Summary
본 프로토콜은 고처리량 약물 스크리닝 및 독성 테스트를 위해 iPSC 유래 심근세포(iPSC-CM)에서 유발된 세포 활성의 전광학 제어 및 관찰을 설명합니다. 시간과 공간에서의 표현형 패턴의 다중 모수적 정량화가 도시된다. 몇 시간에 걸친 약물의 장기적인 효과 또는 며칠에 걸친 순차적 측정이 입증되었습니다.
Abstract
흥분성 세포가 건강과 질병에서 어떻게 작용하는지, 그리고 그 행동이 작은 분자 또는 유전자 조작에 의해 어떻게 바뀔 수 있는지 이해하는 것이 중요합니다. 다중 방출 창을 갖는 유전적으로 암호화된 칼슘 지시약(GECI)은 결합되거나(예를 들어, 별개의 세포하 사건의 동시 관찰을 위해) 흥분성 세포의 다른 광 의존적 액추에이터와 함께 확장된 애플리케이션에 사용될 수 있다(예를 들어, 유전적으로 암호화된 광유전학적 제어와 스펙트럼 호환 칼슘 지시약의 결합). 이러한 접근법은 일차 또는 줄기 세포 유래 뉴런, 심근 세포 및 췌장 베타 세포에서 사용되었습니다. 그러나 기기, 분석 소프트웨어, 지표 성능 및 유전자 전달 효율성의 한계로 인해 이러한 접근 방식의 처리량 또는 관찰 기간을 늘리는 것은 어려웠습니다. 여기에서 고성능 녹색 GECI, mNeonGreen-GECO(mNG-GECO) 및 적색 편이 GECI, K-GECO가 광유전학적 제어와 결합되어 고콘텐츠 이미징 시스템을 사용하여 고처리량 이미징 형식으로 세포 활동의 모든 광학 제어 및 시각화를 달성합니다. 건강한 환자 유래 iPSC-CM을 사용한 심장 독성 테스트 및 표현형 약물 스크리닝을 입증하는 응용 프로그램이 표시됩니다. 또한, 스펙트럼 및 칼슘 친화성 지표 변이체(NIR-GECO, LAR-GECO, 및 mtGCEPIA 또는 Orai1-G-GECO)의 조합을 사용하는 다중 파라미터 평가도 iPSC-CM 모델에서 입증됩니다.
Introduction
인간 기반 유도만능줄기세포(iPSC) 유래 모델은 동물 연구1,2에 대해 설정된 3R 목표(대체, 감소 및 정제)에 대한 유망한 솔루션으로 간주됩니다. iPSC 유래 심근 세포는 인간 생물학의 필수 측면을 요약하기 때문에 질병 모델링 및 약물 발견에 사용되었습니다3. 일반적으로 화학 염료를 사용하는 칼슘 영상은 약물 치료 전후의 세포 활동을 관찰하는 데 사용되었습니다 4,5. 그러나 화학 염료 기반 칼슘 감지 프로브는 Na, K-ATPase를 직접 억제하고 세포 기능을 방해합니다6. 따라서 화학 염료를 사용할 때 몇 시간 또는 며칠에 걸쳐 동일한 세포를 추적하는 것이 문제가되었습니다. 여기에서 유전적으로 암호화된 다양한 칼슘 지표(GECI)7,8,9,10이 광범위한 여기/방출 및 칼슘 친화성 스펙트럼에 걸쳐 활용되어 장기간에 걸쳐 실시간 다중 세포 기관 측정을 제공하는 심장 독성 테스트 플랫폼을 형성합니다11.
적색 편이 칼슘 지표 R-GECO 또는 K-GECO와 광유전학 도구 ChR212,13의 공동 발현에 의한 광학 제어 및 칼슘 이미징을 위한 유전적으로 암호화된 도구를 사용하여 이전에 입증된 학문적 맥락을 넘어 iPSC-CM 모델에서 고처리량 칼슘 기반 스크리닝 개념을 더욱 발전시키기 위해 기성품 바이러스 키트가 생성되었습니다. 이미징을 자동 미세유체 시스템이 장착된 고함량 기기로 전환함으로써 화합물 첨가의 단일 채널 피펫팅이 라이브 셀 이미징 위에 계층화됩니다. 마지막으로, 실험 경로, 이미지 처리 및 분석의 두 가지 중요한 측면이 모두 개선되고 자동화됩니다.
Protocol
좌심실 비 압축 심근 병증 (LVNC) 환자 iPSC 유래 심근 세포 (iPSC-CM)는 국립 대만 대학 병원에서 제공되었습니다. iPSC로 재 프로그래밍하기위한 환자 샘플 수집 및 연구 목적을위한 유지 관리 프로토콜14 는 WMA 헬싱키 선언 (인간 피험자와 관련된 의학 연구의 윤리 원칙)을 따랐으며 기관 검토위원회 : NTUH의 연구 윤리위원회 사무소 (#201612099RINC)의 승인을 받았습니다. 다른 iPSC-CM은 상용 공급 업체로부터 입수했습니다. iPSC 파생 상품의 사용은 우리 기관의 특정 허가를 필요로하지 않습니다.
1. iPSC 유래 심근 세포 제제
- 해동을 위해 iPSC-CM을 냉장 보관에서 꺼내기 전에 멀티웰 플레이트를 준비합니다. 96웰 마이크로플레이트의 각 웰을 100μL의 50μg/mL 피브로넥틴/0.2% 젤라틴 용액( 재료 표 참조)으로 코팅하여 모든 표면을 완전히 덮습니다.
- 플레이트를 가습 인큐베이터에서 37°C에서 1시간 동안 배양합니다.
- 세포 해동 전에 배지( 재료 표 참조)를 실온으로 30분 동안 데웁니다.
알림: 본 프로토콜은 실온을 25°C로 설명합니다. - iPSC-CM을 액체 질소 저장 탱크에서 37°C 수조로 옮깁니다.
참고: iPS-CM은 일반적으로 학술 또는 상업적 출처에서 드라이아이스로 배송됩니다. 그들은 사용 될 때까지 수령시 액체 질소 저장소로 옮겨집니다. - 얼음이 완전히 녹기 전에 바이알을 제거하고 바이알에 75 % 에탄올을 뿌립니다.
- 바이알을 Class II 생물안전 캐비닛으로 가져가 내용물을 실온 배지 9mL가 들어 있는 새로운 15mL 원뿔형 튜브에 부드럽게 옮깁니다.
- 실온에서 3분 동안 200 x g 의 셀을 원심분리합니다.
- 피펫으로 상청액을 버리고 세포를 10μM의 ROCK 억제제(Y27632)와 함께 1mL의 배지에 부드럽게 재현탁합니다( 재료 표 참조).
참고: 최대 세포 회수를 보장하기 위해 해동된 세포의 반복적인 피펫팅을 피하십시오. - 웰에서 코팅 용액을 제거하고 10μM의 ROCK 억제제와 함께 50μL의 배지를 빠르게 추가합니다.
- 혈구계15와 함께 트리판 블루 배제법을 사용하여 생존 세포의 수를 확인합니다.
- 제조업체의 지침에 따라 100,000-150,000 cell/cm2의 밀도로 코팅된 96웰 플레이트의 플레이트 셀16.
- 24 시간 후, 플레이트 표면에 부착 된 세포가 다른 세포와 접촉하는지 확인하십시오.
참고: 단일 세포는 장기 배양에서 잘 생존하지 못하고 일반적으로 더 다양하게 행동합니다. - 예열된 유지보수 유체는 2일마다 교체합니다.
참고: 장기 약물 치료를 위해 LVNC iPSC-CM은 2일마다 소분자 약물의 유무에 관계없이 절반 중간 교체로 교체되었습니다.
2. 유전적으로 암호화된 칼슘 지표의 발현
- 세포를 72시간 동안 플레이팅한 후 GECIs 바이러스 키트( 재료 표 참조)를 얼음에서 해동합니다.
- 유지 관리 매체로 2x 바이러스 키트 스톡 용액을 준비하십시오.
- 배지 부피를 웰당 100 μL로 조정하여 감염에 대비하여 세포를 준비합니다. 미리 혼합된 바이러스 용액 100μL를 추가하고 37°C에서 8-16시간 동안 배양합니다.
- 배양 후 200 μL 예열 배지로 교체하십시오.
- 이미징 시스템을 사용하여 형질도입 후 24시간 동안 GECI 발현을 시각화합니다( 재료 표 참조).
참고: 발현 수준은 형질도입 후 48-72시간에 최대값에 도달합니다. 세포는 24시간 시점부터 이미징할 수 있습니다. 그러나 GECI에서 얻은 신호는 한 달 이상 지속됩니다. - 기능 분석을 수행하기 전에 가습 인큐베이터에서 세포를 유지하십시오.
- 감염 프로토콜을 사용하여 분화 후 25일째에 iPSC-CMS(LVNC 환자 유래 iPSC-CM)를 ChR2-K-GECO 바이러스 키트( 재료 표 참조)로 감염시킵니다(단계 2.1-2.6).
3. Fluo-4를 이용한 염료 기반 칼슘 이미징
- Fluo-4 분말( 재료 표 참조)을 원액(5mM)으로 DMSO에 용해시킵니다.
- 스톡 용액을 Tyrode의 완충액에서 10μM Fluo-4의 농도로 희석합니다.
참고 : Tyrode의 완충액은 1.0g / L의 중탄산 나트륨, 0.2g / L의 염화칼슘, 0.1g / L의 염화 마그네슘, 0.2g / L의 염화칼륨, 8.0g / L의 염화나트륨, 0.05g / L의 인산나트륨 일 염기성 및 1.0g / L의 D- 포도당으로 구성됩니다. - 절반 배지를 10μM의 Fluo-4 용액으로 교체합니다(최종 농도 5μM 제공).
- 세포를 37°C에서 30분 동안 배양한다.
- 미리 예열된 Tyrode의 버퍼로 세포를 세척하고 이미지 획득 전에 배지로 교체합니다.
- 스트림 획득 프로토콜로 녹화를 시작합니다.
참고: 스트림 획득은 간격 시간 없이 지속적으로 이미지를 수집합니다. iPSC-CM의 박동 주파수는 약 1Hz이며 이 스트림 획득 프로토콜은 박동 패턴을 수집하는 데 사용됩니다.
4. 독성 시험 및 표현형 스크리닝을 위한 이미지 획득 및 기능 분석
- 하이콘텐츠 이미징 시스템의 모든 장치를 켭니다( 재료 표 참조).
- 챔버 온도가 37%CO2 보충으로 5°C에 도달하는지 확인합니다. 이미지를 획득하기 전에 시스템을 2시간 동안 평형 상태로 유지하십시오.
참고: 열 드리프트는 장기 라이브 셀 관찰에 중요한 문제이며, 1°C는 초점면을 ~1μm 변경할 수 있으므로 이미지 획득 전에 렌즈와 스테이지가 목표 온도에 도달하도록 하는 것이 필수적입니다. - 이미징 소프트웨어( 재료 표 참조)를 열고 96웰 플레이트의 플레이트 설정을 선택합니다.
- 뚜껑이 없는 96웰 플레이트를 챔버에 넣고 라이브 셀 밀봉 링을 위에 놓습니다.
알림: 라이브 셀 밀봉 링은 환경 평형에 도달하기 위한 어댑터입니다. - 필요한 공간 해상도에 따라 20x(그림 1 및 그림 2), 60x(그림 3 및 그림 4) 및 20x(그림 5) 수침 대물 렌즈를 선택하십시오.
- 실험적으로 획득하기 전에 선명한 이미지를 촬영하도록 초점을 조정합니다.
- 칼슘 활동 기록을 위해 웰당 무작위로 3-5개의 영역을 선택합니다.
참고: 모든 영역에는 최소 20개의 셀(n ≥ 20)이 포함되어야 합니다. - 다른 지표에 적합한 필터를 선택하십시오. mNG-GECO, mtGCEPIA3 및 Oria1-G-GECO에 대한 FITC 475/536; NIR-GECO2의 경우 Cy5 631/692; 에르-라르-게코의 경우 ER 530/593; K-GECO용 텍사스 레드 560/624.
- 사용되는 각 이미징 채널에 적합한 발광 다이오드(LED) 전원을 설정합니다.
알림: 신호(물체의 감지된 강도) 대 노이즈(감지된 배경 강도) 비율에 의한 이미징 획득을 위해 LED 전력을 최적화할 때 S/N 비율은 2보다 높아야 합니다. 이 프로토콜에서 TRITC 및 FITC를 위한 10% LED 전력; Cy5의 경우 20%가 일반적이었습니다. - 카메라 노출 시간을 최대 40ms(25Hz)로 설정하고 스트림 획득을 위한 기록 지속 시간을 30초로 설정하여 심근세포에서 발현되는 mNG-GECO 및 K-GECO 프로브에서 보고된 칼슘 과도 현상을 관찰합니다(그림 1-3 및 그림 5). 더 높은 프레임 속도에서 신호/노이즈가 <2인 경우 LED 전원을 늘립니다.
- 광유전학적 자극(그림 2 및 그림 3C, D)의 경우 1Hz에서 전력(일반적으로 5%-10%)과 청색광 주파수를 최적화합니다.
알림: 일반적으로 인간의 iPSC-CM은 약 ~ 1Hz에서 자발적으로 박동하며 작업자는 자발적인 속도보다 빠르게 페이스해야 합니다. - 순차(그림 3) 또는 확장(그림 4) 측정을 계획하는 경우 어떤 대가를 치르더라도 광독성을 피하십시오. 이는 예를 들어 세포하 Ca2+ 신호의 3채널 실시간 관찰에 사용되는 타임랩스 프로토콜을 사용하여 카메라 노출 시간을 100ms로 늘려 조명 전력 강도를 줄이고 이를 보상하는 것을 의미할 수 있습니다(그림 4).
- 자동 미세유체 시스템을 통해 10mM 카페인 첨가를 위해 비동기 디스펜스 프로토콜을 사용합니다( 재료 표 참조)(그림 4).
참고: 비동기 디스펜스 프로토콜을 사용하면 카페인과 같은 약물이 추가되는 동안 이미지 사이에 간격 없이 이미지 획득이 가능합니다. - 획득을 시작합니다.
5. 소분자 준비
- DMSO에서 E4031, 도페틸라이드 및 베라파밀을 다시 현탁하고 Tyrode의 완충액으로 희석합니다. 배지에서 DMSO의 최종 농도는 0.1 % (v / v)였다.
- 화합물 용액을 원하는 작동 농도의 이중(즉, 2x)으로 제조하고, 첨가 전에 37°C에서 평형을 이룬다.
알림: 수축성은 온도에 의존하고 온도 변화의 영향이 빠르기 때문에 매체 첨가 후 온도 변동을 최소화하는 것이 중요합니다. - 해당 표적 우물에 화합물을 배열하십시오.
- 자동 미세 유체 시스템(재료 표 참조)을 통해 이중 강도(2x) 화합물 100μL를 웰에 추가하고 원하는 인큐베이션 기간(일반적으로 15분) 후에 수집을 시작합니다.
6. 이미징 처리 및 분석
- 소프트웨어로 시간 회전에 따른 펄스의 특징을 자동으로 감지하여 신호 영역을 배경에서 분리합니다.
- 칼슘 피크 분석 소프트웨어( 재료 표 참조)를 사용하여 박동 빈도(BPM), 피크 신호(진폭), 칼슘 과도 지속 시간 50%(CTD50), 칼슘 과도 기간 90%(CTD90), 상승 시간 및 붕괴 시간을 분석합니다(그림 1C).
알림: 이러한 설정에서 광퇴색은 처음 10초 동안 분명했으며 그 이후에는 신호가 안정화되었습니다. 따라서, 칼슘 피크는 11-30 초에서 분석되었다. 3채널 기록(그림 4)에서 셀 윤곽은 강도 변화를 측정하기 위해 수동으로 경계가 지정됩니다.
Representative Results
약물 치료 유무에 관계없이 iPSC 유래 심근 세포 (iPSC-CM)에 의해 발현되는 mNG-GECO10의 자발적인 칼슘 진동 관찰은 그림 1 및 애니메이션 비디오 1에서 입증됩니다. mNG-GECO를 사용하여 얻은 동역학 트레이스는 저분자 이온 채널 억제제인 베라파밀, 도페틸라이드 및 E4031이 예상대로 칼슘 과도 현상에 영향을 미쳤음을 보여줍니다(그림 1B). 그림 1C에 표시된 일반적인 과도 칼슘은 칼슘 피크 분석 소프트웨어로 분석하여 피크 신호 (진폭), 칼슘 과도 지속 시간 50 % (CTD50), 칼슘 과도 지속 시간 90 % (CTD90), 상승 시간 및 붕괴 시간을 도출 할 수 있습니다. L형 칼슘 차단제(17)인 베라파밀은 예상대로 세포 내의 칼슘 유입을 완전히 억제한다(도 1B). 도페틸라이드 및 E4031은 hERG 채널 억제제18,19,20이며 실험 클래스 III 항부정맥제로 등재되어 있습니다. 붕괴 시간은 비히클 그룹과 비교할 때 Dofetilide (p < 0.05) 및 E4031 처리 (p < 0.001) 모두에서 연장됩니다. E4031 처리에 의한 CTD50 (p < 0.01) 및 CTD90 (p < 0.001)의 연장은 비히클 단독 (표 1)과 비교하여 관찰되었으며, 이들 결과는 Q-파의 시작과 T-파의 끝 사이의 오랜 시간으로부터 표면 심전도로부터 결정된 임상적으로 관련된 재분극 측정인 QT 간격에 대한 보고된 효과와 일치하며, 이전 연구12,21에서.
자발적으로 박동하는 세포에서 CTD 평가의 어려움은 CTD에 부과되는 가변성 박동률입니다. 이것은 iPSC-CM 모델의 경우 특히 문제로, 모든 셀이 동일한 모 바이알에서 나오더라도 96웰 플레이트의 각 웰이 자체 박동 속도를 가질 수 있습니다. 광학 또는 전기 페이싱에 의해 박동 속도를 부과 할 수 있습니다. 표준화된 진행 조건에서 E4031의 용량-반응을 평가하기 위해 iPSC-CM을 발현하는 ChR2 및 K-GECO7은 1Hz 470nm 광 펄스를 사용하여 광학 제어되고 빨간색 K-GECO 신호를 사용하여 관찰되었습니다(그림 2A 및 보충 그림 1). 칼슘 과도 현상의 피크 진폭 (p < 0.01)의 점진적인 감소와 붕괴 시간의 증가 (p < 0.05)는 E4031의 농도가 증가함에 따라 발생합니다 (그림 2B1). E4031의 용량 의존적 효과는 피크 진폭의 감소에 대해 가장 분명했습니다(그림 2B1,B2).
몇 분 동안 지속되는 단기 연구가 일반적으로 심장 독성 평가에 사용되지만 몇 주, 몇 달 또는 몇 년에 걸쳐 약물에 대한 환자 노출과 병행하는 만성 독성 평가에는 사각 지대가 있습니다. 임상 실습과 관련된 치료 기간을 반영하는 간격에 걸쳐 질병 또는 독성 효과를 연구하는 것이 유리할 것입니다. 우리는 좌심실 비 압축 (LVNC) 환자의 iPSC 유래 심근 세포를 연구하기 위해 모든 광학 제어 및 검출 시스템을 활용했습니다. iPSC-CMs는 분화 25일째 K-GECO 바이러스 키트(단계 2.2-2.6)로 형질도입하였다. 그런 다음 K-GECO 신호는 추가 약물 치료 유무에 관계없이 동일한 웰에서 1-2 주마다 추적되었습니다. 광학 페이싱(그림 3C, D, 단계 4.11)에서 자발적인 칼슘 활성(그림 3A, 3B)과 칼슘 역학은 모두 고콘텐츠 이미징 시스템(4.1-4.12단계)을 사용하여 얻었으며 칼슘 피크 분석 소프트웨어(6단계)로 처리했습니다. 그림 3A, C에서 볼 수 있듯이 투명한 칼슘 과도 현상은 광학 페이싱에 사용되는 추가 광의 유무에 관계없이 바이러스 형질 도입 후 한 달 동안 계속 볼 수 있습니다. 이 연구는 LVNC iPSC-CM 모델에서 박동 속도를 증가시키고 수축 간격을 규칙화하며 일시적인 칼슘 진폭을 증가시키는 것으로 보이는 약물을 확인했습니다 (그림 3A, B). 이 데이터에서 두 가지 중요한 관찰이 있습니다. 첫째, 치료 적 관점에서 약물 효과는 63 일 및 70 일째 시점에서 지속되는 것으로 보입니다. 둘째, 일반적으로 분석에서 초기 시점 (일반적으로 <50 일)에서 짧은 창 (<1 분) 동안 복합 효과를 분석하는 분야와 관련이 있습니다. 화합물의 질병 표현형 변형 효과는 60 일 후에 만 분명하며, 이는 표준 스크리닝 프로토콜에서 느린 작용 메커니즘을 갖는 약물을 할인하는 것이 쉬울 수 있음을 시사합니다.
박동 빈도의 가변성과 칼슘 과도 지속 시간에 대한 후속 영향은 주어진 시점에서 단지 우물 대 우물 문제가 아닙니다. 또한 iPSC-CM이 배양에서 유지됨에 따라 변화하며, 이는 시간이 지남에 따라 웰 내에서 변합니다(그림 3B). 순차적 실험 내에서 일관성을 유지하기 위해 약물 치료 유무에 관계없이 1Hz 광학 페이싱을 적용할 수 있습니다(그림 3C,D). 여기서 Day 63 결과는 상당히 더 높은 진폭, 더 짧은 CTD90 및 더 짧은 붕괴 시간을 갖는 칼슘 과도 현상의 고무적인 경향을 보여주지만; 70일 시점까지 - 희귀 질환에 대한 약물 스크리닝 과정 동안 만성 평가의 필요성을 나타내고 - 탈분극(EAD)이 검출된 후 조기에 이루어진다. 질병 표현형 또는 소분자 평가에 페이싱 프로토콜을 추가하는 가치는 박동 속도, 칼슘 과도 진폭, CTD90 및 붕괴 시간에 대해 그림 3B, D에 제시된 결과를 비교하여 정성적으로 평가할 수 있습니다.
화학 염료와 비교하여 과도 칼슘을 시각화하는 GECI의 장점은 프로브를 세포 내의 특정 구획으로 제한하는 능력입니다. 이것은 단일 셀에서 다수의 색상 및/또는 친화성 변형을 멀티플렉싱함으로써 더욱 확장될 수 있다. 따라서, ER-LAR-GECO9, mtGCEPIA 22,23 (또는 Oria1-G-GECO) 및 NIR-GECO2 8,24를 포함한 여러 GECI는 소포체/근핵 세망(ER/SR), 미토콘드리아 (또는 CRAC 채널) 및 세포질에서 각각 발생하는 실시간 칼슘 활성 측정을 위한 세포 모델에서 단독으로 또는 조합하여 발현하기 위해 개발되었다. 이들은 iPSC-CM 모델 (그림 4A, C)에서 결합하여 서로 다른 세포 내 칼슘 저장소 간의 상호 작용을 연구 할 수 있습니다. 예를 들어, 10mM 카페인 치료를 사용하여 SR 칼슘 저장소를 비울 수 있습니다. 여기서 ER-LAR-GECO 신호의 감소 (SR에서 칼슘 손실을 나타냄)는 예상대로 NIR-GECO 신호 (세포질 칼슘 농도의 증가를 나타냄)의 감소와 병행했습니다. 다른 세포 내 구획이 이러한 변동에 의해 어떻게 영향을 받는지는 잘 연구되지 않았다. 그럼에도 불구하고 녹색 미토콘드리아 표적 mtGCEPIA3를 포함하면 이러한 조건에서 미토콘드리아에서 칼슘 흡수가 발생한다는 것을 알 수 있습니다(그림 4A,B).
유사하게, 서로 다른 칼슘 전류 간의 상호 작용을 시각화하는 것은 칼슘 방출 활성화 채널 (CRAC)Ca2+ 전류를 밝히기 위해 프로브 Orai1-G-GECO25를 포함하여 볼 수 있습니다 (그림 4C, D). iPSC-CM 모델에서 이 신호는 자발적인 세포질 칼슘 과도 현상에 따라 증가합니다(그림 4D1,D2). 이에 따라 카페인 치료는 세포질과 Orai1 채널 모두에서 큰 칼슘 과도성을 유발합니다.
심근 세포 모델에서 대부분의 칼슘 과도 영상화는 칼슘 염료26을 사용하여 결정되었다는 것이 인정된다. 유전적으로 암호화된 칼슘 지표를 iPSC 유래 심근세포 모델의 화학 염료와 비교하여 다양한 칼슘 이미징 접근 방식을 나란히 비교할 수 있었습니다. iPSC-CM을 발현하는 K-GECO는 Fluo-4 로딩 세포와 함께 이미지화되었습니다. K-GECO 발현 심근 세포는 시간이 지남에 따라 일관된 박동 거동을 보였다 (그림 5A, C). 그러나 Fluo-4 로딩은이 모델의 비트 주파수와 CTD 모두에 영향을 미쳤으며 (그림 5B, C) Fluo-4 자체가 이러한 실험 결과에 영향을 미칠 수 있음을 시사합니다. 이는 이미징 프로브에 장기간 노출된 후 특히 그러하며, 웰당 웰별 웰 시간으로 웰 바이 웰 이미징이 발생하는 경우 다중벽 이미징 형식에서 발생할 수 있습니다.
그림 1: iPSC 유래 심근세포에 적용된 소분자 이온 채널 억제제. (A-B) 25Hz에서 촬영한 mNG-GECO를 발현하는 iPSC-CM의 타임랩스 이미지. 스케일 바 = 50 μm. (B) 화합물 첨가 후의 대표적인Ca 2+ 진동. mNG-GECO 발현 세포로부터 얻은 형광 신호는 형광 비율 F/F0으로 제시되며, 여기서 F0는 기저 강도로 정의되고 F는 각 시점에서 검출된 강도로 정의됩니다. (C) 칼슘 피크 분석 소프트웨어는 절반 최대 폭 (CTD50), 90 % 과도 기간 (CTD 90), 상승 시간 및 붕괴 시간을 포함한 매개 변수를 추출 할 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 광학 페이싱 시스템 내에서 hERG 억제제 E4031을 사용한 용량-반응 예. (A) 다양한 농도의 E4031에서 10% 청색광을 사용한 광학 자극의 흔적. 25Hz에서 촬영한 K-GECO를 발현하는 iPSC 유래 심근세포의 타임랩스 이미지. (B1) 다양한 화합물 용량으로 얻은 칼슘 과도 현상의 대표적인 흔적. 진폭 (B2) 및 감쇠 시간 (B3)에서 E4031의 피크 분석 및 용량 반응. 파란색 막대는 1Hz 470nm 펄스 광 자극을 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: LVNC 환자 유래 심근세포에서 장기 약물 표현형 스크리닝에 적용된 전광학 플랫폼. (A) 환자 유래 심근 세포에서 자발적 박동 활성의 대표적인 흔적 (분화 후 70 일) (빨간색) 또는 (파란색) 5 μM 약물 치료없이. (B) 5 μM 약물 치료 유무에 관계없이 자발적 박동 활성의 피크 분석. (C) 1Hz 광학 자극 하에서 환자 유래 iPSC-CM에서 약물 반응의 강도 흔적. (D) 1Hz 광학 자극을 이용한 환자 유래 심근 세포의 피크 분석. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: iPSC-CM 모델에서 3채널 세포하Ca 2+ 이미징. (A-B) iPSC-CM은 세포질, NIR-GECO2 (적색), 소포체 ER-LAR-GECO (황색) 및 미토콘드리아Ca2+ 지표인 mtGCEPIA3 (청록색)에 대한 세포하 칼슘 프로브로 형질도입하였다. (B) 10mM 카페인 치료 전후의 3채널 타임랩스 칼슘 영상. (C-D) 세포질, NIR-GECO2 (적색), 소포체 ER-LAR-GECO (황색) 및 CRAC 채널 지표 Orai1-G-GECO (청록색)로 형질도입된 iPSC-CM을 시각화하였다. (d) 3채널 타임랩스 칼슘 이미징을 캡처하였다. (D1) NIR-GECO2 및 Orai1-G-GECO에서 자발적인 박동 간 활동이 관찰되었습니다. (D2) ER로부터의 칼슘 유출 (ER-LAR-GECO 신호의 감소)은 카페인 치료시 세포질 칼슘 신호의 증가를 동반했다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: iPSC-CM에서 유전적으로 암호화된 칼슘 지시약(K-GECO)과 화학적 칼슘 민감성 염료(Fluo-4)의 비교. (A-B) K-GECO(A) 및 Fluo-4(B)의 대표적인 칼슘 흔적이 시간이 지남에 따라 제시됩니다. (C) K-GECO 형질도입 또는 Fluo-4 로딩 iPSC-CM의 칼슘 과도 분석. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 증권 시세 표시기 | CTD50 (들) | CTD90 (들) | 진폭 (F / F0) | 상승 시간 | 감쇠 시간 (s) | |
| 차량 (0.1 % DMSO) | 112.3657+/-10.95 | 0.25+/-0.04 | 0.41+/-0.01 | 1.99+/-0.02 | 0.07+/-0.01 | 0.28+/-0.01 |
| 베라파밀 (1 uM) | 0 | - | - | - | - | - |
| 도페틸라이드 (5 nM) | 103.42+/-9.87** | 0.23+/-0.03 | 0.46+/-0.03 | 1.91+/-0.03 | 0.07+/-0.01 | 0.35+/-0.02* |
| E4031 (30 nM) | 75.73+/-12.08*** | 0.37+/-0.04** | 0.58+/-0.08*** | 1.55+/-0.02** | 0.11+/-0.04*** | 0.35+/-0.07** |
표 1: iPSC-CM 모델에서 과도 칼슘 파라미터에 대한 화합물 첨가의 효과. 유의 값은 *(p ≤ 0.05), **(p < 0.01) 및 ***(p < 0.001)로 표시됩니다.
애니메이션 비디오 1: 자발적인 칼슘 활성은 비히클만 있는 iPSC 유래 심근세포에서 mNG-GECO에 의해 관찰되었습니다. 그레이 스케일 이미지의 의사 컬러 동영상이 제공됩니다. 이 비디오를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 그림 1: 아데노바이러스 벡터의 개략적 표현. 여기에는 채널 로돕신 ChR2가 액추에이터로, 적색 형광 칼슘 지표 K-GECO가 전광학 분석을 위한 칼슘 리포터로 포함됩니다. 빛에 민감한 이온 채널은 가시 스펙트럼의 청록색 범위의 빛에 의해 흥분성 세포가 탈분극되도록 합니다. 이들 실험에는 470 nm 광이 사용되었다. 흥분성 세포의 칼슘 과도 현상은 녹색 여기 광이 필요한 K-GECO에 의해 동시에 이미징되어 적색 방출을 생성합니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
Discussion
고처리량 스크리닝을 성공적으로 수행하려면 신호가 배양 용기 전체에 고르게 분포되어 이미징 획득 중에 무작위로 선택된 관심 영역(ROI)이 자동으로 적용될 수 있어야 합니다. 화학적 칼슘 지표는 이 요구 사항을 쉽게 충족하지만 유전적으로 암호화된 프로브는 역사적으로 사용을 제한하는 신호 시트가 아닌 패치를 생성했습니다. 바이러스 형질도입 시스템의 사용은 종래의 형질주입 방법에 비해 표적 세포 사이에서 다중 지표의 높은27,28 및 동등한 발현 수준을 제공한다. 상이한 세포 유형은 상이한 프로모터를 필요로 할 수 있고, 유전자 전달 시스템의 선택은 그에 따라 변경될 필요가 있을 수 있다(29,30,31). 불균질 세포 모델에서, 형질도입 및 발현 효율은 특정 세포 유형에서 상이할 수 있다. 한편으로, 이것은 특정 세포에 대한 적용을 제한할 수 있지만, 이 현상은 공동배양 시스템(32)에서 특정 세포를 구별하기 위해 이용될 수 있다.
이 접근법의 주요 영향은 자동화를 통해 실험자와 샘플 간의 일대일 관계에서 해방된다는 것입니다. 표준 다중 웰 실험에서 단일 웰 내의 4개 위치에서 데이터를 수집하기 위해 현미경으로 96웰 플레이트에서 30초 비디오를 수집하는 데 약 15시간이 걸린다고 추정합니다. 자동화 시스템에서는 ~ 4 시간이 걸립니다. 또한 데이터를 수동으로 분석하는 것은 데이터 수집보다 훨씬 오래 걸립니다. 여기에 사용 된 분석 시스템은 수동 시스템보다 약 200 배 빠릅니다. 결과적으로 워크플로가 개선되고 비용과 시간이 크게 절약됩니다.
칼슘 염료가 적재 된 1 차 심근 세포가 몇 시간 동안 생존하는 것과는 달리, 바이러스 전달 시스템을 통해 iPSC-CM에서 발현 된 GECI는 몇 달 동안 지속되는 실험 모델에서 신호를 생성 할 수 있습니다. 이러한 모델은 멀티 웰 형식으로 유지 관리될 수 있으며 소분자 스크리닝을 위해 개발된 고함량 이미징 시스템에서 직렬 분석을 위해 동시에 추적할 수 있습니다. 이는 독성 분석에 일반적으로 사용되는 시간(몇 분 또는 몇 달)이 아닌 환자가 경험하는 기간(몇 주 또는 몇 달)에 더 가까운 기간 동안 약물 효과를 테스트할 수 있는 간단한 인간 실험 플랫폼을 생성합니다.
이 시스템은 녹색에서 근적외선까지 뚜렷한 방출 특성을 가진 GECI를 포함하여 다중 파라미터 측정을 제공하도록 확장할 수 있습니다. 이러한 실험에는 신호를 별도로 유지하기 위해 실험 설계에서 적절한 여기광과 필터 세트가 필요합니다. 약물 스크리닝 맥락에서 광범위하게 적용하려면 약물 분주 외에도 강력하고 효율적인 분석 플랫폼이 필요합니다. 여기에 설명된 모델은 여러 동적 칼슘 지표의 사용에 초점을 맞추고 있지만 이는 세포 형태 또는 기능의 구조적 마커로 수정될 수 있습니다. 이들은 일반적으로 세포 내 칼슘 농도의 100 배 변동에 비해 비트 간 변동성이 거의 없기 때문에 시각화하기가 더 쉽습니다. 이 접근법은 환자로부터 유래된 iPSC 중간체가 확장 가능한 세포 모델에서 보존될 수 있는 특정 상태의 모든 유전적 동인 및 변형자를 포함할 수 있는 희귀 질환에 특히 유용할 수 있으며, 해명하기 어려울 수 있는 토대 생물학적 메커니즘과 독립적으로 시각화할 수 있는 세포 표현형을 기반으로 다양한 질병에서 약물 발견을 용이하게 합니다.
Disclosures
LumiSTAR는 K-GECO, NIR-GECO 및 LAR-GECO 사용에 대한 특허 보호를 신청했습니다.
Acknowledgments
자료와 귀중한 토론을 공유해 주신 도쿄 대학의 Robert Campbell 교수에게 감사드립니다. 기술 지원을 위한 분자 장치의 Chia-Lin Ho 박사.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 96-well plate | Perkin Elmer | 6055302 | |
| auto microfluidic system | Molecular Device | A device has a single channel pipetter that can be used to add compound automatically | |
| Caffeine | Sigma-Aldrich | C0750 | |
| Cardiosight-S l iPSC derived cardiomyocytes | NEXEL | C-002 | |
| Dimethyl sulfoxide | Millipore Sigma | 1096780100 | |
| Dofetilide | Sigma-Aldrich | PZ0016 | |
| E4031 | Tocris | 1808 | |
| ER-LAR-GECO viral kit | LumiSTAR | AA001a | Red-shifted GECI packed into adeno-viral vector |
| Fibronectin | Sigma-Aldrich | F1141 | |
| Fluo-4 AM | Invitrogen | F14201 | Chmical calcium sensitive dye |
| Gelatin | Sigma-Aldrich | G1890 | |
| ImageXpress Micro Confocal High-Content Imaging System | Molecular Device | ||
| iPSC-CMs Maintenance Medium | NEXEL | CMS-002 | iPSC-CMs Medium (Cardiosight-S medium) + Cardiosight-S Supplement |
| iPSC-CMs Medium (Cardiosight-S medium) | NEXEL | CMS-002 | |
| K-GECO viral kit | LumiSTAR | AA005a | Red-shifted GECI packed into adeno-viral vector |
| LumiCAL software | LumiSTAR | LUCS01a | Software for analysis of calcium peak in cardiomyocytes |
| mNG-GECO viral kit | LumiSTAR | AL008a | Brighter green GECI packed into lenti-viral vector |
| mt-GCEPIA3 viral kit | LumiSTAR | AL011a | GECI targgeting on mitochondria packed into lenti-viral vector |
| NIR-GECO viral kit | LumiSTAR | AV004a | Near infrared GECI packed into viral vector |
| Orai1-GGECO viral kit | LumiSTAR | AL010a | GECI targgeting on Orai1 packed into lenti-viral vector |
| Tyrode's salts | Sigma-Aldrich | T2145 | |
| Verapamil hydrochloride | Sigma-Aldrich | V4629 | |
| Y-27632 dihydrochloride | Tocris | 1254 |
References
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