Summary
Gedetailleerde microchirurgische technieken zijn aangetoond om een langerlopend jugulair aderkannulatieratmodel vast te stellen voor sequentiële bloedafname bij hetzelfde dier. Fysiologische en hematologische parameters zijn gecontroleerd tijdens de herstelfase van de rat. Dit model is toegepast om de farmacokinetiek van oraal toegediend polyfenol te bestuderen zonder stress bij dieren te veroorzaken.
Abstract
Bloedafname bij kleine proefdieren is noodzakelijk voor farmaceutische loodoptimalisatie, maar kan grote schade en stress veroorzaken voor proefdieren, wat mogelijk de resultaten kan beïnvloeden. De jugulaire ader cannulatie (JVC) bij ratten is een veel gebruikt model voor herhaalde bloedafname, maar vereist adequate training van chirurgische vaardigheden en dierverzorging. Dit artikel beschrijft de microchirurgische procedures voor het opzetten en onderhouden van een permanent JVC-rattenmodel met specifieke aandacht voor de plaatsing en afdichting van de jugulaire canule. Het belang van het monitoren van fysiologische (bijv. Lichaamsgewicht, voedsel- en waterinname) en hematologische parameters, werd benadrukt met resultaten die gedurende 6 dagen na de operatie werden gepresenteerd tijdens het herstel van de rat. Het geneesmiddel-plasmaconcentratie-tijdprofiel van oraal toegediend natuurlijk fenolellaginezuur werd bepaald in het JVC-rattenmodel.
Introduction
Herhaalde verwerving van bloedmonsters van kleine proefdieren, zoals knaagdieren, cavia's en konijnen, is een belangrijk aspect voor farmaceutische loodoptimalisatie en ook voor het verminderen van het aantal dieren dat in onderzoek wordt gebruikt 1,2. De pijplijn voor de ontwikkeling van nieuwe diagnostische hulpmiddelen en medicijnformulering (bijv. vaccin) vereist toegang tot verschillende bloedvolumes om hun robuustheid en prestaties in vivo te evalueren, zoals farmacokinetiek (PK), toxiciteit en gevoeligheid 3,4,5.
De laboratoriumbenadering van bloedmonsterafname wordt grofweg ingedeeld in twee soorten, chirurgisch en niet-chirurgisch6. De niet-chirurgische benadering is relatief gemakkelijk te begrijpen voor de onderzoeker, die veel voorkomende technieken omvat, zoals hartpunctie, orbitale sinuspunctie en bloeding van de sapheneuze en staartader. Meerdere bloedafnames zijn mogelijk door sommige niet-chirurgische methoden, maar het monstervolume is klein en kan fysieke wond- en psychologische stress bij de dieren veroorzaken1. Aan de andere kant is de chirurgische aanpak een favoriet alternatief voor herhaalde venapunctie en omvat het plaatsen van een tijdelijke of permanente canule in de bloedvaten van dieren 7,8,9. Het grote bloedvolume kan herhaaldelijk worden teruggetrokken door de canule bij bewuste ratten, terwijl de stress en pijn als gevolg van de hanteringstechniek, insluiting en anesthesieworden vermeden 7,8,10,11. De canule-implantatie vereist echter een ervaren onderzoeker met voldoende training om het bloed met succes te verzamelen.
Bloedafname door halsader cannulatie (JVC) bij ratten is de meest gebruikte methode om het geneesmiddel PK 6,10,12,13 te bestuderen. Toch vereist de oprichting van het JVC-rattenmodel zorgvuldige oefening van microchirurgische vaardigheden en kennis van postoperatieve zorg en onderhoud. Vooral na de operatie heeft de rat toediening van pijnstillers en voldoende hersteltijd nodig om een stabiele fysiologische toestand te bereiken voor verdere experimenten 13,14,15. Hoewel de gewichtstoename (d.w.z. >10 g) een geldige en algemeen toegepaste indicator is voor het herstel van de rat, is het niet ongewoon dat de ratten postoperatief onverwacht sterven als gevolg van uitdroging, infectie en ontsteking, wat subtiel kan zijn om op te merken bij het vroege begin14,15. Bovendien blijft katheterobstructie in het JVC-model een probleem tijdens de bloedafname.
Het huidige protocol heeft in detail de microchirurgische procedures voor JVC bij een verdoofde rat aangetoond met specifieke aandacht voor de identificatie, isolatie en cannulatie van de halsader. Het belang van fysiologische en hematologische monitoring van de ratten tijdens de herstelfase wordt benadrukt. Ten slotte werden seriële bloedmonsters verzameld via de veneuze katheter om de PK van het oraal toegediende natuurlijke fenolellaginezuur met slechte biologische beschikbaarheid (d.w.z. lage systemische concentratie) te bestuderen om het JVC-rattenmodel te verifiëren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
De hieronder beschreven procedures werden uitgevoerd als onderdeel van een protocol dat is goedgekeurd door het Institutional Animal Care and Use Committee van de Northwestern Polytechnical University (nr. 202101117).
1. Preoperatieve voorbereiding (de dag voor de operatie)
OPMERKING: Vereiste oplossingen: normale zoutoplossing (0,9% w / v natriumchloride), gehepariniseerde zoutoplossing (1% w / v heparinenatrium), kathetervergrendelingsoplossing, niet-steroïde anti-inflammatoir geneesmiddel (NSAID), zoals meloxicam-oplossing (2 mg / ml).
- Oplossingsvoorbereiding
- Aliquot 200 μL voorverpakte kathetervergrendelingsoplossing in een steriele microcentrifugebuis van 1,5 ml.
OPMERKING: Kathetervergrendelingsoplossing bestaat uit gehepariniseerde zoutoplossing (0,4% v/v heparinenatrium) gemengd met glycerol (v/v,1:1). - Meng 1 g heparinenatrium in 100 ml van de normale zoutoplossing om 1% gehepariniseerde zoutoplossing te bereiden.
- Los meloxicam op in een normale zoutoplossing om een oplossing met een concentratie van 2 mg/ml te bereiden voor postoperatieve pijnverlichting.
OPMERKING: Bereide heparinized zoutoplossing en meloxicam-oplossing worden gefilterd door een filter van 0,22 μm. Alle oplossingen worden gesteriliseerd en opgeslagen bij 4°C voor toekomstig gebruik.
- Aliquot 200 μL voorverpakte kathetervergrendelingsoplossing in een steriele microcentrifugebuis van 1,5 ml.
- Chirurgische instrumenten en materialen
- Verpak alle schone chirurgische hulpmiddelen in een zakje en plak het af met een stuk autoclaafsterilisatietape. Zie figuur 1A voor de specifieke chirurgische instrumenten die worden gebruikt.
- Autoclaaf het operatiezakje bij 121 °C gedurende 30 minuten voor gebruik de volgende dag.
- Dierbereiding
- Huisvest voorafgaand aan de operatie alle mannelijke Sprague-Dawley (SD) ratten in de standaard dierenkamer met gecontroleerde temperatuur bij 22 ± 1 °C. Voed ze met het standaard laboratorium voedsel en water ad libitum gedurende ten minste 7 dagen.
OPMERKING: Zowel mannelijke als vrouwelijke ratten kunnen worden gebruikt voor het JVC-model en hun typische leeftijden en lichaamsgewicht variëren van respectievelijk 9-14 weken en 294 ± 57 g. - Verdoof de rat met 3% -3,5% isofluraan gemengd met zuurstof in een pre-anesthesiekamer. Bepaal of de rat bewusteloos raakt door het gebrek aan reactie op voetknijpen.
- Haal de rat er voorzichtig uit, plaats de neus van de rat in een verdovingsneusstuk dat 2% -2,5% isofluraan levert.
- Verwijder in de ventrale en dorsale positie de vacht grondig rond de rechterschouder en achterste delen van de nek met ontharingscrème en een scheermes voor huisdieren. Breng de rat terug naar de kooi voor een operatie die de volgende dag moet worden uitgevoerd.
- Huisvest voorafgaand aan de operatie alle mannelijke Sprague-Dawley (SD) ratten in de standaard dierenkamer met gecontroleerde temperatuur bij 22 ± 1 °C. Voed ze met het standaard laboratorium voedsel en water ad libitum gedurende ten minste 7 dagen.
2. Voor de operatie op de dag zelf
- Bereid het aseptische werkstation voor
- Spray 75% medische alcohol om het operatiegebied te desinfecteren en plaats vervolgens het verwarmingskussen bedekt met een schoon kussen. Plaats de LED-lamp met een koude lichtbron naast de werkplek.
- Verwarm de benodigde oplossingen (stap 1.1) voor op kamertemperatuur.
- Vul 0,6 ml gehepariniseerde zoutoplossing en 0,15 ml kathetervergrendelingsoplossing in respectievelijk twee steriele 1,0 ml stompe spuiten met punt. Zuig 2,5 ml van de normale zoutoplossing op met een steriele spuit van 5,0 ml.
- Week de wattenbollen in 75% medische alcohol. Pers overtollige ethanol uit voor gebruik.
- Weeg en noteer het lichaamsgewicht van de rat.
3. Tijdens de operatie
- Chirurgische voorbereiding
- Draag de chirurgische jas, steriele handschoenen en gezichtsmasker. Open vervolgens het gesteriliseerde chirurgische zakje, laat alle chirurgische hulpmiddelen in 75% medische alcohol zitten en droog ze voor gebruik.
- Halsader isolatie
OPMERKING: De geschatte bedrijfstijd voor dit onderdeel is 10 minuten.- Verdoof de operatieklare en geschoren rat met 3% -3,5% isofluraan gemengd met zuurstof in een inductiekamer en bepaal of de rat bewusteloos raakt door het gebrek aan reactie op voetknijpen.
- Plaats de neus van de rat in het neusstuk dat wordt geleverd met 2% -2,5% isofluraan om de anesthesie te behouden.
- Subcutaan injecteer (s.q.) meloxicam oplossing in een dosis van 2 mg/kg.
OPMERKING: Zorg ervoor dat u pijnstillers selecteert die geen interactie hebben met het geneesmiddel dat van belang is in de farmacokinetische studie. - Houd met behulp van plakband de onderarmen van de rat in hun ventrale positie aan elke kant van het chirurgische platform.
- Schrob het operatiegebied voorzichtig door af te wisselen tussen wattenbollen gedrenkt in 75% medische alcohol en scrub op basis van jodium gedurende een totaal van drie keer.
- Til de huid voorzichtig op bij het sleutelbeen aan de rechterkant van de middellijn van de nek met een tang en maak een incisie naar de borst met een lengte van ongeveer 1,5-2,0 cm met een chirurgische schaar.
- Onnauw de dunne weefselbedekking met een irisschaar om de onderliggende halsader bloot te leggen. Het proximale cefalische uiteinde van de uitwendige halsader bestaat uit twee takken, die visueel kunnen worden geïdentificeerd.
OPMERKING: Afhankelijk van de leeftijd en het geslacht van de rat varieert het zachte weefsel (bijv. Speekselklieren, lymfeklieren en vetweefsel) dat de halsader bedekt. In vergelijking met de jonge ratten zijn de oude ratten dikker (bijv. BW > 300 g) en hebben ze dus meer weefselscheiding nodig voordat de halsader zichtbaar is. - Til de halsader samen met zijn bindweefsels op om de lymfklier die aan de halsader is bevestigd te visualiseren. Scheid de ader langs de vasculaire richting zorgvuldig van de omliggende spieren, vetten en andere weefsels.
- Duw de tang onder de halsader zonder de collaterale bloedvaten te beschadigen en passeer twee stukjes 6-0 hechting onder de ader om de twee uiteinden van het bloedvat afzonderlijk te markeren.
- Trek een stuk van de hechting zo ver mogelijk naar de rattenkop en trek de ader met 2-3 knopen met een tang.
- Plaats de tweede ligatuur op het caudale uiteinde van de ader met 1 losse knoop.
- Jugulaire ader cannulatie
OPMERKING: De geschatte bedrijfstijd voor dit onderdeel is 15 minuten.- Open de verpakking met 11 cm polyurethaan (PU) katheter (I.D. 0,6 mm x O.D. 0,9 mm, figuur 1B) en bevestig de katheter aan de voorbereide stompe spuit gevuld met de heparine zoutoplossing.
- Duw de heparinized zoutoplossing langzaam in de katheter om luchtbellen te voorkomen.
- Duw de niet-puntige platte kant van de tang onder de halsader om aan de andere kant uit te komen. Maak een kleine v-vormige snede op de ader in de buurt van de schedelriem met een castroviejo microschaar en open de incisie voorzichtig met de punt van de elleboogvatverwijdertang.
OPMERKING: Spoel de incisie af met voorverwarmde normale zoutoplossing (37 °C) als er een kleine hoeveelheid bloed uit gutst. - Knip de schuine opening van de voorkant van de halsaderkatheter uit. Klem het schuine uiteinde van de buis vast met een tang en schuif deze in de halsader.
OPMERKING: Voor deze stap kan een andere persoon nodig zijn om het glijden van de katheter te vergemakkelijken. - Trek tijdens het vooruitgaan van de katheter langzaam de microchirurgische tang van de elleboog terug en klem het buitenoppervlak van het vat met een tang.
OPMERKING: Als het juiste bloedvat is geselecteerd en de punt van de katheter met succes in het bloedvat is geschoven, mag het hele inbrengproces van de katheter geen stroomweerstand voelen. - Stop met het inbrengen van de katheter bij het raken van de eerste blauwe markering van de PU-buis (figuur 1B), die ongeveer 3,0 cm lang is.
- Bevestig de ingebrachte katheter aan de ader met zowel caudale als rostrale ligaturen met behulp van een tang.
- Rijg een 6-0 hechting door het blootgestelde weefsel aan de rechterkant van de incisie met behulp van een hechtnaald (1/2 gebogen snijden, 12 mm) en bind de ligatuur met een hemostat.
- Buig de katheter bij de tweede blauwe markering (figuur 1B) om te binden met dezelfde ligatuur (in stap 3.3.8) en om te voorkomen dat de PU-slang wordt afgesloten.
- Knip alle extra hechtdraad door en sluit de katheter door de stompe spuit met punt te vervangen door een roestvrijstalen plug van 22 G.
- Verinnerlijking van katheters
OPMERKING: De geschatte bedrijfstijd voor dit onderdeel is 10 minuten.- Plaats de rat in de dorsale positie en maak het gebied tussen de scapulae voorzichtig schoon met het watje gedrenkt in 75% medische alcohol.
- Maak een zeer kleine incisie in het midden van de ruggenhals met een chirurgische schaar. Door de dorsale incisie, leid en duw de trochar voorzichtig onder de huid naar de ventrale incisie aan de rechterkant van de nek.
- Plaats de veneuze katheter in de trochar en trek de veneuze katheter vervolgens uit en leid deze naar de dorsale incisie.
- Bevestig de uitwendige katheter op dezelfde manier in de spierlaag als de hechting (zie de procedure in stap 3.3.8 en 3.3.9).
- Sluit de huidlaag van ventrale en dorsale incisies met de 6-0 nylon hechtdraad en hechtnaald (3/8 gebogen snijden, 17 mm). Veeg alle chirurgische incisies uit met jodofor.
OPMERKING: De wondclips zijn een alternatieve methode om de huidincisie te sluiten. - Verwijder de katheterplug door de katheter met de vingertoppen vast te klemmen. Plaats een nieuwe stompe spuit met punt en trek de spuit langzaam terug om de bloedstroom te testen.
OPMERKING: Omdat de rat zich in rugligging bevindt, kan het zijn dat men geen bloedmonsters kan verkrijgen. Bloedmonsters konden worden verkregen door over te schakelen naar een zijlichaamspositie. - Houd de katheter opnieuw vast met de vingertoppen en injecteer 0,2 ml gehepariniseerde zoutoplossing en 0,1 ml slotoplossing in de katheter met behulp van de stompe spuit met punt.
- Houd de katheter met de vingertoppen vast en vervang de spuit door een roestvrijstalen plug. Maak de katheter los en duw de plug iets naar binnen om de dichtheid van de katheter te garanderen.
4. Onmiddellijke postoperatieve zorg
- Herstel de rat in de dorsale decubituspositie door hem individueel te bedekken met vers maïskolfstrooisel. Zorg vaak voor een temperatuurgeregeld verwarmingskussen om de kerntemperatuur van het lichaam te handhaven.
OPMERKING: Voor het dierenwelzijn is het achterlaten van voedsel en water op het beddengoed een effectieve manier om de pijn te verlichten die wordt veroorzaakt door nekbewegingen tijdens het eten en drinken. - Noteer de eindtijd van de operatie en controleer de rat met intervallen van 2 uur gedurende ten minste 4 uur. Zorg voor extra analgesie voor het herstel als de rat tekenen van pijn of angst vertoont.
5. Fysiologische en hematologische controle tijdens de herstelfase
- Controleer dagelijks het lichaamsgewicht en de voedsel- en waterinname en noteer de gegevens.
- Om een klein volume vers bloed te verzamelen voor hematologische test, plaatst u de rat in een fixator. Open de plug en steek de spuit in de veneuze PU-katheter om ervoor te zorgen dat de katheter niet wordt belemmerd.
OPMERKING: De bloedafname werd dagelijks op hetzelfde tijdstip uitgevoerd gedurende 6 opeenvolgende dagen. - Gooi het initiële onttrokken bloed weg, dat een mengsel van bloed, hepariniseerde zoutoplossing en kathetervergrendelingsoplossing bevat.
- Gebruik een nieuwe spuit om 150 μL vers bloedmonster te verzamelen en breng het bloedmonster over naar de buiswand van 0,5 ml met K2EDTA (1,8 mg/ml bloed) die op de buiswand is gesproeidroogd.
OPMERKING: Als de katheter is geblokkeerd, kan 0,2 ml hepariniseerde zoutoplossing in de katheter worden geïnjecteerd om de katheter een paar minuten voor de volgende bloedafnametijd te spoelen. - Injecteer steriele zoutoplossing in hetzelfde volume om het onttrokken bloed te compenseren. Injecteer 150 μL voorverwarmde normale zoutoplossing (37 °C) en infundeer 0,2 ml steriele gehepariniseerde normale zoutoplossing door de katheter.
- Injecteer 100 μL van de slotoplossing in de katheter om de afdichting en steriliteit van de katheter te garanderen vóór de volgende monsterverzameling.
- Analyseer de bloedmonsters binnen 2 uur na verzameling met behulp van een geautomatiseerde bloedcelteller.
6. Herhaalde bloedafname voor farmacokinetische onderzoeken van oraal toegediend geneesmiddel
OPMERKING: Ratten met een gewichtstoename >10 g en een stabiel hematologisch niveau worden voorgesteld om te worden ingeschreven voor toekomstig onderzoek. Volgens het huidige protocol hadden de JVC-ratten 4 tot 6 dagen nodig om te herstellen.
- Na 4-6 dagen operatie, vast de rat gedurende 12 uur met vrije toegang tot water.
OPMERKING: Afhankelijk van het experimentele doel is het vasten van het dier optioneel. - Oraal gavage de nuchtere rat met natuurlijk fenol bioactief ellaginezuur in een dosis van 6 mg/kg met een rechte maagsonde naald16.
- Verzamel 200 μL bloedmonsters in de hepariniseerde buisjes via de halsadercanule op vooraf bepaalde tijdstippen gedurende 24 uur na orale toediening. Het bloedafnameproces volgt de procedure in stap 5.5.
OPMERKING: De katheter hoeft niet te worden gesloten met de slotoplossing totdat de bloedafname is voltooid. - Centrifugeer het bloedmonster onmiddellijk bij 3000 x g bij 4 °C gedurende 10 minuten.
- Analyseer het geëxtraheerde plasmamonster door vloeistofchromatografie-massaspectroscopie17,18.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Dit protocol heeft grondig aangetoond hoe een JVC-model voor de lange termijn kan worden opgezet met behulp van microchirurgische vaardigheden voor seriële bloedafname. Figuur 1A toont de essentiële chirurgische instrumenten en materialen die zijn gebruikt om de operatie uit te voeren. De specificatie van de PU-katheter met drie blauwe markeringen wordt ook geïllustreerd, wat nuttig is om de onderzoeker te begeleiden bij het plaatsen van de adercanule in stap 3.3., hoe de markeringen op de PU-katheter te gebruiken om de cannulatie te begeleiden (figuur 1B). Het is ook belangrijk om op de hoogte te zijn van de tijdlijn die nodig is om het JVC-rattenmodel vast te stellen (figuur 1C). Hoewel de bedrijfstijd voor de JVC ongeveer 35 minuten is, duurt het, als de onderzoeker bekwaam is, 10-14 dagen (de aanpassings- en herstelfase) voordat het JVC-rattenmodel klaar is voor gebruik, in vergelijking met de niet-chirurgische aanpak, zoals de staartknip of orbitale sinuspunctie, die onmiddellijk kan worden gebruikt met de juiste training.
De fysiologische en hematologische aandoeningen gedurende 6 dagen postoperatief werden ook onderzocht (figuur 2). De gewichtstoename van de rat, de voedsel- en waterinname en het volledige aantal bloedcellen waren variabel tijdens de herstelfase (figuur 2A,B). Het bleek dat de meerderheid van de ratten onder de huidige studieconditie binnen 4-6 dagen na de operatie herstelt, zoals blijkt uit herstelde niveaus van enkele belangrijke kenmerken, zoals gewichtstoename >10 g, regelmatige inname van het dieet en geselecteerde bloedcomponenten met betrekking tot infectie, uitdroging en ontsteking, waaronder het aantal witte bloedcellen, het aantal rode bloedcellen, hemoglobine en aantal bloedplaatjes (figuur 2C-F). Het is vermeldenswaard dat de hoeveelheid waterinname bij ratten relatief groot was op de eerste dag na de operatie, wat wijst op uitdroging.
De farmacokinetiek van het natuurlijke polyfenol, ellaginezuur werd bestudeerd in het vastgestelde JVC-rattenmodel (figuur 3). Het ellaginezuur wordt gekenmerkt door een slechte biologische beschikbaarheid van geneesmiddelen. Bij toediening in een lage dosis (bijv. 6 mg/kg) is een groot volume bloedmonster nodig om de concentratie in het plasma te detecteren. Figuur 3 toont een lage plasmaconcentratie van ellaginezuur in ng/ml gedurende 24 uur en de gevarieerde absorptie van het maag-darmkanaal (GIT) als gevolg van de slechte oplosbaarheid en permeabiliteit.
Figuur 1: Overzicht van de belangrijkste chirurgische instrumenten en benodigdheden die worden gebruikt voor de oprichting van JVC-rattenmodellen. (A) Boven: a-d is normale zoutoplossing, jodofor, plastic waren, spuitfles met respectievelijk 75% medische alcohol; Midden: e-o is 5,0 ml spuit, 1,0 ml spuit, stompe puntspuit, steriele canule, chirurgische schaar, irisschaar, half gebogen tang, vatverwijder gebalanceerde tang, castroviejo micro schaar, roestvrij stalen trochar, huisdier scheermes, respectievelijk; bodem: p-w is wattenstaafjes, 6-0 steriele niet-absorbeerbare nylon hechtdraad, wattenbollen, twee soorten hechtnaald, roestvrijstalen plug, gebogen hemostat, plakband, anesthetisch neusstuk, respectievelijk. (B) Specificatie van de PU-katheter die wordt gebruikt voor cannulatie van halsader bij ratten. De katheter is in totale lengte 11 mm met O.D 0,6 mm x I.D 0,9 mm. De katheter heeft drie blauwe markeringen om te dienen als ankerpunt tijdens de cannulatie; (C) Voorgestelde tijdlijn voor het vaststellen van het JVC-ratmodel. In deze studie werden het lichaamsgewicht van de rat, evenals de voedsel- en waterinname, dagelijks geregistreerd tijdens de herstelfase en werden eenmaal daags bloedmonsters verzameld voor routinematige hematologische monitoring. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Fysiologische en hematologische controle van ratten gedurende 6 dagen postoperatief. (A) Verandering van het lichaamsgewicht; (B) de verandering in water- en voedselinname; (C-F) Aantal witte bloedcellen, aantal rode bloedcellen, hemoglobine en aantal bloedplaatjes, respectievelijk. De gegevens vertegenwoordigen het gemiddelde ± SEM met n = 6. De numerieke waarden in blauw vertegenwoordigen de gemiddelde waarde. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Plasma ellaginezuur concentratie-tijd profielen van ratten meer dan 24 uur na orale maagsonde. De gegevens vertegenwoordigen het gemiddelde ± SEM met n = 3. De waarden van PK-parameters worden verkregen met behulp van het invoegtoepassingsprogramma PKSolver in een spreadsheetsoftware (bijv. Microsoft Excel)19. Cmax: piekconcentratie, Tmax: tijd om Cmax te bereiken; AUCinf: gebied onder de plasmaconcentratie-tijdcurve van tijd nul tot oneindig. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Het beheersen van de techniek van vaatkannulatie vereist veel oefening en het leren van de les van elke operatie. Christakis et al. met behulp van cumulatieve som (CUSUM) analyse, vonden dat een onderzoeker 200 ratten moet oefenen over een periode van een jaar voordat hij klaar is voor de PK-evaluatie van kandidaat-geneesmiddelen20. Toch kan de bedrijfstijd die nodig is voor de aderconnulatie aanzienlijk worden verminderd door het aantal uitgevoerde ratten 13,20. Met behulp van ons protocol steeg het slagingspercentage van het effectief cannuleren van de halsader en het verzamelen van het bloedmonster van ongeveer 50% tot meer dan 80% (het totale aantal uitgevoerde ratten was 15) en de initiële bedrijfstijd werd teruggebracht van 2 uur naar 35 minuten.
De demonstratie van het opzetten van een JVC-rattenmodel omvat verschillende kritieke stappen. Ten eerste is het incisiegebied rond de nek belangrijk voor het in eerste instantie lokaliseren van de halsader. Als de juiste JVC wordt uitgevoerd, wordt het incisiegebied over het algemeen geselecteerd aan de bovenzijde van het sleutelbeen langs de rechterkant van de middellijn van de nek (zie rubriek 3.2 halsaderisolatie). Ten tweede is JVC afhankelijk van de bereiding van een schoon segment van de ader. Bij stompe dissectie van zacht weefsel is de halsader zichtbaar en geïdentificeerd door deze twee kenmerken: 1) twee takken aan het proximale uiteinde en 2) een lymfeklier eraan vast. Ten derde, tijdens het schuiven van de katheter in de halsader (zie rubriek 3.3 jugulaire ader cannulatie), zou het trimmen van de voorkant van de katheter en het ondersteunen van het bloedvat met gestage externe kracht het succespercentage van cannulatie aanzienlijk kunnen verbeteren. Bovendien moeten de juiste analgesie en warmte worden verstrekt om de rat te troosten, omdat stress en pijn veranderingen in het gedrag van dieren kunnen veroorzaken die hun postoperatieve herstel kunnen beïnvloeden. Ten slotte kunnen de duur van anesthesie, warmteverlies en de complicatie onverwachte rattendood veroorzaken; het is dus belangrijk om de ratten tijdens en na de operatie gedurende ten minste 3 dagen nauwlettend te volgen. Evaluatie van meerdere gezondheidsindicatoren, zoals de gewichtstoename, dieet en drinkstatus, en hematologische componenten van ratten tijdens de herstelperiode, kan informatie opleveren die kan worden vergeleken met referentiewaarden van belang van gezonde SD-ratten in de database 21,22,23,24 . Als ratten uitdroging ervaren, kunnen steriele isotone vloeistoffen met 3% -5% van het lichaamsgewicht aan het einde van de operatie subcutaan worden geïnjecteerd om het vochtverlies te compenseren. De meeste ratten krijgen hun lichaamsgewicht (bijv. >10 g) op dag 3 na de operatie en moeten dus klaar zijn voor gebruik. Toch wordt het voor studies met evaluatie van bloedbiomarkers (bijv. Leukocyten, cytokines) aanbevolen om de ratten op dag 4-6 na de operatie in te schrijven, om de normale hematologische indexen voor ratten te garanderen.
Ondanks het nut ervan in pk-onderzoek, afhankelijk van de kathetermaterialen, zijn niet alle kandidaat-geneesmiddelen geschikt voor de enkele cannulatie. Gaud et al. vonden dat hoge log P-verbindingen gebonden waren aan het PE-kathetermateriaal, wat resulteerde in veranderde PK25. Bovendien worden de pijnstillers (bijv. Meloxicam) vaak toegepast om de pijn bij ratten na de operatie te verminderen. Aangezien de eliminatiehalfwaardetijd van meloxicam ongeveer 19-23 h26,27 is, is de enkele dosis meloxicam (2 mg / kg) geïnjecteerd s.q. na 24 uur bijna uit het lichaam verdwenen. Toch kunnen potentiële geneesmiddel-geneesmiddelinteracties optreden bij gebruik van meloxicam. Meloxicam kan bijvoorbeeld concurreren met andere geneesmiddelen voor CytochroomP450-metabolisme 28,29. Daarom moeten de dosis en het type analgetica dat is geselecteerd, worden gescreend afhankelijk van het geneesmiddel dat is gekozen voor het farmacokinetische onderzoek. Als het geneesmiddel van belang interageert met meloxicam, kunnen andere pijnstillers (bijv. Buprenorfine) worden gebruikt.
Kortom, dit protocol heeft grondig aangetoond hoe een JVC-rattenmodel op lange termijn kan worden opgezet voor bloedafname in de laboratoriumomgeving en om de fysiologische status van ratten tijdens de postoperatieve herstelfase te onderzoeken. De gemarkeerde vitale chirurgische stappen en ervaringen kunnen nuttig zijn voor de onderzoeker om de toepassing van het cannulatiemodel efficiënt te bereiken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit werk wordt ondersteund door de National Natural Science Foundation of China (nr. 82003692) aan R.X. Zhang; Top Academische Beurs aan de Northwestern Polytechnical University naar R. Miao.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.5 mL test tube containing EDTA anticoagulant | Xinkang | N/A | collecting blood samples for hematology test |
| 0.5*20 mm 1.0-mL syringe | KLMEDICAL | N/A | washing or replacing the fluid with saline |
| 0.6*28.5 mm 5.0-mL syringe | HD | N/A | Subcutaneous injection |
| 1.0-mL Blunt tipped syringe (22G) | skillsmodel | S4-PKT22G | Inject the saline and collect blood samples through catheter |
| 1.5 mL sterile microcentrifuge tube | Axygen | MCT-150-C-S | Store sterile catheter lock solution heparinized saline and meloxicam solution |
| 1.5 mL microcentrifuge tubes | Biosharp | BS-15-M | blood collection |
| 1/2 circle cutting 5*12 mm suture needle | skillsmodel | S4-FHZ | Thread the muscle layer to fix the catheter |
| 3/8 circle cutting 7*17 mm suture needle | skillsmodel | S5-FHZ | Suture the incision of rat cortex |
| 6-0 sterile non-absorbable silk suture thread | JUNSHENG | N/A | ligature |
| 75% medical alcohol | HONGSONG | N/A | Disinfection |
| Adhensive tape | LIUTAI | N/A | positioning the rat |
| Autoclave sterilization tape | Biosharp | BS-QT-028 | Mark sterilized items |
| Automated blood cell counter | Sysmex | XN-550 | Hematology test |
| Castroviejo micro scissors | skillsmodel | WA1010 | Cut the opening in the blood vessel |
| Centrifuge | Thermo Fisher Scientific | 75002402 | Plasma preparation |
| Clean cushion | Qingjie | N/A | Prepare the operation area |
| Cotton balls | HC | N/A | Wound disinfection and sterilization |
| Cotton swabs | BEITAGOGO | N/A | Disinfection |
| Curved hemostat | skillsmodel | N/A | ligature |
| DN50 Stainless-steel rat restrainer | skillsmodel | S4-RGDQ1 | Restrict the movement of rats for easy operation |
| Ellagic acid | Aladdin | E102710-25g | natural phenol for oral administration |
| Half-curved forceps | skillsmodel | 53072 | Lift the muscle layer and tissue, isolate the jugular vein and tie the suture |
| Heating pad | Warm mate | N/A | preventing heat loss of animal |
| Heparin sodium | Solarbio | H8060 | anticoagulant |
| Iodophor | Xidebao | N/A | Clean the wound |
| Iris scissors | skillsmodel | 54002 | Bluent separation the muscle layer |
| Isoflurane | RWD | R510-22-16 | anaesthesia |
| LED lamp | EMPERORFEEL | N/A | sugery |
| Liquid chromatography-mass spectroscopy | Thermo Fisher Scientific | VQF01-20001/ TSQ02-10002 | detection of drug concentration in plasma |
| Meloxicam | Hongqiang | N/A | Analgesic |
| Normal saline | KL | N/A | Prepara the solution and protect blood vessels from drying out |
| Pet razor | Codos | 3180 | Shaving the fur |
| Phosphate-buffered saline | ZHHC | PW012 | Preparation of Ellagic acid solution |
| PU catheter | skillsmodel | RJVC-PU | Jugular vein cannulation |
| Small animal operation anesthesia console | RWD | 68620 | Operation workstation |
| Spray bottle | Other | N/A | aseptic workstation |
| Stainless steel plug (22G) | skillsmodel | S4-PKD22G | Plug the catheter to ensure its sealing |
| Stainless steel trochar | skillsmodel | S$-PKDGZ | Guide the catheter exteriorization |
| Sterile lock solution | skillsmodel | SK-FB | lock the catheter to ensure its sterility |
| Straight feeding needle | skillsmodel | N/A | Oral gavage |
| Surgical pouch | BKMAM | N/A | container for sterilization of surgical instruments |
| Surgical scissors | skillsmodel | J21070 | Cut incision on rat skin |
| Vessel dilator balanced forceps | skillsmodel | WA3020 | Expand the blood vessel and guide the cannula to slide in |
| ZS-MV Small animal anesthesia machine | ZSLab | 1057003 | inducing and maintaining anaesthesia |
References
- Parasuraman, S., Raveendran, R., Kesavan, R. Blood sample collection in small laboratory animals. Journal of Pharmacology and Pharmacotherapeutics. 1 (2), 87-93 (2010).
- Sadler, A. M., Bailey, S. J. Validation of a refined technique for taking repeated blood samples from juvenile and adult mice. Laboratory Animals. 47 (4), 316-319 (2013).
- Zhang, R. X., et al. Coordinating biointeraction and bioreaction of a nanocarrier material and an anticancer drug to overcome membrane rigidity and target mitochondria in multidrug-resistant cancer cells. Advanced Functional Materials. 27 (39), 12 (2017).
- Zhang, R. X., et al. Polymer-lipid hybrid nanoparticles synchronize pharmacokinetics of co-encapsulated doxorubicin-mitomycin C and enable their spatiotemporal co-delivery and local bioavailability in breast tumor. Nanomedicine-Nanotechnology Biology and Medicine. 12 (5), 1279-1290 (2016).
- Zhang, R. X., et al. Sample extraction and simultaneous chromatographic quantitation of doxorubicin and mitomycin C following drug combination delivery in nanoparticles to tumor-bearing mice. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (128), e11 (2017).
- Bakar, S. K., Niazi, S. Simple reliable method for chronic cannulation of the jugular vein for pharmacokinetic studies in rats. Journal of Pharmaceutical Sciences. 72 (9), 1027-1029 (1983).
- Harms, P. G., Ojeda, S. R. A rapid and simple procedure for chronic cannulation of the rat jugular vein. Journal of Applied Physiology. 36 (3), 391-392 (1974).
- Thrivikraman, K. V., Huot, R. L., Plotsky, P. M. Jugular vein catheterization for repeated blood sampling in the unrestrained conscious rat. Brain Research Protocols. 10 (2), 84-94 (2002).
- Weeks, J. R., Davis, J. D. Chronic intravenous cannulas for rats. Journal of Applied Physiology. 19 (3), 540-541 (1964).
- Goldkuhl, R., et al. Plasma concentrations of corticosterone and buprenorphine in rats subjected to jugular vein catheterization. Laboratory Animals. 44 (4), 337-343 (2010).
- Steffens, A. B. A method for frequent sampling of blood and continuous infusion of fluids in the rat without disturbing the animal. Physiology & Behavior. 4 (5), 833-836 (1969).
- Terao, N., Shen, D. D. Alterations in serum protein binding and pharmacokinetics of l-propranolol in the rat elicited by the presence of an indwelling venous catheter. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 227 (2), 369-375 (1983).
- Feng, J., et al. Catheterization of the carotid artery and jugular vein to perform hemodynamic measures, infusions and blood sampling in a conscious rat model. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (95), e51881 (2015).
- Karim, N., Ali, S. Jugular vein cannulation in rats - A mini review. Canadian Journal of Pure and Applied Sciences. 3, 929-935 (2009).
- Ling, S., Jamali, F. Effect of cannulation surgery and restraint stress on the plasma corticosterone concentration in the rat: application of an improved corticosterone HPLC assay. Journal of Pharmacy & Pharmaceutical Sciences. 6 (2), (2003).
- Lei, F., et al. Pharmacokinetic study of ellagic acid in rat after oral administration of pomegranate leaf extract. Journal of Chromatography B-Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences. 796 (1), 189-194 (2003).
- Yan, L. L., et al. Method development and validation for pharmacokinetic and tissue distributions of ellagic acid using Ultrahigh Performance Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry (UPLC-MS/MS). Molecules. 19 (11), 18923-18935 (2014).
- Long, J. F., et al. Bioavailability and bioactivity of free ellagic acid compared to pomegranate juice. Food & Function. 10 (10), 6582-6588 (2019).
- Zhang, Y., et al. PKSolver: An add-in program for pharmacokinetic and pharmacodynamic data analysis in Microsoft Excel. Computer Methods and Programs in Biomedicine. 99 (3), 306-314 (2010).
- Christakis, I., et al. Learning curve of vessel cannulation in rats using cumulative sum analysis. Journal of Surgical Research. 193 (1), 69-76 (2015).
- Nm, S., Oduola, A. Haematological profile shows that Inbred Sprague Dawley rats have exceptional promise for use in biomedical and pharmacological studies. Asian Journal of Biomedical and Pharmaceutical Sciences. 4 (37), 33-37 (2014).
- Lillie, L. E., Temple, N. J., Florence, L. Z. Reference values for young normal Sprague-Dawley rats: weight gain, hematology and clinical chemistry. Human & Experimental Toxicology. 15 (8), 612-616 (1996).
- He, Q. L., et al. Sex-specific reference intervals of hematologic and biochemical analytes in Sprague-Dawley rats using the nonparametric rank percentile method. PLoS One. 12 (12), 18 (2017).
- EPA. Recommendations for and Documentation of Biological Values for Use in Risk Assessment. U.S. Environmental Protection Agency. , EPA/600/6-87/008 (NTIS PB88179874) (1988).
- Gaud, N., et al. Single jugular vein cannulated rats may not be suitable for intravenous pharmacokinetic screening of high logP compounds. European Journal of Pharmaceutical Sciences. 99, 272-278 (2017).
- Turck, D., et al.
- Aghazadeh-Habashi, A., Jamali, F. Pharmacokinetics of meloxicam administered as regular and fast dissolving formulations to the rat: Influence of gastrointestinal dysfunction on the relative bioavailability of two formulations. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 70 (3), 889-894 (2008).
- Ludwig, E., et al. Activation of human cytochrome P-450 3A4-catalyzed meloxicam 5 '-methylhydroxylation by quinidine and hydroquinidine in vitro. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 290 (1), 1-8 (1999).
- Zhang, R. X., et al. Nanoparticulate drug delivery strategies to address intestinal cytochrome P450 CYP3A4 metabolism towards personalized medicine. Pharmaceutics. 13 (8), (2021).
