Summary
O presente protocolo descreve o controle totalmente óptico e a observação da atividade celular desencadeada em cardiomiócitos derivados de iPSC (iPSC-CMs) para triagem de drogas de alto rendimento e testes de toxicidade. A quantificação multiparamétrica de padrões fenotípicos no tempo e no espaço é mostrada. Efeitos a longo prazo de drogas ao longo de horas, ou medições sequenciais ao longo dos dias, são demonstrados.
Abstract
Entender como as células excitáveis funcionam na saúde e na doença e como esse comportamento pode ser alterado por pequenas moléculas ou manipulação genética é importante. Indicadores de cálcio geneticamente codificados (GECIs) com múltiplas janelas de emissão podem ser combinados (por exemplo, para observação simultânea de eventos subcelulares distintos) ou usados em aplicações estendidas com outros atuadores dependentes de luz em células excitáveis (por exemplo, combinando controle optogenético geneticamente codificado com indicadores de cálcio espectralmente compatíveis). Tais abordagens têm sido usadas em neurônios primários ou derivados de células-tronco, cardiomiócitos e células beta pancreáticas. No entanto, tem sido um desafio aumentar o rendimento, ou a duração da observação, de tais abordagens devido a limitações dos instrumentos, software de análise, desempenho do indicador e eficiência de entrega de genes. Aqui, um GECI verde de alto desempenho, mNeonGreen-GECO (mNG-GECO) e GECI, K-GECO deslocado para o vermelho, é combinado com o controle optogenético para alcançar o controle óptico e a visualização da atividade celular em um formato de imagem de alto rendimento usando um Sistema de Imagem de Alto Conteúdo. Aplicações demonstrando testes de cardiotoxicidade e triagem fenotípica de drogas com CMiPS saudáveis e derivadas do paciente são mostradas. Além disso, avaliações multiparamétricas usando combinações de variantes espectrais e indicadoras de afinidade de cálcio (NIR-GECO, LAR-GECO e mtGCEPIA ou Orai1-G-GECO) também são restritas a diferentes compartimentos celulares também são demonstradas no modelo iPSC-CM.
Introduction
Os modelos derivados de células-tronco pluripotentes induzidas por humanos (iPSC) são considerados uma solução promissora para os objetivos dos 3Rs (Substituição, Redução e Refinamento) estabelecidos para estudos em animais 1,2. Os cardiomiócitos derivados de iPSC têm sido utilizados para modelagem de doenças e descoberta de medicamentos, pois recapitulam aspectos essenciais da biologia humana3. A imagem de cálcio, tipicamente com corantes químicos, tem sido utilizada para observar a atividade celular antes e após o tratamentomedicamentoso 4,5. No entanto, sondas químicas sensíveis ao cálcio à base de corantes inibem diretamente a Na, a K-ATPase e interrompem a função celular6. Assim, rastrear as mesmas células ao longo de horas ou dias tem sido problemático quando corantes químicos são usados. Aqui, uma variedade de indicadores de cálcio (GECIs) geneticamente codificados7,8,9,10 são utilizados em um amplo espectro de excitação/emissão e afinidade de cálcio para formar uma plataforma de teste de toxicidade cardíaca que oferece medições de multiorganelas em tempo real por longos períodos de tempo 11.
Para desenvolver ainda mais o conceito de triagem à base de cálcio de alto rendimento no modelo iPSC-CM além do contexto acadêmico previamente demonstrado usando ferramentas geneticamente codificadas para controle óptico e imagem de cálcio pela co-expressão de um indicador de cálcio deslocado para o vermelho, R-GECO ou K-GECO com uma ferramenta optogenética, ChR2 12,13, kits virais prontos para uso foram gerados. Ao fazer a transição da imagem para um instrumento de alto conteúdo equipado com um sistema auto-microfluídico, a pipetagem de canal único da adição de compostos é colocada em camadas sobre a imagem de células vivas. Finalmente, ambos os aspectos cruciais da via experimental, processamento de imagem e análise são melhorados e automatizados.
Protocol
Cardiomiócitos derivados de iPSC (iPSC-CM) de cardiomiócitos derivados de iPSC do ventrículo esquerdo (ICPC-CM) foram fornecidos pelo Hospital Universitário Nacional de Taiwan. A coleta de amostras de pacientes para reprogramação para iPSC e os protocolos de manutenção14 para fins de pesquisa seguiram a Declaração da WMA de Helsinque (princípios éticos para pesquisa médica envolvendo seres humanos) e foram aprovados pelo Conselho de Revisão Institucional: Escritório do Comitê de Ética em Pesquisa da NTUH (#201612099RINC). Outros iPSC-CM's foram obtidos de fornecedores comerciais. O uso de derivados iPSC não requer permissões específicas em nossa instituição.
1. Preparação de cardiomiócitos derivados de iPSC
- Prepare a placa de vários poços antes que o iPSC-CM seja removido do armazenamento a frio para descongelamento. Revestir cada poço da microplaca de 96 poços com 100 μL de 50 μg/mL de fibronectina/solução de gelatina a 0,2% (ver Tabela de Materiais) para cobrir todas as superfícies completamente.
- Incubar a placa a 37 °C durante 1 h numa incubadora humidificada.
- Aqueça o meio (ver Tabela de Materiais) à temperatura ambiente durante 30 minutos antes do descongelamento celular.
NOTA: O presente protocolo descreve a temperatura ambiente como 25 °C. - Transferir o iPSC-CM do tanque de armazenamento de nitrogênio líquido para um banho de água de 37 °C.
NOTA: Os iPS-CMs são normalmente enviados em gelo seco por fontes acadêmicas ou comerciais. Eles são transferidos para o armazenamento de nitrogênio líquido no recebimento até o uso. - Retire o frasco para injetáveis antes de o gelo derreter completamente e pulverize o frasco para injetáveis com etanol a 75%.
- Leve o frasco para injetáveis a um armário de biossegurança de Classe II e transfira suavemente o conteúdo para um novo tubo cónico de 15 ml contendo 9 ml de meio à temperatura ambiente.
- Centrifugar as células a 200 x g durante 3 min à temperatura ambiente.
- Rejeitar o sobrenadante por pipeta e ressuspender suavemente as células em 1 ml de meio com 10 μM de inibidor de ROCK (Y27632) (ver Tabela de Materiais).
NOTA: Evite pipetagem repetida de células descongeladas para garantir a máxima recuperação celular. - Retire a solução de revestimento do poço e adicione 50 μL de meio com 10 μM de inibidor de ROCK rapidamente.
- Confirmar o número de células viáveis utilizando o método de exclusão do azul de tripano com hemocitômetro15.
- Células de placa em placa revestida de 96 poços a uma densidade de 100.000-150.000 células/cm2, de acordo com as instruções do fabricante16.
- Após 24 h, certifique-se de que as células ligadas à superfície da placa estão em contacto com outras células.
NOTA: Células individuais sobrevivem mal em cultura de longo prazo e normalmente se comportam de forma mais variável. - Substitua o meio de manutenção pré-aquecido a cada 2 dias.
NOTA: Para o tratamento medicamentoso a longo prazo, o NCVE iPSC-CM foi trocado com substituições de meio meio com, ou sem, drogas de moléculas pequenas a cada 2 dias.
2. Expressão de indicadores de cálcio geneticamente codificados
- Depois de revestir as células por 72 h, descongele os kits virais GECIs (ver Tabela de Materiais) no gelo.
- Prepare uma solução de estoque de kit viral 2x com o meio de manutenção.
- Prepare as células para a infecção ajustando o volume médio para 100 μL por poço. Adicionar 100 μL da solução viral pré-misturada e incubar durante 8-16 h a 37 °C.
- Substitua por um meio pré-aquecido de 200 μL após a incubação.
- Visualize a expressão dos GECIs 24 h após a transdução usando um sistema de imagem (ver Tabela de Materiais).
NOTA: O nível de expressão atinge o máximo em 48-72 h pós-transdução. As células podem ser fotografadas a partir do ponto de tempo de 24 horas. No entanto, os sinais obtidos a partir de GECIs se sustentam por mais de um mês. - Mantenha as células na incubadora umidificada antes que os ensaios funcionais sejam realizados.
- Infectar os CMi iPSC (CMi derivados de pacientes com NCVE) com o kit viral ChR2-K-GECO (ver Tabela de Materiais) no dia 25 após a diferenciação usando o protocolo de infecção (etapa 2.1-2.6).
3. Imagem de cálcio à base de corante usando Fluo-4
- Dissolver o pó de Fluo-4 (ver Tabela de Materiais) em DMSO como solução-mãe (5 mM).
- Diluir a solução-mãe até uma concentração de 10 μM de Fluo-4 no tampão de Tyrode.
NOTA: O tampão da Tyrode consiste em 1,0 g/L de bicarbonato de sódio, 0,2 g/L de cloreto de cálcio, 0,1 g/L de cloreto de magnésio, 0,2 g/L de cloreto de potássio, 8,0 g/L de cloreto de sódio, 0,05 g/L de fosfato de sódio monobásico e 1,0 g/L de D-glicose. - Substitua metade do meio por 10 μM de solução de Fluo-4 (dando uma concentração final de 5 μM).
- Incubar as células a 37 °C durante 30 minutos.
- Lave as células com o tampão de Tyrode pré-aquecido e substitua-as pelo meio antes da aquisição da imagem.
- Comece a gravar com o protocolo de aquisição de fluxo.
NOTA: A aquisição de fluxo é a aquisição contínua de imagens sem intervalo de tempo. A frequência de batimento do iPSC-CM é de cerca de 1 Hz, e esse protocolo de aquisição de fluxo é usado para coletar padrões de batimento.
4. Aquisição de imagens e ensaios funcionais para ensaio de toxicidade e rastreio fenotípico
- Ligue todos os dispositivos do High-Content Imaging System (consulte Tabela de materiais).
- Verifique se a temperatura da câmara atinge 37 °C, com suplementação de CO2 a 5%. Mantenha o sistema em equilíbrio por 2 h antes da aquisição da imagem.
NOTA: A deriva térmica é um problema significativo para observações de células vivas a longo prazo, 1 °C pode alterar o plano focal em ~1 μm, portanto, permitir que a lente e o estágio atinjam a temperatura alvo é essencial antes da aquisição da imagem. - Abra o software de imagem (consulte Tabela de materiais) e escolha a configuração da placa para uma placa de 96 poços.
- Coloque uma placa de 96 poços sem tampa na câmara e carregue com o anel de vedação de célula viva na parte superior.
NOTA: O anel de vedação de células vivas é um adaptador para alcançar o equilíbrio ambiental. - Escolha a lente objetiva de imersão em água 20x (Figura 1 e Figura 2), 60x (Figura 3 e Figura 4) e 20x (Figura 5) de acordo com a resolução espacial necessária.
- Ajuste o foco para tirar imagens claras antes da aquisição experimental.
- Selecione 3-5 regiões aleatoriamente por poço para o registro da atividade do cálcio.
NOTA: Cada região deve incluir pelo menos 20 células (n ≥ 20). - Escolha filtros apropriados para diferentes indicadores. FITC 475/536 para mNG-GECO, mtGCEPIA3 e Oria1-G-GECO; Cy5 631/692 para NIR-GECO2; ER 530/593 para ER-LAR-GECO; Texas Red 560/624 para K-GECO.
- Defina a alimentação apropriada do diodo emissor de luz (LED) para cada canal de imagem usado.
NOTA: Ao otimizar a potência do LED para aquisição de imagens por sinal (intensidade detectada do objeto) para a relação ruído (intensidade detectada do fundo), a relação S/N deve ser maior que 2. Neste protocolo, 10% de potência LED para TRITC e FITC; 20% para Cy5 foi típico. - Ajuste o tempo de exposição da câmera para um máximo de 40 ms (25 Hz) e uma duração de registro de 30 sfor stream acquisition para observar os transientes de cálcio relatados pelas sondas mNG-GECO e K-GECO expressas em cardiomiócitos (Figura 1-3 e Figura 5). Aumente a potência do LED se o sinal/ruído for <2 a taxas de quadros mais altas.
- Para estimulação optogenética (Figura 2 e Figura 3C,D), otimize a potência (tipicamente 5%-10%) e a frequência da luz azul a 1 Hz.
NOTA: Geralmente, o iPSC-CM humano bate espontaneamente em torno de ~ 1 Hz, e o operador precisa acelerar mais rápido do que a taxa espontânea. - Se forem planeadas medições sequenciais (Figura 3) ou prolongadas (Figura 4), evitar a todo o custo a fototoxicidade. Isso pode significar reduzir a intensidade da potência de iluminação e compensar isso aumentando o tempo de exposição da câmera, por exemplo, para 100 ms com o protocolo time-lapse usado para observação em tempo real de três canais de sinais subcelulares Ca2+ (Figura 4).
- Use o protocolo de dosagem assíncrona para adição de cafeína de 10 mM através do sistema automicrofluídico (consulte a Tabela de Materiais) (Figura 4).
NOTA: O protocolo de dosagem assíncrona permite que a aquisição de imagens ocorra enquanto drogas como a cafeína são adicionadas, sem intervalos entre as imagens. - Iniciar aquisição.
5. Preparação de moléculas pequenas
- Ressuspeite o E4031, dofetilida e verapamil em DMSO e dilua-os com o tampão de Tyrode. A concentração final de DMSO no meio foi de 0,1% (v/v).
- Preparar as soluções compostas ao dobro (ou seja, 2x) da concentração de trabalho desejada e equilibrar-se a 37 °C antes da adição.
NOTA: Minimizar as flutuações de temperatura após a adição do meio é vital, pois a contratilidade depende da temperatura e o efeito da mudança de temperatura é rápido. - Organize bem os compostos para o alvo correspondente.
- Adicionar 100 μL dos compostos de dupla resistência (2x) através do sistema automicrofluídico (ver Tabela de Materiais) nos poços e iniciar a aquisição após o período de incubação desejado (normalmente 15 min).
6. Processamento e análise de imagens
- Isole a área do sinal do plano de fundo detectando o recurso do pulso ao longo do tempo-revolução automaticamente com o software.
- Use o software de análise de pico de cálcio (consulte Tabela de materiais) para analisar a frequência de batimento (BPM), o sinal de pico (amplitude), a duração transitória de cálcio de 50% (CTD50), a duração transitória de cálcio de 90% (CTD90), o tempo de subida e o tempo de decaimento (Figura 1C).
NOTA: Nessas configurações, o fotobranqueamento foi aparente nos primeiros 10 s, e os sinais são estabilizados depois disso. Assim, o pico de cálcio foi analisado de 11 a 30 s. Em gravações de três canais (Figura 4), o contorno celular é bordado manualmente para medir a mudança de intensidade.
Representative Results
A observação da oscilação espontânea do cálcio no mNG-GECO10 expressa por cardiomiócitos derivados de iPSC (iPSC-CMs) com ou sem tratamentos medicamentosos é demonstrada na Figura 1 e no Vídeo Animado 1. Traços cinéticos obtidos usando mNG-GECO mostram que pequenos inibidores de canais iônicos moleculares, verapamil, dofetilida e E4031, afetaram os transientes de cálcio (Figura 1B) como esperado. O transiente de cálcio típico mostrado na Figura 1C pode ser analisado pelo software de análise de pico de cálcio para derivar sinal de pico (amplitude), duração transitória de cálcio 50% (CTD50), duração transitória de cálcio 90% (CTD90), tempo de ascensão e tempo de decaimento. O verapamil, um bloqueador de cálcio do tipo L17, inibe completamente o influxo de cálcio nas células, conforme esperado (Figura 1B). Dofetilida e E4031 são inibidores do canal hERG18,19,20, listados como drogas antiarrítmicas experimentais classe III. O tempo de decaimento é prolongado com o tratamento com Dofetilida (p < 0,05) e E4031 (p < 0,001) quando comparado com o grupo veículo. O prolongamento da CTD50 (p < 0,01) e CTD90 (p < 0,001) com o tratamento com E4031 foi observado em comparação com o veículo apenas (Tabela 1), estes resultados são consistentes com os efeitos relatados no intervalo QT, uma medida clinicamente relevante de repolarização determinada a partir do eletrocardiograma de superfície de um longo tempo entre o início da onda Q e o final da onda T, em estudos anteriores 12,21.
Uma dificuldade da avaliação da DTC em células que batem espontaneamente é a variabilidade que a taxa de batimento impõe à CTD. Este é um problema particular para o modelo iPSC-CM, onde cada poço de uma placa de 96 poços pode ter sua própria taxa de batida, mesmo que todas as células venham do mesmo frasco pai. É possível impor uma taxa de batida por estimulação óptica ou elétrica. Para avaliar a dose-resposta de E4031 em condições padronizadas, ChR2 e K-GECO7 expressando iPSC-CMs foram controlados eletronicamente usando pulsos de luz de 1 Hz 470 nm e observados usando o sinal vermelho K-GECO (Figura 2A e Figura Suplementar 1). Reduções progressivas da amplitude de pico (p < 0,01) e aumento do tempo de decaimento (p < 0,05) dos transientes de cálcio ocorrem com o aumento das concentrações de E4031 (Figura 2B1). Um efeito dose-dependente de E4031 foi mais aparente para as reduções na amplitude de pico (Figura 2B1,B2).
Embora estudos de curto prazo com duração de minutos sejam tipicamente usados para avaliações de cardiotoxicidade, há um ponto cego para avaliações de toxicidade crônica que acompanham as exposições dos pacientes a medicamentos ao longo de semanas, meses ou anos. Seria vantajoso estudar os efeitos da doença, ou toxicidade, ao longo dos intervalos que reflectem as durações do tratamento relevantes para a prática clínica. Utilizamos nosso sistema de controle e detecção totalmente óptico para estudar os cardiomiócitos derivados de iPSC de um paciente com não-compactação ventricular esquerda (NCVE). Os CMiPSC foram transduzidos com um kit viral K-GECO (etapa 2.2-2.6) após a diferenciação Dia 25. O sinal K-GECO foi então rastreado a cada 1-2 semanas nos mesmos poços, com ou sem tratamentos medicamentosos adicionais. Tanto a atividade espontânea do cálcio (Figura 3A,3B) quanto a dinâmica do cálcio sob estimulação óptica (Figura 3C,D, etapa 4.11) foram obtidas por meio do Sistema de Imagem de Alto Conteúdo (etapa 4.1-4.12) e processadas por software de análise de pico de cálcio (etapa 6). Conforme demonstrado na Figura 3A,C, os transientes claros de cálcio permanecem visíveis um mês após a transdução viral, com ou sem a luz adicional usada para estimulação óptica. Este trabalho identificou um fármaco que parece aumentar a taxa de batimento, regularizar o intervalo de contração e aumentar a amplitude transitória de cálcio no modelo iPSC-CM da NCVE (Figura 3A,B). Há duas observações importantes a fazer a partir desses dados. Em primeiro lugar, do ponto de vista terapêutico, o efeito da droga parece duradouro nos pontos de tempo do Dia 63 e do Dia 70. Em segundo lugar, e de relevância para um campo que, em geral, avalia efeitos compostos durante breves janelas (<1 min) em momentos anteriores (normalmente <50 dias); os efeitos modificadores do fenótipo da doença do composto só são aparentes após o Dia 60, sugerindo que pode ser fácil descartar drogas que têm mecanismos lentos de ação nos protocolos de triagem padrão.
A variabilidade da frequência de batimentos e o impacto subsequente na duração transitória do cálcio não são apenas um problema do poço ao bem em qualquer ponto de tempo. Também muda à medida que as iPSC-CM são mantidas em cultura, o que varia dentro de um poço ao longo do tempo (Figura 3B). Para impor consistência dentro de experimentos sequenciais, a estimulação óptica de 1 Hz pode ser aplicada com ou sem tratamento medicamentoso (Figura 3C,D). Aqui, embora os resultados do Dia 63 mostrem as tendências encorajadoras no transiente de cálcio com uma amplitude significativamente maior, CTD90 mais curto e menor tempo de decaimento; até ao período de tempo de 70 dias - e indicativo da necessidade de avaliações crónicas durante o processo de rastreio de medicamentos para doenças raras - logo após a deteção de despolarizações (EAD). O valor da adição de um protocolo de estimulação à fenotipagem da doença, ou avaliação de pequenas moléculas, pode ser avaliado qualitativamente pela comparação dos resultados apresentados na Figura 3B,D para taxa de batimento, amplitude transitória de cálcio, CTD90 e tempo de decaimento.
Uma vantagem de um GECI, em comparação com a metodologia baseada em corante químico, para visualizar o transiente de cálcio é a capacidade de restringir a sonda a um compartimento específico dentro de uma célula. Isso pode ser expandido ainda mais pela multiplexação de múltiplas variantes de cor e/ou afinidade em células únicas. Assim, vários GECIs, incluindo ER-LAR-GECO9, mtGCEPIA22,23 (ou Oria1-G-GECO) e NIR-GECO28,24, foram desenvolvidos para expressão isolada, ou em combinação, em modelos celulares para medição da atividade de cálcio em tempo real que surge no retículo endoplasmático / retículo sarcoplasmático (ER / SR), mitocôndrias (ou canal CRAC) e citosol, respectivamente. Eles podem ser combinados no modelo iPSC-CM (Figura 4A,C) para estudar a interação entre diferentes reservas intracelulares de cálcio. Por exemplo, o tratamento com cafeína de 10 mM pode ser usado para esvaziar o estoque de cálcio SR. Aqui, uma diminuição do sinal ER-LAR-GECO (indicativo de perda de cálcio do SR) foi paralela a um declínio do sinal NIR-GECO (indicativo de um aumento na concentração de cálcio citosólico) como esperado. Como outros compartimentos intracelulares são afetados por essas flutuações não é bem estudado. Ainda assim, a inclusão de um mtGCEPIA3 verde direcionado às mitocôndrias mostra que a captação de cálcio ocorre nas mitocôndrias nessas condições (Figura 4A,B).
Da mesma forma, a visualização da interação entre diferentes correntes de cálcio pode ser vista pela inclusão de uma sonda, Orai1-G-GECO25, para revelar a corrente Ca2+ do canal ativado por liberação de cálcio (CRAC) (Figura 4C,D). No modelo iPSC-CM, esse sinal aumenta com o transiente espontâneo de cálcio citosólico (Figura 4D1,D2). De acordo com isso, o tratamento com cafeína evoca um grande transiente de cálcio no citosol e no canal Orai1.
Reconhece-se que a maioria das imagens transitórias de cálcio em modelos de cardiomiócitos foi determinada usando corantes de cálcio26. Um indicador de cálcio geneticamente codificado foi comparado a um corante químico no modelo de cardiomiócitos derivado de iPSC para permitir uma comparação lado a lado de diferentes abordagens de imagem de cálcio. K-GECO expressando iPSC-CMs foram fotografados ao lado de células carregadas de Fluo-4. Os cardiomiócitos expressivos de K-GECO apresentaram comportamento consistente de batimento ao longo do tempo (Figura 5A,C). No entanto, a carga do Fluo-4 impactou tanto a frequência de batimento quanto a CTD neste modelo (Figura 5B,C), sugerindo que o próprio Fluo-4 pode influenciar os resultados de tais experimentos. Isso será especialmente verdadeiro após a exposição a longo prazo à sonda de imagem, o que pode ocorrer no formato de imagem multiparede se a imagem bem a poço ocorrer com um tempo de permanência minuto por poço.
Figura 1: Inibidores de canais iônicos de moléculas pequenas aplicados a cardiomiócitos derivados de iPSC. (A-B) Imagens de lapso de tempo de iPSC-CM expressando mNG-GECO tomadas a 25 Hz. Barra de escala = 50 μm. (B) Oscilações representativas de Ca2+ após adição de composto. Os sinais fluorescentes obtidos a partir de células que expressam mNG-GECO são apresentados como uma relação de fluorescência F/F0, onde F0 é definido como intensidade basal e F a intensidade detectada em cada ponto de tempo. (C) O software de análise de pico de cálcio pode extrair parâmetros, incluindo largura máxima de meio (CTD50), duração transitória de 90% (CTD 90), tempo de subida e tempo de decaimento. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Exemplo dose-resposta usando o inibidor de hERG E4031 dentro de um sistema de estimulação óptica. (A) Traços de estimulação óptica com 10% de luz azul em diferentes concentrações de E4031. Imagens de lapso de tempo de cardiomiócitos derivados de iPSC expressando K-GECO tomadas a 25 Hz. (B1) Traços representativos de transientes de cálcio obtidos com diferentes doses compostas. Análise de pico e dose-resposta de E4031 em amplitude (B2) e tempo de decaimento (B3). Barras azuis indicam estimulação de luz de pulso de 1 Hz 470 nm. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Plataforma totalmente óptica aplicada para triagem fenotípica de drogas de longo prazo em cardiomiócitos derivados de pacientes com NCVE. (A) Traço representativo de atividade de batimento espontâneo em cardiomiócitos derivados do paciente (pós-diferenciação Dia 70) com tratamento medicamentoso (vermelho) ou sem (azul) 5 μM. (B) Análise de pico da atividade de espancamento espontâneo com ou sem tratamento medicamentoso de 5 μM. (C) Traços de intensidade da resposta medicamentosa em CMi iPSC derivada do paciente sob estimulação óptica de 1 Hz. (D) Análise de pico de cardiomiócitos derivados do paciente com estimulação óptica de 1 Hz. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Três canais subcelulares de Ca 2+ no modelo iPSC-CM. (A-B) iPSC-CMs foram transduzidos com sondas subcelulares de cálcio para o citoplasma, NIR-GECO2 (vermelho), retículo endoplasmático ER-LAR-GECO (amarelo) e mtGCEPIA3 (ciano), um indicador mitocondrial de Ca2 +. (B) Imagem de cálcio de lapso de tempo de três canais antes e após o tratamento com cafeína de 10 mM. Foram visualizados iPSC-CMs (C-D) transduzidos com indicadores citoplasmáticos, NIR-GECO2 (vermelho), retículo endoplasmático ER-LAR-GECO (amarelo) e canal CRAC Orai1-G-GECO (ciano). (D) Foram capturadas imagens de cálcio em time-lapse de três canais. (D1) Atividade espontânea batimento a batimento foi observada com NIR-GECO2 e Orai1-G-GECO. (D2) O efluxo de cálcio do ER (diminuição do sinal ER-LAR-GECO) acompanhou um aumento no sinal citosólico de cálcio após o tratamento com cafeína. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: Comparação do indicador de cálcio geneticamente codificado (K-GECO) com o corante químico sensível ao cálcio (Fluo-4) em iPSC-CMs. (A-B) Traços representativos de cálcio de K-GECO (A) e Fluo-4 (B) são apresentados ao longo do tempo. (C) Análise transitória de cálcio de K-GECO transduzido ou iPSC-CM carregado com Fluo-4. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| BPM | CTD50 (s) | CTD90 (s) | Amplitude (F/F0) | Tempo de subida | Tempo(s) de decaimento | |
| Veículo (0,1% DMSO) | 112.3657+/-10.95 | 0.25+/-0.04 | 0.41+/-0.01 | 1.99+/-0.02 | 0.07+/-0.01 | 0.28+/-0.01 |
| Verapamil (1 uM) | 0 | - | - | - | - | - |
| Dofetilida (5 nM) | 103.42+/-9.87** | 0.23+/-0.03 | 0.46+/-0.03 | 1.91+/-0.03 | 0.07+/-0.01 | 0.35+/-0.02* |
| E4031 (30 nM) | 75.73+/-12.08*** | 0.37+/-0.04** | 0.58+/-0.08*** | 1.55+/-0.02** | 0.11+/-0.04*** | 0.35+/-0.07** |
Tabela 1: Efeitos da adição de compostos a parâmetros transitórios de cálcio no modelo iPSC-CM. Os valores de significância são indicados por *(p ≤ 0,05), **(p < 0,01) e ***(p < 0,001).
Vídeo Animado 1: A atividade espontânea do cálcio foi observada pelo mNG-GECO em cardiomiócitos derivados de iPSC apenas com veículo. Um filme pseudocolorido de uma imagem em escala de cinza é fornecido. Clique aqui para baixar este vídeo.
Figura 1 Suplementar: Representação esquemática do vetor adenoviral. Isso inclui a rodopsina de canal ChR2 como atuador, com um indicador de cálcio fluorescente vermelho K-GECO como um repórter de cálcio para um ensaio totalmente óptico. O canal iônico sensível à luz permite que as células excitáveis sejam despolarizadas pela luz na faixa azul-esverdeada do espectro visível. A luz de 470 nm foi utilizada nesses experimentos. Transientes de cálcio em células excitáveis podem ser simultaneamente fotografados pelo K-GECO, que requer luz de excitação verde, produzindo emissões vermelhas. Clique aqui para baixar este arquivo.
Discussion
Para realizar com sucesso a triagem de alto rendimento, os sinais devem ser distribuídos uniformemente pelo vaso de cultura, garantindo que as regiões de interesse (ROIs) selecionadas aleatoriamente possam ser aplicadas automaticamente durante a aquisição de imagens. Embora os indicadores químicos de cálcio atendam facilmente a esse requisito, as sondas geneticamente codificadas historicamente produziram manchas, em vez de folhas, de sinal limitando seu uso. O uso de um sistema de transdução viral proporciona altos níveis de expressão27,28 e equivalentes de múltiplos indicadores entre as células-alvo em comparação com os métodos convencionais de transfecção. Diferentes tipos de células podem exigir diferentes promotores, e a escolha do sistema de liberação gênica pode precisar mudar de acordo 29,30,31. Em modelos celulares heterogêneos, a transdução e a eficiência de expressão podem ser diferentes em tipos específicos de células. Por um lado, isso pode limitar a aplicação a células específicas, mas o fenômeno pode ser explorado para distinguir células específicas em um sistema de cocultura32.
O principal impacto dessa abordagem é a liberação da relação um-para-um entre o experimentador e a amostra pela automação. Em um experimento padrão de vários poços, para coletar dados em quatro posições dentro de um único poço, estimamos que leva cerca de 15 horas no microscópio para coletar vídeos de 30 s de uma placa de 96 poços. No sistema automatizado, isso leva ~ 4 h. Além disso, a análise dos dados manualmente leva muito mais tempo do que a aquisição de dados. O sistema de análise usado aqui é cerca de 200 vezes mais rápido do que o equivalente manual. O resultado líquido é um fluxo de trabalho aprimorado e uma alta economia de custos e tempo.
Em contraste com os cardiomiócitos primários carregados com corantes de cálcio que sobrevivem na ordem de horas, os GECIs expressos em iPSC-CM através de sistemas de entrega viral podem produzir um sinal em um modelo experimental que vive por alguns meses. Esses modelos podem ser mantidos em um formato de vários poços e rastreados simultaneamente para análise serial em sistemas de imagem de alto conteúdo desenvolvidos para triagem de moléculas pequenas. Isso produz uma plataforma experimental humana simples para testar os efeitos da droga ao longo de durações mais próximas das experimentadas pelos pacientes (semanas ou meses), em vez dos minutos normalmente usados em ensaios toxicológicos.
O sistema pode ser expandido para fornecer medições multiparâmetros, incluindo GECIs com propriedades de emissão distintas, do verde ao infravermelho próximo. Tais experimentos requerem luz de excitação adequada e conjuntos de filtros no projeto experimental para manter os sinais separados. A ampla aplicação em um contexto de triagem de medicamentos requer plataformas de análise robustas e eficientes, além da dispensação de medicamentos. Embora o modelo descrito aqui se concentre no uso de múltiplos indicadores dinâmicos de cálcio, isso poderia ser modificado para marcadores estruturais de forma ou função celular. Estes são tipicamente mais fáceis de visualizar, pois mostram pouca variabilidade batimento a batimento em comparação com a variação de cem vezes na concentração intracelular de cálcio. Essa abordagem pode ser particularmente valiosa para doenças raras, onde o intermediário iPSC derivado de pacientes pode conter todos os drivers genéticos e modificadores de uma condição particular que podem ser preservados em um modelo celular escalável, facilitando a descoberta de medicamentos em várias doenças com base em fenótipos celulares que podem ser visualizados independentemente do mecanismo biológico subjacente que pode ser difícil de elucidar.
Disclosures
A LumiSTAR solicitou proteção de patente do uso de K-GECO, NIR-GECO e LAR-GECO.
Acknowledgments
Agradecemos ao Prof. Robert Campbell, da Universidade de Tóquio, por compartilhar o material e a valiosa discussão; Dr. Chia-Lin Ho em Dispositivo Molecular para suporte técnico.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 96-well plate | Perkin Elmer | 6055302 | |
| auto microfluidic system | Molecular Device | A device has a single channel pipetter that can be used to add compound automatically | |
| Caffeine | Sigma-Aldrich | C0750 | |
| Cardiosight-S l iPSC derived cardiomyocytes | NEXEL | C-002 | |
| Dimethyl sulfoxide | Millipore Sigma | 1096780100 | |
| Dofetilide | Sigma-Aldrich | PZ0016 | |
| E4031 | Tocris | 1808 | |
| ER-LAR-GECO viral kit | LumiSTAR | AA001a | Red-shifted GECI packed into adeno-viral vector |
| Fibronectin | Sigma-Aldrich | F1141 | |
| Fluo-4 AM | Invitrogen | F14201 | Chmical calcium sensitive dye |
| Gelatin | Sigma-Aldrich | G1890 | |
| ImageXpress Micro Confocal High-Content Imaging System | Molecular Device | ||
| iPSC-CMs Maintenance Medium | NEXEL | CMS-002 | iPSC-CMs Medium (Cardiosight-S medium) + Cardiosight-S Supplement |
| iPSC-CMs Medium (Cardiosight-S medium) | NEXEL | CMS-002 | |
| K-GECO viral kit | LumiSTAR | AA005a | Red-shifted GECI packed into adeno-viral vector |
| LumiCAL software | LumiSTAR | LUCS01a | Software for analysis of calcium peak in cardiomyocytes |
| mNG-GECO viral kit | LumiSTAR | AL008a | Brighter green GECI packed into lenti-viral vector |
| mt-GCEPIA3 viral kit | LumiSTAR | AL011a | GECI targgeting on mitochondria packed into lenti-viral vector |
| NIR-GECO viral kit | LumiSTAR | AV004a | Near infrared GECI packed into viral vector |
| Orai1-GGECO viral kit | LumiSTAR | AL010a | GECI targgeting on Orai1 packed into lenti-viral vector |
| Tyrode's salts | Sigma-Aldrich | T2145 | |
| Verapamil hydrochloride | Sigma-Aldrich | V4629 | |
| Y-27632 dihydrochloride | Tocris | 1254 |
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