Summary
여기서는 항원 표시 바이러스 유사 입자(VLP)에서 중화 에피토프를 검출하는 프로토콜을 제시한다. 인간 면역결핍 바이러스(HIV)-유래 VLP의 면역 침전은 단백질 G-컨쥬게이트 자기 비드에 결합된 봉투 당단백질 특이적 단일 클론 항체를 사용하여 수행된다. 포획된 VLP는 이후 바이러스 성 코어 단백질 개그 특이적 항체를 사용하는 SDS-PAGE 및 서양 블롯 분석을 받게 된다.
Abstract
바이러스와 같은 입자(VLP) 포획 분석법은 일반적으로 항원 표시 VLP를 정화하고 분리하는 데 사용되는 '풀다운 분석법'으로 알려진 면역 침전 방법이며, 따라서 비드와 같은 고체 및 불용성 매트릭스에 고정된다. 표적 항원과의 높은 친화력으로 인해 이러한 항체는 VLP의 막 봉투에 고정된 코냑 항원으로 장식된 VLP를 포획할 수 있다. 이 프로토콜은 단백질 A-또는 G-컨쥬게이드 자기 구슬에 항원 특이적 항체의 결합을 설명합니다. 우리의 연구에서, 인간 면역 결핍 바이러스 (HIV)-유래 VLP 그룹 특정 항원 (Gag) 바이러스 코어 전구체 단백질 p55 개그와 HIV의 봉투 당단백질 (Env)을 표시 검사. VLP는 Env에서 중화에 민감한 에피토프를 대상으로 광범위하게 중화 항체(bNAbs)를 사용하여 포획됩니다. 여기에 설명된 VLP 포획 분석법은 (i) VLP가 각각의 표적 항원으로 장식되어 있음을 입증하기 쉬운 민감하고 수행하기 쉬운 방법을 나타내며, (ii) 표면 항원은 분석에서 사용되는 bNAbs의 에피토프 특이적 결합에 의해 입증된 바와 같이 구조적 무결성을 유지하고(iii) 후속 서양 blot에서 개그 단백질의 검출에 의해 밝혀진 VLP의 구조적 무결성을 나타낸다. 따라서 면역 강수량을 위한 bNAbs의 활용은 VLP 백신이 예방 접종된 인간에서 중화 B 세포 반응을 유도할 수 있는지 여부를 예측하는 것을 용이하게 합니다. 우리는 이 프로토콜이 잠재적인 VLP 기지를 둔 백신을 검토하기 위하여 귀중하고 간단한 실험적인 접근으로 그밖 연구원을 제출할 것이라는 점을 예상합니다.
Introduction
바이러스와 유사한 입자(VLP)는 바이러스 게놈이 결여된 상태에서 토착 바이러스 입자 구조를 유사하므로 높은 안전 프로파일1,2를 제공한다. VLP는 그들의 높은 면역genicity3,4,5,6,7 때문에 점점 개발된 백신의 개별 적인 클래스를 나타냅니다. 이는 특히 막에 둘러싸인 VLP의 경우 상동성 바이러스 표면 항원뿐만 아니라 종양 항원8,9,10과 같은 이성화 항원도 표시할 수 있다. 도 1은 봉투에 싸인 항원 장식 VLP의 구조에 대한 예시적인 개요를 제공한다. VLP 기반 백신의 개발 과정에서, 분석은 VLP 표면에 표시되는 각각의 표적 항원분석을 가능하게 하는 데 필수적이다. 이러한 분석서는 미립자 백신의 조성을 해명하는 데 도움이 되어야 합니다: (i) VLP는 각각의 표면 항원으로 장식되어 있습니까? (ii) 표면 항원은 중화 항체(bNAbs)의 에피토프 인식에 의해 입증된 바와 같이 고유의 구조를 유지하고 있으며(iii) VLP 형성을 중재하는 바이러스 단백질의 검출으로 인해 VLP의 구조적 무결성을 확인할 수 있습니까?
그림 1: 멤브레인으로 둘러싸인 VLP의 회로도 그림입니다. VLP는 미숙한 전구체 개그 코어 단백질에 의해 형성되고 숙주 세포에서 파생된 지질 막에 둘러싸여 있습니다. 항원, 예를 들어, 봉투 당단백질은 지질 막에 통합되어 VLP의 표면에 표시됩니다(오른쪽). 항원 특이적 항체는 항원을 인식한다. 왼쪽에는 항원 장식이 없는 대머리 VLP가 표시됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
특히 인간 면역결핍 바이러스 유형 1(HIV-1)의 바이러스 성 전구체 단백질 p55에 의해 형성된 VLP는 백신 개발에서 항원 디스플레이를 선호하는 비계가 수많은 항체로서, ELISA 키트를 사용할 수 있어 이들 VLP11,12의 정량화를 가능하게 한다. HIV-1 봉투 당단백질(Env), 즉, 막 단백질 gp41(gp41-TM) 및 이성구를 형성하는 수용성 표면 단위 gp120(gp120-SU)은 입자의 막 봉투에 통합되어 HIV감염에 대한 백신 개발을 위한 중요한 표적 항원입니다13,14,155 . 이러한 표적 항원에 중화에 민감한 전형체의 표시는 백신에서 광범위하게 중화 항체 반응을 유도하기위한 전제 조건이다. 개그 단백질에 대 한 지시 하는 T 세포 응답 외에, 이것은 HIV 감염에 대 한 보호의 중요 한 상관 관계 간주 16. 따라서 표적 항원 후보로 장식된 VLP의 설계 및 생산시, 표시된 항원들의 품질에 대한 후속 분석은 백신 개발 과정에서 중요한 단계를 나타낸다.
면역 강수량(IP)은 단백질-단백질 상호 작용의 검출및 작은 척도에서 단백질 복합체의 정제를 위해 널리 사용되는 기술이다17. 바렛 외. 1960년 IP 개발에 대해 처음 보고했지만, 이 방법은 지속적으로 개선되고 있습니다. IP는 비슬18,19에 결합하여 고정된 항원 특이적 항체(bait)를 채택함으로써 용액으로부터 표적 항원(prey)의 포획 및 분리를 가능하게 한다. 본 프로토콜에서, 우리는 미끼 단백질로 VLP의 표면에 전시된 봉투 단백질에 중화에 민감한 에피토프를 인식하는 먹이및 bNAbs로 멤브레인 포위 된 p55 개그 형성 VLP를 사용하여 고전적인 IP 응용 프로그램의 변화를 보여줍니다. 이러한 VLP 포획 분석의 성공적인 적용은 검증된 항원 양성 VLP가 예방 접종된 사람들의 중화 B 세포 반응을 유도할 수 있는지 여부를 예측하는 것을 용이하게 합니다. VLP 기반 백신 후보의 이러한 면역 원성 특성은 작은 동물 모델20,21,22에서 자주 입증된다.
새로 개발된 VLP 백신 후보의 품질을 평가하기 위해 VLP 포획 아세약이 성공적으로 사용되었습니다5,23,24. 그러나 게시된 메서드의 수는 제한됩니다. 여기에 제시된 VLP 포획 분석은 포유류 유래 항체의 Fc 지구에 결합하는 단백질 G-conjugated 구슬에 Env 특이bNAbs의 고정으로 시작합니다. 선택의 항체의 고정을 위한 전형적인 행렬은 아가로즈 또는 자기 구슬이다. 그러나 자기 구슬은 고처리량 응용 프로그램에 유리합니다25. 다음 단계에서, 표적 항원을 표시하는 VLP는 bNAb 코팅 구슬에 의해 포획된다. Env 양성 VLP 및 고정형 bNAbs로 구성된 형성된 면역 복합체는 자석을 사용하여 쉽게 농축됩니다. 고립 된 면역 복합체는 마지막 단계에서 용해됩니다. 그 후, VLP는 생화학적으로 특성화될 수 있다. 여기서, 우리는 침전된 표적 Env 항원이 중화에 민감한 에피토프를 품고 있었다는 것을 보여주기 위하여 p55 개그 바이러스 성 코어 단백질 특이항체를 채택한 서양 얼룩 분석을 수행했습니다 그러나 또한 개그 형성 VLP에 표시되었다. 더욱이, 바이러스 코어 개그 단백질의 검출은 개그 단백질이 VLP에서 Env보다 더 풍부하기 때문에 캡처 분석의 감도를 증가시킨다. HIV-1에서 Env 단백질은 단일 또는 두 자릿수 number26에서만 존재하지만 3,500개 이상의 개그 분자가 particle27의 코어를 형성합니다.
단백질-단백질 상호작용28,29의 검사를 위한 다른 기술에 비해, VLP 포획 분석법은 고가의 분석 기구에 접근하지 않는 연구 실험실을 위한 대체 방법을 제공합니다. 예를 들어, 투과 전자 현미경 분석(TEM), 표면 플라스몬 공명 분광법(SPR), 및 나노입자 추적 분석(NTA)은 비용 집약적일 수 있다. 여기에 제시된 포획 분석법은 또한 겔 전기포고리, 면역블로팅, 전자 현미경 및 질량 분석법(MS)을 각각 사용하는 단백질 특성화를 위해 포획된 항원 양성 VLP 샘플의 후기 주관을 허용한다. 표적 항원의 기본 구조가 VLP 포획 분석 중에 보존된다는 점을 고려할 때, 또한 네이티브 PAGE 및 후속 면역 블로팅 기술의 성능을 활용할 수 있다.
VLP 포획 분석법은 중화에 민감한 에피토프를 노출하는 표적 항원을 가진 VLP의 장식을 검사하기 쉽고 민감한 방법을 나타내며, 따라서 미래의 백신 후보로서 그들의 유용성을 나타낸다.
Protocol
1. 샘플 준비
- 293-F 발현 배지에서 mL당 0.5 x 106 세포의 낮은 세포 밀도에서 단독으로 또는 env 30을 사용하는 293-F 세포에서 유래한 VLP 생산자 서스펜션 세포주를 종자.
- 37°C에서 3-4일, 분당 5cm 및 135발의 궤도를 가진 셰이커 인큐베이터 회전에서 8%의 CO2 를 확장하게 한다.
- 5 분 동안 100 x g 에서 원심 분리에 의해 생산자 세포를 펠렛. 0.45 μm 폴리비닐리데인 불소(PVDF) 멤브레인 주사기 필터를 사용하여 잔류 세포 및 세포 이물질을 제거하여 세포없는 세포 배양 슈퍼나탄트(CFSN)를 획득하도록 명확히 된 초상체를 필터링한다.
참고: 프로토콜은 여기에서 일시 중지할 수 있습니다. CFSN은 4°C에서 하룻밤 동안 보관할 수 있습니다. - 극심분리(112,700 x g, 4°C, 1.5h)를 채용하는 CFSN의 35mL로부터의 실험 또는 펠릿 VLP에 CFSN을 직접 사용한다.
- 초원심분리시, 상신체를 버리고 200 μL에서 15%(w/v) 트레할로오스 용액을 원심분리기 튜브로 중단한다.
참고 : VLP 펠릿은 종종 육안으로 볼 수 없습니다. 프로토콜은 여기에서 일시 중지할 수 있습니다. VLP는 -80°C에 저장할 수 있습니다. - VLP 포획 분석 전에, ELISA를 사용하여 샘플을 포함하는 VLP의 바이러스 핵심 단백질 농도를 결정한다. 이 단계는 캡처 분석 입력을 표준화하는 것이 중요합니다.
2. VLP 캡처 분석
참고: 워크플로에 대한 개요는 그림 2에 설명되어 있습니다.
- 50rpm에서 회전기에서 위아래로 파이프팅하거나 50rpm에 혼합하여 마그네틱 구슬을 5분 이상 중단합니다.
- 한편, bNAbs를 함유하는 항체 용액을 준비한다. 반응당 항체 결합 및 세척 버퍼( 재료 표 참조)의 200μL에 각 bNAb의 10 μg를 사용하십시오.
참고: 항체 양은 사용되는 VLP에 대한 bNAb 및 항원 장식 밀도의 선호도에 따라 달라질 수 있다. - 반응당 자기 비드 용액50 μL( 재료 표 참조)을 사용하고 구슬을 1.5mL 반응 튜브로 옮킨다. 자기 분리 랙에 튜브를 놓습니다.
참고: 또는 각 튜브에 강한 단일 자석을 사용하여 구슬을 상체에서 분리할 수 있습니다. - 구슬이 튜브 벽에 모일 때까지 몇 분 간 기다려 모든 구슬이 수집되도록 하십시오. 상부체를 제거합니다.
- 자석을 제거하고 2.2 단계에서 제조된 bNAb 용액의 200 μL에서 구슬을 일시 중단합니다. 실온에서 50 rpm에서 회전에 30 분 ~ 3 시간 혼합을 위해 배양하십시오.
- 반응 튜브를 자기 분리 랙에 다시 놓고 기다렸다가 상체를 제거합니다.
- 자석에서 튜브를 제거하고 항체 결합 및 세척 버퍼의 200 μL에서 재연하여 구슬을 세척하십시오.
- 2.4 단계를 반복합니다. 가능한 한 많은 세척 버퍼를 제거합니다.
- 비드 바인딩 bNAbs에 샘플을 추가합니다.
참고: HIV 유래 입자를 이용한 포획 분석에 대한 VLP 입력은 반응당 바이러스 성 코어 단백질의 적어도 15 ng여야 합니다. VLP 양은 사용되는 VLP에 대한 bNAb및 항원 장식 밀도의 친화성에 따라 달라질 수 있다. - 2.9 단계에서 추가된 샘플 볼륨이 1mL 미만인 경우 PBS를 추가하여 샘플 볼륨을 1mL로 조정합니다. 파이프팅으로 구슬을 부드럽게 중단합니다.
- 실온에서 회전기에서 2.5h의 샘플과 구슬을 배양합니다. 구슬이 정지 상태를 유지하고 잠복 하는 동안 솔루션이 완전히 혼합되어 있는지 확인합니다.
- 자석에 튜브를 놓고 상체를 제거합니다.
- 200μL의 세척 버퍼에서 자석 구슬을 세척하십시오( 재료 표 참조). 세정 단계를 세 번 반복합니다.
- 구슬을 세척 버퍼의 100 μL로 중단하고 서스펜션을 깨끗한 (내열성) 반응 튜브로 옮기십시오.
- 자기 분리 랙에 튜브를 놓고( 재료 표 참조) 상체를 완전히 제거합니다.
- 단계 2.16.1-2.16.2 단계 다음 의 SDS-PAGE 샘플을 2.16.16.3-2.16.5 단계 다음 자기 구슬에서 VLP를 용해하여 비변성 샘플을 준비합니다.
- 변성 SDS-PAGE 샘플을 준비하기 위해, 라에믈리 버퍼의 20-80 μL (p55 개그 분석 입력의 1 ng 당 Laemmli 버퍼의 0.8 μL)에서 구슬을 중단하고 5 분 동안 95 °C에서 배양하십시오.
- SDS-PAGE로 직접 진행하거나 샘플을 -20°C에 저장합니다.
주의: Laemmli 버퍼에는 2-mercaptoethanol 및 나트륨 도데킬 황산염이 들어 있습니다. 보호 장갑과 눈 보호 기능을 착용하십시오. 피부, 눈, 옷과의 접촉을 피하십시오. 증기를 흡입하지 마십시오. 통풍이 잘 되는 공간에서 작업하십시오( 예: 연기 후드).
참고: 프로토콜은 여기에서 일시 중지할 수 있습니다. - 대안적으로, 보존된 토착 단백질 구조를 가진 VLP를 얻기 위하여 비-데니레이션 용출 단계를 수행한다.
- 자기 구슬에 25 μL(구슬이 자주 제공)을 추가하고 실온에서 2-5분 동안 배양합니다.
- 구슬을 제거하고 용루를 깨끗한 튜브로 옮기십시오. 후속 에세이용 용루아제를 사용하거나 4°C에 저장하십시오.
참고: 프로토콜은 여기에서 일시 중지할 수 있습니다.
3. 캡처 된 VLP 샘플 분석
참고: 캡처된 VLP를 분석하려면 SDS-PAGE를 수행하고 이후 서부 블롯 분석31,32를 수행합니다.
- 샘플 튜브를 마그네틱 랙에 배치하여 구슬을 용액과 분리합니다.
- 각 샘플의 10 μL을 젤의 개별 우물에 적재합니다.
참고: 이 프로토콜에서 바이러스 성 p55 개그 코어 단백질은 HIV 개그와 이차 폴리클론 치킨 안티 래빗 IgG를 고추냉이 과산화기(HRP) 항체에 결합하여 폴리클론 토끼 항체를 사용하여 검출되었다. 바이러스 성 핵심 단백질은 화학 발광 검출을 사용하여 시각화되었습니다.
그림 2: 세포없는 초월제를 사용하여 VLP 캡처 분석의 주요 단계의 회로도 그림입니다. (1) VLP 포획 분석법은 HIV-1 bNAbs의 결합으로 단백질 G-결합 자기 구슬로 시작한다. 한편, 정의된 p55 농도를 가진 VLP 용액이 제조된다. 세포없는 배양 상체는 p55 개그 VLP, 숙주 세포 단백질 및 핵산의 혼합물로 구성됩니다. (2) bNAbs 및 VLP 용액에 결합된 자기 비드는 1.5mL 반응 튜브로 옮겨진 다음 회전 하에서 인큐베이션을 한다. (3) 항원 표시 VLP는 bNAbs 코팅 구슬에 의해 포획된다. 숙주 세포 유래 오염 물질로부터 이러한 면역 복합체의 분리는 자기장에서 수행된다. (4) 피펫팅에 의해 상체가 제거되고, 비드는 언바운드 VLP를 제거하기 위해 세 번 세척된다. (5) 다음 단계에서, 단백질 적재 버퍼를 감소시키는 것은 bNAbs로 코팅된 자기 비드로 이루어진 면역 복합체에 첨가되고 VLP를 포획한다. (6) 시료를 끓여 서 bNAbs 및 표적 항원을 자기 비드로부터 끓이고 VLPs로부터 의 표적 항원을 끓이는 것은 자기용액(자기용액)이다. (8) 단백질 샘플은 SDS-PAGE를 받습니다. (9) 바이러스 성 p55 개그 코어 단백질을 검출하기 위해 서양 블롯 분석이 수행됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
Representative Results
도 3 은 BNAbs를 사용하여 각각 CFSN 및 VLP 펠릿에서 처음 포획된 VLP의 대표적인 결과를 나타내며, 이후 바이러스 성 코어 단백질을 검출하기 위해 서양 블롯 분석을 실시한다. 포획 분석에 사용되는 구슬은 각각 음의 대조군역할을 하는 Env 당단백질 및 동형 항체의 중화 에피토프에 대한 3가지 상이한 bNAbs로 코팅되었다. 동종타입 항체 코팅 구슬을 사용하여, 서양 블롯 분석을 사용하는 Env-negative(대머리 VLP) 또는 Env-displaying VLP를 포함하는 견본에서 어떤 개그 단백질도 검출되지 않았습니다. 이것은 VLP가 인간 항체로 코팅된 구슬에 특이적이지 않은 결합이 VLP 포획을 중재하지 않았다는 것을 입증했습니다. 대머리 VLP는 또한 bNAbs 코팅 구슬에 의해 구속되지 않았고, 결과적으로 다시, 어떤 개그 단백질도 검출할 수 없었다. 대조적으로, 3개의 bNAbs는 모두 Env 단백질 (Env VLP)를 표시하는 VLP를 붙잡고, 그러므로, 개그 단백질은 그 후에 쉽게 검출되었습니다. 도 3에서 볼 수 있듯이, 포획 분석은 각각 CFSN 및 펠릿 VLP 샘플에서 VLP를 표시하는 표적 항원분석에 활용될 수 있다.
그림 3: 광범위하게 중화 항체를 사용하여 p55 개그 형성 VLP에 표시되는 HIV-1 봉투 당단백질에서 중화에 민감한 에피토프검출. HIV-1 봉투 당단백질(Env) 내의 에피토프를 표적으로 하는 3개의 다른 광범위하게 중화 항체(bNAb 1, bNAb 2 및 bnAb 3)를 이용한 VLP 포획 분석을 수행한 후 바이러스 개그 코어 단백질 특이적 항체를 이용한 서양 블롯 분석의 대표적인 결과. 인간 세라로부터 풀려난 등형 인체 항체는 부정적인 대조군으로 작용했다. 세포 배양 슈퍼나탕은 Env 단백질(Env VLP)과 대머리 VLP(Env-negative)를 가진 VLP를 생산하는 현탁액 세포 배양에서 수확되었으며, 임의의 바이러스 성 단백질(mock)을 발현하지 않는 순진한 세포로부터 각각 수확되었다. 대머리 VLP 생산자 세포 배양뿐만 아니라 모의 세포 배양에서 초월제 모두 부정적인 대조군역할을 했다. 수퍼나탈제는 분석을 위해 세포없는 초나티(CFSN)를 얻기 위해 저속 원심분리 및 후속 여과를 사용하여 세포를 오염시키는 데서 해방되었다. 면역 침전 시, 서양 얼룩 분석은 개그와 이차 안티 래빗 IgG-HRP 컨쥬게이트에 대하여 지시된 폴리클론 토끼 항체를 사용하여 수행되었다. 분자량 마커(MW)에서 볼 수 있는 킬로달톤(kDa)의 명백한 분자량이 왼쪽에 묘사된다. 화살표는 검출된 전구체 단백질 p55 개그를 나타냅니다. (A) 각 시료에 대해, 100 ng의 개그 단백질을 함유한 CFSN은 VLP의 입력량을 표준화하기 위해 포획 분석서에 적용되었다. (B) VLP 펠릿은 CFSN의 초원심분리에 의해 수득되었다. 개그 단백질의 100 ng를 함유하는 펠릿은 등형 항체 및 bNAb 3을 사용하여 포획 분석에 적용되었다. bNAb 1 및 bNAb 2에 대한 샘플은 개그의 단지 25 ng를 포함. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
Discussion
VLP 포획 분석 전에, VLP 의 형성 및 VLP 생산자 세포주에서 표적 항원의 발현을 평가한다. 기악 방법은 CFSN 및 펠릿 VLP의 항원 및 바이러스 코어 단백질 특이적 ELISA뿐만 아니라 항원의 세포 표면 발현의 흐름 세포 분석이다.
VLP 포획 분석의 중요한 단계는 포획 항체를 가진 구슬의 코팅입니다 - 여기 bNAbs - 및 항체 코팅 구슬에 의한 항원 양성 VLP의 후속 포획. 항체를 가진 구슬의 성공적인 코팅은 공액된 면역글로불린 (Ig)결합 단백질의 선택에 달려 있습니다. 공여자 종뿐만 아니라 항체의 Ig 클래스는 단백질 G-또는 단백질 A-접합 구슬이 바람직하다는 것을 결정한다. 대부분의 종과 Ig 클래스의 경우, 단백질 G는 선택33의 리간드입니다. 단백질 A/G-컨쥬게이드 구슬에 대한 대안으로, 생체화 항체코팅을 위한 스트렙타비딘 구슬을 사용할 수 있다. 구슬은 또한 항체와 공동으로 결합될 수 있습니다.
항체 코팅 구슬에 의한 VLP의 포획은 철저한 혼합, 충분한 배양 시간, 항원 풍부 성 및 포획 항체의 친화성에 달려 있다. 우리의 경험에서, VLP 견본과 항체 코팅구슬의 철저한 혼합은 실온 또는 4°C에서 적어도 2 시간 또는 4°C에 대한 회전하에 1.5 mL 튜브에 >500 μL의 부피의 활용에 의해 달성되는 것이 가장 좋습니다. 또 다른 잠재적 장애물은 샘플에서 너무 적은 양의 VLP입니다. 표적 항원에게 강하게 결합하는 항체의 경우, VLP 입력은 개그 단백질의 15 ng만큼 낮을 때 일반적으로 서양 블롯 분석을 활용하여 바이러스 코어 단백질의 쉽게 검출 가능한 양을 허용한다. 그러나, 낮은 친화성 항체는 결정적 결과를 얻기 위하여 개그 단백질의 100 ng와 같은 더 높은 입력 양을 요구합니다 (그림 3, bNAb 3).
일부 표면 항원은 저하를 프로테아이즈하는 경향이 있습니다. 여기서, VLP 샘플및 4°C에서 배양에 프로테아제 억제제의 첨가를 권장합니다. 비특이적 유착은 비특이적 인 접착 항체에 관찰되지 않으며, 우리가 모의 및 대머리 VLP 샘플 및 동형 제어 항체를 사용하여 여기에서 입증한 바와 같이 적절한 부정적인 대조를 이용하여 배제되어야한다. 비특이적 결합을 줄이기 위한 전략에는 확장된 세척 단계와 세척 버퍼34에 카제인 추가가 포함됩니다. 더욱이, 포획 분석은 항체의 최적 비율을 항원 표시 VLP 양에 결정함으로써 개선될 수 있다.
VLP 포획 분석의 마지막 단계에서, 우리는 Laemmli 버퍼를 감소시키는 끓여서 구슬에서 면역 복합체의 용출을 설명합니다. 이 단계에서, VLP는 분해되고, 포획 항체 및 표적 항원은 구슬에서 분리된다. 특히, 후속 서양 블롯 분석에 사용되는 1차 항체의 기증자 종은 이차 항공자 IgG HRP-접주 항체에 의한 포획 항체의 의도하지 않은 검출을 피하기 위해 포획 항체의 기증자와 차이가 있다.
여기에 제시된 VLP 포획 분석법은 VLP 표면에 표시되는 구조적 손상되지 않은 표적 항원에서 중화에 민감한 에피토프를 검출하는 사용하기 쉽고 민감한 방법을 제공한다. 그러나, 포획 분석은 직접적인 에피토프 정량화를 가능하게 하지 않는다. bNAbs로 수행된 ELISA는 이러한 목적을 위해 중요한 역할을 하며, 특히 검사된 VLP가 동물 모델을 사용하는 전임상 연구에서 사용하기 위한 경우 병렬로 실시되어야 한다35. 이는 항원의 양이 면역동물에서 중화 항체 반응의 유도와 직접 상관관계가 있기 때문에, 돼지 경하바이러스 제2(PCV2) 백신36에 도시된 바와 같이 중추적인 이다.
이상적인 백신은 비리온 표면에 중화 에피토프를 대상으로 bNAbs의 유도귀착되어야 한다. 특히 미립자 백신 표면에 그들의 완전한 구조적 무결성을 언급하는 이 전형의 분석은 잠재적인 백신 후보를 확인하기 위해 중요합니다. 이것은 HIV 유래 VLP뿐만 아니라 개발의 다른 많은 VLP 백신의 경우37입니다. 저명한 VLP 기지를 둔 백신은, 예를 들면, 인간 유두종 바이러스와 같은 비 포위되거나 capsid 부모 바이러스에서 파생됩니다 (HPV). 하나의 구조적 코어 단백질, 즉 p55 Gag에 의해 형성되고 VLP 생산자 세포에서 유래한 막에 의해 둘러싸인 HIV-1 입자와 달리 HPV 입자는 하나 또는 두 개의 구조적 코어 단백질38,39로 만 구성됩니다. 마찬가지로, 여기에 봉투된 VLP에 대해 제시된 바와 같이, VLP 포획 분석은 비봉투형 VLP의 중화 에피토프 검출에도 적용될 수 있다.
포획 분석의 대안으로, VLP 샘플은 BNAbs및 HRP40에 결합된 적절한 이차 항체를 사용하여 서양 블롯 분석 다음에 네이티브 PAGE를 직접 실시할 수 있다. 그러나 HIV Env 장식 VLP의 분석을 위해, VLP 당 항원 단백질의 낮은 수만 예상될 수 있기 때문에 이 분석은 덜 민감하다. 대조적으로, 포획 분석체는 VLP당 다량으로 풍부한 핵심 단백질의 검출을 용이하게 하며, HIV 유래 VLP의 경우 3,500개 이상의 개그 단백질이 VLP27을 형성한다. 이를 통해 VLP의 낮은 밀도에서도 Env에서 에피토프를 매우 민감한 간접적으로 감지할 수 있습니다.
VLP의 표면 항원에서 중화 에피토프를 검사하는 잘 확립된 방법의 수는 제한되어 있다. VLP에 표시되는 항원 라벨링은 에피토프 특이적 항체-플루오로포어 컨쥬게이트및 나노입자 추적 분석(NTA)에 의한 후속 검출을 통해 가능하다, VLP의 검출 및 정량화를 가능하게 한다. 이 방법은 또한 성공적으로 개발 및 세포 표면 마커를 제시 엑소좀에 최적화되었다41. 또한, 표면 플라스몬 공명(SPR) 분광법은 VLP에 제시된 공자 중화 항체와 톱니상 검사 사이의 상호 작용의 분석을 허용한다. 더 높은 처리량 분석에 적합하지는 않지만, VLP는 또한 금 입자 및 후속 전송 전자 현미경 (TEM)-검사42에 결합된 bNAbs로 표시될 수 있습니다.
결론적으로, VLP 포획 분석법은 몇 가지 상당한 이점을 제공합니다: (i) VLP의 표면에 중화 에피토프의 구조적 무결성평가, (ii) VLP의 낮은 밀도에 표시될 때에도 항원의 민감하고 간접적인 검출, 그리고 (iii) 방법은 비용 집약적 분석 장비를 필요로 하지 않는다.
Disclosures
저자는 이해 상충이 없다고 선언합니다.
Acknowledgments
이 작품은 독일 연방 교육 연구부, 자금 조달 프로그램 Forshochschulen, 계약 번호 13FH767IA6 및 13FH242PX6에서 JS에 대한 보조금에 의해 지원되었습니다. 그림 1과 2는 BioRender.com 함께 만들어졌습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL reaction tubes | Eppendorf | ||
| 10x PBS | gibco | 70011044 | |
| 4%–15% Mini-PROTEAN TGX stain-free protein gels | BioRad | 4568085 | |
| Antibodies (bnAbs) | Polymun Scientic | ||
| Isotype control antibody | invitrogen (Thermo Fisher Scientific) | 02-7102 | |
| Chemidoc XRS+ imaging system | BioRad | 1708265 | |
| Chicken anti-rabbit IgG HRP-coupled | Life technologies | A15987 | 1:5000 in TBS-T + 2 % (w/v) powdered milk |
| Dynabeads Protein G Immunoprecipitation Kit | invitrogen (Thermo Fisher Scientific) | 10007D | includes buffers and washing solutions |
| FreeStyle 293-F cells | invitrogen (Thermo Fisher Scientific) | R790-07 | |
| FreeStyle 293 Expression Medium | invitrogen (Thermo Fisher Scientific) | 12338026 | |
| Gel blotting papers | Whatman | GB005 | |
| Glycine | Carl Roth | 0079 | blotting buffer |
| Magnetic separation rack | New England Biolabs | S1509S | for 12 x 1.5 mL or 6 x 1.5 mL tubes |
| Methanol | Carl Roth | 4627 | blotting buffer |
| Mini-PROTEAN Tetra Cell electrophoresis system | BioRad | ||
| Optima XE-90 ultracentrifuge | Beckman Coulter | ||
| PageRuler prestained protein ladder | Thermo Scientific | 26616 | |
| Polyvinylidene fluoride (PVDF) syringe filters, 0.45 µm | Carl Roth | KC89.1 | |
| Powdered milk | Carl Roth | T145 | blocking buffer |
| PVDF transfermembrane, 0.45 µm | Carl Roth | T830.1 | |
| QuickTiter HIV p24 ELISA | Cell Biolabs | VPK-108-H | |
| Rabbit polyclonal to HIV1 p55 + p24 + p17 | abcam | ab63917 | 1:2000 in TBS-T + 2 % (w/v) powdered milk |
| Rotator | Heidolph | REAX2 | |
| ROTI Load 1 (laemmli buffer) | Carl Roth | K929.1 | 4x concentrated reducing protein gel loading buffer |
| ROTIPHORESE 10x SDS-PAGE | Carl Roth | 3060 | |
| Sodium chloride | Carl Roth | 3957 | TBS-T buffer |
| SuperSignal West Pico PLUS chemiluminescent substrate | Thermo Scientific | 34579 | |
| SW28 rotor | Beckman Coulter | ||
| Thermomixer | Cel Media | basic | |
| Trans-Blot Turbo | BioRad | ||
| Trehalose dihydrate | Carl Roth | 8897.2 | |
| TRIS | Carl Roth | 5429 | blotting buffer |
| TRIS hydrochloride | Carl Roth | 9090 | TBS-T buffer |
| Tween-20 | Carl Roth | 9127 | TBS-T buffer |
| Ultra Clear centrifuge tubes | Beckman Coulter | 344058 |
References
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