशिएंसी वायरस (एचआईवी) -व्युत्पन्न वीएलपी समूह-विशिष्ट एंटीजन (गैग) वायरल कोर अग्रदूत प्रोटीन पी 55 गैग द्वारा गठित और एचआईवी के लिफाफे ग्लाइकोप्रोटीन (एनवी) को प्रदर्शित करने की जांच की जाती है। VLPs को Env में न्यूट्रलाइजेशन-संवेदनशील एपिटोप के खिलाफ निर्देशित मोटे तौर पर बेअसर करने वाले एंटीबॉडी (bNAbs) का उपयोग करके कब्जा कर लिया जाता है। यहां उल्लिखित वीएलपी कैप्चर परख एक संवेदनशील और आसान-से-प्रदर्शन विधि का प्रतिनिधित्व करता है ताकि यह प्रदर्शित किया जा सके कि (i) वीएलपी को संबंधित लक्ष्य एंटीजन के साथ सजाया जाता है, (ii) सतह एंटीजन ने अपनी संरचनात्मक अखंडता को बनाए रखा, जैसा कि परख में उपयोग किए जाने वाले बीएनएबी के एपिटोप-विशिष्ट बंधन द्वारा प्रदर्शित किया गया था और (iii) वीएलपी की संरचनात्मक अखंडता बाद के पश्चिमी धब्बा-विश्लेषण में गैग प्रोटीन का पता लगाने से पता चला है। नतीजतन, immunoprecipitation के लिए bNAbs का उपयोग इस बात की भविष्यवाणी की सुविधा प्रदान करता है कि क्या वीएलपी टीके टीकाकरण किए गए मनुष्यों में एक बेअसर बी सेल प्रतिक्रिया प्राप्त करने में सक्षम होंगे। हम उम्मीद करते हैं कि यह प्रोटोकॉल संभावित वीएलपी-आधारित टीकों की जांच करने के लिए एक मूल्यवान और सरल प्रयोगात्मक दृष्टिकोण के साथ अन्य शोधकर्ताओं को प्रस्तुत करेगा।

Introduction

वायरस जैसे कण (वीएलपी) वायरल जीनोम की कमी के दौरान देशी वायरस कण संरचना के समान होते हैं, इस प्रकार एक उच्च सुरक्षा प्रोफ़ाइल प्रदान करते हैं1,2। वीएलपी टीकों के एक व्यक्तिगत वर्ग का प्रतिनिधित्व करते हैं जो तेजी से उनके उच्च इम्युनोजेनेसिटी 3,4,5,6,7 के कारण विकसित हुए हैं। यह विशेष रूप से झिल्ली-कवर वीएलपी के लिए मामला है, जो न केवल होमोलोगस वायरल सतह एंटीजन के प्रदर्शन के लिए अनुमति देता है, बल्कि ट्यूमर एंटीजन 8,9,10 जैसे हेटरोलॉगस एंटीजन भी है। चित्रा 1 एक कवर एंटीजन-सजाए गए वीएलपी की संरचना का एक अनुकरणीय अवलोकन प्रदान करता है। वीएलपी-आधारित टीकों की विकास प्रक्रिया के दौरान, एसेस वीएलपी सतह पर प्रदर्शित संबंधित लक्ष्य एंटीजन के विश्लेषण को सक्षम करने के लिए अपरिहार्य हैं। इस तरह के assays एक कण वैक्सीन की संरचना को स्पष्ट करने के लिए महत्वपूर्ण होना चाहिए: (i) क्या वीएलपी संबंधित सतह एंटीजन के साथ सजाया गया है? (ii) क्या सतह एंटीजन ने अपनी मूल संरचना को बरकरार रखा है जैसा कि बेअसर करने वाले एंटीबॉडी (बीएनएबी) की एपिटोप मान्यता द्वारा प्रदर्शित किया गया है और (iii) क्या वायरल प्रोटीन मध्यस्थता वीएलपी गठन का पता लगाने के कारण वीएलपी की संरचनात्मक अखंडता की पुष्टि की जा सकती है?

Figure 1
चित्रा 1: एक झिल्ली-कवर वीएलपी का योजनाबद्ध चित्रण। वीएलपी अपरिपक्व अग्रदूत गैग कोर प्रोटीन द्वारा बनाए जाते हैं और मेजबान कोशिका से व्युत्पन्न लिपिड झिल्ली से घिरे होते हैं। एंटीजन, उदाहरण के लिए, लिफाफा ग्लाइकोप्रोटीन, लिपिड झिल्ली में शामिल होते हैं और वीएलपी की सतह पर (दाईं ओर) प्रदर्शित होते हैं। एंटीजन-विशिष्ट एंटीबॉडी एंटीजन को पहचानते हैं। बाईं ओर, एंटीजन सजावट के बिना एक गंजा वीएलपी दिखाया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

विशेष रूप से वायरल समूह-विशिष्ट एंटीजन (गैग) मानव इम्यूनोडेफिशिएंसी वायरस टाइप 1 (एचआईवी -1) के कोर अग्रदूत प्रोटीन पी 55 द्वारा गठित वीएलपी कई एंटीबॉडी के रूप में वैक्सीन विकास में एंटीजन प्रदर्शन के लिए पसंदीदा मचान हैं, और एलिसा किट उपलब्ध हैं, जो इन वीएलपी 11,12 के परिमाणीकरण को सक्षम करते हैं। एचआईवी -1 लिफाफा ग्लाइकोप्रोटीन (Env), अर्थात्, ट्रांसमेम्ब्रेन प्रोटीन gp41 (gp41-TM) और घुलनशील सतह इकाई gp120 (gp120-SU) heterodimers बनाने, कणों के झिल्ली लिफाफे में शामिल कर रहे हैं और एचआईवी संक्रमण के खिलाफ टीकों के विकास के लिए महत्वपूर्ण लक्ष्य एंटीजन हैं13,14,15 . इन लक्ष्य एंटीजन में न्यूट्रलाइजेशन-संवेदनशील एपिटोप का प्रदर्शन टीकों में व्यापक रूप से बेअसर एंटीबॉडी प्रतिक्रिया प्राप्त करने के लिए एक शर्त है। गैग प्रोटीन के खिलाफ निर्देशित एक टी सेल प्रतिक्रिया के अलावा, इसे एचआईवी संक्रमण के खिलाफ सुरक्षा का एक महत्वपूर्ण सहसंबंध माना जाता है। नतीजतन, और लक्ष्य एंटीजन उम्मीदवारों के साथ सजाए गए वीएलपी के डिजाइन और उत्पादन पर, प्रदर्शित एंटीजन की गुणवत्ता का बाद का विश्लेषण टीका विकास की प्रक्रिया में एक महत्वपूर्ण कदम का प्रतिनिधित्व करता है।

Immunoprecipitation (आईपी) प्रोटीन-प्रोटीन इंटरैक्शन का पता लगाने और छोटे पैमाने पर प्रोटीन परिसरों के शुद्धिकरण के लिए एक व्यापक रूप से उपयोग की जाने वाली तकनीक है। बैरेट एट अल। पहली बार 1960 में आईपी के विकास पर रिपोर्ट की गई थी, फिर भी, इस विधि में लगातार और सुधार किया गया है। आईपी एक एंटीजन-विशिष्ट एंटीबॉडी (चारा) को मोतियों 18,19 के युग्मन द्वारा स्थिर करके एक समाधान से एक लक्ष्य एंटीजन (शिकार) को कैप्चर और अलगाव को सक्षम बनाता है। इस प्रोटोकॉल में, हम झिल्ली-कवर वाले p55 गैग-गठित वीएलपी का उपयोग करके शास्त्रीय आईपी एप्लिकेशन की एक भिन्नता को शिकार और बीएनएबी के रूप में प्रदर्शित करते हैं जो वीएलपी की सतह पर चारा प्रोटीन के रूप में प्रदर्शित लिफाफे प्रोटीन में न्यूट्रलाइजेशन-संवेदनशील एपिटोप को पहचानते हैं। इस वीएलपी कैप्चर परख के सफल आवेदन की भविष्यवाणी की सुविधा है कि क्या परीक्षण एंटीजन सकारात्मक वीएलपी टीका लगाए गए लोगों में एक बेअसर बी सेल प्रतिक्रिया प्राप्त करने में सक्षम होगा। वीएलपी-आधारित वैक्सीन उम्मीदवारों के इस तरह के इम्युनोजेनिक गुणों को अक्सर छोटे पशु मॉडल 20,21,22 में प्रदर्शित किया जाता है।

नव विकसित वीएलपी वैक्सीन उम्मीदवार की गुणवत्ता का आकलन करने के लिए, वीएलपी कैप्चर एसेस का सफलतापूर्वक उपयोग किया गया है5,23,24। हालाँकि, प्रकाशित विधियों की संख्या सीमित है। यहां प्रस्तुत वीएलपी कैप्चर परख प्रोटीन जी-संयुग्मित मोतियों पर एनवी-विशिष्ट बीएनएबी के स्थिरीकरण के साथ शुरू होता है, जो स्तनधारी-व्युत्पन्न एंटीबॉडी के एफसी क्षेत्र से बंधता है। पसंद के एंटीबॉडी के स्थिरीकरण के लिए विशिष्ट आव्यूह agarose या चुंबकीय मोती हैं। हालांकि, चुंबकीय मोती उच्च-थ्रूपुट अनुप्रयोगों 25 के लिए अनुकूल हैं। अगले चरण में, लक्ष्य एंटीजन प्रदर्शित करने वाले वीएलपी को बीएनएबी-लेपित मोतियों द्वारा कैप्चर किया जाता है। Env-positive VLPs और immobilized bNAbs से मिलकर गठित प्रतिरक्षा परिसरों को चुंबक का उपयोग करके आसानी से समृद्ध किया जाता है। पृथक प्रतिरक्षा परिसरों को अंतिम चरण में अलग किया जाता है। इसके बाद, वीएलपी को जैव रासायनिक रूप से विशेषता दी जा सकती है। यहां, हमने पश्चिमी धब्बा-विश्लेषण किया जिसमें पी 55 गैग वायरल कोर प्रोटीन-विशिष्ट एंटीबॉडी को नियोजित किया गया था ताकि यह प्रदर्शित किया जा सके कि अवक्षेपित लक्ष्य एनवी एंटीजन न केवल न्यूट्रलाइजेशन-संवेदनशील एपिटोप को आश्रय दे रहे थे, बल्कि गैग-गठित वीएलपी पर भी प्रदर्शित किए गए थे। इसके अलावा, वायरल कोर गैग प्रोटीन का पता लगाने से कैप्चर परख की संवेदनशीलता बढ़ जाती है क्योंकि गैग प्रोटीन एक वीएलपी में एनवी की तुलना में अधिक प्रचुर मात्रा में होते हैं। एचआईवी -1 में, एनवी प्रोटीन केवल एक एकल या दोहरे अंकों की संख्या 26 पर मौजूद होते हैं, जबकि 3,500 से अधिक गैग अणु एक कण 27 के कोर का निर्माण करते हैं।

प्रोटीन-प्रोटीन इंटरैक्शन 28,29 की परीक्षा के लिए अन्य तकनीकों की तुलना में, वीएलपी कैप्चर परख अनुसंधान प्रयोगशालाओं के लिए एक वैकल्पिक विधि प्रदान करता है जो महंगे विश्लेषणात्मक उपकरणों तक पहुंच नहीं रखते हैं। उदाहरण के लिए, संचरण इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपिक-विश्लेषण (टीईएम), सतह प्लास्मोन अनुनाद स्पेक्ट्रोस्कोपी (एसपीआर), और नैनोपार्टिकल ट्रैकिंग-विश्लेषण (एनटीए) लागत-गहन हो सकते हैं। कैप्चर परख यहाँ भी कब्जा कर लिया एंटीजन सकारात्मक वीएलपी नमूनों के बाद के अधीनता की अनुमति देता है आगे प्रोटीन लक्षण वर्णन करने के लिए, उदाहरण के लिए, जेल वैद्युतकणसंचलन, immunoblotting, इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी, और मास स्पेक्ट्रोमेट्री (एमएस), क्रमशः रोजगार. यह देखते हुए कि लक्ष्य एंटीजन की मूल संरचना वीएलपी कैप्चर परख के दौरान संरक्षित है, यह भी एक देशी पृष्ठ और बाद में immunoblotting तकनीकों के प्रदर्शन का उपयोग किया जा सकता है।

वीएलपी कैप्चर परख एक आसान-से-उपयोग और संवेदनशील विधि का प्रतिनिधित्व करता है ताकि लक्ष्य एंटीजन के साथ वीएलपी की सजावट की जांच की जा सके, जो न्यूट्रलाइजेशन-संवेदनशील एपिटोप को उजागर करता है, और इस प्रकार भविष्य के वैक्सीन उम्मीदवारों के रूप में उनकी उपयोगिता।

Protocol

1. नमूना तैयारी

  1. बीज वीएलपी उत्पादक निलंबन सेल लाइनों एचआईवी संरचनात्मक जीन को व्यक्त करने वाली 293-एफ कोशिकाओं से व्युत्पन्न अकेले या 293-एफ अभिव्यक्ति माध्यम में 0.5 x 106 कोशिकाओं प्रति एमएल के कम सेल घनत्व पर एनवी 30 के साथ कॉन्सर्ट में।
  2. उन्हें 37 डिग्री सेल्सियस पर 3-4 दिनों के लिए विस्तार करने दें और 5 सेमी और 135 राउंड प्रति मिनट (आरपीएम) की कक्षा के साथ शेकर इनक्यूबेटर रोटेशन में 8% सीओ 2 ।
  3. 5 मिनट के लिए 100 x g पर centrifugation द्वारा निर्माता कोशिकाओं गोली. सेल-मुक्त सेल संस्कृति supernatant (CFSN) प्राप्त करने के लिए 0.45 μm polyvinylidene फ्लोराइड (PVDF) झिल्ली सिरिंज फिल्टर का उपयोग कर अवशिष्ट कोशिकाओं और सेल मलबे को हटाने के लिए स्पष्ट supernatant फ़िल्टर।
    नोट:: प्रोटोकॉल यहाँ रोका जा सकता है। CFSN को 4 °C पर रात भर संग्रहीत किया जा सकता है।
  4. या तो प्रयोग के लिए सीधे सीएफएसएन का उपयोग करें या CFSN के 35 मिलीलीटर से गोली वीएलपी का उपयोग करें जो अल्ट्रासेंट्रीफ्यूजेशन (112,700 x g, 4 °C, 1.5 h) को नियोजित करता है।
  5. Ultracentrifugation पर, supernatant को त्यागें और 15% (w / v) trehalose समाधान प्रति सेंट्रीफ्यूज ट्यूब के 200 μL में VLP छर्रों को निलंबित करें।
    नोट: वीएलपी गोली अक्सर नग्न आंखों को दिखाई नहीं देती है। प्रोटोकॉल को यहां रोका जा सकता है। वीएलपी को -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है।
  6. वीएलपी कैप्चर परख से पहले, एक एलिसा का उपयोग करके नमूने वाले वीएलपी में वायरल कोर प्रोटीन सांद्रता निर्धारित करें। यह कदम कैप्चर परख इनपुट मानकीकृत करने के लिए महत्वपूर्ण है।

2. वीएलपी परख पर कब्जा

नोट:: वर्कफ़्लो का एक सिंहावलोकन चित्र 2 में दर्शाया गया है।

  1. चुंबकीय मोतियों को या तो ऊपर और नीचे पिपेट करके या कम से कम 5 मिनट के लिए 50 आरपीएम पर एक रोटेटर पर मिश्रण करके निलंबित करें।
  2. इस बीच, bNAbs युक्त एंटीबॉडी समाधान तैयार करें। प्रति प्रतिक्रिया एंटीबॉडी बाइंडिंग और वॉशिंग बफर के 200 μL में प्रत्येक bNAb के 10 μg का उपयोग करें ( सामग्री की तालिका देखें)।
    नोट:: एंटीबॉडी मात्रा bNAb और एंटीजन सजावट घनत्व की आत्मीयता के आधार पर उपयोग किए गए VLPs पर भिन्न हो सकता है।
  3. प्रति प्रतिक्रिया चुंबकीय मनका समाधान के 50 μL का उपयोग करें ( सामग्री की तालिका देखें) और एक 1.5 मिलीलीटर प्रतिक्रिया ट्यूब में मोतियों को स्थानांतरित करें। चुंबकीय पृथक्करण रैक पर ट्यूबों को रखें।
    नोट: वैकल्पिक रूप से, एक मजबूत एकल चुंबक supernatant से मोतियों को अलग करने के लिए प्रत्येक ट्यूब के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।
  4. कुछ मिनट प्रतीक्षा करें जब तक कि मोती ट्यूब की दीवार पर इकट्ठा न हो जाएं ताकि यह सुनिश्चित हो सके कि सभी मोतियों को एकत्र किया जाता है। supernatant निकालें.
  5. चुंबक को निकालें और चरण 2.2 में तैयार bNAb समाधान के 200 μL में मोतियों को निलंबित करें। कमरे के तापमान पर 50 आरपीएम पर एक रोटेटर पर मिश्रण करने के लिए 30 मिनट से 3 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें।
  6. चुंबकीय पृथक्करण रैक में प्रतिक्रिया ट्यूबों को फिर से रखें, प्रतीक्षा करें और supernatant को हटा दें।
  7. चुंबक से ट्यूबों को निकालें और एंटीबॉडी बाइंडिंग और धोने बफर के 200 μL में resuspending द्वारा मोतियों को धोएं।
  8. चरण 2.4 को दोहराएँ। जितना संभव हो उतना धोने का बफर निकालें।
  9. मनका-बाउंड bNAbs के लिए नमूने जोड़ें।
    नोट: एचआईवी व्युत्पन्न कणों का उपयोग कर कब्जा परख के लिए VLP इनपुट प्रतिक्रिया प्रति वायरल कोर प्रोटीन के कम से कम 15 एनजी होना चाहिए. VLP मात्रा bNAb की आत्मीयता के आधार पर भिन्न हो सकती है, और उपयोग किए गए VLPs पर एंटीजन सजावट घनत्व।
  10. चरण 2.9 में जोड़ा गया नमूना वॉल्यूम 1 mL से नीचे है, तो नमूना वॉल्यूम को 1 mL में समायोजित करने के लिए PBS जोड़ें। पिपेटिंग द्वारा मोतियों को धीरे से निलंबित करें।
  11. कमरे के तापमान पर एक रोटेटर पर 2.5 घंटे के लिए नमूनों और मोतियों को इनक्यूबेट करें। सुनिश्चित करें कि मोती निलंबन में रहते हैं और समाधान इनक्यूबेशन के दौरान अच्छी तरह से मिलाया जाता है।
  12. चुंबक पर ट्यूबों जगह और supernatant को हटाने.
  13. वाशिंग बफर के 200 μL में उन्हें निलंबित करके चुंबकीय मोतियों को धोएं ( सामग्री की तालिका देखें)। धोने के चरण को तीन बार दोहराएं।
  14. धोने बफर के 100 μL में मोतियों को निलंबित करें और निलंबन को एक साफ (गर्मी प्रतिरोधी) प्रतिक्रिया ट्यूब में स्थानांतरित करें।
  15. चुंबकीय पृथक्करण रैक पर ट्यूब रखें ( सामग्री की तालिका देखें) और supernatant को पूरी तरह से हटा दें।
  16. 2.16.1-2.16.2 चरणों के बाद विकृत SDS-पृष्ठ नमूने तैयार करें या 2.16.3-2.16.5 चरणों के बाद चुंबकीय मोतियों से VLPs को एल्यूट करके गैर-विकृत नमूने तैयार करें।
    1. विकृत एसडीएस-पेज नमूने तैयार करने के लिए, Laemmli बफर के 20-80 μL में मोतियों को निलंबित (p55 गैग परख इनपुट के प्रति 1 ng Laemmli बफर के 0.8 μL) और 5 मिनट के लिए 95 °C पर इनक्यूबेट।
    2. SDS-PAGE के साथ सीधे आगे बढ़ें या नमूनों को -20 °C पर संग्रहीत करें।
      सावधानी: Laemmli बफर 2-mercaptoethanol और सोडियम dodecyl सल्फेट शामिल हैं. सुरक्षात्मक दस्ताने पहनें और आंखों की सुरक्षा करें। त्वचा, आंखों और कपड़ों के संपर्क से बचें। वाष्पों को साँस न लें। एक अच्छी तरह से हवादार अंतरिक्ष में काम करें, उदाहरण के लिए, एक धुआं हुड।
      नोट:: प्रोटोकॉल यहाँ रोका जा सकता है।
    3. वैकल्पिक रूप से, संरक्षित देशी प्रोटीन संरचना के साथ वीएलपी प्राप्त करने के लिए एक गैर-विकृत क्षालन चरण करें।
    4. चुंबकीय मोतियों के लिए क्षालन बफर (अक्सर मोतियों के साथ प्रदान की जाती है) के 25 μL जोड़ें और कमरे के तापमान पर 2-5 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
    5. मोतियों को निकालें और एक साफ ट्यूब के लिए eluate हस्तांतरण। बाद के assays के लिए eluate का उपयोग करें या इसे 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
      नोट:: प्रोटोकॉल यहाँ रोका जा सकता है।

3. कब्जा कर लिया VLP नमूनों का विश्लेषण

नोट: कैप्चर किए गए VLPs के विश्लेषण के लिए, एक SDS-PAGE और बाद में पश्चिमी धब्बा-विश्लेषण 31,32 का संचालन करें।

  1. समाधान से मोतियों को अलग करने के लिए चुंबकीय रैक पर नमूना ट्यूब रखें।
  2. जेल के अलग-अलग कुओं में प्रत्येक नमूने के 10 μL लोड करें।
    नोट: इस प्रोटोकॉल में, वायरल p55 गैग कोर प्रोटीन एचआईवी गैग और माध्यमिक polyclonal चिकन विरोधी खरगोश IgG हॉर्सरैडिश पेरोक्सीडेज (HRP) एंटीबॉडी के लिए युग्मित के खिलाफ निर्देशित polyclonal खरगोश एंटीबॉडी को नियोजित करके पता लगाया गया था। वायरल कोर प्रोटीन chemiluminescence का पता लगाने का उपयोग कर कल्पना की गई थी.

Figure 2
चित्रा 2: वीएलपी कैप्चर परख के प्रमुख चरणों के योजनाबद्ध चित्रण सेल मुक्त supernatants का उपयोग कर. (1) वीएलपी कैप्चर परख प्रोटीन जी युग्मित चुंबकीय मोतियों के लिए एचआईवी -1 bNAbs के बंधन के साथ शुरू होता है। इस बीच, एक परिभाषित p55 एकाग्रता के साथ VLP समाधान तैयार किया जाता है। सेल-मुक्त संस्कृति supernatant p55 गैग VLPs, मेजबान सेल प्रोटीन, और न्यूक्लिक एसिड का मिश्रण के होते हैं। (2) बीएनएबी और वीएलपी समाधान के लिए युग्मित चुंबकीय मोतियों को 1.5 मिलीलीटर प्रतिक्रिया ट्यूब में स्थानांतरित किया जाता है, जिसके बाद रोटेशन के तहत इनक्यूबेशन होता है। (3) एंटीजन-प्रदर्शित वीएलपी को बीएनएबी-लेपित मोतियों द्वारा कैप्चर किया जाता है। मेजबान सेल-व्युत्पन्न संदूषकों से इन प्रतिरक्षा परिसरों का पृथक्करण एक चुंबकीय क्षेत्र में किया जाता है। (4) supernatant pipetting द्वारा हटा दिया जाता है, और मोतियों को तीन बार धोया जाता है ताकि अनबाउंड VLPs को हटा दिया जा सके। (5) अगले चरण में, प्रोटीन लोडिंग बफर को कम करने के लिए प्रतिरक्षा परिसरों में जोड़ा जाता है जिसमें bNAbs के साथ लेपित चुंबकीय मोती होते हैं और VLPs पर कब्जा कर लिया जाता है। (6) नमूने को उबालने से bNAbs और लक्ष्य एंटीजन को चुंबकीय मोतियों से अलग किया जाता है और VLPs को लिसिस किया जाता है। (7) चुंबकीय मोतियों को चुंबकीय क्षेत्र में समाधान से अलग किया जाता है। (8) प्रोटीन के नमूनों को एसडीएस-पेज के अधीन किया जाता है। (9) पश्चिमी धब्बा-विश्लेषण वायरल p55 गैग कोर प्रोटीन का पता लगाने के लिए किया जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Representative Results

चित्रा 3 वीएलपी के एक प्रतिनिधि परिणाम को दर्शाता है जो पहले CFSN और VLP छर्रों से कब्जा कर लिया गया था, क्रमशः, bNAbs का उपयोग करके और बाद में वायरल कोर प्रोटीन का पता लगाने के लिए पश्चिमी धब्बा-विश्लेषण के अधीन था। कैप्चर परख के लिए इस्तेमाल किए जाने वाले मोतियों को तीन अलग-अलग बीएनएबी के साथ लेपित किया गया था, जो क्रमशः नकारात्मक नियंत्रण के रूप में सेवारत एनवी ग्लाइकोप्रोटीन और आइसोटाइप एंटीबॉडी के न्यूट्रलाइजेशन-संवेदनशील एपिटोप के खिलाफ निर्देशित थे। आइसोटाइप एंटीबॉडी-लेपित मोतियों का उपयोग करते हुए, एनवी-नकारात्मक (गंजा वीएलपी) या एनवी-प्रदर्शित वीएलपी वाले नमूनों में कोई गैग प्रोटीन नहीं पाया गया था जो पश्चिमी धब्बा-विश्लेषण को नियोजित करते थे। इसने प्रदर्शित किया कि मानव एंटीबॉडी के साथ लेपित मोतियों के लिए वीएलपी के अनिर्दिष्ट बंधन ने वीएलपी कैप्चर की मध्यस्थता नहीं की। गंजा वीएलपी भी बीएनएबी-लेपित मोतियों से बंधे नहीं थे, और नतीजतन, फिर से, कोई गैग प्रोटीन पता लगाने योग्य नहीं थे। इसके विपरीत, सभी तीन बीएनएबी ने एनवी प्रोटीन (एनवी वीएलपी) प्रदर्शित करने वाले वीएलपी पर कब्जा कर लिया, और इसलिए, गैग प्रोटीन को बाद में आसानी से पता लगाया गया। जैसा कि चित्रा 3 में दिखाई देता है, कैप्चर परख का उपयोग क्रमशः CFSN और छर्रे वाले VLP नमूनों में VLPs प्रदर्शित करने वाले लक्ष्य एंटीजन का विश्लेषण करने के लिए किया जा सकता है।

Figure 3
चित्रा 3: एचआईवी -1 लिफाफे ग्लाइकोप्रोटीन में न्यूट्रलाइजेशन-संवेदनशील एपिटोप का पता लगाना जो मोटे तौर पर बेअसर एंटीबॉडी का उपयोग करके पी 55 गैग-गठित वीएलपी पर प्रदर्शित होता है। पश्चिमी धब्बा-विश्लेषण के प्रतिनिधि परिणाम वायरल गैग कोर प्रोटीन-विशिष्ट एंटीबॉडी का उपयोग करने के बाद एक वीएलपी कैप्चर परख तीन अलग-अलग व्यापक रूप से बेअसर एंटीबॉडी (bNAb 1, bNAb 2, और bnAb 3) एचआईवी -1 लिफाफा ग्लाइकोप्रोटीन (Env) के भीतर एपिटोप को लक्षित करने के लिए नियोजित करते हैं। आइसोटाइप मानव एंटीबॉडी मानव सेरा से पूल नकारात्मक नियंत्रण के रूप में कार्य किया। सेल संस्कृति supernatants निलंबन सेल संस्कृतियों Env प्रोटीन (Env VLPs) और गंजा VLPs (Env-नकारात्मक) के साथ VLPs का उत्पादन से काटा गया था, साथ ही भोले कोशिकाओं से किसी भी वायरल प्रोटीन (नकली) व्यक्त नहीं किया. गंजे वीएलपी निर्माता सेल संस्कृति के साथ-साथ मॉक सेल संस्कृति से दोनों supernatants नकारात्मक नियंत्रण के रूप में कार्य किया। Supernatants को विश्लेषण के लिए सेल-मुक्त supernatants (CFSN) प्राप्त करने के लिए कम गति centrifugation और बाद में निस्पंदन का उपयोग करके दूषित कोशिकाओं से मुक्त कर दिया गया था। immunoprecipitation पर, पश्चिमी धब्बा-विश्लेषण गैग और द्वितीयक विरोधी खरगोश IgG-HRP conjugates के खिलाफ निर्देशित polyclonal खरगोश एंटीबॉडी का उपयोग कर प्रदर्शन किया गया था। किलोडाल्टन (केडीए) में आणविक भार मार्कर (मेगावाट) से दिखाई देने वाले स्पष्ट आणविक वजन को बाईं ओर दर्शाया गया है। तीर का पता लगाया अग्रदूत प्रोटीन p55 गैग इंगित करते हैं। (A) प्रत्येक नमूने के लिए, 100 ng गैग प्रोटीन युक्त CFSN को VLPs की इनपुट मात्रा को मानकीकृत करने के लिए कैप्चर परख पर लागू किया गया था। CFSN को सीधे एंटीबॉडी-लेपित मोतियों के साथ इनक्यूबेट किया गया था। (बी) वीएलपी छर्रों को सीएफएसएन के अल्ट्रासेंट्रिफ्यूजन द्वारा प्राप्त किया गया था। गैग प्रोटीन के 100 एनजी युक्त छर्रों को आइसोटाइप एंटीबॉडी और बीएनएबी 3 का उपयोग करके कैप्चर परख पर लागू किया गया था। BNAb 1 और bNAb 2 के लिए नमूनों में गैग के केवल 25 ng शामिल थे। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Discussion

वीएलपी कैप्चर परख से पहले, वीएलपी के गठन और वीएलपी निर्माता सेल लाइनों में लक्ष्य एंटीजन की अभिव्यक्ति का मूल्यांकन करें। वाद्य विधियां एंटीजन की कोशिका सतह अभिव्यक्ति के साथ-साथ एंटीजन- और वायरल कोर प्रोटीन-विशिष्ट एलिसा के सीएफएसएन और पैलेटेड वीएलपी के प्रवाह साइटोमेट्रिक-विश्लेषण हैं।

वीएलपी कैप्चर परख के महत्वपूर्ण कदम कैप्चर एंटीबॉडी के साथ मोतियों की कोटिंग हैं - यहां bNAbs - और एंटीबॉडी-लेपित मोतियों द्वारा एंटीजन-पॉजिटिव वीएलपी के बाद के कैप्चर। एंटीबॉडी के साथ मोतियों की सफल कोटिंग संयुग्मित इम्युनोग्लोबुलिन (आईजी) -बाध्यकारी प्रोटीन की पसंद पर निर्भर करती है। दाता प्रजातियों के साथ-साथ एंटीबॉडी के आईजी वर्ग यह निर्धारित करते हैं कि प्रोटीन जी- या प्रोटीन ए-संयुग्मित मोती बेहतर हैं या नहीं। अधिकांश प्रजातियों और आईजी वर्गों के लिए, प्रोटीन जी चॉइस 33 का लिगैंड है। प्रोटीन ए / जी-संयुग्मित मोतियों के विकल्प के रूप में, बायोटिनिलेटेड एंटीबॉडी के साथ कोटिंग के लिए स्ट्रेप्टाविडिन मोतियों उपलब्ध हैं। मोतियों को एंटीबॉडी के साथ सहसंयोजक रूप से भी जोड़ा जा सकता है।

एंटीबॉडी-लेपित मोतियों द्वारा वीएलपी का कब्जा पूरी तरह से मिश्रण, पर्याप्त इनक्यूबेशन समय, एंटीजन बहुतायत और कैप्चर एंटीबॉडी की आत्मीयता पर निर्भर करता है। हमारे अनुभव में, वीएलपी नमूनों के साथ एंटीबॉडी-लेपित मोतियों का पूरी तरह से मिश्रण कमरे के तापमान या 4 डिग्री सेल्सियस पर कम से कम 2 घंटे के लिए रोटेशन के तहत 1.5 एमएल ट्यूबों में वॉल्यूम >500 μL के उपयोग से सबसे अच्छा हासिल किया जाता है। एक और संभावित बाधा नमूने में वीएलपी की बहुत कम मात्रा है। एंटीबॉडी के लिए दृढ़ता से बाध्यकारी लक्ष्य एंटीजन, VLP इनपुट के रूप में कम के रूप में 15 एनजी गैग प्रोटीन आमतौर पर पश्चिमी धब्बा विश्लेषण का उपयोग कर वायरल कोर प्रोटीन की आसानी से पता लगाने योग्य मात्रा के लिए अनुमति देते हैं। हालांकि, कम आत्मीयता एंटीबॉडी को निर्णायक परिणाम प्राप्त करने के लिए उच्च इनपुट मात्रा की आवश्यकता होती है, उदाहरण के लिए, गैग प्रोटीन के 100 एनजी, (चित्रा 3, बीएनएबी 3)।

कुछ सतह एंटीजन प्रोटीज गिरावट के लिए प्रवण हैं। यहां, हम वीएलपी नमूनों में प्रोटीज इनहिबिटर के अलावा और 4 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेशन की सलाह देते हैं। मनका-बाध्य एंटीबॉडी के लिए मेजबान सेल प्रोटीन और वीएलपी के गैर-विशिष्ट आसंजन को शायद ही कभी देखा जाता है और उचित नकारात्मक नियंत्रणों का उपयोग करके बाहर रखा जाना चाहिए, जैसा कि हमने यहां नकली और गंजे वीएलपी नमूनों और आइसोटाइप नियंत्रण एंटीबॉडी का उपयोग करके प्रदर्शित किया है। गैर-विशिष्ट बाध्यकारी को कम करने के लिए रणनीतियों में विस्तारित धोने के चरण और वॉशिंग बफर 34 में केसिन के अलावा शामिल हैं। इसके अलावा, कैप्चर परख भी एंटीजन के लिए एंटीबॉडी के इष्टतम अनुपात का निर्धारण करके सुधार किया जा सकता है-वीएलपी राशि प्रदर्शित.

वीएलपी कैप्चर परख के अंतिम चरण में, हम Laemmli बफर को कम करने में उबलते हुए मोतियों से प्रतिरक्षा परिसरों के क्षालन का वर्णन करते हैं। इस चरण के दौरान, VLPs disassembled हैं, और कैप्चर एंटीबॉडी और लक्ष्य एंटीजन मोतियों से अलग कर रहे हैं। विशेष रूप से, बाद के पश्चिमी धब्बा-विश्लेषण में उपयोग किए जाने वाले प्राथमिक एंटीबॉडी की दाता प्रजातियों को द्वितीयक एंटी-डोनर आईजीजी एचआरपी-संयुग्मित एंटीबॉडी द्वारा कैप्चर एंटीबॉडी का अनपेक्षित पता लगाने से बचने के लिए कैप्चर एंटीबॉडी के दाता से अलग होना पड़ता है।

VLP कैप्चर परख यहाँ प्रस्तुत एक आसान करने के लिए उपयोग और संवेदनशील विधि प्रदान करता है संरचनात्मक बरकरार लक्ष्य एंटीजन में neutralization-संवेदनशील epitopes का पता लगाने के लिए VLP सतहों पर प्रदर्शित. हालांकि, कैप्चर परख प्रत्यक्ष एपिटोप परिमाणीकरण सक्षम नहीं करता है। बीएनएबी के साथ किए गए एलिसा इस उद्देश्य के लिए महत्वपूर्ण हैं और समानांतर में आयोजित किए जाने चाहिए, खासकर यदि जांच किए गए वीएलपी का उद्देश्य पशु मॉडल 35 को नियोजित करने वाले प्रीक्लिनिकल अध्ययनों में उपयोग किया जाना है। यह निर्णायक है, क्योंकि एंटीजन की मात्रा सीधे प्रतिरक्षित जानवरों में एक बेअसर एंटीबॉडी प्रतिक्रिया के साथ सहसंबंधित हो सकती है, जैसा कि पोर्सिनी सर्कोवायरस टाइप 2 (पीसीवी 2) टीके 36 के लिए दिखाया गया है।

एक आदर्श वैक्सीन के परिणामस्वरूप virion सतह पर न्यूट्रलाइजेशन-संवेदनशील एपिटोप को लक्षित करने वाले bNAbs का इलिटेशन होना चाहिए। इन एपिटोप का विश्लेषण विशेष रूप से कण वैक्सीन सतह पर उनकी पूर्ण संरचनात्मक अखंडता का उल्लेख करते हुए संभावित वैक्सीन उम्मीदवारों की पहचान करने के लिए महत्वपूर्ण है। यह न केवल एचआईवी-व्युत्पन्न वीएलपी के लिए मामला है, बल्कि विकास में कई अन्य वीएलपी टीकों के लिए भी है। प्रमुख वीएलपी-आधारित टीके, उदाहरण के लिए, गैर-लिफाफे वाले या कैप्सिड माता-पिता के वायरस जैसे मानव पैपिलोमावायरस (एचपीवी) से व्युत्पन्न होते हैं। एचआईवी -1 कणों के विपरीत, जो केवल एक संरचनात्मक कोर प्रोटीन द्वारा बनाए जाते हैं, अर्थात् पी 55 गैग, और वीएलपी निर्माता सेल से उत्पन्न झिल्ली द्वारा कवर किया जाता है, एचपीवी कणों में केवल एक या दो संरचनात्मक कोर प्रोटीन होते हैं38,39। इसी तरह और के रूप में यहाँ envelopeed VLPs के लिए प्रस्तुत के रूप में, VLP पर कब्जा परख भी गैर-कवर VLPs के neutralization-संवेदनशील epitopes का पता लगाने के लिए लागू हो सकता है.

कैप्चर परख के लिए एक विकल्प के रूप में, वीएलपी नमूनों को सीधे देशी पेज के अधीन किया जा सकता है, जिसके बाद पश्चिमी धब्बा-विश्लेषण bNAbs और HRP40 के लिए युग्मित उचित माध्यमिक एंटीबॉडी का उपयोग किया जा सकता है। हालांकि और एचआईवी Env के विश्लेषण के लिए-सजाया VLPs, इस परख कम संवेदनशील के रूप में केवल प्रतिजन प्रोटीन प्रति VLP की एक कम संख्या की उम्मीद की जा सकती है. इसके विपरीत, कैप्चर परख प्रति वीएलपी बड़ी मात्रा में कोर प्रोटीन का पता लगाने की सुविधा प्रदान करता है, एचआईवी-व्युत्पन्न वीएलपी के मामले में 3,500 से अधिक गैग प्रोटीन एक वीएलपी 27 बनाते हैं। यह एनवी में एपिटोप का बहुत संवेदनशील अप्रत्यक्ष पता लगाने की अनुमति देता है जो वीएलपी पर कम घनत्व पर भी प्रदर्शित होता है।

वीएलपी के सतह एंटीजन में न्यूट्रलाइजेशन-संवेदनशील एपिटोप की जांच करने के लिए अच्छी तरह से स्थापित तरीकों की संख्या सीमित है। वीएलपी पर प्रदर्शित एंटीजन को लेबल करना एपिटोप-विशिष्ट एंटीबॉडी-फ्लोरोफोर संयुग्मों और नैनोपार्टिकल ट्रैकिंग-विश्लेषण (एनटीए) द्वारा बाद में पता लगाने के साथ संभव है, जिससे वीएलपी का पता लगाने और परिमाणीकरण को सक्षम किया जा सकता है। इस विधि को भी सफलतापूर्वक विकसित किया गया है और सेल सतह मार्करों 41 प्रस्तुत एक्सोसोम के लिए अनुकूलित किया गया है। इसके अलावा, सतह प्लास्मोन अनुनाद (एसपीआर) स्पेक्ट्रोस्कोपी VLPs पर प्रस्तुत unconjugated बेअसर एंटीबॉडी और संज्ञेय एपिटोप के बीच बातचीत के विश्लेषण के लिए अनुमति देता है। हालांकि उच्च थ्रूपुट विश्लेषण के लिए उपयुक्त नहीं है, वीएलपी को सोने के कणों और बाद के संचरण इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपिक (टीईएम) -परीक्षा 42 के लिए युग्मित बीएनएबी के साथ भी लेबल किया जा सकता है।

अंत में, वीएलपी कैप्चर परख कुछ काफी फायदे प्रदान करता है: (i) वीएलपी की सतह पर न्यूट्रलाइजेशन-संवेदनशील एपिटोप की संरचनात्मक अखंडता का आकलन, (ii) वीएलपी पर कम घनत्व पर प्रदर्शित होने पर भी एंटीजन का संवेदनशील और अप्रत्यक्ष पता लगाना, और (iii) विधि को लागत-गहन विश्लेषणात्मक उपकरणों की आवश्यकता नहीं होती है।

Disclosures

लेखकों ने घोषणा की है कि उनके पास हितों का कोई टकराव नहीं है।

Acknowledgments

इस काम को जर्मन संघीय शिक्षा और अनुसंधान मंत्रालय से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था, वित्त पोषण कार्यक्रम Forschung an Fachhochschulen, अनुबंध संख्या 13FH767IA6 और जेएस को 13FH242PX6। आंकड़े 1 और 2 BioRender.com के साथ बनाए गए थे।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1.5 mL reaction tubes Eppendorf
10x PBS gibco 70011044
4%–15% Mini-PROTEAN TGX stain-free protein gels BioRad 4568085
Antibodies (bnAbs) Polymun Scientic
Isotype control antibody invitrogen (Thermo Fisher Scientific) 02-7102
Chemidoc XRS+ imaging system BioRad 1708265
Chicken anti-rabbit IgG HRP-coupled Life technologies A15987 1:5000 in TBS-T + 2 % (w/v) powdered milk
Dynabeads Protein G Immunoprecipitation Kit invitrogen (Thermo Fisher Scientific) 10007D includes buffers and washing solutions
FreeStyle 293-F cells invitrogen (Thermo Fisher Scientific) R790-07
FreeStyle 293 Expression Medium invitrogen (Thermo Fisher Scientific) 12338026
Gel blotting papers Whatman GB005
Glycine Carl Roth 0079 blotting buffer
Magnetic separation rack New England Biolabs S1509S for 12 x 1.5 mL or 6 x 1.5 mL tubes
Methanol Carl Roth 4627 blotting buffer
Mini-PROTEAN Tetra Cell electrophoresis system BioRad
Optima XE-90 ultracentrifuge Beckman Coulter
PageRuler prestained protein ladder Thermo Scientific 26616
Polyvinylidene fluoride (PVDF) syringe filters, 0.45 µm Carl Roth KC89.1
Powdered milk Carl Roth T145 blocking buffer
PVDF transfermembrane, 0.45 µm Carl Roth T830.1
QuickTiter HIV p24 ELISA Cell Biolabs VPK-108-H
Rabbit polyclonal to HIV1 p55 + p24 + p17 abcam ab63917 1:2000 in TBS-T + 2 % (w/v) powdered milk
Rotator Heidolph REAX2
ROTI Load 1 (laemmli buffer) Carl Roth K929.1 4x concentrated reducing protein gel loading buffer
ROTIPHORESE 10x SDS-PAGE Carl Roth 3060
Sodium chloride Carl Roth 3957 TBS-T buffer
SuperSignal West Pico PLUS chemiluminescent substrate Thermo Scientific 34579
SW28 rotor Beckman Coulter
Thermomixer Cel Media basic
Trans-Blot Turbo BioRad
Trehalose dihydrate Carl Roth 8897.2
TRIS Carl Roth 5429 blotting buffer
TRIS hydrochloride Carl Roth 9090 TBS-T buffer
Tween-20 Carl Roth 9127 TBS-T buffer
Ultra Clear centrifuge tubes Beckman Coulter 344058

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References

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