Summary
Här presenterar vi ett protokoll för att upptäcka neutralisering epitoper på antigen-displaying virus-liknande partiklar (VLPs). Immunoprecipitation av humant immunbristvirus (HIV)-härledda VLPs utförs med hjälp av kuvert glykoproteiner-specifika monoklonala antikroppar kopplade till protein G-konjugerade magnetiska pärlor. Fångade VLPs utsätts därefter för SDS-PAGE och western blot-analys med viralt kärnprotein Gag-specifika antikroppar.
Abstract
Den virusliknande partikeln (VLP) capture assay är en immunoprecipitationsmetod, allmänt känd som en "pull-down assay" som används för att rena och isolera antigendisplay VLPs. På grund av deras höga affinitet till målantigenet kan dessa antikroppar fånga VLPs dekorerade med cognate antigen förankrade i membran kuvertet av VLPs. Detta protokoll beskriver bindning av antigenspecifika antikroppar till protein A- eller G-konjugerade magnetiska pärlor. I vår studie undersöks humant immunbristvirus (HIV)-härlett VLPs som bildas av det gruppspecifika antigenet (Gag) virala kärnprekursorproteinet p55 Gag och som visar kuvertglykoproteiner (Env) av HIV. VLPs fångas med hjälp av i stort sett neutraliserande antikroppar (bNAbs) riktade mot neutraliseringskänsliga epitoper i Env. Vlp-fångstanalysen som beskrivs här representerar en känslig och lätt att utföra metod för att visa att i) VLPs är dekorerade med respektive målantigen, ii) ytantigenet behöll sin strukturella integritet, vilket framgår av den epitopspecifika bindningen av bNAbs som används i analysen och iii) den strukturella integriteten hos VLPs som avslöjas genom påvisande av Gag proteiner i en efterföljande västerländsk blot-analys. Följaktligen underlättar användningen av bNAbs för immunprecipitation en förutsägelse om VLP-vacciner kommer att kunna framkalla ett neutraliserande B-cellssvar hos vaccinerade människor. Vi förväntar oss att detta protokoll kommer att ge andra forskare ett värdefullt och enkelt experimentellt tillvägagångssätt för att undersöka potentiella VLP-baserade vacciner.
Introduction
Virusliknande partiklar (VLPs) liknar den inhemska viruspartikelstrukturen samtidigt som de saknar det virala genomet, vilket ger en hög säkerhetsprofil1,2. VLP representerar en individuell klass av vacciner som utvecklas alltmer på grund av deras höga immunogenicitet3,4,5,6,7. Detta gäller särskilt membran-hölje VLPs, vilket möjliggör visning av inte bara homologa virala ytan antigener men också heterologous antigener såsom tumör antigener8,9,10. Figur 1 ger en föredömlig översikt över strukturen hos en omsluten antigendekorerad VLP. Under utvecklingsprocessen av VLP-baserade vacciner är analyser oumbärliga för att möjliggöra analys av respektive målantigen som visas på VLP-ytan. Sådana analyser bör vara avgörande för att klargöra sammansättningen av ett partikelvaccin: i) Är VLP dekorerade med respektive ytantigen? ii) Har ytantigenet behållit sin ursprungliga struktur, vilket framgår av epitopigenkänning av neutraliserande antikroppar (bNAbs) och iii) kan VLP:s strukturella integritet bekräftas på grund av påvisande av det virala protein som förmedlar VLP-bildandet?
Bild 1: Schematisk illustration av en membransluten VLP. VLPs bildas av omogna prekursor Gag kärnproteiner och omges av ett lipidmembran som härrör från värdcellen. Antigenerna, t.ex. kuvertglykoproteiner, införlivas i lipidmembranet och visas på VLP:s yta (till höger). Antigenspecifika antikroppar känner igen antigenet. Till vänster visas en skallig VLP utan antigendekoration. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Särskilt VLPs bildas av viral gruppspecifik antigen (Gag) core precursor protein p55 av humant immunbristvirus typ 1 (HIV-1) är föredragna byggnadsställningar för antigen display i vaccin utveckling som många antikroppar, och ELISA kit finns tillgängliga, vilket möjliggör kvantifiering av dessa VLPs11,12. Hiv-1-kuvertet glykoproteiner (Env), nämligen transmembranproteinet gp41 (gp41-TM) och den lösliga ytanheten gp120 (gp120-SU) som bildar heterodimerer, införlivas i membranhöljet av partiklar och är viktiga målantigener för utveckling av vacciner mot HIV-infektion13,14,15 . Visning av neutraliseringskänsliga epitoper i dessa målantigener är en förutsättning för att framkalla ett i stort sett neutraliserande antikroppssvar i vacciner. Förutom ett T-cellssvar riktat mot Gag-proteinerna anses detta vara en viktig korrelat av skydd mot HIV-infektion16. Följaktligen, och vid utformning och produktion av VLP dekorerade med målantigenkandidater, utgör den efterföljande analysen av kvaliteten på de visade antigenerna ett kritiskt steg i processen för vaccinutveckling.
Immunoprecipitation (IP) är en allmänt använd teknik för detektion av protein-proteininteraktioner och rening av proteinkomplex i liten skala17. Barret et al. först rapporterades om utvecklingen av immateriella rättigheter 1960, men denna metod har ständigt förbättrats ytterligare. IP möjliggör avskiljning och isolering av ett målantigen (byte) från en lösning genom att använda en antigenspecifik antikropp (bete) immobiliserad genom koppling till pärlor18,19. I detta protokoll visar vi en variation av den klassiska IP-applikationen med membran-enveloped p55 Gag-formade VLPs som byte och bNAbs som känner igen neutraliserande känsliga epitoper i kuvertproteinerna som visas på ytan av VLPs som beteproteiner. Den framgångsrika tillämpningen av denna VLP-fångstanalys underlättar förutsägelsen om huruvida de testade antigenpositiva VLPs kommer att kunna framkalla en neutraliserande B-cellsrespons hos vaccinerade personer. Sådana immunogenica egenskaper hos VLP-baserade vaccinkandidater demonstreras ofta i smådjursmodeller20,21,22.
För att bedöma kvaliteten på den nyutvecklade VLP-vaccinkandidaten har VLP-insamlingsanalyser framgångsrikt använts5,23,24. Antalet publicerade metoder är dock begränsat. VLP fångst analys som presenteras här börjar med immobilisering av Env-specifika bNAbs på protein G-konjugerade pärlor, som binder till Fc regionen av däggdjur-härledda antikroppar. Typiska matriser för immobilisering av den antikropp som valts är agaros eller magnetiska pärlor. Magnetiska pärlor är dock gynnsamma för applikationer med hög genomströmning25. I nästa steg fångas VLP:er som visar målantigenet av bNAb-belagda pärlor. De bildade immunkomplexen bestående av Env-positiva VLPs och immobiliserade bNAbs berikas lätt med hjälp av en magnet. De isolerade immunkomplexen eluteras i det sista steget. Därefter kan VLPs biokemiskt karakteriseras. Här utförde vi western blot-analys med p55 Gag viral kärna protein-specifika antikroppar för att visa att det utfällda målet Env antigener inte bara hyser neutraliserande känsliga epitopes men visades också på Gag-bildade VLPs. Dessutom ökar upptäckten av viruskärnan Gag-proteiner känsligheten hos fångstanalysen eftersom Gag-proteiner är mer rikliga än Env i en VLP. I HIV-1 finns Env-proteiner endast på ett ensiffrigt eller tvåsiffrigt nummer26, medan mer än 3 500 gagmolekyler utgör kärnan i en partikel27.
Jämfört med andra tekniker för undersökning av interaktioner mellan protein och protein28,29 ger VLP-insamlingsanalysen en alternativ metod för forskningslaboratorier som inte har tillgång till dyra analysinstrument. Till exempel kan transmissionselektronmikroskopisk analys (TEM), ytplasmonresonansspektroskopi (SPR) och nanopartikelspårningsanalys (NTA) vara kostnadsintensiva. Den avskiljningsanalys som presenteras här tillåter också senare subjektering av fångade antigenpositiva VLP-prover till ytterligare proteinkarakterisering, t.ex. med hjälp av gelelektrofores, immunoblotting, elektronmikroskopi respektive masspektrometri (MS). Med tanke på att målantigenets ursprungliga struktur bevaras under VLP-fångstanalysen kan även prestandan hos en inbyggd SIDA och efterföljande immunblåsningstekniker användas.
VLP-fångstanalysen representerar en lättanvänd och känslig metod för att undersöka dekorationen av VLPs med målantigener som exponerar neutraliserande känsliga epitoper, och därmed deras användbarhet som framtida vaccinkandidater.
Protocol
1. Provberedning
- Frö VLP-producentens suspensionscelllinjer som härrör från 293-F-celler som uttrycker HIV-strukturella gener munkavle ensam eller i samförstånd med env 30 vid en låg celltäthet på 0,5 x 106 celler per ml i 293-F Expression Medium.
- Låt dem expandera i 3-4 dagar vid 37 °C och 8% CO2 i en shakerinkubatorrotation med en omloppsbana på 5 cm och 135 rundor per minut (rpm).
- Pellet producentcellerna genom centrifugering vid 100 x g i 5 min. Filtrera det klarnade supernatanten för att avlägsna restceller och cellrester med hjälp av 0,45 μm polyvinylidenfluoridsprutfilter (PVDF) för att erhålla cellfria cellodlingsfant (CFSN).
PROTOKOLLET kan pausas här. CFSN kan förvaras över natten vid 4 °C. - Använd antingen CFSN direkt för experimentet eller pellet VLPs från 35 ml CFSN med ultracentrifugation (112 700 x g, 4 °C, 1,5 h).
- Vid ultracentrifugation kassera supernatanten och suspendera VLP-pelletsen i 200 μL av 15% (w/v) trehaloslösning per centrifugrör.
OBS: VLP-pelleten är ofta inte synlig för blotta ögat. Protokollet kan pausas här. VLPs kan lagras vid -80 °C. - Innan VLP-insamlingsanalysen, bestäm viruskärnproteinkoncentrationerna i VLP som innehåller prover med hjälp av ett ELISA. Det här steget är viktigt för att standardisera indata för insamlingsanalys.
2. VLP-fångstanalys
En översikt över arbetsflödet visas i bild 2.
- Häng upp de magnetiska pärlorna genom att antingen pipettera upp och ner eller blanda på en rotator vid 50 varv/min i minst 5 minuter.
- Förbered under tiden antikroppslösningen som innehåller bNAbs. Använd 10 μg av varje bNAb i 200 μL antikroppsbindnings- och tvättbuffert (se Materialtabell) per reaktion.
OBS: Antikroppsmängderna kan variera beroende på bNAb:s affinitet och antigendekorationstätheten på de VLPs som används. - Använd 50 μL av den magnetiska pärlan (se Materialtabell) per reaktion och överför pärlorna till ett 1,5 ml reaktionsrör. Placera rören på det magnetiska separationsstället.
OBS: Alternativt kan en stark enmagnet användas för varje rör för att separera pärlorna från supernatanten. - Vänta några minuter tills pärlorna samlas vid rörväggen för att säkerställa att alla pärlor samlas in. Ta bort supernatanten.
- Ta bort magneten och suspendera pärlorna i 200 μL av bNAb-lösningen som bereds i steg 2.2. Inkubera i 30 min till 3 h blandning på en rotator vid 50 varv/min vid rumstemperatur.
- Placera reaktionsrören i det magnetiska separationsstället igen, vänta och ta bort supernatanten.
- Ta bort rören från magneten och tvätta pärlorna genom att återanvända i 200 μL antikroppsbindning och tvättbuffert.
- Upprepa steg 2.4. Ta bort så mycket tvättbuffert som möjligt.
- Lägg till exemplen i den pärlbundna bNAbs.
OBS: VLP-indata för insamlingsanalysen med hiv-härledda partiklar bör vara minst 15 ton viruskärnprotein per reaktion. VLP-mängder kan variera beroende på bNAb:s affinitet och antigendekorationstätheten på de VLPs som används. - Om provvolymen som läggs till i steg 2,9 är lägre än 1 ml lägger du till PBS för att justera provvolymen till 1 ml. Häng upp pärlorna försiktigt genom pipettering.
- Inkubera proverna och pärlorna i 2,5 timmar på en rotator vid rumstemperatur. Se till att pärlorna förblir i suspension och lösningen blandas noggrant under inkubation.
- Placera rören på magneten och ta bort supernatanten.
- Tvätta de magnetiska pärlorna genom att suspendera dem i 200 μL tvättbuffert (se Materialtabell). Upprepa tvättsteget tre gånger.
- Suspendera pärlorna i 100 μL tvättbuffert och överför suspensionen till ett rent (värmebeständigt) reaktionsrör.
- Placera röret på det magnetiska separationsstället (se Materialtabell) och ta bort supernatanten helt.
- Förbered denaturerade SDS-PAGE-prover enligt steg 2.16.1-2.16.2 eller icke-denaturerade prover genom att eluta VLP från de magnetiska pärlorna enligt steg 2.16.3-2.16.5.
- För att förbereda denaturerade SDS-PAGE-prover, suspendera pärlorna i 20-80 μL Laemmli-buffert (0,8 μL Laemmli-buffert per 1 ng p55 Gag assay input) och inkubera vid 95 °C i 5 min.
- Fortsätt direkt med SDS-PAGE eller lagra proverna vid -20 °C.
VARNING: Laemmli buffert innehåller 2-mercaptoethanol och natrium dodecylsulfat. Använd skyddshandskar och ögonskydd. Undvik kontakt med hud, ögon och kläder. Andas inte in ångor. Arbeta i ett välventilerat utrymme, t.ex. en rökhuv.
PROTOKOLLET kan pausas här. - Alternativt, utföra en icke-denaturing elution steg för att få VLPs med bevarad inhemska protein struktur.
- Tillsätt 25 μL elutionbuffert (ofta försedd med pärlorna) till de magnetiska pärlorna och inkubera i 2-5 min vid rumstemperatur.
- Ta bort pärlorna och överför eluatet till ett rent rör. Använd eluatet för efterföljande analyser eller förvara det vid 4 °C.
PROTOKOLLET kan pausas här.
3. Analys av infångade VLP-prover
OBS: För analys av de fångade VLPs, utför en SDS-PAGE och därefter Western blot-analysis31,32.
- Placera provrören på magnetstället för att separera pärlorna från lösningen.
- Lasta 10 μL av varje prov i enskilda brunnar i gelén.
OBS: I detta protokoll upptäcktes virala p55 Gag kärnproteiner genom att använda polyklonala kanin antikroppar riktade mot HIV Gag och sekundära polyklonal kyckling anti-kanin IgG kopplade till pepparrot peroxidas (HRP) antikroppar. Viral kärnproteiner visualiserades med hjälp av chemiluminescens upptäckt.
Bild 2: Schematisk illustration av viktiga steg i VLP-fångstanalysen med hjälp av cellfria supernatanter. (1) VLP-fångstanalysen börjar med bindning av HIV-1 bNAbs till proteinet G-kopplade magnetiska pärlor. Under tiden bereds VLP-lösningen med en definierad p55-koncentration. Den cellfria kulturgengenten består av en blandning av p55 Gag VLPs, värdcellproteiner och nukleinsyror. (2) De magnetiska pärlor som är kopplade till bNAbs och VLP-lösningen överförs till ett 1,5 ml reaktionsrör följt av inkubation under rotation. (3) Antigendisplayer av VLP fångas upp av de bNAbs-belagda pärlorna. Separation av dessa immunkomplex från värdcell-härledda föroreningar utförs i ett magnetfält. (4) Supernatanten avlägsnas genom pipettering, och pärlor tvättas tre gånger för att avlägsna obundna VLPs. (5) I nästa steg tillsätts reducerande proteinbelastningsbuffert till immunkomplexen bestående av magnetiska pärlor belagda med bNAbs och fångade VLPs. (6) Kokning av provet separerar bNAbs och målantigen från de magnetiska pärlorna och lyser VLPs. (7) Magnetiska pärlor separeras från lösningen. (8) Proteinproverna skall genomgå SDS-PAGE. (9) Western blot-analys utförs för att påvisa virala p55 Gag-kärnproteiner. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Representative Results
Figur 3 visar ett representativt resultat av VLP som först fångades från CFSN respektive VLP pellets, med hjälp av bNAbs och därefter utsätts för västerländsk blot-analys för att upptäcka virala kärnproteiner. Pärlor som användes för fångstanalysen var belagda med tre olika bNAbs riktade mot neutraliseringskänsliga epitoper av Env glykoproteiner respektive isotypantikroppar som fungerar som negativa kontroller. Med hjälp av isotyp antikroppar-belagda pärlor, inga Gag proteiner kunde påvisas i prover som innehåller Env-negativa (skalliga VLPs) eller Env-displaying VLPs använder västra blot-analys. Detta visade att den ospecificerade bindningen av VLPs till pärlor belagda med mänskliga antikroppar inte medlade VLP fångst. Skalliga VLPs var inte heller bundna av bNAbs-belagda pärlor, och följaktligen, igen, inga Gag proteiner var detekterbara. Däremot fångade alla tre bNAbs VLPs som visar Env-proteiner (Env VLPs), och därför upptäcktes gagproteiner därefter lätt. Som framgår av figur 3 kan insamlingsanalysen användas för att analysera målantigen som visar VLPs i CFSN respektive pelleterade VLP-prover.
Figur 3: Påvisande av neutraliseringskänsliga epitoper i hiv-1-kuvertglykoproteiner som visas på p55 Gag-formade VLPs med hjälp av i stort sett neutraliserande antikroppar. Representativa resultat av western blot-analys med virala Gag core proteinspecifika antikroppar efter att ha utfört en VLP-fångstanalys med tre olika i stort neutraliserande antikroppar (bNAb 1, bNAb 2 och bnAb 3) som riktar sig mot epitoper inom HIV-1-kuvertet glykoproteiner (Env). Isotyp mänskliga antikroppar poolade från mänskliga serum tjänade som negativa kontroller. Cellodling supernatanter skördades från suspension cell kulturer producerar VLPs med Env proteiner (Env VLPs) och skalliga VLPs (Env-negativa), samt från naiva celler som inte uttrycker några virala proteiner (mock). Både supernatanterna från den skalliga VLP-producentcellkulturen och från mockcellkulturen fungerade som negativa kontroller. Supernatants befriades från förorenande celler med låg hastighet centrifugering och efterföljande filtrering för att erhålla cellfria supernatanter (CFSN) för analys. Vid immunoprecipitation utfördes western blot-analys med polyklonala kanin antikroppar riktade mot Gag och sekundära anti-kanin IgG-HRP konjugat. Den uppenbara molekylvikten i kilodalton (kDa) som synlig från molekylviktsmarkören (MW) visas till vänster. Pilarna indikerar det detekterade prekursorproteinet p55 Gag. (A) Cfsn innehållande 100 ng gagprotein tillämpades för insamlingsanalysen för att standardisera indatamängden vlps. B) VLP-pellets erhölls genom ultracentrifugation av CFSN. Pellets som innehåller 100 ng Gag-protein applicerades på insamlingsanalysen med isotypantikroppar och bNAb 3. Proverna för bNAb 1 och bNAb 2 innehöll endast 25 ng Gag. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Discussion
Före VLP-insamlingsanalysen, utvärdera bildandet av VLP och uttrycket av målantigenet i VLP-producentcelllinjerna. Instrumentella metoder är flödescytometrisk analys av antigenets cellytans uttryck samt antigen- och viral kärnproteinspecifik ELISA av CFSN och pelleterade VLPs.
Kritiska steg i VLP-fångstanalysen är beläggningen av pärlor med fångstantikroppar - här bNAbs - och den efterföljande fångsten av antigenpositiva VLPs av de antikroppsbelagda pärlorna. Framgångsrik beläggning av pärlor med antikroppar beror på valet av det konjugerade immunglobulinbindningsproteinet (Ig)-bindande proteinet. Donatorarten samt Ig-klassen av antikropparna avgör om protein G- eller protein A-konjugerade pärlor är att föredra. För de flesta arter och Ig klasser, protein G är ligand av val33. Som ett alternativ till protein A/G-konjugerade pärlor finns streptavidinpärlor för beläggningen med biotinylerade antikroppar tillgängliga. Pärlor kan också kovalent kopplas med antikroppar.
Avskiljningen av VLPs genom antikroppsbelagda pärlor beror på noggrann blandning, tillräcklig inkubationstid, antigen överflöd och affinitet av capture antikroppen. Enligt vår erfarenhet uppnås grundlig blandning av de antikroppsbelagda pärlor med VLP-proverna bäst genom användning av volymer >500 μL i 1,5 ml rör under rotation i minst 2 timmar vid rumstemperatur eller 4 °C. Ett annat potentiellt hinder är den för låga mängden VLPs i exemplet. För antikroppar som starkt binder målantigenet tillåter VLP-ingångar så låga som 15 ng Gag-protein vanligtvis lätt detekterbara mängder av de virala kärnproteiner som använder västerländsk blot-analys. Antikroppar med låg affinitet kräver dock högre inmatningsmängder, t.ex. 100 ng gagprotein, för att uppnå avgörande resultat (figur 3, bNAb 3).
Vissa ytantigener är benägna att proteasnedbrytning. Här rekommenderar vi tillsats av proteashämmare till VLP-proverna och inkubation vid 4 °C. Icke-specifik vidhäftning av värdcellsproteiner och VLPs till de pärlbundna antikropparna observeras sällan och bör uteslutas genom att använda lämpliga negativa kontroller, som vi här visade här med hjälp av mock och skalliga VLP-prover och isotyp kontroll antikroppar. Strategier för att minska icke-specifik bindning inkluderar förlängda tvättsteg och tillsats av kasein i tvättbufferten34. Dessutom kan infångningsanalysen också förbättras genom att bestämma det optimala förhållandet mellan antikroppar och antigendisplay VLP-mängd.
I det sista steget i VLP-fångstanalysen beskriver vi elutionen av immunkomplexen från pärlorna genom att koka för att minska Laemmli-bufferten. Under detta steg demonteras VLPs, och fångstantikroppar och målantigener separeras från pärlorna. I synnerhet måste donatorarten av den primära antikroppen som används i den efterföljande västerländska blot-analysen skilja sig från givaren av infångningsantikroppen för att undvika oavsiktlig detektion av infångningsantikroppen av de sekundära antidonatoriska IgG HRP- konjugerade antikropparna.
VLP-fångstanalysen som presenteras här ger en lättanvänd och känslig metod för att upptäcka neutraliseringskänsliga epitoper i strukturella intakta målantigener som visas på VLP-ytor. Insamlingsanalysen möjliggör dock inte direkt epitopkvantifiering. ELISA som utförs med bNAbs är avgörande för detta ändamål och bör utföras parallellt, särskilt om undersökta VLPs är avsedda att användas i prekliniska studier med användning av djurmodeller35. Detta är avgörande, eftersom mängden antigen direkt kan korrelera med elicitation av ett neutraliserande antikroppssvar hos immuniserade djur, vilket visas för porcin circovirus typ 2 (PCV2) vacciner36.
Ett idealiskt vaccin bör resultera i att bNAbs framkallas med inriktning på de neutraliserande känsliga epitoperna på virionytan. Analysen av dessa epitoper som särskilt hänvisar till deras fullständiga strukturella integritet på partikelvaccinytan är avgörande för att identifiera potentiella vaccinkandidater. Detta är inte bara fallet för hiv-härledda VLPs utan också för många andra VLP-vacciner under utveckling37. Framstående VLP-baserade vacciner härrör till exempel från icke-hölje eller kapsejsade föräldravirus som humant papillomvirus (HPV). Till skillnad från HIV-1-partiklar, som bildas av endast ett strukturellt kärnprotein, nämligen p55 Gag, och omsluts av membranet som härstammar från VLP-producentcellen, består HPV-partiklar av endast ett eller två strukturella kärnproteiner38,39. På samma sätt och som presenteras här för hölje vlps, VLP fångst analysen kan också tillämpas på påvisande av neutraliseringskänsliga epitoper av icke-hölje vlps.
Som ett alternativ till fångstanalysen kan VLP-prover direkt utsättas för inbyggt PAGE följt av western blot-analys med bNAbs och lämpliga sekundära antikroppar kopplade till HRP40. Men för analys av HIV Env-dekorerade VLPs är denna analys mindre känslig eftersom endast ett lågt antal antigenproteiner per VLP kan förväntas. Däremot underlättar fångstanalysen upptäckten av kärnproteinerna som är rikliga i stora mängder per VLP, när det gäller HIV-härledda VLPs mer än 3 500 Gag-proteiner bildar en VLP27. Detta möjliggör mycket känslig indirekt detektion av epitoper i Env som visas även vid låg densitet på VLPs.
Antalet väletablerade metoder för att undersöka neutraliseringskänsliga epitoper i ytantigener av VLPs är begränsat. Märkning av de antigener som visas på VLP: erna är möjlig med epitopspecifika antikropps-fluoroforkonjugat och efterföljande detektion genom nanopartikelspårningsanalys (NTA), vilket möjliggör detektion och kvantifiering av VLPs. Denna metod har också framgångsrikt utvecklats och optimerats för exosomer som presenterar cellytans markörer41. Ytplasmon resonans (SPR) spektroskopi möjliggör också analys av interaktioner mellan okonjugerade neutraliserande antikroppar och cognate epitopes presenteras på VLPs. Även om vlps inte är lämpliga för högre genomströmningsanalys kan de också märkas med bNAbs kopplade till guldpartiklar och efterföljande transmissionselektronmikroskopiska (TEM)-undersökning42.
Sammanfattningsvis ger vlp-fångstanalysen vissa betydande fördelar: i) Bedömning av den strukturella integriteten hos neutraliseringskänsliga epitoper på vlp:s yta, ii) känslig och indirekt detektion av antigener även när den visas vid låg densitet på VLP, och iii) metoden kräver inte kostnadsintensiv analysutrustning.
Disclosures
Författarna förklarar att de inte har någon intressekonflikt.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av ett bidrag från det tyska federala ministeriet för utbildning och forskning, finansieringsprogram Forschung an Fachhochschulen, kontraktsnummer 13FH767IA6 och 13FH242PX6 till JS. Figurerna 1 och 2 skapades med BioRender.com.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL reaction tubes | Eppendorf | ||
| 10x PBS | gibco | 70011044 | |
| 4%–15% Mini-PROTEAN TGX stain-free protein gels | BioRad | 4568085 | |
| Antibodies (bnAbs) | Polymun Scientic | ||
| Isotype control antibody | invitrogen (Thermo Fisher Scientific) | 02-7102 | |
| Chemidoc XRS+ imaging system | BioRad | 1708265 | |
| Chicken anti-rabbit IgG HRP-coupled | Life technologies | A15987 | 1:5000 in TBS-T + 2 % (w/v) powdered milk |
| Dynabeads Protein G Immunoprecipitation Kit | invitrogen (Thermo Fisher Scientific) | 10007D | includes buffers and washing solutions |
| FreeStyle 293-F cells | invitrogen (Thermo Fisher Scientific) | R790-07 | |
| FreeStyle 293 Expression Medium | invitrogen (Thermo Fisher Scientific) | 12338026 | |
| Gel blotting papers | Whatman | GB005 | |
| Glycine | Carl Roth | 0079 | blotting buffer |
| Magnetic separation rack | New England Biolabs | S1509S | for 12 x 1.5 mL or 6 x 1.5 mL tubes |
| Methanol | Carl Roth | 4627 | blotting buffer |
| Mini-PROTEAN Tetra Cell electrophoresis system | BioRad | ||
| Optima XE-90 ultracentrifuge | Beckman Coulter | ||
| PageRuler prestained protein ladder | Thermo Scientific | 26616 | |
| Polyvinylidene fluoride (PVDF) syringe filters, 0.45 µm | Carl Roth | KC89.1 | |
| Powdered milk | Carl Roth | T145 | blocking buffer |
| PVDF transfermembrane, 0.45 µm | Carl Roth | T830.1 | |
| QuickTiter HIV p24 ELISA | Cell Biolabs | VPK-108-H | |
| Rabbit polyclonal to HIV1 p55 + p24 + p17 | abcam | ab63917 | 1:2000 in TBS-T + 2 % (w/v) powdered milk |
| Rotator | Heidolph | REAX2 | |
| ROTI Load 1 (laemmli buffer) | Carl Roth | K929.1 | 4x concentrated reducing protein gel loading buffer |
| ROTIPHORESE 10x SDS-PAGE | Carl Roth | 3060 | |
| Sodium chloride | Carl Roth | 3957 | TBS-T buffer |
| SuperSignal West Pico PLUS chemiluminescent substrate | Thermo Scientific | 34579 | |
| SW28 rotor | Beckman Coulter | ||
| Thermomixer | Cel Media | basic | |
| Trans-Blot Turbo | BioRad | ||
| Trehalose dihydrate | Carl Roth | 8897.2 | |
| TRIS | Carl Roth | 5429 | blotting buffer |
| TRIS hydrochloride | Carl Roth | 9090 | TBS-T buffer |
| Tween-20 | Carl Roth | 9127 | TBS-T buffer |
| Ultra Clear centrifuge tubes | Beckman Coulter | 344058 |
References
- Roldão, A., Mellado, M. C. M., Castilho, L. R., Carrondo, M. J. T., Alves, P. M.
- Noad, R., Roy, P.
- Qian, C., et al. Recent progress on the versatility of virus-like particles. Vaccines. 8 (1), 139 (2020).
- Zabel, F., Kündig, T. M., Bachmann, M. F. Virus-induced humoral immunity: On how B cell responses are initiated. Current Opinion in Virology. 3 (3), 357-362 (2013).
- Garg, H., Mehmetoglu-Gurbuz, T., Joshi, A. Virus Like Particles (VLP) as multivalent vaccine candidate against Chikungunya, Japanese Encephalitis, Yellow Fever and Zika Virus. Scientific Reports. 10 (1), 4017 (2020).
- Hodgins, B., Pillet, S., Landry, N., Ward, B. J. A plant-derived VLP influenza vaccine elicits a balanced immune response even in very old mice with co-morbidities. PLoS ONE. 14 (1), 0210009 (2019).
- Lai, C. C., et al. Process development for pandemic influenza VLP vaccine production using a baculovirus expression system. Journal of Biological Engineering. 13, 78 (2019).
- Caldeira, J. C., Perrine, M., Pericle, F., Cavallo, F. Virus-like particles as an immunogenic platform for cancer vaccines. Viruses. 12 (5), 488 (2020).
- Nika, L., et al. An HER2-displaying virus-like particle vaccine protects from challenge with mammary carcinoma cells in a mouse model. Vaccines. 7 (2), 41 (2019).
- Mohsen, M. O., Zha, L., Cabral-Miranda, G., Bachmann, M. F. Major findings and recent advances in virus-like particle (VLP)-based vaccines. Seminars in Immunology. 34, 123-132 (2017).
- Fontana, D., Garay, E., Cevera, L., Kratje, R., Prieto, C., Gòdia, F. Chimeric VLPs based on hiv-1 gag and a fusion rabies glycoprotein induce specific antibodies against rabies and foot-and-mouth disease virus. Vaccines. 9 (3), 251 (2021).
- Cervera, L., et al. Production of HIV-1-based virus-like particles for vaccination: achievements and limits. Applied Microbiology and Biotechnology. 103 (18), 7367-7384 (2019).
- Gonelli, C. A., King, H. A. D., Mackenzie, C., Sonza, S., Center, R. J., Purcell, D. F. J. Immunogenicity of HIV-1-based virus-like particles with increased incorporation and stability of membrane-bound env. Vaccines. 9 (3), 1-36 (2021).
- Trkola, A. HIV not as simple as one, two, three. Nature. 568, 321-322 (2019).
- Berman, P. W., et al. Protection of chimpanzees from infection by HIV-1 after vaccination with recombinant glycoprotein gp120 but not gp160. Nature. 345 (6276), 622-625 (1990).
- Barouch, D. H. Challenges in the development of an HIV-1 vaccine. Nature. 455 (7213), 613-619 (2008).
- DeCaprio, J., Kohl, T. O. Immunoprecipitation. Cold Spring Harbor Protocols. 2020 (11), 449-461 (2020).
- Barret, B., Wood, P. A., Volwiler, W. Quantitation of gamma globulins in human serum by immunoprecipitation. Journal of Laboratory and Clinical Medicine. 55, 605-615 (1960).
- Kaboord, B., Perr, M. Isolation of proteins and protein complexes by immunoprecipitation. Methods in Molecular Biology. 424, Clifton, N.J. 349-364 (2008).
- Lee, S. H., Chu, K. B., Kang, H. J., Quan, F. S. Virus-like particles containing multiple antigenic proteins of Toxoplasma gondii induce memory T cell and B cell responses. PLoS ONE. 14 (8), 0220865 (2019).
- Lee, Y. T., et al. Intranasal vaccination with M2e5x virus-like particles induces humoral and cellular immune responses conferring cross-protection against heterosubtypic influenza viruses. PLoS ONE. 13 (1), 0190868 (2018).
- Wang, J., et al. Large-scale manufacture of VP2 VLP vaccine against porcine parvovirus in Escherichia coli with high-density fermentation. Applied Microbiology and Biotechnology. 104 (9), 3847-3857 (2020).
- Swenson, D. L., et al. Generation of Marburg virus-like particles by co-expression of glycoprotein and matrix protein. FEMS Immunology and Medical Microbiology. 40 (1), 27-31 (2004).
- Latham, T., Galarza, J. M. Formation of wild-type and chimeric influenza virus-like particles following simultaneous expression of only four structural proteins. Journal of Virology. 75 (13), 6154-6165 (2001).
- Doyle, J., Ray, M., Ouyang, A., Benton, B., Bell, P. A. Abstract 4877: High throughput proteomic applications using protein A/G magnetic beads. Association for Cancer Research (AACR) 102nd Annual Meeting. 20, 4877 (2011).
- Zhu, P., et al. Electron tomography analysis of envelope glycoprotein trimers on HIV and simian immunodeficiency virus virions. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (26), 15812-15817 (2003).
- Lavado-García, J., Jorge, I., Boix-Besora, A., Vázquez, J., Gòdia, F., Cervera, L. Characterization of HIV-1 virus-like particles and determination of Gag stoichiometry for different production platforms. Biotechnology and Bioengineering. 118 (7), 2660-2675 (2021).
- Miura, K. An overview of current methods to confirm protein-protein interactions. Protein & Peptide Letters. 25 (8), 728-733 (2018).
- Rao, V. S., Srinivas, K., Sujini, G. N., Kumar, G. N. Advances in molecular techniques to study diversity. Plant Biotechnology, Volume 1: Principles, Techniques, and Applications. , 341-365 (2017).
- Rosengarten, J. F., Schatz, S., Wolf, T., Barbe, S., Stitz, J. Components of a HIV-1 vaccine mediate virus-like particle (VLP)-formation and display of envelope proteins exposing broadly neutralizing epitopes. Virology. , 41-48 (2022).
- JoVE, JoVE. Grundlegende Methoden in der Zell- und Molekularbiologie. Separating Protein with SDS-PAGE. JoVE Science Education Database. , Cambridge, MA. (2021).
- Eslami, A., Lujan, J. Western blotting: sample preparation to detection. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (44), e2359 (2010).
- Sheng, S., Kong, F. Separation of antigens and antibodies by immunoaffinity chromatography. Pharmaceutical Biology. 50 (8), 1038-1044 (2012).
- Guzzo, C., et al. Virion incorporation of integrin 47 facilitates HIV-1 infection and intestinal homing. Science Immunology. 2 (11), (2017).
- Wei, M., et al. Bacteria expressed hepatitis E virus capsid proteins maintain virion-like epitopes. Vaccine. 32 (24), 2859-2865 (2014).
- Jin, J., Park, C., Cho, S. H., Chung, J. The level of decoy epitope in PCV2 vaccine affects the neutralizing activity of sera in the immunized animals. Biochemical and Biophysical Research Communications. 496 (3), 846-851 (2018).
- Zhang, X., et al. Lessons learned from successful human vaccines: Delineating key epitopes by dissecting the capsid proteins. Human Vaccines and Immunotherapeutics. 11 (5), 1277-1292 (2015).
- DiGiuseppe, S., Bienkowska-Haba, M., Guion, L. G. M., Keiffer, T. R., Sapp, M. Human papillomavirus major capsid protein L1 remains associated with the incoming viral genome throughout the entry process. Journal of Virology. 91 (16), 00537 (2017).
- Wang, J. W., Roden, R. B. S.
- Binley, J. M., et al. Profiling the specificity of neutralizing antibodies in a large panel of plasmas from patients chronically infected with human immunodeficiency virus type 1 subtypes B and C. Journal of Virology. 82 (23), 11651-11668 (2008).
- Thane, K. E., Davis, A. M., Hoffman, A. M. Improved methods for fluorescent labeling and detection of single extracellular vesicles using nanoparticle tracking analysis. Scientific Reports. 9 (1), 12295 (2019).
- Mulder, A. M., et al. Toolbox for non-intrusive structural and functional analysis of recombinant VLP based vaccines: A case study with hepatitis B vaccine. PLoS ONE. 7 (4), 0033235 (2012).
