Summary
Здесь мы представляем протокол для обнаружения эпитопов нейтрализации на антиген-дисплейных вирусоподобных частицах (VLP). Иммунопреципитация VLP, полученных из вируса иммунодефицита человека (ВИЧ), выполняется с использованием гликопротеин-специфических моноклональных антител, связанных с белками G-конъюгированных магнитных шариков. Захваченные VLP впоследствии подвергаются SDS-PAGE и вестерн-блот-анализу с использованием вирусных основных белков, специфичных для Gag.
Abstract
Анализ захвата вирусоподобных частиц (VLP) представляет собой метод иммунопреципитации, широко известный как «анализ вытягивания», используемый для очистки и выделения антиген-дисплейных VLP. Поверхностные антиген-специфические антитела связаны и, таким образом, иммобилизуются на твердой и нерастворимой матрице, такой как шарики. Из-за их высокого сродства к антигену-мишени эти антитела могут захватывать VLP, украшенные родственным антигеном, закрепленным в мембранной оболочке VLP. Этот протокол описывает связывание антиген-специфических антител с белком A- или G-конъюгированных магнитных шариков. В нашем исследовании исследуются VLP, полученные из вируса иммунодефицита человека (ВИЧ), образованные групповым специфическим антигеном (Gag) вирусного белка-предшественника ядра p55 Gag и отображающие оболочку гликопротеинов (Env) ВИЧ. VLP захватываются с использованием широко нейтрализующих антител (bNAbs), направленных против чувствительных к нейтрализации эпитопов в Env. Анализ захвата VLP, описанный здесь, представляет собой чувствительный и простой в исполнении метод демонстрации того, что (i) VLP украшены соответствующим целевым антигеном, (ii) поверхностный антиген сохранил свою структурную целостность, как показано эпитоп-специфическим связыванием bNAbs, используемым в анализе, и (iii) структурная целостность VLP, выявленная обнаружением белков Gag в последующем анализе вестерн-блоттинга. Следовательно, использование bNAbs для иммунопреципитации облегчает прогнозирование того, смогут ли вакцины VLP вызвать нейтрализующий ответ В-клеток у вакцинированных людей. Мы ожидаем, что этот протокол предоставит другим исследователям ценный и простой экспериментальный подход к изучению потенциальных вакцин на основе VLP.
Introduction
Вирусоподобные частицы (VLP) напоминают структуру нативных вирусных частиц, не имея вирусного генома, что обеспечивает высокий профиль безопасности1,2. VLP представляют собой индивидуальный класс вакцин, все более развивающихся из-за их высокой иммуногенности3,4,5,6,7. Это особенно касается VLP с мембранной оболочкой, что позволяет отображать не только гомологичные вирусные поверхностные антигены, но и гетерологичные антигены, такие как опухолевые антигены8,9,10. На рисунке 1 представлен примерный обзор структуры Окутанного антигеном VLP. В процессе разработки вакцин на основе VLP необходимы анализы, позволяющие анализировать соответствующий целевой антиген, отображаемый на поверхности VLP. Такие анализы должны быть полезными для выяснения состава вакцины с твердыми частицами: (i) Украшены ли VLP соответствующим поверхностным антигеном? (ii) Сохранил ли поверхностный антиген свою нативную структуру, о чем свидетельствует эпитопное распознавание нейтрализующих антител (bNAbs) и (iii) может ли быть подтверждена структурная целостность VLP благодаря обнаружению вирусного белка, опосредующего образование VLP?
Рисунок 1: Схематическая иллюстрация VLP с мембранной оболочкой. VLP образованы незрелыми белками ядра предшественника Gag и окружены липидной мембраной, полученной из клетки-хозяина. Антигены, например, гликопротеины оболочки, включаются в липидную мембрану и отображаются на поверхности VLP (справа). Антиген-специфические антитела распознают антиген. Слева показан лысый ВЛП без антигенного украшения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
В частности, VLP, образованные вирусным группово-специфическим антигеном (Gag) основным белком-предшественником p55 вируса иммунодефицита человека типа 1 (ВИЧ-1), являются предпочтительными каркасами для проявления антигена при разработке вакцины в виде многочисленных антител и доступны наборы ИФА, позволяющие количественно оценить эти VLP11,12. Гликопротеины оболочки ВИЧ-1 (Env), а именно трансмембранный белок gp41 (gp41-TM) и растворимый поверхностный блок gp120 (gp120-SU), образующие гетеродимеры, включены в мембранную оболочку частиц и являются важнейшими антигенами-мишенью для разработки вакцин против ВИЧ-инфекции13,14,15 . Проявление чувствительных к нейтрализации эпитопов в этих антигенах-мишенях является предпосылкой для получения широко нейтрализующего ответа антител у вакцинаторов. Помимо ответа Т-клеток, направленного против белков Gag, это считается важным коррелятом защиты от ВИЧ-инфекции16. Следовательно, при разработке и производстве VLP, украшенных целевыми антигенами-кандидатами, последующий анализ качества отображаемых антигенов представляет собой критический шаг в процессе разработки вакцины.
Иммунопреципитация (ИП) является широко используемым методом обнаружения белково-белковых взаимодействий и очистки белковых комплексов в небольшом масштабе17. Баррет и др. Впервые сообщалось о развитии ИС в 1960 году, однако этот метод постоянно совершенствовался. IP позволяет захватывать и выделять целевой антиген (добычу) из раствора путем использования антиген-специфического антитела (приманки), иммобилизованного путем соединения с шариками18,19. В этом протоколе мы демонстрируем вариацию классического применения IP с использованием VLP с мембранной оболочкой p55 Gag в качестве добычи и bNAbs, которые распознают чувствительные к нейтрализации эпитопы в белках оболочки, отображаемых на поверхности VLP в качестве белков приманки. Успешное применение этого анализа захвата VLP облегчает прогнозирование того, смогут ли протестированные антиген-положительные VLP вызвать нейтрализующий ответ В-клеток у вакцинированных людей. Такие иммуногенные свойства вакцин-кандидатов на основе VLP часто демонстрируются на моделях мелких животных20,21,22.
Для оценки качества недавно разработанной вакцины-кандидата на VLP успешно использованы анализы захвата VLP5,23,24. Однако количество публикуемых методов ограничено. Представленный здесь анализ захвата VLP начинается с иммобилизации Env-специфических bNAbs на белковых G-конъюгированных шариках, которые связываются с областью Fc антител млекопитающих. Типичными матрицами для иммобилизации антител по выбору являются агарозные или магнитные шарики. Однако магнитные шарики благоприятны для высокопроизводительных применений25. На следующем этапе VLP, отображающие антиген-мишень, захватываются шариками, покрытыми bNAb. Образующиеся иммунные комплексы, состоящие из Env-положительных VLP и иммобилизованных bNAbs, легко обогащаются с помощью магнита. Изолированные иммунные комплексы элюируются на заключительном этапе. Впоследствии VLP могут быть биохимически охарактеризованы. Здесь мы провели западный блот-анализ с использованием специфических антител к вирусному ядру p55 Gag, чтобы продемонстрировать, что осажденные антигены Env-мишени не только содержали чувствительные к нейтрализации эпитопы, но и отображались на VLP, сформированных Gag. Кроме того, обнаружение вирусного ядра белков Gag повышает чувствительность анализа захвата, поскольку белки Gag более распространены, чем Env в VLP. В ВИЧ-1 белки Env присутствуют только при однозначном или двузначном числе26, тогда как более 3 500 молекул Gag образуют ядро частицы27.
По сравнению с другими методами изучения белково-белковых взаимодействий28,29, анализ захвата VLP обеспечивает альтернативный метод для исследовательских лабораторий, не имеющих доступа к дорогостоящим аналитическим приборам. Например, просвечивающий электронный микроскопический анализ (TEM), поверхностная плазмонная резонансная спектроскопия (SPR) и анализ отслеживания наночастиц (NTA) могут быть дорогостоящими. Анализ захвата, представленный здесь, также позволяет в дальнейшем подвергать захваченные антиген-положительные образцы VLP для дальнейшей характеристики белка, например, с использованием гелевого электрофореза, иммуноблоттинга, электронной микроскопии и масс-спектрометрии (МС), соответственно. Учитывая, что нативная структура целевого антигена сохраняется во время анализа захвата VLP, также может быть использована производительность нативного PAGE и последующие методы иммуноблоттинга.
Анализ захвата VLP представляет собой простой в использовании и чувствительный метод для изучения украшения VLP целевыми антигенами, обнажающими чувствительные к нейтрализации эпитопы, и, следовательно, их полезность в качестве будущих кандидатов на вакцину.
Protocol
1. Пробоподготовка
- Посейте клеточные линии суспензии, полученные из 293-F клеток, экспрессирующих структурные гены ВИЧ в одиночку или совместно с env 30 при низкой плотности клеток 0,5 х 106 клеток на мл в среде экспрессии 293-F.
- Дайте им расшириться в течение 3-4 дней при 37 °C и 8% CO2 во вращении шейкера инкубатора с орбитой 5 см и 135 выстрелами в минуту (об/мин).
- Гранулируют клетки-продуценты центрифугированием при 100 х г в течение 5 мин. Фильтруйте осветленный супернатант для удаления остаточных клеток и клеточного мусора с использованием мембранных шприцевых фильтров из поливинилиденфторида (PVDF) 0,45 мкм для получения супернатанта безклеточной клеточной культуры (CFSN).
ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь протокол можно приостановить. CFSN можно хранить в течение ночи при температуре 4 °C. - Либо используйте CFSN непосредственно для эксперимента, либо гранулированные VLP из 35 мл CFSN с использованием ультрацентрифугирования (112 700 x g, 4 °C, 1,5 ч).
- После ультрацентрифугирования отбросьте супернатант и суспендируйте гранулы VLP в 200 мкл 15% (мас./об.) раствора трегалозы на пробирку центрифуги.
ПРИМЕЧАНИЕ: Гранула VLP часто не видна невооруженным глазом. Здесь протокол можно приостановить. VLP могут храниться при -80 °C. - Перед анализом захвата VLP определите концентрации белка вирусного ядра в образцах, содержащих VLP, с помощью ИФА. Этот шаг важен для стандартизации входных данных анализа захвата.
2. Анализ захвата VLP
ПРИМЕЧАНИЕ: Обзор рабочего процесса показан на рисунке 2.
- Подвешивайте магнитные шарики путем пипетки вверх и вниз или смешивания на ротаторе при 50 об/мин в течение не менее 5 мин.
- Тем временем готовят раствор антител, содержащий bNAbs. Используйте 10 мкг каждого bNAb в 200 мкл буфера связывания антител и промывки (см. Таблицу материалов) на реакцию.
ПРИМЕЧАНИЕ: Количество антител может варьироваться в зависимости от сродства bNAb и плотности украшения антигена на используемых VLP. - Используйте 50 мкл раствора магнитного шарика (см. Таблицу материалов) на реакцию и перенесите шарики в реакционную трубку объемом 1,5 мл. Поместите трубки на магнитную разделительную стойку.
ПРИМЕЧАНИЕ: Альтернативно, сильный одиночный магнит может быть использован для каждой трубки, чтобы отделить шарики от супернатанта. - Подождите несколько минут, пока бусины соберутся у стенки трубки, чтобы убедиться, что все бусины собраны. Удалите супернатант.
- Извлеките магнит и подвешивайте шарики в 200 мкл раствора bNAb, приготовленного на стадии 2.2. Инкубировать в течение 30 мин до 3 ч, перемешивая на ротаторе при 50 об/мин при комнатной температуре.
- Снова поместите реакционные трубки в стойку магнитного разделения, подождите и удалите супернатант.
- Извлеките трубки из магнита и вымойте шарики, повторно добавив в 200 мкл буфер связывания антител и промывки.
- Повторите шаг 2.4. Удалите как можно больше буфера для стирки.
- Добавьте образцы в связанные с бусинами bNAbs.
ПРИМЕЧАНИЕ: Вход VLP для анализа захвата с использованием частиц, полученных из ВИЧ, должен составлять не менее 15 нг белка вирусного ядра на реакцию. Количество VLP может варьироваться в зависимости от сродства bNAb и плотности украшения антигена на используемых VLP. - Если объем образца, добавленный на шаге 2.9, составляет менее 1 мл, добавьте PBS, чтобы отрегулировать объем образца до 1 мл. Осторожно подвешивайте бусины путем пипетки.
- Инкубировать образцы и шарики в течение 2,5 ч на ротаторе при комнатной температуре. Убедитесь, что шарики остаются в суспензии, а раствор тщательно перемешивается во время инкубации.
- Поместите трубки на магнит и удалите супернатант.
- Промывайте магнитные шарики, подвешивая их в 200 мкл промывочного буфера (см. Таблицу материалов). Повторите шаг стирки три раза.
- Суспендировать шарики в 100 мкл промывочного буфера и перенести суспензию в чистую (термостойкую) реакционную трубку.
- Поместите трубку на магнитную разделительную стойку (см. Таблицу материалов) и полностью удалите супернатант.
- Подготовьте денатурированные образцы SDS-PAGE, следуя шагам 2.16.1-2.16.2, или неденатурированные образцы, элюируя VLP из магнитных шариков, следуя шагам 2.16.3-2.16.5.
- Для получения денатурированных образцов SDS-PAGE суспендируют шарики в 20-80 мкл буфера Laemmli (0,8 мкл буфера Laemmli на 1 нг входа p55 Gag) и инкубируют при 95 °C в течение 5 мин.
- Переходите непосредственно к SDS-PAGE или храните образцы при -20 °C.
ВНИМАНИЕ: Буфер Laemmli содержит 2-меркаптоэтанол и додецилсульфат натрия. Носите защитные перчатки и защиту глаз. Избегайте контакта с кожей, глазами и одеждой. Не вдыхайте пары. Работайте в хорошо проветриваемом помещении, например, в вытяжном шкафу.
ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь протокол можно приостановить. - Альтернативно, выполняют стадию неденатурирующего элюирования для получения VLP с сохраненной нативной белковой структурой.
- Добавьте 25 мкл элюционного буфера (часто поставляемого с шариками) к магнитным шарикам и инкубируйте в течение 2-5 мин при комнатной температуре.
- Снимите шарики и перенесите элюат в чистую трубку. Используйте элюат для последующих анализов или храните его при 4 °C.
ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь протокол можно приостановить.
3. Анализ захваченных образцов VLP
ПРИМЕЧАНИЕ: Для анализа захваченных VLP проведите SDS-PAGE и впоследствии вестерн-блот-анализ31,32.
- Поместите пробирки для образцов на магнитную стойку, чтобы отделить шарики от раствора.
- Загрузите 10 мкл каждого образца в отдельные колодцы геля.
ПРИМЕЧАНИЕ: В этом протоколе вирусные белки ядра р55 Gag были обнаружены с использованием поликлональных антител кролика, направленных против ВИЧ Gag и вторичного поликлонального куриного анти-кролика IgG в сочетании с антителами пероксидазы хрена (HRP). Вирусные основные белки были визуализированы с использованием обнаружения хемилюминесценции.
Рисунок 2: Схематическая иллюстрация ключевых этапов анализа захвата VLP с использованием бесклеточных супернатантов. (1) Анализ захвата VLP начинается с связывания ВИЧ-1 bNAbs с белками G-связанных магнитных шариков. Тем временем готовят раствор VLP с определенной концентрацией р55. Супернатант бесклеточной культуры состоит из смеси p55 Gag VLP, белков клеток-хозяев и нуклеиновых кислот. (2) Магнитные шарики, соединенные с bNAbs и раствором VLP, переносятся в реакционную трубку объемом 1,5 мл с последующей инкубацией при вращении. (3) Антиген-дисплейные VLP захватываются шариками, покрытыми bNAbs. Отделение этих иммунных комплексов от загрязняющих веществ, полученных из клеток-хозяев, осуществляется в магнитном поле. (4) Супернатант удаляется путем пипетирования, а шарики промывают три раза для удаления несвязанных VLP. (5) На следующем этапе к иммунным комплексам, состоящим из магнитных шариков, покрытых bNAbs и захваченных VLP, добавляют восстанавливающий буфер нагрузки белка. (6) Кипение образца диссоциирует bNAbs и антиген-мишень из магнитных шариков и лизирует VLP. (7) Магнитные шарики отделяются от раствора в магнитном поле. (8) Образцы белка подвергаются воздействию SDS-PAGE. (9) Вестерн-блот-анализ проводится с целью выявления вирусных белков ядра р55 Gag. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Representative Results
На рисунке 3 показан репрезентативный результат VLP, впервые захваченных из гранул CFSN и VLP, соответственно, с использованием bNAbs, а затем подвергнутых вестерн-блот-анализу для обнаружения белков вирусного ядра. Шарики, используемые для анализа захвата, были покрыты тремя различными bNAbs, направленными против чувствительных к нейтрализации эпитопов гликопротеинов Env и антител изотипа, служащих отрицательным контролем, соответственно. Используя шарики, покрытые изотипами антител, белки Gag не были обнаружены в образцах, содержащих Env-отрицательные (лысые VLP) или ENV-дисплейные VLP с использованием западного блот-анализа. Это продемонстрировало, что неспецифическое связывание VLP с шариками, покрытыми человеческими антителами, не опосредует захват VLP. Лысые VLP также не были связаны бусинами, покрытыми bNAbs, и, следовательно, опять же, белки Gag не были обнаружены. Напротив, все три bNAb захватывали VLP, отображающие белки Env (Env VLP), и, следовательно, белки Gag были впоследствии легко обнаружены. Как показано на рисунке 3, анализ захвата может быть использован для анализа целевого антигена, отображающего VLP в образцах CFSN и гранулированных VLP, соответственно.
Рисунок 3: Обнаружение чувствительных к нейтрализации эпитопов в гликопротеинах оболочки ВИЧ-1, отображаемых на p55 Gag-образованных VLP с использованием широко нейтрализующих антител. Репрезентативные результаты западного блот-анализа с использованием вирусных белковых специфических антител Gag после выполнения анализа захвата VLP с использованием трех различных широко нейтрализующих антител (bNAb 1, bNAb 2 и bnAb 3), нацеленных на эпитопы в гликопротеинах оболочки ВИЧ-1 (Env). Изотипные человеческие антитела, объединенные из человеческих сывороток, служили отрицательным контролем. Супернатанты клеточных культур собирали из культур суспензионных клеток, продуцирующих VLP с белками Env (Env VLP) и лысыми VLP (Env-отрицательные), соответственно, а также из наивных клеток, не экспрессирующих никаких вирусных белков (mock). Как супернатанты из лысой клеточной культуры-продуцента VLP, так и из макета клеточной культуры служили отрицательным контролем. Супернатанты освобождали от загрязняющих клеток с помощью низкоскоростного центрифугирования и последующей фильтрации для получения бесклеточных супернатантов (CFSN) для анализа. При иммунопреципитации проводили вестерн-блот-анализ с использованием поликлональных антител кролика, направленных против Gag и вторичных анти-кроличьих конъюгатов IgG-HRP. Видимая молекулярная масса в килодальтонах (кДа), видимая из маркера молекулярной массы (MW), изображена слева. Стрелки указывают на обнаруженный белок-предшественник p55 Gag. (A) Для каждого образца CFSN, содержащий 100 нг белка Gag, наносили на анализ захвата для стандартизации входного количества VLP. CFSN непосредственно инкубировали с шариками, покрытыми антителами. (B) Гранулы VLP были получены путем ультрацентрифугирования CFSN. Гранулы, содержащие 100 нг белка Gag, наносили на анализ захвата с использованием антител изотипа и bNAb 3. Образцы для bNAb 1 и bNAb 2 содержали только 25 нг Gag. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Discussion
Перед анализом захвата VLP оцените образование VLP и экспрессию целевого антигена в клеточных линиях VLP-продуцента. Инструментальными методами являются проточный цитометрический анализ экспрессии антигена на клеточной поверхности, а также антиген- и вирусного ядра белково-специфической ИФА CFSN и гранулированных VLP.
Критическими этапами анализа захвата VLP являются покрытие шариков антителами захвата - здесь bNAbs - и последующий захват антиген-положительных VLP шариками, покрытыми антителами. Успешное покрытие шариков антителами зависит от выбора конъюгированного иммуноглобулинового (Ig)-связывающего белка. Донорские виды, а также класс антител Ig определяют, являются ли белковые G- или белковые А-конъюгированные шарики предпочтительными. Для большинства видов и классов Ig белок G является лигандом выбора33. В качестве альтернативы белковым А/Г-конъюгированным шарикам доступны стрептавидиновые шарики для покрытия биотинилированными антителами. Бусины также могут быть ковалентно связаны с антителами.
Захват VLP шариками, покрытыми антителами, зависит от тщательного перемешивания, достаточного времени инкубации, обилия антигена и сродства антитела захвата. По нашему опыту, тщательное смешивание шариков, покрытых антителами, с образцами VLP лучше всего достигается путем использования объемов >500 мкл в пробирках по 1,5 мл при вращении в течение не менее 2 ч при комнатной температуре или 4 °C. Другим потенциальным препятствием является слишком низкое количество VLP в образце. Для антител, сильно связывающих антиген-мишень, VLP вводит всего 15 нг белка Gag, как правило, позволяет легко обнаруживать количество белков вирусного ядра с использованием западного блот-анализа. Однако низкоаффинные антитела требуют более высоких входных количеств, например, 100 нг белка Gag, для получения окончательных результатов (Рисунок 3, bNAb 3).
Некоторые поверхностные антигены склонны к деградации протеазы. Здесь мы рекомендуем добавление ингибиторов протеазы к образцам VLP и инкубацию при 4 °C. Неспецифическая адгезия белков клеток-хозяев и VLP к связанным с шариками антителам наблюдается редко и должна быть исключена путем использования соответствующих отрицательных контрольных элементов, как мы продемонстрировали здесь с использованием образцов имитации и лысой VLP и контрольных антител изотипа. Стратегии уменьшения неспецифического связывания включают расширенные этапы промывки и добавление казеина в буфер промывки34. Кроме того, анализ захвата также может быть улучшен путем определения оптимального отношения антитела к количеству VLP, отображающему антиген.
На последнем этапе анализа захвата VLP мы описываем элюирование иммунных комплексов из шариков путем кипячения при уменьшении буфера Laemmli. На этом этапе VLP разбираются, а захватные антитела и антигены-мишени отделяются от шариков. Примечательно, что донорские виды первичного антитела, используемые в последующем вестерн-блот-анализе, должны отличаться от донора антитела захвата, чтобы избежать непреднамеренного обнаружения антитела захвата вторичными антидонорскими IgG HRP-конъюгированными антителами.
Представленный здесь анализ захвата VLP обеспечивает простой в использовании и чувствительный метод обнаружения чувствительных к нейтрализации эпитопов в структурных неповрежденных антигенах-мишенях, отображаемых на поверхностях VLP. Однако анализ захвата не позволяет проводить прямую количественную оценку эпитопа. ИФА, выполняемая с bNAbs, играет важную роль для этой цели и должна проводиться параллельно, особенно если исследуемые VLP предназначены для использования в доклинических исследованиях с использованием моделей на животных35. Это имеет решающее значение, поскольку количество антигена может напрямую коррелировать с получением нейтрализующего ответа антител у иммунизированных животных, как показано для вакцин против цирковируса свиней типа 2 (PCV2)36.
Идеальная вакцина должна привести к выявлению bNAbs, нацеленных на чувствительные к нейтрализации эпитопы на поверхности вириона. Анализ этих эпитопов, особенно с учетом их полной структурной целостности на поверхности вакцины с твердыми частицами, имеет решающее значение для выявления потенциальных кандидатов на вакцину. Это относится не только к VLP, полученным из ВИЧ, но и ко многим другим вакцинам VLP, находящимся в разработке37. Известные вакцины на основе VLP, например, получены из необолоченных или капсидных родительских вирусов, таких как вирус папилломы человека (ВПЧ). В отличие от частиц ВИЧ-1, которые образованы только одним структурным основным белком, а именно p55 Gag, и окутаны мембраной, происходящей из клетки-продуцента VLP, частицы ВПЧ состоят только из одного или двух структурных белков ядра38,39. Аналогично и как представлено здесь для Окутанных VLP, анализ захвата VLP может также применяться к обнаружению чувствительных к нейтрализации эпитопов необолоченных VLP.
В качестве альтернативы анализу захвата образцы VLP могут быть непосредственно подвергнуты нативному PAGE с последующим вестерн-блот-анализом с использованием bNAbs и соответствующих вторичных антител, связанных с HRP40. Однако и для анализа VLP, украшенных HIV Env, этот анализ менее чувствителен, поскольку можно ожидать только низкого количества белков антигена на VLP. Напротив, анализ захвата облегчает обнаружение основных белков, обильных в больших количествах на VLP, в случае ВИЧ-производных VLP более 3 500 белков Gag образуют VLP27. Это позволяет очень чувствительно обнаруживать эпитопы в Env, отображаемые даже при низкой плотности на VLP.
Количество хорошо зарекомендовавших себя методов исследования чувствительных к нейтрализации эпитопов в поверхностных антигенах VLP ограничено. Маркировка антигенов, отображаемых на VLP, возможна с помощью эпитоп-специфических конъюгатов антитело-флуорофор и последующее обнаружение с помощью анализа отслеживания наночастиц (NTA), что позволяет обнаруживать и количественно оценивать VLP. Этот метод также был успешно разработан и оптимизирован для экзосом, представляющих маркеры клеточной поверхности41. Кроме того, спектроскопия поверхностного плазмонного резонанса (SPR) позволяет анализировать взаимодействия между неконъюгированными нейтрализующими антителами и родственными эпитопами, представленными на VLP. Несмотря на то, что они не подходят для анализа с более высокой пропускной способностью, они также могут быть помечены bNAbs, связанными с частицами золота и последующим просвечивающим электронным микроскопическим (TEM)-исследованием42.
В заключение, анализ захвата VLP дает некоторые значительные преимущества: (i) оценка структурной целостности чувствительных к нейтрализации эпитопов на поверхности VLP, (ii) чувствительное и косвенное обнаружение антигенов даже при отображении при низкой плотности на VLP и (iii) метод не требует затратного аналитического оборудования.
Disclosures
Авторы заявляют, что у них нет конфликта интересов.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана грантом Федерального министерства образования и исследований Германии, программой финансирования Forschung an Fachhochschulen, контрактными номерами 13FH767IA6 и 13FH242PX6 для JS. Рисунки 1 и 2 были созданы с BioRender.com.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL reaction tubes | Eppendorf | ||
| 10x PBS | gibco | 70011044 | |
| 4%–15% Mini-PROTEAN TGX stain-free protein gels | BioRad | 4568085 | |
| Antibodies (bnAbs) | Polymun Scientic | ||
| Isotype control antibody | invitrogen (Thermo Fisher Scientific) | 02-7102 | |
| Chemidoc XRS+ imaging system | BioRad | 1708265 | |
| Chicken anti-rabbit IgG HRP-coupled | Life technologies | A15987 | 1:5000 in TBS-T + 2 % (w/v) powdered milk |
| Dynabeads Protein G Immunoprecipitation Kit | invitrogen (Thermo Fisher Scientific) | 10007D | includes buffers and washing solutions |
| FreeStyle 293-F cells | invitrogen (Thermo Fisher Scientific) | R790-07 | |
| FreeStyle 293 Expression Medium | invitrogen (Thermo Fisher Scientific) | 12338026 | |
| Gel blotting papers | Whatman | GB005 | |
| Glycine | Carl Roth | 0079 | blotting buffer |
| Magnetic separation rack | New England Biolabs | S1509S | for 12 x 1.5 mL or 6 x 1.5 mL tubes |
| Methanol | Carl Roth | 4627 | blotting buffer |
| Mini-PROTEAN Tetra Cell electrophoresis system | BioRad | ||
| Optima XE-90 ultracentrifuge | Beckman Coulter | ||
| PageRuler prestained protein ladder | Thermo Scientific | 26616 | |
| Polyvinylidene fluoride (PVDF) syringe filters, 0.45 µm | Carl Roth | KC89.1 | |
| Powdered milk | Carl Roth | T145 | blocking buffer |
| PVDF transfermembrane, 0.45 µm | Carl Roth | T830.1 | |
| QuickTiter HIV p24 ELISA | Cell Biolabs | VPK-108-H | |
| Rabbit polyclonal to HIV1 p55 + p24 + p17 | abcam | ab63917 | 1:2000 in TBS-T + 2 % (w/v) powdered milk |
| Rotator | Heidolph | REAX2 | |
| ROTI Load 1 (laemmli buffer) | Carl Roth | K929.1 | 4x concentrated reducing protein gel loading buffer |
| ROTIPHORESE 10x SDS-PAGE | Carl Roth | 3060 | |
| Sodium chloride | Carl Roth | 3957 | TBS-T buffer |
| SuperSignal West Pico PLUS chemiluminescent substrate | Thermo Scientific | 34579 | |
| SW28 rotor | Beckman Coulter | ||
| Thermomixer | Cel Media | basic | |
| Trans-Blot Turbo | BioRad | ||
| Trehalose dihydrate | Carl Roth | 8897.2 | |
| TRIS | Carl Roth | 5429 | blotting buffer |
| TRIS hydrochloride | Carl Roth | 9090 | TBS-T buffer |
| Tween-20 | Carl Roth | 9127 | TBS-T buffer |
| Ultra Clear centrifuge tubes | Beckman Coulter | 344058 |
References
- Roldão, A., Mellado, M. C. M., Castilho, L. R., Carrondo, M. J. T., Alves, P. M.
- Noad, R., Roy, P.
- Qian, C., et al. Recent progress on the versatility of virus-like particles. Vaccines. 8 (1), 139 (2020).
- Zabel, F., Kündig, T. M., Bachmann, M. F. Virus-induced humoral immunity: On how B cell responses are initiated. Current Opinion in Virology. 3 (3), 357-362 (2013).
- Garg, H., Mehmetoglu-Gurbuz, T., Joshi, A. Virus Like Particles (VLP) as multivalent vaccine candidate against Chikungunya, Japanese Encephalitis, Yellow Fever and Zika Virus. Scientific Reports. 10 (1), 4017 (2020).
- Hodgins, B., Pillet, S., Landry, N., Ward, B. J. A plant-derived VLP influenza vaccine elicits a balanced immune response even in very old mice with co-morbidities. PLoS ONE. 14 (1), 0210009 (2019).
- Lai, C. C., et al. Process development for pandemic influenza VLP vaccine production using a baculovirus expression system. Journal of Biological Engineering. 13, 78 (2019).
- Caldeira, J. C., Perrine, M., Pericle, F., Cavallo, F. Virus-like particles as an immunogenic platform for cancer vaccines. Viruses. 12 (5), 488 (2020).
- Nika, L., et al. An HER2-displaying virus-like particle vaccine protects from challenge with mammary carcinoma cells in a mouse model. Vaccines. 7 (2), 41 (2019).
- Mohsen, M. O., Zha, L., Cabral-Miranda, G., Bachmann, M. F. Major findings and recent advances in virus-like particle (VLP)-based vaccines. Seminars in Immunology. 34, 123-132 (2017).
- Fontana, D., Garay, E., Cevera, L., Kratje, R., Prieto, C., Gòdia, F. Chimeric VLPs based on hiv-1 gag and a fusion rabies glycoprotein induce specific antibodies against rabies and foot-and-mouth disease virus. Vaccines. 9 (3), 251 (2021).
- Cervera, L., et al. Production of HIV-1-based virus-like particles for vaccination: achievements and limits. Applied Microbiology and Biotechnology. 103 (18), 7367-7384 (2019).
- Gonelli, C. A., King, H. A. D., Mackenzie, C., Sonza, S., Center, R. J., Purcell, D. F. J. Immunogenicity of HIV-1-based virus-like particles with increased incorporation and stability of membrane-bound env. Vaccines. 9 (3), 1-36 (2021).
- Trkola, A. HIV not as simple as one, two, three. Nature. 568, 321-322 (2019).
- Berman, P. W., et al. Protection of chimpanzees from infection by HIV-1 after vaccination with recombinant glycoprotein gp120 but not gp160. Nature. 345 (6276), 622-625 (1990).
- Barouch, D. H. Challenges in the development of an HIV-1 vaccine. Nature. 455 (7213), 613-619 (2008).
- DeCaprio, J., Kohl, T. O. Immunoprecipitation. Cold Spring Harbor Protocols. 2020 (11), 449-461 (2020).
- Barret, B., Wood, P. A., Volwiler, W. Quantitation of gamma globulins in human serum by immunoprecipitation. Journal of Laboratory and Clinical Medicine. 55, 605-615 (1960).
- Kaboord, B., Perr, M. Isolation of proteins and protein complexes by immunoprecipitation. Methods in Molecular Biology. 424, Clifton, N.J. 349-364 (2008).
- Lee, S. H., Chu, K. B., Kang, H. J., Quan, F. S. Virus-like particles containing multiple antigenic proteins of Toxoplasma gondii induce memory T cell and B cell responses. PLoS ONE. 14 (8), 0220865 (2019).
- Lee, Y. T., et al. Intranasal vaccination with M2e5x virus-like particles induces humoral and cellular immune responses conferring cross-protection against heterosubtypic influenza viruses. PLoS ONE. 13 (1), 0190868 (2018).
- Wang, J., et al. Large-scale manufacture of VP2 VLP vaccine against porcine parvovirus in Escherichia coli with high-density fermentation. Applied Microbiology and Biotechnology. 104 (9), 3847-3857 (2020).
- Swenson, D. L., et al. Generation of Marburg virus-like particles by co-expression of glycoprotein and matrix protein. FEMS Immunology and Medical Microbiology. 40 (1), 27-31 (2004).
- Latham, T., Galarza, J. M. Formation of wild-type and chimeric influenza virus-like particles following simultaneous expression of only four structural proteins. Journal of Virology. 75 (13), 6154-6165 (2001).
- Doyle, J., Ray, M., Ouyang, A., Benton, B., Bell, P. A. Abstract 4877: High throughput proteomic applications using protein A/G magnetic beads. Association for Cancer Research (AACR) 102nd Annual Meeting. 20, 4877 (2011).
- Zhu, P., et al. Electron tomography analysis of envelope glycoprotein trimers on HIV and simian immunodeficiency virus virions. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (26), 15812-15817 (2003).
- Lavado-García, J., Jorge, I., Boix-Besora, A., Vázquez, J., Gòdia, F., Cervera, L. Characterization of HIV-1 virus-like particles and determination of Gag stoichiometry for different production platforms. Biotechnology and Bioengineering. 118 (7), 2660-2675 (2021).
- Miura, K. An overview of current methods to confirm protein-protein interactions. Protein & Peptide Letters. 25 (8), 728-733 (2018).
- Rao, V. S., Srinivas, K., Sujini, G. N., Kumar, G. N. Advances in molecular techniques to study diversity. Plant Biotechnology, Volume 1: Principles, Techniques, and Applications. , 341-365 (2017).
- Rosengarten, J. F., Schatz, S., Wolf, T., Barbe, S., Stitz, J. Components of a HIV-1 vaccine mediate virus-like particle (VLP)-formation and display of envelope proteins exposing broadly neutralizing epitopes. Virology. , 41-48 (2022).
- JoVE, JoVE. Grundlegende Methoden in der Zell- und Molekularbiologie. Separating Protein with SDS-PAGE. JoVE Science Education Database. , Cambridge, MA. (2021).
- Eslami, A., Lujan, J. Western blotting: sample preparation to detection. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (44), e2359 (2010).
- Sheng, S., Kong, F. Separation of antigens and antibodies by immunoaffinity chromatography. Pharmaceutical Biology. 50 (8), 1038-1044 (2012).
- Guzzo, C., et al. Virion incorporation of integrin 47 facilitates HIV-1 infection and intestinal homing. Science Immunology. 2 (11), (2017).
- Wei, M., et al. Bacteria expressed hepatitis E virus capsid proteins maintain virion-like epitopes. Vaccine. 32 (24), 2859-2865 (2014).
- Jin, J., Park, C., Cho, S. H., Chung, J. The level of decoy epitope in PCV2 vaccine affects the neutralizing activity of sera in the immunized animals. Biochemical and Biophysical Research Communications. 496 (3), 846-851 (2018).
- Zhang, X., et al. Lessons learned from successful human vaccines: Delineating key epitopes by dissecting the capsid proteins. Human Vaccines and Immunotherapeutics. 11 (5), 1277-1292 (2015).
- DiGiuseppe, S., Bienkowska-Haba, M., Guion, L. G. M., Keiffer, T. R., Sapp, M. Human papillomavirus major capsid protein L1 remains associated with the incoming viral genome throughout the entry process. Journal of Virology. 91 (16), 00537 (2017).
- Wang, J. W., Roden, R. B. S.
- Binley, J. M., et al. Profiling the specificity of neutralizing antibodies in a large panel of plasmas from patients chronically infected with human immunodeficiency virus type 1 subtypes B and C. Journal of Virology. 82 (23), 11651-11668 (2008).
- Thane, K. E., Davis, A. M., Hoffman, A. M. Improved methods for fluorescent labeling and detection of single extracellular vesicles using nanoparticle tracking analysis. Scientific Reports. 9 (1), 12295 (2019).
- Mulder, A. M., et al. Toolbox for non-intrusive structural and functional analysis of recombinant VLP based vaccines: A case study with hepatitis B vaccine. PLoS ONE. 7 (4), 0033235 (2012).
