Summary
Burada, antijen gösteren virüs benzeri parçacıklar (VLP'ler) üzerindeki nötralizasyon epitoplarını tespit etmek için bir protokol sunuyoruz. İnsan immün yetmezlik virüsünün (HIV) türevli VLP'lerin immün özürlülüğü, protein G-konjuge manyetik boncuklarla birleştirilmiş zarf glikoproteinlere özgü monoklonal antikorlar kullanılarak gerçekleştirilir. Yakalanan VLP'ler daha sonra viral çekirdek protein Gag spesifik antikorlar kullanan SDS-PAGE ve Batı blot analizine tabi tutulur.
Abstract
Virüs benzeri parçacık (VLP) yakalama testi, antijen gösteren VLP'leri arındırmak ve izole etmek için kullanılan ve yaygın olarak 'aşağı çekme testi' olarak bilinen bir immün önkalım yöntemidir. Yüzey antijenine özgü antikorlar bir araya getirilir ve böylece boncuklar gibi katı ve çözünmez bir matris üzerinde hareketsiz hale getirilir. Hedef antijene yüksek yakınlıkları nedeniyle, bu antikorlar VLP'lerin membran zarfında tutturulmuş konyak antijeni ile süslenmiş VLP'leri yakalayabilir. Bu protokol, antijene özgü antikorların protein A veya G-konjuge manyetik boncuklara bağlanmasını açıklar. Çalışmamızda, gruba özgü antijen (Gag) viral çekirdek öncül protein p55 Gag tarafından oluşturulan ve HIV'in zarf glikoproteinlerinin (Env) görüntülenmesi ile oluşturulan insan immün yetmezlik virüsü (HIV) türevi VLP'ler incelenmiştir. VLP'ler, Env'deki nötralizasyona duyarlı epitoplara karşı yönlendirilen geniş nötralize edici antikorlar (bNAbs) kullanılarak yakalanır. Burada özetlenen VLP yakalama tahlili, (i) VLP'lerin ilgili hedef antijenle süslendiğini, (ii) yüzey antijeninin testte kullanılan bNAb'lerin epitopa özgü bağlanmasında ve (iii) gag proteinlerinin sonraki bir Batı blot analizinde tespit edilmesiyle ortaya çıkan VLP'lerin yapısal bütünlüğünün gösterildiği gibi yapısal bütünlüğünü koruduğunu gösteren hassas ve gerçekleştirilmesi kolay bir yöntemi temsil eder. Sonuç olarak, bNAbs'in immün önksepitasyon için kullanılması, VLP aşılarının aşılanmış insanlarda nötralize edici bir B hücresi yanıtı ortaya çıkarıp çıkaramayacağına dair bir tahminde bulunur. Bu protokolün diğer araştırmacılara potansiyel VLP tabanlı aşıları incelemek için değerli ve basit bir deneysel yaklaşım sağlayacağı öngörüldür.
Introduction
Virüs benzeri parçacıklar (VLP'ler) viral genomdan yoksunken yerel virüs parçacık yapısına benzer, böylece yüksek bir güvenlik profili sağlar1,2. VLP'ler, yüksek immünojeniklikleri nedeniyle giderek artan bir şekilde geliştirilen bireysel bir aşı sınıfını temsil eder3,4,5,6,7. Bu durum özellikle membran kaplı VLP'ler için söz konusudur ve sadece homolog viral yüzey antijenlerinin değil, tümör antijenleri gibi heterolog antijenlerin de görüntülenmesini sağlar8,9,10. Şekil 1, zarflı antijen süslemeli bir VLP'nin yapısına örnek bir genel bakış sağlar. VLP tabanlı aşıların geliştirme sürecinde, tahliller, VLP yüzeyinde görüntülenen ilgili hedef antijenin analizini sağlayan vazgeçilmezdir. Bu tür tahliller bir partikül aşısının bileşimini aydınlatmak için etkili olmalıdır: (i) VLP'ler ilgili yüzey antijeni ile dekore edilmiş midir? (ii) Yüzey antijeni nötralize edici antikorların epitop tanıması (bNAbs) ve (iii) VLP oluşumuna aracılık eden viral proteinin tespiti nedeniyle VLP'lerin yapısal bütünlüğü doğrulanabilir mi?
Şekil 1: Membran zarflı bir VLP'nin şematik illüstrasyonu. VLP'ler olgunlaşmamış öncü Gag çekirdek proteinleri tarafından oluşturulur ve konak hücreden elde edilen bir lipid zarı ile çevrilidir. Antijenler, örneğin zarf glikoproteinleri lipid zarına dahil edilir ve VLP yüzeyinde (sağda) görüntülenir. Antijene özgü antikorlar antijeni tanır. Solda, antijen dekorasyonu olmayan kel bir VLP gösterilir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Özellikle insan immün yetmezlik virüsü tip 1'in (HIV-1) viral gruba özgü antijen (Gag) çekirdek öncül protein p55'inin oluşturduğu VLP'ler, aşı geliştirmede antijen gösterimi için çok sayıda antikor olarak tercih edilen iskelelerdir ve BU VLP'lerin nicelleştirilmesini sağlayan ELISA kitleri mevcuttur11,12. HIV-1 zarf glikoproteinleri (Env), yani transmembran protein gp41 (gp41-TM) ve çözünür yüzey ünitesi gp120 (gp120-SU) oluşturan heterodimerler, parçacıkların membran zarfına dahil edilir ve HIV enfeksiyonuna karşı aşı geliştirilmesi için çok önemli hedef antijenlerdir13,14,15 . Bu hedef antijenlerde nötralizasyona duyarlı epitopların görüntülenmesi, aşılarda geniş ölçüde nötralize edici bir antikor yanıtı ortaya çıkarırken ön koşuldur. Gag proteinlerine yönelik bir T hücre yanıtının yanı sıra, bu HIV enfeksiyonuna karşı korumanın önemli bir korelasyon olarak kabul edilir16. Sonuç olarak ve hedef antijen adayları ile dekore edilmiş VLP'lerin tasarımı ve üretimi üzerine, görüntülenen antijenlerin kalitesinin daha sonraki analizi aşı geliştirme sürecinde kritik bir adımı temsil eder.
İmmün önksepitasyon (IP), protein-protein etkileşimlerinin tespiti ve protein komplekslerinin küçük ölçekte saflaştırılması için yaygın olarak kullanılan bir tekniktir17. Barret ve ark. ilk olarak 1960 yılında IP'nin gelişimi hakkında rapor edildi, ancak bu yöntem sürekli olarak daha da geliştirildi. IP, boncuklara kapılarak hareketsiz hale getirilen antijene özgü bir antikor (yem) kullanarak hedef antijenin (av) bir çözeltiden yakalanmasını ve izolasyon edilmesini sağlar18,19. Bu protokolde, membran zarflı p55 Gag biçimli VLP'leri av olarak kullanan klasik IP uygulamasının bir varyasyonunu ve VLP'lerin yüzeyinde yem proteinleri olarak görüntülenen zarf proteinlerindeki nötralizasyona duyarlı epitopları tanıyan bNAb'leri gösteriyoruz. Bu VLP yakalama testinin başarılı bir şekilde uygulanması, test edilen antijen pozitif VLP'lerin aşılanmış kişilerde nötralize edici bir B hücresi yanıtı ortaya çıkarıp çıkaramayacağı tahminini kolaylaştırır. VLP tabanlı aşı adaylarının bu tür immünojenik özellikleri küçük hayvan modellerinde sıklıkla gösterilmiştir20,21,22.
Yeni geliştirilen VLP aşı adayının kalitesini değerlendirmek için VLP yakalama tahlilleri başarıyla kullanılmıştır5,23,24. Ancak, yayımlanan yöntemlerin sayısı sınırlıdır. Burada sunulan VLP yakalama testi, memeli türevi antikorların Fc bölgesine bağlanan protein G-konjuge boncuklar üzerinde Env'e özgü bNAb'lerin hareketsiz hale getirilmesiyle başlar. Tercih edilen antikorun hareketsiz hale getirilmesi için tipik matrisler agarose veya manyetik boncuklardır. Bununla birlikte, manyetik boncuklar yüksek verimli uygulamalar için uygundur25. Bir sonraki adımda, hedef antijeni görüntüleyen VIP'ler bNAb kaplı boncuklar tarafından yakalanır. Env-pozitif VLP'ler ve hareketsiz bNAb'lardan oluşan oluşan bağışıklık kompleksleri bir mıknatıs kullanılarak kolayca zenginleştirilir. İzole bağışıklık kompleksleri son adımda ele geçirilerek uzlaşmaktadır. Daha sonra, VLP'ler biyokimyasal olarak karakterize edilebilir. Burada, çökelmiş hedef Env antijenlerinin sadece nötralizasyona duyarlı epitopları barındırmadığını, aynı zamanda Gag-formlu VLP'lerde de görüntülendiğini göstermek için p55 Gag viral çekirdek proteine özgü antikorlar kullanarak Batı blot analizi yaptık. Ayrıca, viral çekirdek Gag proteinlerinin tespiti, Gag proteinleri bir VLP'deki Env'den daha bol olduğu için yakalama testinin hassasiyetini arttırır. HIV-1'de, Env proteinleri sadece tek veya çift basamaklı bir sayıda bulunur26, 3.500'den fazla Gag molekülü ise bir parçacığın çekirdeğini oluşturur27.
Protein-protein etkileşimlerinin incelenmesi için diğer tekniklerle karşılaştırıldığında28,29, VLP yakalama testi, araştırma laboratuvarlarının pahalı analitik aletlere erişimi olmaması için alternatif bir yöntem sağlar. Örneğin, iletim elektron mikroskobik analizi (TEM), yüzey plazmon rezonans spektroskopisi (SPR) ve nanopartikül izleme-analizi (NTA) maliyet yoğun olabilir. Burada sunulan yakalama tahlili, yakalanan antijen pozitif VLP örneklerinin daha sonra protein karakterizasyonuna tabi tutulmasına izin verir, örneğin, sırasıyla jel elektroforezi, immünblotting, elektron mikroskopisi ve kütle spektrometresi (MS) kullanarak. VLP yakalama tahlili sırasında hedef antijenin doğal yapısının korunduğu göz önüne alındığında, yerel bir PAGE'in performansı ve daha sonraki immünblotting teknikleri de kullanılabilir.
VLP yakalama tahlili, VLP'lerin nötralizasyona duyarlı epitopları açığa çıkaran hedef antijenlerle dekorasyonunu ve dolayısıyla gelecekteki aşı adayları olarak yararlarını incelemek için kullanımı kolay ve hassas bir yöntemi temsil eder.
Protocol
1. Numune hazırlama
- HIV yapısal genlerini ifade eden 293-F hücrelerinden elde edilen VLP prodüktör süspansiyon hücre hatlarının tohumlama tek başına veya 293-F Expression Medium'da mL başına 0,5 x 106 hücrelik düşük hücre yoğunluğunda env 30 ile uyumlu olarak.
- Dakikada 5 cm ve 135 mermi (rpm) yörüngeye sahip bir çalkalayıcı inkübatör rotasyonunda 3-4 gün boyunca 37 °C'de ve% 8 CO2'de genişlemelerine izin verin.
- Üretici hücrelerini 5 dakika boyunca 100 x g'da santrifüjleme ile pelet. Hücre içermeyen hücre kültürü süpernatantı (CFSN) elde etmek için 0,45 μm polivinylidene florür (PVDF) membran şırıng filtreleri kullanarak artık hücreleri ve hücre kalıntılarını gidermek için netleştirilmiş süpernatantı filtreleyin.
NOT: Protokol burada duraklatılabilir. CFSN gece boyunca 4 °C'de saklanabilir. - CFSN'yi doğrudan deney için kullanın veya ultracentrifugation (112.700 x g, 4 °C, 1,5 saat) kullanan 35 mL CFSN'den pelet VLP'leri kullanın.
- Ultrasantrifüjleme üzerine, süpernatantı atın ve VLP peletlerini santrifüj tüpü başına % 15 (w/v) trehaloz çözeltisinin 200 μL'sinde askıya alın.
NOT: VLP peletı genellikle çıplak gözle görülemez. Protokol burada duraklatılabilir. VLP'ler -80 °C'de saklanabilir. - VLP yakalama testlerinden önce, VLP'de ELISA kullanarak örnekler içeren viral çekirdek protein konsantrasyonlarını belirleyin. Bu adım, yakalama tahlili girişini standartlaştırmak için önemlidir.
2. VLP yakalama tahlilleri
NOT: İş akışına genel bakış Şekil 2'de tasvir edilir.
- Manyetik boncukları yukarı ve aşağı borulayarak veya en az 5 dakika boyunca 50 rpm'de bir rotatorda karıştırarak askıya alın.
- Bu arada, bNAbs içeren antikor çözeltisini hazırlayın. Reaksiyon başına 200 μL antikor bağlama ve yıkama tamponunda her bNAb'den 10 μg kullanın (bkz. Malzeme Tablosu).
NOT: Antikor miktarları bNAb'ın benzeşimine ve kullanılan VLP'lerdeki antijen dekorasyon yoğunluğuna bağlı olarak değişebilir. - Reaksiyon başına 50 μL manyetik boncuk çözeltisi kullanın (bkz. Malzeme Tablosu) ve boncukları 1,5 mL reaksiyon tüpüne aktarın. Tüpleri manyetik ayırma rafı üzerine yerleştirin.
NOT: Alternatif olarak, boncukları süperndan ayırmak için her tüp için güçlü bir tek mıknatıs kullanılabilir. - Boncukların toplanmasını sağlamak için boncuklar tüp duvarında toplanana kadar birkaç dakika bekleyin. Üsttekini çıkarın.
- Mıknatısı çıkarın ve 2.2 adımında hazırlanan bNAb çözeltisinin 200 μL'sinde boncukları askıya alın. Oda sıcaklığında 50 rpm'de bir rotator üzerinde 30 dakika ila 3 saat karıştırma için kuluçkaya yatırın.
- Reaksiyon tüplerini tekrar manyetik ayırma rafı içine yerleştirin, bekleyin ve üstnatant çıkarın.
- Tüpleri mıknatıstan çıkarın ve 200 μL antikor bağlama ve yıkama tamponunda yeniden oluşturarak boncukları yıkayın.
- 2.4. Mümkün olduğunca çok yıkama tamponu çıkarın.
- Örnekleri boncuk bağlı bNAbs'e ekleyin.
NOT: HIV türevi parçacıklar kullanılarak yapılan testlerin yakalanması için VLP girişi reaksiyon başına en az 15 ng viral çekirdek protein olmalıdır. VLP miktarları bNAb'ın benzeşimine ve kullanılan VLP'lerdeki antijen dekorasyon yoğunluğuna bağlı olarak değişebilir. - 2.9 adımına eklenen örnek hacim 1 mL'nin altındaysa, örnek hacmi 1 mL'ye ayarlamak için PBS ekleyin. Boncukları pipetleme ile hafifçe askıya alın.
- Numuneleri ve boncukları oda sıcaklığında bir rotatörde 2,5 saat kuluçkaya yatırın. Boncukların süspansiyonda kaldığından ve çözeltinin kuluçka sırasında iyice karıştırılmasından emin olun.
- Tüpleri mıknatısın üzerine yerleştirin ve üstnatant çıkarın.
- Manyetik boncukları 200 μL yıkama tamponunda askıya alarak yıkayın (bkz. Malzeme Tablosu). Yıkama adımını üç kez tekrarlayın.
- Boncukları 100 μL yıkama tamponunda askıya alın ve süspansiyonu temiz (ısıya dayanıklı) bir reaksiyon tüpüne aktarın.
- Tüpü manyetik ayırma rafının üzerine yerleştirin (bkz. Malzeme Tablosu) ve süpernatant tamamen çıkarın.
- 2.16.3-2.16.5 adımlarını izleyerek VLP'leri manyetik boncuklardan elde ederek 2.16.1-2.16.2 veya denatüre olmayan örnekleri izleyerek denatüre SDS-PAGE örnekleri hazırlayın.
- Denatüre SDS-PAGE örnekleri hazırlamak için boncukları 20-80 μL Laemmli tamponunda (1 ng p55 Gag tahlil girişi başına 0,8 μL Laemmli tampon) askıya alın ve 95 °C'de 5 dakika kuluçkaya yatırın.
- Doğrudan SDS-PAGE ile devam edin veya örnekleri -20 °C'de saklayın.
DİkKAT: Laemmli tampon 2-mercaptoethanol ve sodyum dodecyl sülfat içerir. Koruyucu eldiven ve göz koruması giyin. Cilt, göz ve kıyafetlerle temastan kaçının. Buharları soluma. İyi havalandırılmış bir alanda çalışın, örneğin duman kaputu.
NOT: Protokol burada duraklatılabilir. - Alternatif olarak, korunmuş yerli protein yapısına sahip VLP'leri elde etmek için denatüre olmayan bir elution adımı gerçekleştirin.
- Manyetik boncuklara 25 μL elution tamponu (genellikle boncuklarla birlikte verilir) ekleyin ve oda sıcaklığında 2-5 dakika kuluçkaya yatırın.
- Boncukları çıkarın ve eluat'ı temiz bir tüpe aktarın. Sonraki tahliller için elüat kullanın veya 4 °C'de saklayın.
NOT: Protokol burada duraklatılabilir.
3. Yakalanan VLP örneklerinin analizi
NOT: Yakalanan VLP'lerin analizi için bir SDS-PAGE ve daha sonra Batı blot analizi yapın31,32.
- Boncukları çözeltiden ayırmak için numune tüplerini manyetik rafa yerleştirin.
- Her numunenin 10 μL'sini jelin ayrı kuyularına yükleyin.
NOT: Bu protokolde viral p55 Gag çekirdek proteinleri HIV Gag ve ikincil poliklonal tavuk anti-tavşan IgG'ye karşı yönlendirilmiş poliklonal tavşan antikorları at turpu peroksidaz (HRP) antikorları ile birleştiğinde saptanmıştır. Viral çekirdek proteinler chemiluminescence tespiti kullanılarak görselleştirildi.
Şekil 2: Hücre içermeyen süpernatantlar kullanarak VLP yakalama testinin önemli adımlarının şematik çizimi. (1) VLP yakalama tahlili, HIV-1 bNAb'lerin G-bağlantılı manyetik boncuklara bağlanmasıyla başlar. Bu arada, tanımlanmış bir p55 konsantrasyonuna sahip VLP çözeltisi hazırlanır. Hücresiz kültür süpernatant p55 Gag VLP'leri, konak hücre proteinleri ve nükleik asitlerin bir karışımından oluşur. (2) bNAbs ve VLP çözeltisi ile birleştirilen manyetik boncuklar, 1,5 mL reaksiyon tüpüne ve ardından rotasyon altında inkübasyona aktarılır. (3) Antijen ekranlı VLP'ler bNAbs kaplı boncuklar tarafından yakalanır. Bu bağışıklık komplekslerinin konak hücre kaynaklı kirleticilerden ayrılması manyetik bir alanda gerçekleştirilir. (4) Süpernatant pipetleme ile çıkarılır ve boncuklar ilişkisiz VLP'leri çıkarmak için üç kez yıkanır. (5) Bir sonraki adımda, bNAb'lar ve yakalanan VLP'lerle kaplanmış manyetik boncuklardan oluşan bağışıklık komplekslerine protein yükleme tamponunun azaltılması eklenir. (6) Numunenin kaynatılması bNAb'ları ayırır ve antijeni manyetik boncuklardan hedefler ve VLP'leri liziz eder. (7) Manyetik boncuklar manyetik bir alanda çözeltiden ayrılır. (8) Protein örnekleri SDS-PAGE'e tabi tutulur. (9) Viral p55 Gag çekirdek proteinlerini tespit etmek için Batı blot analizi yapılır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Representative Results
Şekil 3 , ilk olarak CFSN ve VLP peletlerinden yakalanan VLP'lerin bNAb'ları kullanarak ve daha sonra viral çekirdek proteinleri tespit etmek için Batı blot analizine tabi tutularak temsili bir sonucunu göstermektedir. Yakalama testi için kullanılan boncuklar, sırasıyla Env glikoproteinlerinin nötralizasyona duyarlı epitoplarına ve negatif kontrol görevi gören izotip antikorlarına karşı yönlendirilmiş üç farklı bNAb ile kaplanmıştır. İzotip antikor kaplı boncuklar kullanılarak, Batı blot analizi kullanan Env negatif (kel VLP'ler) veya Env-displaying VLP'ler içeren örneklerde Gag proteini saptanamamıştır. Bu, VLP'lerin insan antikorlarıyla kaplanmış boncuklara spesifik olmayan bağlanmasının VLP yakalamasına aracılık etmediğini göstermiştir. Kel VLP'ler de bNAbs kaplı boncuklarla bağlanmadı ve sonuç olarak, yine hiçbir Gag proteini tespit edilemedi. Buna karşılık, her üç bNAb da Env proteinlerini (Env VLP' ler) gösteren VLP'leri yakaladı ve bu nedenle Gag proteinleri daha sonra kolayca tespit edildi. Şekil 3'te de görülebildiği gibi, yakalama tahlili cfsn ve peletlenmiş VLP örneklerinde VLP'leri görüntüleyen hedef antijeni analiz etmek için kullanılabilir.
Şekil 3: Geniş çapta nötralize edici antikorlar kullanılarak p55 Gag ile oluşturulan VLP'lerde görüntülenen HIV-1 zarf glikoproteinlerinde nötralizasyona duyarlı epitopların tespiti. HIV-1 zarf glikoproteinleri (Env) içindeki epitopları hedefleyen üç farklı geniş nötralize edici antikor (bNAb 1, bNAb 2 ve bnAb 3) kullanan bir VLP yakalama testi yaptıktan sonra viral Gag çekirdeği proteine özgü antikorlar kullanılarak Batı blot analizinin temsili sonuçları. İnsan serasından birikmiş izotip insan antikorları negatif kontrol görevi buldu. Hücre kültürü süpernatantları, sırasıyla Env proteinleri (Env VLP'ler) ve kel VLP'ler (Env-negatif) ile VLP'ler üreten süspansiyon hücre kültürlerinden ve ayrıca herhangi bir viral protein ifade etmeyen naif hücrelerden (sahte) elde edildi. Hem kel VLP üretici hücre kültüründen hem de sahte hücre kültüründen gelen üstünlükler olumsuz kontroller olarak hizmet etti. Süpernatantlar, analiz için hücresiz süpernatantlar (CFSN) elde etmek için düşük hızlı santrifüjleme ve daha sonra filtrasyon kullanılarak hücreleri kirletmekten kurtuldu. İmmün prekipitasyon üzerine, Gag ve ikincil anti-tavşan IgG-HRP konjugelerine karşı yönlendirilen poliklonal tavşan antikorları kullanılarak Batı blot analizi yapıldı. Kilodaltonlardaki (kDa) moleküler ağırlık işaretçisinden (MW) görülebilen belirgin moleküler ağırlık solda tasvir edilir. Oklar tespit edilen öncül protein p55 Gag'ı gösteriyor. (A) Her örnek için, VLP'lerin giriş miktarını standartlaştırmak için yakalama testine 100 ng Gag proteini içeren CFSN uygulandı. (B) VLP peletleri CFSN'nin ultrasantrifüjlenmesi ile elde edildi. Yakalama testine izotip antikorları ve bNAb 3 kullanılarak 100 ng Gag proteini içeren peletler uygulandı. bNAb 1 ve bNAb 2 örnekleri yalnızca 25 ng Gag içeriyordu. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Discussion
VLP yakalama tahlilden önce, VLP'lerin oluşumunu ve VLP üretici hücre hatlarındaki hedef antijenin ifadesini değerlendirin. Enstrümantal yöntemler, antijenin hücre yüzeyi ekspresyonunun yanı sıra CFSN ve peletli VLP'lerin antijen ve viral çekirdek proteine özgü ELISA'sının akış sitometrik analizidir.
VLP yakalama testinin kritik adımları, boncukların yakalama antikorları ile kaplanması - burada bNAbs - ve daha sonra antijen pozitif VLP'lerin antikor kaplı boncuklar tarafından yakalanmasıdır. Boncukların antikorlarla başarılı bir şekilde kaplanması, konjuge immünoglobulin (Ig) bağlayıcı proteinin seçimine bağlıdır. Antikorların Ig sınıfının yanı sıra donör türler, protein G veya protein A-konjuge boncukların tercih edilip edilmediğini belirler. Çoğu tür ve Ig sınıfı için protein G, tercih 33'ün ligand'ıdır. Protein A/G konjuge boncuklara alternatif olarak, biyotinilasyonlu antikorlarla kaplama için streptavidin boncuklar mevcuttur. Boncuklar antikorlarla da eşçekimli olarak birleşebilir.
VLP'lerin antikor kaplı boncuklar tarafından yakalanması, kapsamlı karıştırmaya, yeterli kuluçka süresine, antijen bolluğuna ve yakalama antikorunun benzeşimine bağlıdır. Deneyimlerimize göre, antikor kaplı boncukların VLP örnekleriyle kapsamlı bir şekilde karıştırılması, oda sıcaklığında veya 4 °C'de en az 2 saat dönme altında 1,5 mL tüplerde 500 μL > hacimlerin kullanılmasıyla elde edilir. Diğer bir olası engel, örnekteki çok düşük VLP miktarıdır. Hedef antijeni güçlü bir şekilde bağlayan antikorlar için, 15 ng Kadar düşük Gag proteini VLP girişleri genellikle Batı blot analizi kullanılarak viral çekirdek proteinlerin kolayca tespit edilebilir miktarlarına izin verir. Bununla birlikte, düşük benzeşimli antikorlar kesin sonuçlar elde etmek için 100 ng Gag proteini gibi daha yüksek girdi miktarları gerektirir (Şekil 3, bNAb 3).
Bazı yüzey antijenleri proteaz bozulmasına eğilimlidir. Burada, VLP örneklerine proteaz inhibitörlerinin eklenmesini ve 4 °C'de inkübasyonu öneririz. Konak hücre proteinlerinin ve VLP'lerin boncuk bağlı antikorlara spesifik olmayan yapışıklığı nadiren gözlenir ve burada sahte ve kel VLP örnekleri ve izotip kontrol antikorları kullanarak gösterdiğimiz gibi uygun negatif kontroller kullanılarak dışlanmalıdır. Spesifik olmayan bağlamayı azaltma stratejileri arasında genişletilmiş yıkama adımları ve yıkama tamponu34'e kazein eklenmesi yer almaktadır. Ayrıca, antikorun antijen gösteren VLP miktarına en uygun oranı belirlenerek yakalama testi de geliştirilebilir.
VLP yakalama testinin son adımında, Laemmli tamponu azaltarak kaynatarak bağışıklık komplekslerinin boncuklardan emilmesini tarif ediyoruz. Bu adım sırasında VLP'ler sökülür ve yakalama antikorları ve hedef antijenler boncuklardan ayrılır. Özellikle, sonraki Batı blot analizinde kullanılan birincil antikorun donör türü, ikincil anti-donör IgG HRP konjuge antikorları tarafından yakalama antikorunun istenmeyen tespitini önlemek için yakalama antikorunun donöründen farklı olmak zorundadır.
Burada sunulan VLP yakalama tahlili, VLP yüzeylerinde görüntülenen yapısal bozulmamış hedef antijenlerdeki nötralizasyona duyarlı epitopları tespit etmek için kullanımı kolay ve hassas bir yöntem sağlar. Ancak, yakalama tahlili doğrudan epitope nicelesini etkinleştirmez. bNAbs ile gerçekleştirilen ELISA bu amaç için etkilidir ve özellikle incelenen VLP'lerin hayvan modelleri kullanan preklinik çalışmalarda kullanılması amaçlanıyorsa paralel olarak yapılmalıdır35. Bu çok önemlidir, çünkü antijen miktarı, porcine sirkovirüs tip 2 (PCV2) aşılarında gösterildiği gibi, bağışıklanmış hayvanlarda nötralize edici bir antikor yanıtının ortaya konmasıyla doğrudan ilişkili olabilir36.
İdeal bir aşı, virion yüzeyinde nötralizasyona duyarlı epitopları hedef alan bNAb'lerin ortaya çıkmasıyla sonuçlanmalıdır. Bu epitopların analizi, özellikle partikül aşı yüzeyindeki tam yapısal bütünlüklerine atıfta bulunarak potansiyel aşı adaylarını belirlemek için çok önemlidir. Bu sadece HIV kaynaklı VLP'ler için değil, aynı zamanda geliştirme aşamasındaki diğer birçok VLP aşısı için de geçerli37. Öne çıkan VLP tabanlı aşılar, örneğin, insan papillomavirüsü (HPV) gibi zarfsız veya kapsid ebeveyn virüslerinden türetilmiştir. Sadece bir yapısal çekirdek proteinden yani p55 Gag'dan oluşan ve VLP üretici hücresinden kaynaklanan zar tarafından kuşatılan HIV-1 parçacıklarının aksine, HPV parçacıkları sadece bir veya iki yapısal çekirdek proteinden oluşur38,39. Aynı şekilde ve zarflı VLP'ler için burada sunulduğu gibi, VLP yakalama tahlili, zarflanmamış VLP'lerin nötralizasyona duyarlı epitoplarının tespiti için de uygulanabilir.
Yakalama testine alternatif olarak, VLP örnekleri doğrudan yerel PAGE'e ve ardından bNAbs ve HRP40 ile birleştirilmiş uygun ikincil antikorlar kullanılarak Batı blot analizine tabi tutulabilir. Bununla birlikte ve HIV Env ile dekore edilmiş VLP'lerin analizi için, VLP başına sadece düşük sayıda antijen proteini beklenebilir olduğu için bu test daha az hassastır. Buna karşılık, yakalama tahlili, HIV'den türetilmiş VLP'ler durumunda VLP başına büyük miktarlarda bol miktarda bulunan çekirdek proteinlerin tespitini kolaylaştırır, 3.500'den fazla Gag proteini bir VLP27 oluşturur. Bu, VIP'lerde düşük yoğunluklarda bile görüntülenen Env'deki epitopların çok hassas dolaylı olarak algılanmasını sağlar.
VLP'lerin yüzey antijenlerinde nötralizasyona duyarlı epitopları incelemek için iyi kurulmuş yöntemlerin sayısı sınırlıdır. VLP'lerde görüntülenen antijenlerin etiketlenmesi, epitopa özgü antikor-florofor konjugeleri ve daha sonra nanopartikül izleme-analizi (NTA) ile tespit edilmesiyle mümkündür ve VLP'lerin tespitini ve nicelleştirilmesini sağlar. Bu yöntem ayrıca hücre yüzeyi işaretleyicileri sunan eksozomlar için başarıyla geliştirilmiş ve optimize edilmiştir41. Ayrıca, yüzey plazmon rezonansı (SPR) spektroskopisi, VLP'lerde sunulan yargısız nötralize edici antikorlar ve konyak epitopları arasındaki etkileşimlerin analizini sağlar. Daha yüksek verim analizi için uygun olmasa da, VLP'ler altın parçacıklara ve sonraki iletim elektron mikroskobik (TEM)- incelemesi42 ile birleştirilmiş bNAb'lerle de etiketlenebilir.
Sonuç olarak, VLP yakalama tahlili bazı önemli avantajlar sağlar: (i) VLP'lerin yüzeyinde nötralizasyona duyarlı epitopların yapısal bütünlüğünün değerlendirilmesi, (ii) VLP'lerde düşük yoğunluklarda görüntülendiğinde bile antijenlerin hassas ve dolaylı olarak algılanması ve (iii) yöntem maliyet yoğun analitik ekipman gerektirmez.
Disclosures
Yazarlar çıkar çatışması olmadığını beyan ederler.
Acknowledgments
Bu çalışma, Alman Federal Eğitim ve Araştırma Bakanlığı'nın hibesi, Fon programı Forschung an Fachhochschulen, sözleşme numaraları 13FH767IA6 ve 13FH242PX6'dan JS'ye desteklendi. Şekil 1 ve 2 BioRender.com ile oluşturulmuştur.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL reaction tubes | Eppendorf | ||
| 10x PBS | gibco | 70011044 | |
| 4%–15% Mini-PROTEAN TGX stain-free protein gels | BioRad | 4568085 | |
| Antibodies (bnAbs) | Polymun Scientic | ||
| Isotype control antibody | invitrogen (Thermo Fisher Scientific) | 02-7102 | |
| Chemidoc XRS+ imaging system | BioRad | 1708265 | |
| Chicken anti-rabbit IgG HRP-coupled | Life technologies | A15987 | 1:5000 in TBS-T + 2 % (w/v) powdered milk |
| Dynabeads Protein G Immunoprecipitation Kit | invitrogen (Thermo Fisher Scientific) | 10007D | includes buffers and washing solutions |
| FreeStyle 293-F cells | invitrogen (Thermo Fisher Scientific) | R790-07 | |
| FreeStyle 293 Expression Medium | invitrogen (Thermo Fisher Scientific) | 12338026 | |
| Gel blotting papers | Whatman | GB005 | |
| Glycine | Carl Roth | 0079 | blotting buffer |
| Magnetic separation rack | New England Biolabs | S1509S | for 12 x 1.5 mL or 6 x 1.5 mL tubes |
| Methanol | Carl Roth | 4627 | blotting buffer |
| Mini-PROTEAN Tetra Cell electrophoresis system | BioRad | ||
| Optima XE-90 ultracentrifuge | Beckman Coulter | ||
| PageRuler prestained protein ladder | Thermo Scientific | 26616 | |
| Polyvinylidene fluoride (PVDF) syringe filters, 0.45 µm | Carl Roth | KC89.1 | |
| Powdered milk | Carl Roth | T145 | blocking buffer |
| PVDF transfermembrane, 0.45 µm | Carl Roth | T830.1 | |
| QuickTiter HIV p24 ELISA | Cell Biolabs | VPK-108-H | |
| Rabbit polyclonal to HIV1 p55 + p24 + p17 | abcam | ab63917 | 1:2000 in TBS-T + 2 % (w/v) powdered milk |
| Rotator | Heidolph | REAX2 | |
| ROTI Load 1 (laemmli buffer) | Carl Roth | K929.1 | 4x concentrated reducing protein gel loading buffer |
| ROTIPHORESE 10x SDS-PAGE | Carl Roth | 3060 | |
| Sodium chloride | Carl Roth | 3957 | TBS-T buffer |
| SuperSignal West Pico PLUS chemiluminescent substrate | Thermo Scientific | 34579 | |
| SW28 rotor | Beckman Coulter | ||
| Thermomixer | Cel Media | basic | |
| Trans-Blot Turbo | BioRad | ||
| Trehalose dihydrate | Carl Roth | 8897.2 | |
| TRIS | Carl Roth | 5429 | blotting buffer |
| TRIS hydrochloride | Carl Roth | 9090 | TBS-T buffer |
| Tween-20 | Carl Roth | 9127 | TBS-T buffer |
| Ultra Clear centrifuge tubes | Beckman Coulter | 344058 |
References
- Roldão, A., Mellado, M. C. M., Castilho, L. R., Carrondo, M. J. T., Alves, P. M. Virus-like particles in vaccine development. Expert Review of Vaccines. 9 (10), 1149-1176 (2010).
- Noad, R., Roy, P. Virus-like particles as immunogens. Trends in Microbiology. 11 (9), 438-444 (2003).
- Qian, C., et al. Recent progress on the versatility of virus-like particles. Vaccines. 8 (1), 139 (2020).
- Zabel, F., Kündig, T. M., Bachmann, M. F. Virus-induced humoral immunity: On how B cell responses are initiated. Current Opinion in Virology. 3 (3), 357-362 (2013).
- Garg, H., Mehmetoglu-Gurbuz, T., Joshi, A. Virus Like Particles (VLP) as multivalent vaccine candidate against Chikungunya, Japanese Encephalitis, Yellow Fever and Zika Virus. Scientific Reports. 10 (1), 4017 (2020).
- Hodgins, B., Pillet, S., Landry, N., Ward, B. J. A plant-derived VLP influenza vaccine elicits a balanced immune response even in very old mice with co-morbidities. PLoS ONE. 14 (1), 0210009 (2019).
- Lai, C. C., et al. Process development for pandemic influenza VLP vaccine production using a baculovirus expression system. Journal of Biological Engineering. 13, 78 (2019).
- Caldeira, J. C., Perrine, M., Pericle, F., Cavallo, F. Virus-like particles as an immunogenic platform for cancer vaccines. Viruses. 12 (5), 488 (2020).
- Nika, L., et al. An HER2-displaying virus-like particle vaccine protects from challenge with mammary carcinoma cells in a mouse model. Vaccines. 7 (2), 41 (2019).
- Mohsen, M. O., Zha, L., Cabral-Miranda, G., Bachmann, M. F. Major findings and recent advances in virus-like particle (VLP)-based vaccines. Seminars in Immunology. 34, 123-132 (2017).
- Fontana, D., Garay, E., Cevera, L., Kratje, R., Prieto, C., Gòdia, F. Chimeric VLPs based on hiv-1 gag and a fusion rabies glycoprotein induce specific antibodies against rabies and foot-and-mouth disease virus. Vaccines. 9 (3), 251 (2021).
- Cervera, L., et al. Production of HIV-1-based virus-like particles for vaccination: achievements and limits. Applied Microbiology and Biotechnology. 103 (18), 7367-7384 (2019).
- Gonelli, C. A., King, H. A. D., Mackenzie, C., Sonza, S., Center, R. J., Purcell, D. F. J. Immunogenicity of HIV-1-based virus-like particles with increased incorporation and stability of membrane-bound env. Vaccines. 9 (3), 1-36 (2021).
- Trkola, A. HIV not as simple as one, two, three. Nature. 568, 321-322 (2019).
- Berman, P. W., et al. Protection of chimpanzees from infection by HIV-1 after vaccination with recombinant glycoprotein gp120 but not gp160. Nature. 345 (6276), 622-625 (1990).
- Barouch, D. H. Challenges in the development of an HIV-1 vaccine. Nature. 455 (7213), 613-619 (2008).
- DeCaprio, J., Kohl, T. O. Immunoprecipitation. Cold Spring Harbor Protocols. 2020 (11), 449-461 (2020).
- Barret, B., Wood, P. A., Volwiler, W. Quantitation of gamma globulins in human serum by immunoprecipitation. Journal of Laboratory and Clinical Medicine. 55, 605-615 (1960).
- Kaboord, B., Perr, M. Isolation of proteins and protein complexes by immunoprecipitation. Methods in Molecular Biology. 424, Clifton, N.J. 349-364 (2008).
- Lee, S. H., Chu, K. B., Kang, H. J., Quan, F. S. Virus-like particles containing multiple antigenic proteins of Toxoplasma gondii induce memory T cell and B cell responses. PLoS ONE. 14 (8), 0220865 (2019).
- Lee, Y. T., et al. Intranasal vaccination with M2e5x virus-like particles induces humoral and cellular immune responses conferring cross-protection against heterosubtypic influenza viruses. PLoS ONE. 13 (1), 0190868 (2018).
- Wang, J., et al. Large-scale manufacture of VP2 VLP vaccine against porcine parvovirus in Escherichia coli with high-density fermentation. Applied Microbiology and Biotechnology. 104 (9), 3847-3857 (2020).
- Swenson, D. L., et al. Generation of Marburg virus-like particles by co-expression of glycoprotein and matrix protein. FEMS Immunology and Medical Microbiology. 40 (1), 27-31 (2004).
- Latham, T., Galarza, J. M. Formation of wild-type and chimeric influenza virus-like particles following simultaneous expression of only four structural proteins. Journal of Virology. 75 (13), 6154-6165 (2001).
- Doyle, J., Ray, M., Ouyang, A., Benton, B., Bell, P. A. Abstract 4877: High throughput proteomic applications using protein A/G magnetic beads. Association for Cancer Research (AACR) 102nd Annual Meeting. 20, 4877 (2011).
- Zhu, P., et al. Electron tomography analysis of envelope glycoprotein trimers on HIV and simian immunodeficiency virus virions. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (26), 15812-15817 (2003).
- Lavado-García, J., Jorge, I., Boix-Besora, A., Vázquez, J., Gòdia, F., Cervera, L. Characterization of HIV-1 virus-like particles and determination of Gag stoichiometry for different production platforms. Biotechnology and Bioengineering. 118 (7), 2660-2675 (2021).
- Miura, K. An overview of current methods to confirm protein-protein interactions. Protein & Peptide Letters. 25 (8), 728-733 (2018).
- Rao, V. S., Srinivas, K., Sujini, G. N., Kumar, G. N. Advances in molecular techniques to study diversity. Plant Biotechnology, Volume 1: Principles, Techniques, and Applications. , 341-365 (2017).
- Rosengarten, J. F., Schatz, S., Wolf, T., Barbe, S., Stitz, J. Components of a HIV-1 vaccine mediate virus-like particle (VLP)-formation and display of envelope proteins exposing broadly neutralizing epitopes. Virology. , 41-48 (2022).
- JoVE, JoVE. Grundlegende Methoden in der Zell- und Molekularbiologie. Separating Protein with SDS-PAGE. JoVE Science Education Database. , Cambridge, MA. (2021).
- Eslami, A., Lujan, J. Western blotting: sample preparation to detection. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (44), e2359 (2010).
- Sheng, S., Kong, F. Separation of antigens and antibodies by immunoaffinity chromatography. Pharmaceutical Biology. 50 (8), 1038-1044 (2012).
- Guzzo, C., et al. Virion incorporation of integrin 47 facilitates HIV-1 infection and intestinal homing. Science Immunology. 2 (11), (2017).
- Wei, M., et al. Bacteria expressed hepatitis E virus capsid proteins maintain virion-like epitopes. Vaccine. 32 (24), 2859-2865 (2014).
- Jin, J., Park, C., Cho, S. H., Chung, J. The level of decoy epitope in PCV2 vaccine affects the neutralizing activity of sera in the immunized animals. Biochemical and Biophysical Research Communications. 496 (3), 846-851 (2018).
- Zhang, X., et al. Lessons learned from successful human vaccines: Delineating key epitopes by dissecting the capsid proteins. Human Vaccines and Immunotherapeutics. 11 (5), 1277-1292 (2015).
- DiGiuseppe, S., Bienkowska-Haba, M., Guion, L. G. M., Keiffer, T. R., Sapp, M. Human papillomavirus major capsid protein L1 remains associated with the incoming viral genome throughout the entry process. Journal of Virology. 91 (16), 00537 (2017).
- Wang, J. W., Roden, R. B. S. L2, the minor capsid protein of papillomavirus. Virology. 445 (1-2), 175-186 (2013).
- Binley, J. M., et al. Profiling the specificity of neutralizing antibodies in a large panel of plasmas from patients chronically infected with human immunodeficiency virus type 1 subtypes B and C. Journal of Virology. 82 (23), 11651-11668 (2008).
- Thane, K. E., Davis, A. M., Hoffman, A. M. Improved methods for fluorescent labeling and detection of single extracellular vesicles using nanoparticle tracking analysis. Scientific Reports. 9 (1), 12295 (2019).
- Mulder, A. M., et al. Toolbox for non-intrusive structural and functional analysis of recombinant VLP based vaccines: A case study with hepatitis B vaccine. PLoS ONE. 7 (4), 0033235 (2012).
