Summary
Aqui, apresentamos um protocolo para detectar epítopos de neutralização em partículas semelhantes a vírus que exibem antígenos (VLPs). A imunoprecipitação do vírus da imunodeficiência humana (HIV) derivada de VLPs é realizada usando anticorpos monoclonais específicos de glicoproteínas de envelope acoplados a contas magnéticas conjugadas por G. Os VLPs capturados são posteriormente submetidos à análise de SDS-PAGE e western blot empregando anticorpos específicos da proteína do núcleo viral.
Abstract
O ensaio de captura de partículas semelhantes a vírus (VLP) é um método de imunoprecipitação, comumente conhecido como um "ensaio puxado para baixo" usado para purificar e isolar VLPs que exibem antígeno. Anticorpos específicos de antígeno da superfície são acoplados e, portanto, imobilizados em uma matriz sólida e insolúvel, como contas. Devido à sua alta afinidade com o antígeno alvo, esses anticorpos podem capturar VLPs decorados com o antígeno cognato ancorado no envelope de membrana dos VLPs. Este protocolo descreve a ligação de anticorpos específicos de antígeno à proteína a proteínas conjugadas A ou G. Em nosso estudo, vLPs derivados do vírus da imunodeficiência humana (HIV) formados pela proteína precursora do núcleo viral p55 Gag e exibindo o envelope glicoproteínas (Env) do HIV são examinados. Os VLPs são capturados utilizando anticorpos amplamente neutralizantes (bNAbs) direcionados contra epítopos sensíveis à neutralização em Env. O ensaio de captura VLP descrito aqui representa um método sensível e de fácil desempenho para demonstrar que (i) os VLPs são decorados com o respectivo antígeno alvo, (ii) o antígeno de superfície manteve sua integridade estrutural como demonstrado pela ligação específica de epítope de bNAbs usados no ensaio e (iii) a integridade estrutural dos VLPs revelada pela detecção de proteínas gag em uma subsequente análise de manchas ocidentais. Consequentemente, a utilização de bNAbs para imunoprecipitação facilita uma previsão de se as vacinas VLP serão capazes de obter uma resposta neutralizante de células B em humanos vacinados. Prevemos que este protocolo fornecerá a outros pesquisadores uma abordagem experimental valiosa e direta para examinar possíveis vacinas baseadas em VLP.
Introduction
As partículas semelhantes a vírus (VLPs) se assemelham à estrutura de partículas de vírus nativos, sem o genoma viral, fornecendo assim um alto perfil de segurança1,2. As VLPs representam uma classe individual de vacinas cada vez mais desenvolvidas devido à sua alta imunogenicidade3,4,5,6,7. Este é particularmente o caso dos VLPs envoltos em membrana, permitindo a exibição não apenas de antígenos de superfície viral homólogos, mas também antígenos heteromanetos, como antígenos tumorais8,9,10. A Figura 1 fornece uma visão geral exemplar da estrutura de um VLP decorado com antígeno envolto. Durante o processo de desenvolvimento de vacinas baseadas em VLP, os ensaios são indispensáveis permitindo a análise do respectivo antígeno alvo exibido na superfície VLP. Tais ensaios devem ser fundamentais para elucidar a composição de uma vacina particulada: (i) Os VLPs são decorados com o respectivo antígeno superficial? (ii) O antígeno superficial manteve sua estrutura nativa como demonstrado pelo reconhecimento de epítope de anticorpos neutralizantes (bNAbs) e (iii) a integridade estrutural dos VLPs pode ser confirmada devido à detecção da formação de VLP mediadora de proteínas virais?
Figura 1: Ilustração esquemática de um VLP envolto em membrana. Os VLPs são formados por proteínas do núcleo mordaça precursora imatura e cercados por uma membrana lipídica derivada da célula hospedeira. Os antígenos, por exemplo, glicoproteínas envelope, são incorporados na membrana lipídica e exibidos na superfície do VLP (à direita). Anticorpos específicos de antígeno reconhecem o antígeno. À esquerda, um VLP careca sem decoração de antígeno é mostrado. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Especialmente os VLPs formados pela proteína precursora do núcleo do grupo viral (Gag) p55 do vírus da imunodeficiência humana tipo 1 (HIV-1) são andaimes preferidos para exibição de antígeno no desenvolvimento de vacinas como numerosos anticorpos, e kits ELISA estão disponíveis, permitindo a quantificação desses VLPs11,12. As glicoproteínas do envelope HIV-1 (Env), ou seja, a proteína transmembrana gp41 (gp41-TM) e a unidade de superfície solúvel gp120 (gp120-SU) formando heterodimers, são incorporadas ao envelope de membrana de partículas e são antígenos-alvo cruciais para o desenvolvimento de vacinas contra infecções por HIV13,14,15 . A exibição de epítopos sensíveis à neutralização nesses antígenos alvo é um pré-requisito para obter uma resposta de anticorpos amplamente neutralizante nas vacinas. Além de uma resposta celular T dirigida contra as proteínas Gag, esta é considerada uma importante correlação de proteção contra a infecção pelo HIV16. Consequentemente, e após o desenho e produção de VLPs decorados com candidatos a antígeno alvo, a análise subsequente da qualidade dos antígenos exibidos representa um passo crítico no processo de desenvolvimento de vacinas.
A imunoprecipitação (IP) é uma técnica amplamente utilizada para a detecção de interações proteína-proteína e a purificação de complexos proteicos em pequena escala17. Barret et al. relatado pela primeira vez sobre o desenvolvimento do PI em 1960, no entanto, este método tem sido constantemente melhorado. O IP permite a captura e isolamento de um antígeno alvo (presa) de uma solução, empregando um anticorpo específico de antígeno (isca) imobilizado pelo acoplamento a contas18,19. Neste protocolo, demonstramos uma variação da aplicação IP clássica usando VLPs p55 formados por gag com envelopes de membrana como presas e bNAbs que reconhecem epítopos sensíveis à neutralização nas proteínas envelope exibidas na superfície dos VLPs como proteínas de isca. A aplicação bem-sucedida deste ensaio de captura de VLP facilita a previsão de se os VLPs testados positivos de antígeno serão capazes de obter uma resposta neutralizante de células B em pessoas vacinadas. Tais propriedades imunogênicas dos candidatos à vacina baseada em VLP são frequentemente demonstradas em pequenos modelos animais20,21,22.
Para avaliar a qualidade do recém-desenvolvido candidato à vacina VLP, os ensaios de captura de VLP foram utilizados com sucesso5,23,24. No entanto, o número de métodos publicados é limitado. O ensaio de captura de VLP apresentado aqui começa com a imobilização de bNAbs específicos do Env em contas conjugadas por proteínas G, que se ligam à região fc de anticorpos derivados de mamíferos. Matrizes típicas para a imobilização do anticorpo de escolha são agarose ou contas magnéticas. No entanto, as contas magnéticas são favoráveis para aplicações de alto rendimento25. No próximo passo, os VLPs que exibem o antígeno alvo são capturados por contas revestidas de bNAb. Os complexos imunológicos formados que consistem em VLPs Env positivos e bNAbs imobilizados são facilmente enriquecidos usando um ímã. Os complexos imunológicos isolados são elucidos na etapa final. Posteriormente, os VLPs podem ser bioquimicamente caracterizados. Aqui, realizamos a análise de manchas ocidentais empregando anticorpos específicos do núcleo de mordaça p55 para demonstrar que os antígenos Env alvo precipitados não estavam apenas abrigando os epítopos sensíveis à neutralização, mas também foram exibidos em VLPs formados por Gag. Além disso, a detecção do núcleo viral de proteínas gag aumenta a sensibilidade do ensaio de captura, uma vez que as proteínas Gag são mais abundantes do que Env em um VLP. No HIV-1, as proteínas Env estão presentes apenas em um número de um ou dois dígitos26, enquanto mais de 3.500 moléculas de Mordaça formam o núcleo de uma partícula27.
Em comparação com outras técnicas para o exame de interações proteína-proteína28,29, o ensaio de captura de VLP fornece um método alternativo para laboratórios de pesquisa não terem acesso a instrumentos analíticos caros. Por exemplo, a análise microscópica eletrônica de transmissão (TEM), a espectroscopia de ressonância de plasmon superficial (SPR) e a análise de rastreamento de nanopartículas (NTA) podem ser intensivas em custos. O ensaio de captura apresentado aqui também permite a subjeção posterior de amostras VLP hivpositivas de antígeno capturado para caracterização adicional de proteína, por exemplo, empregando eletroforese de gel, imunoblotting, microscopia eletrônica e espectrometria de massa (MS), respectivamente. Considerando que a estrutura nativa do antígeno alvo é preservada durante o ensaio de captura de VLP, também pode ser utilizado o desempenho de uma PÁGINA nativa e técnicas subsequentes de imunoblotação.
O ensaio de captura vlp representa um método fácil de usar e sensível para examinar a decoração de VLPs com antígenos-alvo expondo epítopos sensíveis à neutralização e, portanto, sua utilidade como futuros candidatos à vacina.
Protocol
1. Preparação da amostra
- Sementes as linhas de células de suspensão do produtor VLP derivadas de células 293-F expressando genes estruturais do HIV amordaçam sozinho ou em conjunto com env 30 a uma baixa densidade celular de 0,5 x 106 células por mL em 293-F Expression Medium.
- Deixe-os expandir por 3-4 dias a 37 °C e 8% de CO2 em uma rotação de incubadora shaker com uma órbita de 5 cm e 135 rodadas por minuto (rpm).
- Pelota as células produtoras por centrifugação a 100 x g por 5 min. Filtre os filtros de seringa de membrana de supernascer polivinida (PVDF) de 0,45 μm para obter filtros de seringa de membrana livre de células (CFSN).
NOTA: O protocolo pode ser pausado aqui. CFSN pode ser armazenado durante a noite a 4 °C. - Use o CFSN diretamente para o experimento ou VLPs de pelotas de 35 mL de CFSN empregando ultracentrifugação (112.700 x g, 4 °C, 1,5 h).
- Após a ultracentrifugação, descarte o supernascido e suspenda as pelotas VLP em 200 μL de 15% (w/v) solução de trehalose por tubo de centrífuga.
NOTA: A pelota VLP muitas vezes não é visível a olho nu. O protocolo pode ser pausado aqui. Os VLPs podem ser armazenados a -80 °C. - Antes do ensaio de captura de VLP, determine as concentrações de proteína do núcleo viral no VLP contendo amostras usando um ELISA. Esta etapa é importante para padronizar a entrada de ensaio de captura.
2. Ensaio de captura VLP
NOTA: Uma visão geral do fluxo de trabalho é retratada na Figura 2.
- Suspenda as contas magnéticas, tubulando para cima e para baixo ou misturando-se em um rotador a 50 rpm por pelo menos 5 min.
- Enquanto isso, prepare a solução de anticorpos contendo os bNAbs. Use 10 μg de cada bNAb em 200 μL de ligação de anticorpos e tampão de lavagem (ver Tabela de Materiais) por reação.
NOTA: As quantidades de anticorpos podem variar dependendo da afinidade da densidade de decoração de bNAb e antígeno nos VLPs utilizados. - Use 50 μL da solução de contas magnéticas (ver Tabela de Materiais) por reação e transfira as contas para um tubo de reação de 1,5 mL. Coloque os tubos no rack de separação magnética.
NOTA: Alternativamente, um ímã único forte pode ser usado para cada tubo para separar as contas do supernatante. - Espere alguns minutos até que as contas se reúnam na parede do tubo para garantir que todas as contas sejam coletadas. Remova o supernatante.
- Remova o ímã e suspenda as contas em 200 μL da solução bNAb preparada na etapa 2.2. Incubar por 30 min a 3 h misturando-se em uma rotadora a 50 rpm em temperatura ambiente.
- Coloque os tubos de reação no rack de separação magnética novamente, espere e remova o sobrenatário.
- Remova os tubos do ímã e lave as contas reutilizando em 200 μL de ligação de anticorpos e tampão de lavagem.
- Repita o passo 2.4. Remova o máximo de tampão de lavagem possível.
- Adicione as amostras aos bNAbs ligados a contas.
NOTA: A entrada VLP para o ensaio de captura usando partículas derivadas do HIV deve ser de pelo menos 15 ng de proteína do núcleo viral por reação. Os valores de VLP podem variar dependendo da afinidade do bNAb e da densidade de decoração de antígeno nos VLPs utilizados. - Se o volume amostral adicionado na etapa 2.9 estiver abaixo de 1 mL, adicione PBS para ajustar o volume da amostra a 1 mL. Suspenda as contas suavemente por pipetação.
- Incubar as amostras e as contas por 2,5 h em um rotador à temperatura ambiente. Certifique-se de que as contas permaneçam em suspensão e que a solução seja completamente misturada durante a incubação.
- Coloque os tubos no ímã e remova o sobrenatante.
- Lave as contas magnéticas suspendendo-as em 200 μL de tampão de lavagem (ver Tabela de Materiais). Repita o passo de lavagem três vezes.
- Suspenda as contas em 100 μL de tampão de lavagem e transfira a suspensão para um tubo de reação limpo (resistente ao calor).
- Coloque o tubo no rack de separação magnética (ver Tabela de Materiais) e remova completamente o sobrenatante.
- Prepare amostras SDS-PAGE desnaturadas seguindo as etapas 2.16.1-2.16.2 ou amostras não desnaturadas, eluindo os VLPs das contas magnéticas seguindo as etapas 2.16.3-2.16.5.
- Para preparar amostras SDS-PAGE desnaturadas, suspenda as contas em 20-80 μL de tampão Laemmli (0,8 μL de tampão de Laemmli por 1 ng de entrada de ensaio de mordaça p55) e incubar a 95 °C por 5 min.
- Proceda diretamente com o SDS-PAGE ou armazene as amostras a -20 °C.
ATENÇÃO: O tampão de laemmli contém 2 mercaptoetanol e sulfato de dodecyl de sódio. Use luvas de proteção e proteção ocular. Evite contato com pele, olhos e roupas. Não inale vapores. Trabalhe em um espaço bem ventilado, por exemplo, um capô de fumaça.
NOTA: O protocolo pode ser pausado aqui. - Alternativamente, realize uma etapa de eluição não desnaturada para obter VLPs com estrutura proteica nativa preservada.
- Adicione 25 μL de tampão de eluição (frequentemente fornecido com as contas) às contas magnéticas e incubar por 2-5 min à temperatura ambiente.
- Retire as contas e transfira o elunato para um tubo limpo. Use o eluado para ensaios subsequentes ou armazene-o a 4 °C.
NOTA: O protocolo pode ser pausado aqui.
3. Análise das amostras de VLP capturadas
NOTA: Para análise dos VLPs capturados, realize um SDS-PAGE e, posteriormente, análise de manchas ocidentais31,32.
- Coloque os tubos de amostra no rack magnético para separar as contas da solução.
- Carregue 10 μL de cada amostra em poços individuais do gel.
NOTA: Neste protocolo, as proteínas do núcleo de mordaça p55 viral foram detectadas utilizando anticorpos de coelho policlonal direcionados contra a hiv gag e anti-coelho de frango policlonal secundário IgG acoplado a anticorpos de peroxidase de rabanete (HRP). As proteínas do núcleo viral foram visualizadas através da detecção de chemiluminescência.
Figura 2: Ilustração esquemática dos passos-chave do ensaio de captura VLP usando supernantes livres de células. (1) O ensaio de captura de VLP começa com a vinculação dos bNAbs hiv-1 às contas magnéticas acoplados à proteína G. Enquanto isso, a solução VLP com uma concentração p55 definida é preparada. O supernanato de cultura livre de células consiste em uma mistura de VLPs de Gag p55, proteínas celulares hospedeiras e ácidos nucleicos. (2) As contas magnéticas acopléticas aos bNAbs e à solução VLP são transferidas para um tubo de reação de 1,5 mL seguido de incubação em rotação. (3) Os VLPs que exibem antígeno são capturados pelas contas revestidas de bNAbs. A separação desses complexos imunológicos de contaminantes derivados de células hospedeiras é realizada em um campo magnético. (4) O supernatante é removido por pipetação, e as contas são lavadas três vezes para remover VLPs não vinculados. (5) No próximo passo, a redução do tampão de carga de proteínas é adicionada aos complexos imunológicos constituídos por contas magnéticas revestidas com bNAbs e VLPs capturadas. (6) A ebulição da amostra dissocia os bNAbs e o antígeno alvo das contas magnéticas e as contas magnéticas (7) são separadas da solução em um campo magnético. (8) As amostras de proteínas são submetidas a SDS-PAGE. (9) A análise de manchas ocidentais é realizada para detectar proteínas virais p55 Mordaça. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Representative Results
A Figura 3 mostra um resultado representativo de VLPs capturados pela primeira vez a partir de pelotas CFSN e VLP, respectivamente, usando bNAbs e posteriormente submetidos à análise de manchas ocidentais para detectar proteínas do núcleo viral. As contas utilizadas para o ensaio de captura foram revestidas com três bNAbs diferentes direcionados contra epítopos sensíveis à neutralização das glicoproteínas Env e anticorpos isótipos que servem como controles negativos, respectivamente. Usando contas revestidas de anticorpos de isótipo, nenhuma proteína gag foi detectável em amostras contendo Env-negativo (VLPs careca) ou VLPs de exibição env empregando análise de manchas ocidentais. Isso demonstrou que a vinculação inespecífica de VLPs a contas revestidas com anticorpos humanos não mediava a captura de VLP. Os VLPs carecas também não foram vinculados por contas revestidas de bNAbs e, consequentemente, novamente, nenhuma proteína gag foi detectável. Em contraste, todos os três bNAbs capturaram VLPs exibindo proteínas Env (Env VLPs), e, portanto, as proteínas Gag foram posteriormente detectadas. Como visível na Figura 3, o ensaio de captura pode ser utilizado para analisar o antígeno alvo que exibe VLPs em amostras de CFSN e VLP pelleted, respectivamente.
Figura 3: Detecção de epítopos sensíveis à neutralização em glicoproteínas de envelope HIV-1 exibidas em VLPs formados por mordaça p55 usando anticorpos amplamente neutralizantes. Resultados representativos da análise de manchas ocidentais usando anticorpos específicos de proteína do núcleo gag viral depois de realizar um ensaio de captura VLP empregando três anticorpos amplamente neutralizantes (bNAb 1, bNAb 2 e bnAb 3) visando epítopos dentro do envelope HIV-1 glicoproteínas (Env). Anticorpos humanos isótipos agrupados de soros humanos serviram como controles negativos. Os supernacantes da cultura celular foram colhidos a partir de culturas celulares suspensas que produzem VLPs com proteínas Env (Env VLPs) e VLPs carecas (Env-negativo), respectivamente, bem como de células ingênuas que não expressam proteínas virais (simulação). Tanto os supernantes da cultura celular do produtor de VLP careca quanto da cultura celular simulada serviram como controles negativos. Os supernacantes foram libertados de contaminar células usando centrifugação de baixa velocidade e filtragem subsequente para obter supernacantes livres de células (CFSN) para análise. Após a imunoprecipitação, a análise de manchas ocidentais foi realizada utilizando anticorpos de coelho policlonal direcionados contra gag e conjugados anti-coelho secundários IgG-HRP. O peso molecular aparente em kilodaltons (kDa) visível do marcador de peso molecular (MW) é representado à esquerda. As setas indicam a proteína precursora detectada p55 Gag. (A) Para cada amostra, cfsn contendo 100 ng de proteína gag foi aplicado ao ensaio de captura para padronizar a quantidade de entrada de VLPs. CFSN foi diretamente incubado com contas revestidas de anticorpos. (B) As pelotas VLP foram obtidas por ultracentrifugação de CFSN. Pelotas contendo 100 ng de proteína Gag foram aplicadas no ensaio de captura utilizando anticorpos isótipos e bNAb 3. Amostras para bNAb 1 e bNAb 2 continham apenas 25 ng de Gag. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Discussion
Antes do ensaio de captura de VLP, avalie a formação de VLPs e a expressão do antígeno alvo nas linhas celulares do produtor VLP. Os métodos instrumentais são a análise citométrica do fluxo da expressão da superfície celular do antígeno, bem como a elisa específica de proteína do núcleo de antígeno e viral da CFSN e das VLPs pelleted.
Os passos críticos do ensaio de captura de VLP são o revestimento das contas com anticorpos de captura - aqui bNAbs - e a subsequente captura dos VLPs positivos de antígeno pelas contas revestidas de anticorpos. O revestimento bem sucedido das contas com anticorpos depende da escolha da proteína conjugada de imunoglobulina (Ig) . As espécies doadoras, bem como a classe Ig dos anticorpos determinam se as contas conjugadas por proteína G ou proteínas A são preferíveis. Para a maioria das espécies e classes Ig, a proteína G é o ligante de escolha33. Como alternativa às contas conjugadas proteínas A/G, estão disponíveis contas de streptavidin para o revestimento com anticorpos biotinilados. As contas também podem ser covalentemente acoplado com anticorpos.
A captura dos VLPs por contas revestidas de anticorpos depende de mistura completa, tempo suficiente de incubação, abundância de antígeno e afinidade do anticorpo de captura. Em nossa experiência, a mistura completa das contas revestidas de anticorpos com as amostras VLP é melhor alcançada pela utilização de volumes >500 μL em tubos de 1,5 mL em rotação por pelo menos 2 h em temperatura ambiente ou 4 °C. Outro obstáculo potencial é a quantidade muito baixa de VLPs na amostra. Para anticorpos que ligam fortemente o antígeno alvo, as entradas VLP tão baixas quanto 15 ng de proteína Gag geralmente permitem quantidades facilmente detectáveis das proteínas do núcleo viral que utilizam a análise de manchas ocidentais. No entanto, anticorpos de baixa afinidade requerem maiores quantidades de insumos, por exemplo, 100 ng de proteína gag, para obter resultados conclusivos (Figura 3, bNAb 3).
Alguns antígenos superficiais são propensos à degradação da protease. Aqui, recomendamos a adição de inibidores de protease às amostras de VLP e incubação a 4 °C. A adesão não específica de proteínas de células hospedeiras e VLPs aos anticorpos ligados a contas raramente é observada e deve ser excluída utilizando controles negativos apropriados, como demonstramos aqui usando amostras de VLP falsas e carecas e anticorpos de controle de isótipo. As estratégias para reduzir a ligação não específica incluem etapas de lavagem estendidas e a adição de caseína no buffer de lavagem34. Além disso, o ensaio de captura também pode ser melhorado determinando a razão ideal de anticorpos para a quantidade VLP que exibe antígeno.
Na última etapa do ensaio de captura de VLP, descrevemos a eluição dos complexos imunológicos das contas fervendo na redução do tampão de Laemmli. Durante esta etapa, os VLPs são desmontados, e os anticorpos de captura e antígenos de destino são separados das contas. Notavelmente, a espécie doadora do anticorpo primário utilizado na subsequente análise de manchas ocidentais tem que diferir do doador do anticorpo de captura para evitar a detecção não intencional do anticorpo de captura pelos anticorpos conjugados igG HRP secundários.
O ensaio de captura VLP apresentado aqui fornece um método fácil de usar e sensível para detectar epítopos sensíveis à neutralização em antígenos de alvo intactos estruturais exibidos em superfícies VLP. No entanto, o ensaio de captura não permite quantificação direta de epítope. ELISA realizada com bNAbs são fundamentais para este fim e devem ser conduzidas em paralelo, particularmente se as VLPs examinadas forem destinadas a ser utilizadas em estudos pré-clínicos que empregam modelos animais35. Isso é fundamental, pois a quantidade de antígeno pode se correlacionar diretamente com a obtenção de uma resposta de anticorpos neutralizante em animais imunizados, como mostra as vacinas porcine circovirus tipo 2 (PCV2)36.
Uma vacina ideal deve resultar na obtenção de bNAbs visando os epítopos sensíveis à neutralização na superfície de virion. A análise desses epítopos especialmente referentes à sua plena integridade estrutural na superfície da vacina particulada é crucial para identificar potenciais candidatos à vacina. Este não é apenas o caso para VLPs derivados do HIV, mas também para muitas outras vacinas VLP em desenvolvimento37. As vacinas proeminentes baseadas em VLP são, por exemplo, derivadas de vírus parentais não envoltos ou capsídeos, como o papilomavírus humano (HPV). Ao contrário das partículas HIV-1, que são formadas por apenas uma proteína estrutural do núcleo, ou seja, p55 Gag, e envoltas pela membrana originária da célula produtora de VLP, as partículas de HPV consistem em apenas uma ou duas proteínas do núcleo estrutural38,39. Da mesma forma e como apresentado aqui para VLPs envoltos, o ensaio de captura VLP também pode ser aplicável à detecção de epítopos sensíveis à neutralização de VLPs não envoltos.
Como alternativa ao ensaio de captura, as amostras de VLP podem ser diretamente submetidas à PAGE nativa, seguidas pela análise de manchas ocidentais usando bNAbs e anticorpos secundários apropriados acoplados ao HRP40. No entanto, e para a análise de VLPs decoradas pelo HIV Env, este ensaio é menos sensível, pois apenas um baixo número de proteínas de antígeno por VLP pode ser esperado. Em contraste, o ensaio de captura facilita a detecção das proteínas principais abundantes em grandes quantidades por VLP, no caso de VLPs derivados do HIV mais de 3.500 proteínas gag formam um VLP27. Isso permite a detecção indireta muito sensível de epítopos em Env exibidos mesmo em baixas densidades em VLPs.
O número de métodos bem estabelecidos para examinar epítopos sensíveis à neutralização em antígenos superficiais de VLPs é limitado. A rotulagem dos antígenos exibidos nos VLPs é possível com conjugados de anticorpos-fluoroforeiro específicos de epítope e posterior detecção por análise de rastreamento de nanopartículas (NTA), permitindo a detecção e quantificação de VLPs. Este método também foi desenvolvido e otimizado com sucesso para exosóis que apresentam marcadores de superfície celular41. Além disso, a espectroscopia de ressonância de plasmon superficial (SPR) permite a análise de interações entre anticorpos neutralizantes não julgados e epítopos cognatos apresentados em VLPs. Embora não seja adequado para análise de maior rendimento, os VLPs também podem ser rotulados com bNAbs acoplados a partículas de ouro e subsequentes microscópicos de elétrons de transmissão (TEM)-examination42.
Em conclusão, o ensaio de captura de VLP oferece algumas vantagens consideráveis: (i) Avaliação da integridade estrutural de epítopos sensíveis à neutralização na superfície de VLPs, (ii) detecção sensível e indireta de antígenos mesmo quando exibido em baixas densidades em VLPs, e (iii) o método não requer equipamento analítico intensivo em custos.
Disclosures
Os autores declaram que não têm conflito de interesses.
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado por uma subvenção do Ministério Federal alemão da Educação e pesquisa, programa de financiamento Forschung an Fachhochschulen, números de contrato 13FH767IA6 e 13FH242PX6 para JS. As figuras 1 e 2 foram criadas com BioRender.com.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL reaction tubes | Eppendorf | ||
| 10x PBS | gibco | 70011044 | |
| 4%–15% Mini-PROTEAN TGX stain-free protein gels | BioRad | 4568085 | |
| Antibodies (bnAbs) | Polymun Scientic | ||
| Isotype control antibody | invitrogen (Thermo Fisher Scientific) | 02-7102 | |
| Chemidoc XRS+ imaging system | BioRad | 1708265 | |
| Chicken anti-rabbit IgG HRP-coupled | Life technologies | A15987 | 1:5000 in TBS-T + 2 % (w/v) powdered milk |
| Dynabeads Protein G Immunoprecipitation Kit | invitrogen (Thermo Fisher Scientific) | 10007D | includes buffers and washing solutions |
| FreeStyle 293-F cells | invitrogen (Thermo Fisher Scientific) | R790-07 | |
| FreeStyle 293 Expression Medium | invitrogen (Thermo Fisher Scientific) | 12338026 | |
| Gel blotting papers | Whatman | GB005 | |
| Glycine | Carl Roth | 0079 | blotting buffer |
| Magnetic separation rack | New England Biolabs | S1509S | for 12 x 1.5 mL or 6 x 1.5 mL tubes |
| Methanol | Carl Roth | 4627 | blotting buffer |
| Mini-PROTEAN Tetra Cell electrophoresis system | BioRad | ||
| Optima XE-90 ultracentrifuge | Beckman Coulter | ||
| PageRuler prestained protein ladder | Thermo Scientific | 26616 | |
| Polyvinylidene fluoride (PVDF) syringe filters, 0.45 µm | Carl Roth | KC89.1 | |
| Powdered milk | Carl Roth | T145 | blocking buffer |
| PVDF transfermembrane, 0.45 µm | Carl Roth | T830.1 | |
| QuickTiter HIV p24 ELISA | Cell Biolabs | VPK-108-H | |
| Rabbit polyclonal to HIV1 p55 + p24 + p17 | abcam | ab63917 | 1:2000 in TBS-T + 2 % (w/v) powdered milk |
| Rotator | Heidolph | REAX2 | |
| ROTI Load 1 (laemmli buffer) | Carl Roth | K929.1 | 4x concentrated reducing protein gel loading buffer |
| ROTIPHORESE 10x SDS-PAGE | Carl Roth | 3060 | |
| Sodium chloride | Carl Roth | 3957 | TBS-T buffer |
| SuperSignal West Pico PLUS chemiluminescent substrate | Thermo Scientific | 34579 | |
| SW28 rotor | Beckman Coulter | ||
| Thermomixer | Cel Media | basic | |
| Trans-Blot Turbo | BioRad | ||
| Trehalose dihydrate | Carl Roth | 8897.2 | |
| TRIS | Carl Roth | 5429 | blotting buffer |
| TRIS hydrochloride | Carl Roth | 9090 | TBS-T buffer |
| Tween-20 | Carl Roth | 9127 | TBS-T buffer |
| Ultra Clear centrifuge tubes | Beckman Coulter | 344058 |
References
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