Summary
El presente protocolo describe el control totalmente óptico y la observación de la actividad celular desencadenada en cardiomiocitos derivados de iPSC (iPSC-CM) para la detección de fármacos de alto rendimiento y pruebas de toxicidad. Se muestra la cuantificación multiparamétrica de patrones fenotípicos en el tiempo y el espacio. Se demuestran los efectos a largo plazo de los medicamentos durante horas, o mediciones secuenciales durante días.
Abstract
Es importante comprender cómo funcionan las células excitables en la salud y la enfermedad y cómo ese comportamiento puede ser alterado por moléculas pequeñas o manipulación genética. Los indicadores de calcio codificados genéticamente (GECI) con múltiples ventanas de emisión pueden combinarse (por ejemplo, para la observación simultánea de distintos eventos subcelulares) o usarse en aplicaciones extendidas con otros actuadores dependientes de la luz en células excitables (por ejemplo, combinando control optogenético codificado genéticamente con indicadores de calcio espectralmente compatibles). Tales enfoques se han utilizado en neuronas primarias o derivadas de células madre, cardiomiocitos y células beta pancreáticas. Sin embargo, ha sido difícil aumentar el rendimiento, o la duración de la observación, de tales enfoques debido a las limitaciones de los instrumentos, el software de análisis, el rendimiento de los indicadores y la eficiencia de la entrega de genes. Aquí, un GECI verde de alto rendimiento, mNeonGreen-GECO (mNG-GECO) y GECI CON DESPLAZAMIENTO AL ROJO, K-GECO, se combina con el control optogenético para lograr un control totalmente óptico y la visualización de la actividad celular en un formato de imágenes de alto rendimiento utilizando un sistema de imágenes de alto contenido. Se muestran las aplicaciones que demuestran pruebas de cardiotoxicidad y detección fenotípica de fármacos con iPSC-CM sanos y derivados del paciente. Además, las evaluaciones multiparamétricas utilizando combinaciones de variantes espectrales e indicadores de afinidad cálcica (NIR-GECO, LAR-GECO y mtGCEPIA u Orai1-G-GECO) también se delimitan a diferentes compartimentos celulares y también se demuestran en el modelo iPSC-CM.
Introduction
Los modelos derivados de células madre pluripotentes inducidas (iPSC) de origen humano se consideran una solución prometedora para los objetivos de las 3R (Reemplazo, Reducción y Refinamiento) establecidos para los estudios en animales 1,2. Los cardiomiocitos derivados de iPSC se han utilizado para el modelado de enfermedades y el descubrimiento de fármacos, ya que recapitulan aspectos esenciales de la biología humana3. La imagen de calcio, típicamente con colorantes químicos, ha sido utilizada para observar la actividad celular antes y después del tratamiento farmacológico 4,5. Sin embargo, las sondas sensibles al calcio basadas en colorantes químicos inhiben directamente la Na, K-ATPasa e interrumpen la función celular6. Por lo tanto, el seguimiento de las mismas células durante horas o días ha sido problemático cuando se utilizan tintes químicos. Aquí, una gama de indicadores de calcio codificados genéticamente (GECIs)7,8,9,10 se utilizan en un amplio espectro de excitación/emisión y afinidad de calcio para formar una plataforma de pruebas de toxicidad cardíaca que ofrece mediciones de múltiples orgánulos en tiempo real durante largos períodos de tiempo 11.
Para desarrollar aún más el concepto de cribado basado en calcio de alto rendimiento en el modelo iPSC-CM más allá del contexto académico previamente demostrado utilizando herramientas codificadas genéticamente para el control óptico y las imágenes de calcio mediante la coexpresión de un indicador de calcio desplazado al rojo, R-GECO o K-GECO con una herramienta optogenética, se han generado kits virales listos para usar ChR212,13. Al hacer la transición de las imágenes a un instrumento de alto contenido equipado con un sistema automicrofluídico, el pipeteo de un solo canal de adición de compuestos se superpone a las imágenes de células vivas. Finalmente, ambos aspectos cruciales de la vía experimental, el procesamiento de imágenes y el análisis se mejoran y automatizan.
Protocol
Los cardiomiocitos derivados de iPSC (iPSC-CM) del paciente con miocardiopatía ventricular izquierda sin compactación (LVNC) fueron proporcionados por el Hospital Universitario Nacional de Taiwán. La recolección de muestras de pacientes para su reprogramación a iPSC y los protocolos de mantenimiento14 con fines de investigación siguieron la Declaración de Helsinki de la AMM (principios éticos para la investigación médica con seres humanos) y fueron aprobados por la Junta de Revisión Institucional: Oficina del Comité de Ética en Investigación en NTUH (#201612099RINC). Otros iPSC-CM se obtuvieron de proveedores comerciales. El uso de derivados de iPSC no requiere permisos específicos en nuestra institución.
1. Preparación de cardiomiocitos derivados de iPSC
- Prepare la placa de pocillos múltiples antes de retirar el iPSC-CM del almacenamiento en frío para su descongelación. Cubra cada pocillo de la microplaca de 96 pocillos con 100 μL de 50 μg/ml de fibronectina/solución de gelatina al 0,2% (consulte la Tabla de materiales) para cubrir bien todas las superficies.
- Incubar la placa a 37 °C durante 1 h en una incubadora humidificada.
- Caliente el medio (consulte la Tabla de materiales) a temperatura ambiente durante 30 minutos antes de la descongelación celular.
NOTA: El presente protocolo describe la temperatura ambiente como 25 °C. - Transfiera el iPSC-CM del tanque de almacenamiento de nitrógeno líquido a un baño de agua a 37 °C.
NOTA: Los iPS-CM generalmente se envían en hielo seco por fuentes académicas o comerciales. Se transfieren al almacenamiento de nitrógeno líquido desde su recepción hasta su uso. - Retire el vial antes de que el hielo se derrita por completo y rocíe el vial con etanol al 75%.
- Lleve el vial a un gabinete de bioseguridad de clase II y transfiera suavemente el contenido a un nuevo tubo cónico de 15 ml que contenga 9 ml de medio a temperatura ambiente.
- Centrifugar las células a 200 x g durante 3 min a temperatura ambiente.
- Deseche el sobrenadante con pipeta y resuspenda suavemente las células en 1 ml de medio con 10 μM de inhibidor ROCK (Y27632) (ver Tabla de materiales).
NOTA: Evite el pipeteo repetido de las células descongeladas para garantizar la máxima recuperación celular. - Retire la solución de recubrimiento del pocillo y agregue 50 μL de medio con 10 μM de inhibidor de ROCK rápidamente.
- Confirmar el número de células viables utilizando el método de exclusión de azul de tripano con un hemocitómetro15.
- Celdas de placa en placa recubierta de 96 pocillos a una densidad de 100,000-150,000 celda / cm2, según las instrucciones del fabricante16.
- Después de 24 h, asegúrese de que las celdas unidas a la superficie de la placa estén en contacto con otras células.
NOTA: Las células individuales sobreviven pobremente en cultivo a largo plazo y generalmente se comportan de manera más variable. - Reemplace el medio de mantenimiento precalentado cada 2 días.
NOTA: Para el tratamiento farmacológico a largo plazo, el LVNC iPSC-CM se cambió con reemplazos medios con o sin medicamentos de moléculas pequeñas cada 2 días.
2. Expresión de indicadores de calcio codificados genéticamente
- Después de colocar las células durante 72 h, descongele los kits virales GECI (ver Tabla de materiales) en hielo.
- Prepare una solución de stock de kit viral 2x con el medio de mantenimiento.
- Preparar las células para la infección ajustando el volumen medio a 100 μL por pocillo. Añadir 100 μL de la solución viral premezclada e incubar durante 8-16 h a 37 °C.
- Sustituir por medio precalentado de 200 μL después de la incubación.
- Visualice la expresión de GECIs 24 h después de la transducción utilizando un sistema de imágenes (ver Tabla de materiales).
NOTA: El nivel de expresión alcanza el máximo a las 48-72 h después de la transducción. Las células se pueden visualizar a partir del punto de tiempo de 24 h. Sin embargo, las señales obtenidas de los GECI se mantienen durante más de un mes. - Mantenga las células en la incubadora humidificada antes de realizar ensayos funcionales.
- Infectar las iPSC-CM (iPSC-CM derivadas de pacientes LVNC) con el kit viral ChR2-K-GECO (ver Tabla de materiales) en el día 25 después de la diferenciación utilizando el protocolo de infección (paso 2.1-2.6).
3. Imágenes de calcio basadas en colorante usando Fluo-4
- Disuelva el polvo de Fluo-4 (ver Tabla de materiales) en DMSO como una solución madre (5 mM).
- Diluir la solución madre hasta alcanzar una concentración de 10 μM de Fluo-4 en el tampón de Tyrode.
NOTA: El tampón de Tyrode consiste en 1.0 g / L de bicarbonato de sodio, 0.2 g / L de cloruro de calcio, 0.1 g / L de cloruro de magnesio, 0.2 g / L de cloruro de potasio, 8.0 g / L de cloruro de sodio, 0.05 g / L de fosfato de sodio monobásico y 1.0 g / L de D-glucosa. - Reemplace el medio medio con 10 μM de solución de Fluo-4 (dando una concentración final de 5 μM).
- Incubar las células a 37 °C durante 30 min.
- Lave las celdas con el tampón de Tyrode precalentado y reemplácelas con el medio antes de la adquisición de la imagen.
- Comience a grabar con el protocolo de adquisición de flujos.
NOTA: La adquisición de secuencias es la adquisición continua de imágenes sin intervalo de tiempo. La frecuencia de batido de iPSC-CM es de aproximadamente 1 Hz, y este protocolo de adquisición de flujo se utiliza para recopilar patrones de latido.
4. Adquisición de imágenes y ensayos funcionales para ensayo de toxicidad y cribado fenotípico
- Encienda todos los dispositivos del sistema de imágenes de alto contenido (consulte la Tabla de materiales).
- Verifique que la temperatura de la cámara alcance los 37 °C, con un 5% de suplementación deCO2 . Mantenga el sistema en equilibrio durante 2 h antes de la adquisición de la imagen.
NOTA: La deriva térmica es un problema importante para las observaciones de células vivas a largo plazo, 1 °C puede cambiar el plano focal en ~1 μm, por lo que permitir que la lente y la etapa alcancen la temperatura objetivo es esencial antes de la adquisición de la imagen. - Abra el software de imágenes (consulte Tabla de materiales) y elija la configuración de la placa para una placa de 96 pocillos.
- Coloque una placa de 96 pocillos sin tapa en la cámara y cárguela con el anillo de sellado de células vivas en la parte superior.
NOTA: El anillo de sellado de células vivas es un adaptador para alcanzar el equilibrio ambiental. - Elija la lente del objetivo de inmersión en agua 20x (Figura 1 y Figura 2), 60x (Figura 3 y Figura 4) y 20x (Figura 5) de acuerdo con la resolución espacial requerida.
- Ajuste el enfoque para tomar imágenes claras antes de la adquisición experimental.
- Seleccione 3-5 regiones al azar por pocillo para el registro de la actividad del calcio.
NOTA: Cada región debe incluir al menos 20 celdas (n ≥ 20). - Elija los filtros apropiados para diferentes indicadores. FITC 475/536 para mNG-GECO, mtGCEPIA3 y Oria1-G-GECO; Cy5 631/692 para NIR-GECO2; ER 530/593 para ER-LAR-GECO; Texas Red 560/624 para K-GECO.
- Establezca la potencia de diodo emisor de luz (LED) adecuada para cada canal de imagen utilizado.
NOTA: Al optimizar la potencia del LED para la adquisición de imágenes por señal (intensidad detectada del objeto) a ruido (intensidad detectada del fondo), la relación señal/ruido debe ser superior a 2. En este protocolo, 10% de potencia LED para TRITC y FITC; 20% para Cy5 fue típico. - Ajuste el tiempo de exposición de la cámara a un máximo de 40 ms (25 Hz) y una duración de grabación de 30 sfor de adquisición de flujo para observar los transitorios de calcio reportados por las sondas mNG-GECO y K-GECO expresados en cardiomiocitos (Figura 1-3 y Figura 5). Aumente la potencia del LED si la señal/ruido es <2 a velocidades de cuadro más altas.
- Para la estimulación optogenética (Figura 2 y Figura 3C, D), optimice la potencia (típicamente 5% -10%) y la frecuencia de la luz azul a 1 Hz.
NOTA: Generalmente, el iPSC-CM humano late espontáneamente alrededor de ~ 1 Hz, y el operador necesita acelerar el ritmo más rápido que la velocidad espontánea. - Si se planifican mediciones secuenciales (Figura 3) o extendidas (Figura 4), evite la fototoxicidad a toda costa. Esto puede significar reducir la intensidad de la potencia de iluminación y compensarla aumentando el tiempo de exposición de la cámara, por ejemplo, a 100 ms con el protocolo de lapso de tiempo utilizado para la observación en tiempo real de tres canales de señales subcelulares de Ca2+ (Figura 4).
- Utilice el protocolo de dispensación asíncrona para la adición de cafeína de 10 mM a través del sistema de microfluídica automática (consulte la Tabla de materiales) (Figura 4).
NOTA: El protocolo de dispensación asíncrona permite que la adquisición de imágenes ocurra mientras se agregan medicamentos como la cafeína, sin espacios entre las imágenes. - Iniciar adquisición.
5. Preparación de moléculas pequeñas
- Resuspender el E4031, dofetilida y verapamilo en DMSO y diluirlos con el tampón de Tyrode. La concentración final de DMSO en el medio fue de 0,1% (v/v).
- Preparar las soluciones compuestas al doble (es decir, 2x) de la concentración de trabajo deseada y equilibrar a 37 °C antes de la adición.
NOTA: Minimizar las fluctuaciones de temperatura después de la adición de medio es vital ya que la contractilidad depende de la temperatura y el efecto del cambio de temperatura es rápido. - Organice bien los compuestos en el objetivo correspondiente.
- Agregue 100 μL de los compuestos de doble fuerza (2x) a través del sistema de microfluídica automática (consulte la Tabla de materiales) en los pozos y comience la adquisición después del período de incubación deseado (generalmente 15 minutos).
6. Procesamiento y análisis de imágenes
- Aísle el área de la señal del fondo detectando la función del pulso a lo largo del tiempo de revolución automáticamente con el software.
- Utilice el software de análisis de picos de calcio (consulte la Tabla de materiales) para analizar la frecuencia de batido (BPM), la señal máxima (amplitud), la duración transitoria del calcio al 50% (CTD50), la duración transitoria del calcio 90% (CTD90), el tiempo de subida y el tiempo de decaimiento (Figura 1C).
NOTA: En estos entornos, el fotoblanqueo fue evidente durante los primeros 10 s, y las señales se estabilizan después de eso. Por lo tanto, el pico de calcio se analizó de 11-30 s. En las grabaciones de tres canales (Figura 4), el contorno de la celda se bordea manualmente para medir el cambio de intensidad.
Representative Results
La observación de la oscilación espontánea del calcio en mNG-GECO10 expresada por cardiomiocitos derivados de iPSC (iPSC-CM) con o sin tratamientos farmacológicos se demuestra en la Figura 1 y el Video Animado 1. Las trazas cinéticas obtenidas utilizando mNG-GECO muestran que los inhibidores de los canales iónicos moleculares pequeños, verapamilo, dofetilida y E4031, afectaron los transitorios de calcio (Figura 1B) como se esperaba. El transitorio de calcio típico que se muestra en la Figura 1C se puede analizar mediante el software de análisis de picos de calcio para derivar la señal de pico (amplitud), la duración transitoria de calcio 50% (CTD50), la duración transitoria de calcio 90% (CTD90), el tiempo de subida y el tiempo de descomposición. El verapamilo, un bloqueador de calcio tipo L17, inhibe completamente la afluencia de calcio en las células como se esperaba (Figura 1B). Dofetilida y E4031 son inhibidores del canal hERG18,19,20, catalogados como fármacos antiarrítmicos experimentales de clase III. El tiempo de decaimiento se prolonga con el tratamiento con dofetilida (p < 0,05) y E4031 (p < 0,001) en comparación con el grupo de vehículos. Se observó una prolongación de CTD50 (p < 0,01) y CTD90 (p < 0,001) con el tratamiento con E4031 en comparación con el vehículo solo (Tabla 1), estos resultados son consistentes con los efectos informados sobre el intervalo QT, una medida clínicamente relevante de la repolarización determinada a partir del electrocardiograma de superficie desde un largo período de tiempo entre el inicio de la onda Q y el final de la onda T, en estudios previos 12,21.
Una dificultad de la evaluación de la CTD en las células que laten espontáneamente es la variabilidad que la tasa de latido impone a la CTD. Este es un problema particular para el modelo iPSC-CM, donde cada pocillo de una placa de 96 pocillos puede tener su propia frecuencia de latido a pesar de que todas las células provienen del mismo vial original. Es posible imponer una tasa de latido mediante ritmo óptico o eléctrico. Para evaluar la dosis-respuesta de E4031 en condiciones de ritmo estandarizado, ChR2 y K-GECO7 que expresan iPSC-CM se controlaron ópticamente utilizando pulsos de luz de 1 Hz 470 nm y se observaron utilizando la señal roja K-GECO (Figura 2A y Figura complementaria 1). Las reducciones progresivas de la amplitud máxima (p < 0,01) y el aumento del tiempo de decaimiento (p < 0,05) de los transitorios de calcio ocurren con concentraciones crecientes de E4031 (Figura 2B1). Un efecto dependiente de la dosis de E4031 fue más evidente para las reducciones en la amplitud máxima (Figura 2B1, B2).
Aunque los estudios a corto plazo que duran minutos se utilizan típicamente para las evaluaciones de cardiotoxicidad, existe un punto ciego para las evaluaciones de toxicidad crónica que son paralelas a las exposiciones de los pacientes a los medicamentos durante semanas, meses o años. Sería ventajoso estudiar los efectos de la enfermedad, o toxicidad, durante los intervalos que reflejen las duraciones del tratamiento relevantes para la práctica clínica. Utilizamos nuestro sistema de control y detección totalmente óptico para estudiar los cardiomiocitos derivados de iPSC de un paciente con no compactación ventricular izquierda (LVNC). Las iPSC-CM se transducieron con un kit viral K-GECO (paso 2.2-2.6) después del día 25 de diferenciación. La señal K-GECO se rastreó cada 1-2 semanas en los mismos pozos, con o sin tratamientos farmacológicos adicionales. Tanto la actividad espontánea del calcio (Figura 3A,3B) como la dinámica del calcio bajo estimulación óptica (Figura 3C, D, paso 4.11) se obtuvieron utilizando el Sistema de Imágenes de Alto Contenido (paso 4.1-4.12) y se procesaron mediante un software de análisis de picos de calcio (paso 6). Como se demuestra en la Figura 3A,C, los transitorios de calcio claro permanecen visibles un mes después de la transducción viral, con o sin la luz adicional utilizada para la estimulación óptica. Este trabajo identificó un fármaco que parece aumentar la frecuencia de latido, regularizar el intervalo de contracción y aumentar la amplitud transitoria del calcio en el modelo LVNC iPSC-CM (Figura 3A, B). Hay dos observaciones importantes que hacer a partir de estos datos. En primer lugar, desde la perspectiva terapéutica, el efecto del fármaco parece duradero en los puntos de tiempo del día 63 y el día 70. En segundo lugar, y de relevancia para un campo que en general ensaya efectos compuestos durante breves ventanas (<1 min) en puntos temporales anteriores (típicamente <50 días); los efectos modificadores del fenotipo de la enfermedad del compuesto solo son aparentes después del día 60, lo que sugiere que puede ser fácil descartar los medicamentos que tienen mecanismos de acción lentos en los protocolos de detección estándar.
La variabilidad de la frecuencia de latido, y el impacto posterior en la duración transitoria del calcio, no es solo un problema de bien a bien en un momento dado. También cambia a medida que las iPSC-CM se mantienen en cultivo, lo que varía dentro de un pozo a lo largo del tiempo (Figura 3B). Para imponer consistencia dentro de los experimentos secuenciales, se puede aplicar un ritmo óptico de 1 Hz con o sin tratamiento farmacológico (Figura 3C, D). Aquí, aunque los resultados del Día 63 muestran las tendencias alentadoras en el transitorio de calcio con una amplitud significativamente mayor, CTD90 más corta y un tiempo de decaimiento más corto; en el punto de tiempo de 70 días, e indicativo de la necesidad de evaluaciones crónicas durante el proceso de detección de medicamentos para enfermedades raras, poco después de que se detecten las despolarizaciones (EAD). El valor de agregar un protocolo de estimulación al fenotipado de la enfermedad, o evaluación de moléculas pequeñas, se puede evaluar cualitativamente mediante la comparación de los resultados presentados en la Figura 3B, D para la frecuencia de latido, la amplitud transitoria del calcio, CTD90 y el tiempo de desintegración.
Una ventaja de una metodología basada en GECI, en comparación con el colorante químico, para visualizar el transitorio de calcio es la capacidad de restringir la sonda a un compartimento específico dentro de una célula. Esto se puede ampliar aún más mediante la multiplexación de múltiples variantes de color y / o afinidad en celdas individuales. Por lo tanto, se han desarrollado varios GECI que incluyen ER-LAR-GECO9, mtGCEPIA 22,23 (o Oria1-G-GECO) y NIR-GECO2 8,24 para la expresión individual, o en combinación, en modelos celulares para la medición de la actividad del calcio en tiempo real que surge en el retículo endoplásmico / retículo sarcoplásmico (ER / SR), mitocondrias (o canal CRAC) y citosol, respectivamente. Se pueden combinar en el modelo iPSC-CM (Figura 4A,C) para estudiar la interacción entre diferentes reservas intracelulares de calcio. Por ejemplo, se puede usar un tratamiento con cafeína de 10 mM para vaciar la reserva de calcio SR. Aquí una disminución de la señal ER-LAR-GECO (indicativa de pérdida de calcio de la RS) fue paralela a una disminución de la señal NIR-GECO (indicativa de un aumento en la concentración de calcio citosólico) como se esperaba. No se ha estudiado bien cómo otros compartimentos intracelulares se ven afectados por estas fluctuaciones. Aún así, la inclusión de un mtGCEPIA3 verde dirigido a las mitocondrias muestra que la absorción de calcio ocurre en las mitocondrias en estas condiciones (Figura 4A, B).
Del mismo modo, la visualización de la interacción entre diferentes corrientes de calcio se puede ver mediante la inclusión de una sonda, Orai1-G-GECO25, para revelar el canal activado por liberación de calcio (CRAC) Ca2+ corriente (Figura 4C, D). En el modelo iPSC-CM, esta señal aumenta con el transitorio de calcio citosólico espontáneo (Figura 4D1, D2). De acuerdo con esto, el tratamiento con cafeína evoca un gran transitorio de calcio tanto en el citosol como en el canal Orai1.
Se reconoce que la mayoría de las imágenes transitorias de calcio en modelos de cardiomiocitos se han determinado utilizando colorantes de calcio26. Se comparó un indicador de calcio codificado genéticamente con un colorante químico en el modelo de cardiomiocitos derivado de iPSC para permitir una comparación lado a lado de diferentes enfoques de imágenes de calcio. Las imágenes de K-GECO que expresan iPSC-CM junto con las células cargadas con Fluo-4. Los cardiomiocitos que expresan K-GECO mostraron un comportamiento de latido consistente a lo largo del tiempo (Figura 5A, C). Sin embargo, la carga de Fluo-4 afectó tanto la frecuencia de latido como el CTD en este modelo (Figura 5B, C), lo que sugiere que Fluo-4 podría influir en los resultados de tales experimentos. Esto será especialmente cierto después de la exposición a largo plazo a la sonda de imágenes, que puede ocurrir en el formato de imágenes de pared múltiple si las imágenes de pozo a pozo ocurren con un tiempo de permanencia minuto por pocillo.
Figura 1: Inhibidores de canales iónicos de moléculas pequeñas aplicados a cardiomiocitos derivados de iPSC. (A-B) Imágenes de lapso de tiempo de iPSC-CM expresando mNG-GECO tomadas a 25 Hz. Barra de escala = 50 μm. (B) Oscilaciones representativas de Ca2+ después de la adición del compuesto. Las señales fluorescentes obtenidas de las células que expresan mNG-GECO se presentan como una relación de fluorescencia F/F0, donde F0 se define como intensidad basal y F la intensidad detectada en cada punto de tiempo. (C) El software de análisis de picos de calcio puede extraer parámetros que incluyen ancho medio máximo (CTD50), 90% de duración transitoria (CTD 90), tiempo de subida y tiempo de descomposición. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Ejemplo de dosis-respuesta utilizando el inhibidor de hERG E4031 dentro de un sistema de estimulación óptica. (A) Trazas de estimulación óptica con 10% de luz azul en diferentes concentraciones de E4031. Imágenes de lapso de tiempo de cardiomiocitos derivados de iPSC que expresan K-GECO tomadas a 25 Hz. (B1) Trazas representativas de transitorios de calcio obtenidas con diferentes dosis compuestas. Análisis de picos y dosis-respuesta de E4031 en amplitud (B2) y tiempo de decaimiento (B3). Las barras azules indican una estimulación de luz de pulso de 1 Hz y 470 nm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Plataforma totalmente óptica aplicada para el cribado fenotípico de fármacos a largo plazo en cardiomiocitos derivados de pacientes con LVNC. (A) Traza representativa de la actividad de latido espontáneo en cardiomiocitos derivados de pacientes (día 70 posterior a la diferenciación) con tratamiento farmacológico (rojo) o sin (azul) 5 μM. (B) Análisis máximo de la actividad de latido espontáneo con o sin tratamiento farmacológico de 5 μM. (C) Trazas de intensidad de la respuesta al fármaco en iPSC-CM derivada del paciente bajo estimulación óptica de 1 Hz. (D) Análisis de picos de cardiomiocitos derivados de pacientes con estimulación óptica de 1 Hz. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Imágenes de Ca 2+ subcelulares de tres canales en el modelo iPSC-CM. (A-B) Se transdujeron iPSC-CMs con sondas de calcio subcelular para el citoplasma, NIR-GECO2 (rojo), el retículo endoplásmico ER-LAR-GECO (amarillo) y mtGCEPIA3 (cian), un indicador mitocondrial de Ca2+. (B) Imágenes de calcio de lapso de tiempo de tres canales antes y después del tratamiento con cafeína de 10 mM. (C-D) se visualizaron iPSC-CMs transducidos con indicadores citoplasmáticos, NIR-GECO2 (rojo), retículo endoplásmico ER-LAR-GECO (amarillo) y canal CRAC Orai1-G-GECO (cian). (D) Se capturaron imágenes de calcio de lapso de tiempo de tres canales. (D1) Se observó actividad espontánea latido a latido con NIR-GECO2 y Orai1-G-GECO. (D2) El flujo de calcio del RE (disminución de la señal ER-LAR-GECO) acompañó a un aumento en la señal de calcio citosólico durante el tratamiento con cafeína. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: Comparación del indicador de calcio codificado genéticamente (K-GECO) con el colorante químico sensible al calcio (Fluo-4) en iPSC-CMs. (A-B) Se presentan trazas de calcio representativas de K-GECO (A) y Fluo-4 (B) a lo largo del tiempo. (C) Análisis transitorio de calcio de K-GECO transducido, o Fluo-4 cargado iPSC-CM. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| BPM | CTD50 (s) | CTD90 (s) | Amplitud (F/F0) | Tiempo de subida | Tiempo(s) de decaimiento | |
| Vehículo (0,1% DMSO) | 112.3657+/-10.95 | 0.25+/-0.04 | 0.41+/-0.01 | 1.99+/-0.02 | 0.07+/-0.01 | 0.28+/-0.01 |
| Verapamilo (1 uM) | 0 | - | - | - | - | - |
| Dofetilida (5 nM) | 103.42+/-9.87** | 0.23+/-0.03 | 0.46+/-0.03 | 1.91+/-0.03 | 0.07+/-0.01 | 0.35+/-0.02* |
| E4031 (30 nM) | 75.73+/-12.08*** | 0.37+/-0.04** | 0.58+/-0.08*** | 1.55+/-0.02** | 0.11+/-0.04*** | 0.35+/-0.07** |
Tabla 1: Efectos de la adición de compuestos a parámetros transitorios de calcio en el modelo iPSC-CM. Los valores de significancia se indican con *(p ≤ 0,05), **(p < 0,01) y ***(p < 0,001).
Video animado 1: La actividad espontánea del calcio fue observada por mNG-GECO en cardiomiocitos derivados de iPSC con vehículo solamente. Se proporciona una película pseudocoloreada de una imagen en escala de grises. Haga clic aquí para descargar este video.
Figura complementaria 1: Representación esquemática del vector adenoviral. Esto incluye el canal de rodopsina ChR2 como actuador, con un indicador de calcio fluorescente rojo K-GECO como reportero de calcio para un ensayo totalmente óptico. El canal iónico sensible a la luz permite que las células excitables sean despolarizadas por la luz en el rango azul-verde del espectro visible. En estos experimentos se utilizó luz de 470 nm. Los transitorios de calcio en las células excitables pueden ser fotografiados simultáneamente por K-GECO, que requiere luz de excitación verde, produciendo emisiones rojas. Haga clic aquí para descargar este archivo.
Discussion
Para realizar con éxito el cribado de alto rendimiento, las señales deben distribuirse uniformemente en todo el recipiente de cultivo, lo que garantiza que las regiones de interés (ROI) seleccionadas al azar se puedan aplicar automáticamente durante la adquisición de imágenes. Aunque los indicadores químicos de calcio cumplen fácilmente con este requisito, las sondas codificadas genéticamente han producido históricamente parches, en lugar de hojas, de señal que limitan su uso. El uso de un sistema de transducción viral proporciona altos niveles de expresión de27,28 y equivalentes de múltiples indicadores entre las células diana en comparación con los métodos de transfección convencionales. Diferentes tipos de células pueden requerir diferentes promotores, y la elección del sistema de administración de genes puede necesitar cambiar en consecuencia 29,30,31. En modelos celulares heterogéneos, la transducción y la eficiencia de expresión pueden ser diferentes en tipos celulares específicos. Por un lado, esto puede limitar la aplicación a células particulares, pero el fenómeno puede ser explotado para distinguir células particulares en un sistema de cocultivo32.
El principal impacto de este enfoque es la liberación de la relación uno a uno entre el experimentador y la muestra mediante la automatización. En un experimento estándar de múltiples pozos, para recopilar datos en cuatro posiciones dentro de un solo pozo, estimamos que se necesitan aproximadamente 15 h en el microscopio para recopilar videos de 30 s de una placa de 96 pocillos. En el sistema automatizado, esto toma ~ 4 h. Además, el análisis manual de los datos lleva mucho más tiempo que la adquisición de datos. El sistema de análisis utilizado aquí es aproximadamente 200 veces más rápido que el equivalente manual. El resultado neto es un flujo de trabajo mejorado y un alto ahorro de costos y tiempo.
A diferencia de los cardiomiocitos primarios cargados con colorantes de calcio que sobreviven en el orden de horas, los GECI expresados en iPSC-CM a través de sistemas de administración viral pueden producir una señal en un modelo experimental que vive durante unos pocos meses. Estos modelos pueden mantenerse en un formato de múltiples pocillos y rastrearse simultáneamente para el análisis en serie en sistemas de imágenes de alto contenido desarrollados para el cribado de moléculas pequeñas. Esto produce una plataforma experimental humana simple para probar los efectos de los medicamentos en duraciones más cercanas a las experimentadas por los pacientes (semanas o meses) en lugar de los minutos típicamente utilizados en los ensayos de toxicología.
El sistema se puede ampliar para ofrecer mediciones multiparamétricas mediante la inclusión de GECI con distintas propiedades de emisión desde el verde hasta el infrarrojo cercano. Tales experimentos requieren luz de excitación adecuada y conjuntos de filtros en el diseño experimental para mantener las señales separadas. La amplia aplicación en un contexto de detección de drogas requiere plataformas de análisis robustas y eficientes, además de la dispensación de drogas. Aunque el modelo descrito aquí se centra en el uso de múltiples indicadores dinámicos de calcio, esto podría modificarse a marcadores estructurales de forma o función celular. Estos son típicamente más fáciles de visualizar, ya que muestran poca variabilidad latido a latido en comparación con la variación de cien veces en la concentración de calcio intracelular. Este enfoque puede ser particularmente valioso para enfermedades raras donde el intermediario iPSC derivado de pacientes puede contener todos los impulsores y modificadores genéticos de una condición particular que pueden preservarse en un modelo celular escalable, facilitando el descubrimiento de fármacos en diversas enfermedades basadas en fenotipos celulares que se pueden visualizar independientemente del mecanismo biológico subyacente que puede ser difícil de dilucidar.
Disclosures
LumiSTAR ha solicitado la protección de patentes del uso de K-GECO, NIR-GECO y LAR-GECO.
Acknowledgments
Agradecemos al Prof. Robert Campbell de la Universidad de Tokio por compartir el material y la valiosa discusión; Dr. Chia-Lin Ho en Dispositivo Molecular para soporte técnico.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 96-well plate | Perkin Elmer | 6055302 | |
| auto microfluidic system | Molecular Device | A device has a single channel pipetter that can be used to add compound automatically | |
| Caffeine | Sigma-Aldrich | C0750 | |
| Cardiosight-S l iPSC derived cardiomyocytes | NEXEL | C-002 | |
| Dimethyl sulfoxide | Millipore Sigma | 1096780100 | |
| Dofetilide | Sigma-Aldrich | PZ0016 | |
| E4031 | Tocris | 1808 | |
| ER-LAR-GECO viral kit | LumiSTAR | AA001a | Red-shifted GECI packed into adeno-viral vector |
| Fibronectin | Sigma-Aldrich | F1141 | |
| Fluo-4 AM | Invitrogen | F14201 | Chmical calcium sensitive dye |
| Gelatin | Sigma-Aldrich | G1890 | |
| ImageXpress Micro Confocal High-Content Imaging System | Molecular Device | ||
| iPSC-CMs Maintenance Medium | NEXEL | CMS-002 | iPSC-CMs Medium (Cardiosight-S medium) + Cardiosight-S Supplement |
| iPSC-CMs Medium (Cardiosight-S medium) | NEXEL | CMS-002 | |
| K-GECO viral kit | LumiSTAR | AA005a | Red-shifted GECI packed into adeno-viral vector |
| LumiCAL software | LumiSTAR | LUCS01a | Software for analysis of calcium peak in cardiomyocytes |
| mNG-GECO viral kit | LumiSTAR | AL008a | Brighter green GECI packed into lenti-viral vector |
| mt-GCEPIA3 viral kit | LumiSTAR | AL011a | GECI targgeting on mitochondria packed into lenti-viral vector |
| NIR-GECO viral kit | LumiSTAR | AV004a | Near infrared GECI packed into viral vector |
| Orai1-GGECO viral kit | LumiSTAR | AL010a | GECI targgeting on Orai1 packed into lenti-viral vector |
| Tyrode's salts | Sigma-Aldrich | T2145 | |
| Verapamil hydrochloride | Sigma-Aldrich | V4629 | |
| Y-27632 dihydrochloride | Tocris | 1254 |
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