Summary
Denne protokollen beskriver all-optisk kontroll og observasjon av utløst cellulær aktivitet i iPSC-avledede kardiomyocytter (iPSC-CMs) for høy gjennomstrømning narkotika screening og toksisitetstesting. Multiparametrisk kvantifisering av fenotypiske mønstre i tid og rom er vist. Langtidseffekter av legemidler over timer, eller sekvensielle målinger over dager, er demonstrert.
Abstract
Å forstå hvordan spennende celler fungerer i helse og sykdom, og hvordan den oppførselen kan endres av små molekyler eller genetisk manipulasjon er viktig. Genetisk kodede kalsiumindikatorer (GECIer) med flere emisjonsvinduer kan kombineres (f.eks. for samtidig observasjon av distinkte subcellulære hendelser) eller brukes i utvidede applikasjoner med andre lysavhengige aktuatorer i spennende celler (f.eks. kombinere genetisk kodet optogenetisk kontroll med spektralt kompatible kalsiumindikatorer). Slike tilnærminger har blitt brukt i primære eller stamcelleavledede nevroner, kardiomyocytter og beta-celler i bukspyttkjertelen. Det har imidlertid vært utfordrende å øke gjennomstrømningen, eller varigheten av observasjon, av slike tilnærminger på grunn av begrensninger i instrumentene, analyseprogramvare, indikatorytelse og genleveringseffektivitet. Her kombineres en høyytelses grønn GECI, mNeonGreen-GECO (mNG-GECO) og rødforskjøvet GECI, K-GECO, med optogenetisk kontroll for å oppnå all-optisk kontroll og visualisering av cellulær aktivitet i et bildeformat med høy gjennomstrømning ved hjelp av et High-Content Imaging System. Søknader som demonstrerer kardiotoksisitetstesting og fenotypisk legemiddelscreening med friske og pasientavledede iPSC-CM-er er vist. I tillegg er multiparametriske vurderinger ved bruk av kombinasjoner av spektral- og kalsiumaffinitetsindikatorvarianter (NIR-GECO, LAR-GECO og mtGCEPIA eller Orai1-G-GECO) begrenset til forskjellige cellulære rom også demonstrert i iPSC-CM-modellen.
Introduction
Human-based induced pluripotent stem cells (iPSC)-avledede modeller anses som en lovende løsning på 3R-målene (Replacement, Reduction, and Refinement) som er angitt for dyreforsøk 1,2. iPSC-avledede kardiomyocytter har blitt brukt til sykdomsmodellering og legemiddeloppdagelse når de rekapitulerer viktige aspekter ved menneskelig biologi3. Kalsiumavbildning, vanligvis med kjemiske fargestoffer, har blitt brukt til å observere cellulær aktivitet før og etter medikamentell behandling 4,5. Imidlertid hemmer kjemiske fargestoffbaserte kalsiumfølerprober direkte Na, K-ATPase og forstyrrer cellulær funksjon6. Dermed har sporing av de samme cellene over timer eller dager vært problematisk når kjemiske fargestoffer brukes. Her benyttes en rekke genetisk kodede kalsiumindikatorer (GECIer)7,8,9,10 over et bredt eksitasjons- / utslipps- og kalsiumaffinitetsspekter for å danne en plattform for testing av hjertetoksisitet som tilbyr sanntids multiorganelle målinger over lengre tidsperioder 11.
For å videreutvikle det kalsiumbaserte screeningkonseptet med høy gjennomstrømning i iPSC-CM-modellen utover den tidligere demonstrerte akademiske konteksten ved hjelp av genetisk kodede verktøy for optisk kontroll og kalsiumavbildning ved samuttrykk av en rødforskjøvet kalsiumindikator, R-GECO eller K-GECO med et optogenetisk verktøy, har ChR212,13, hyllevare virale sett blitt generert. Ved å overføre avbildning til et høyt innholdsinstrument utstyrt med et auto-mikrofluidisk system, blir enkanals pipettering av sammensatt tilsetning lagdelt på toppen av levende celleavbildning. Til slutt forbedres og automatiseres både viktige aspekter ved eksperimentell vei, bildebehandling og analyse.
Protocol
Venstre ventrikkel non-compaction kardiomyopati (LVNC) pasient iPSC-avledede kardiomyocytter (iPSC-CM) ble levert av National Taiwan University Hospital. Innsamlingen av pasientprøver for omprogrammering til iPSC og vedlikeholdsprotokollene14 for forskningsformål fulgte WMA-erklæringen fra Helsinki (etiske prinsipper for medisinsk forskning som involverer mennesker) og ble godkjent av Institutional Review Board: Research Ethics Committee Office ved NTUH (#201612099RINC). Andre iPSC-CM-er ble hentet fra kommersielle leverandører. Bruken av iPSC-derivater krever ikke spesifikke tillatelser i vår institusjon.
1. iPSC-avledet kardiomyocyttpreparat
- Forbered flerbrønnsplaten før iPSC-CM fjernes fra kjølelager for tining. Belegg hver brønn i mikroplaten med 96 brønner med 100 μL 50 μg/ml fibronektin/0,2 % gelatinoppløsning (se materialfortegnelse) for å dekke alle overflater grundig.
- Inkuber platen ved 37 °C i 1 time i en fuktet inkubator.
- Varm mediet (se Materialfortegnelse) til romtemperatur i 30 minutter før celletining.
MERK: Denne protokollen beskriver romtemperatur som 25 °C. - Overfør iPSC-CM fra lagringstanken for flytende nitrogen til et vannbad på 37 °C.
MERK: iPS-CM-er sendes vanligvis på tørris av akademiske eller kommersielle kilder. De overføres til lagring av flytende nitrogen ved mottak til bruk. - Fjern hetteglasset før isen smelter helt og spray hetteglasset med 75% etanol.
- Ta hetteglasset til et klasse II biosikkerhetsskap og overfør innholdet forsiktig til et nytt 15 ml konisk rør som inneholder 9 ml romtemperaturmedium.
- Sentrifuge cellene ved 200 x g i 3 minutter ved romtemperatur.
- Kast supernatanten med pipette og resuspender cellene forsiktig i 1 ml medium med 10 μM ROCK-hemmer (Y27632) (se Materialfortegnelse).
MERK: Unngå gjentatt pipettering av tinte celler for å sikre maksimal cellegjenoppretting. - Fjern beleggoppløsningen fra brønnen og tilsett 50 μL medium med 10 μM ROCK-hemmer raskt.
- Bekreft antall levedyktige celler ved hjelp av trypanblå eksklusjonsmetode med et hemocytometer15.
- Plateceller i belagt 96-brønnsplate med en tetthet på 100 000-150 000 celler / cm2, i henhold til produsentens instruksjoner16.
- Etter 24 timer, sørg for at cellene festet til overflaten av platen er i kontakt med andre celler.
MERK: Enkeltceller overlever dårlig i langvarig kultur og oppfører seg vanligvis mer variabelt. - Skift ut forvarmet vedlikeholdsmedium hver 2.
MERK: For langvarig medikamentell behandling ble LVNC iPSC-CM endret med halv middels erstatning med eller uten småmolekylære legemidler hver 2.
2. Uttrykk for genetisk kodede kalsiumindikatorer
- Etter plating cellene i 72 timer, tine GECIs viral kits (se tabell over materialer) på is.
- Forbered en 2x viral kit lagerløsning med vedlikeholdsmediet.
- Forbered cellene for infeksjon ved å justere mediumvolumet til 100 μL per brønn. Tilsett 100 μL av den ferdigblandede virusoppløsningen og inkuber i 8-16 timer ved 37 °C.
- Bytt ut med 200 μL forvarmet medium etter inkubering.
- Visualiser GECIs uttrykk 24 timer etter transduksjon ved hjelp av et bildebehandlingssystem (se Tabell over materialer).
MERK: Uttrykksnivået når maksimum ved 48-72 timer etter transduksjon. Celler kan avbildes fra 24 timers tidspunkt. Signalene hentet fra GECIer opprettholdes imidlertid i mer enn en måned. - Opprettholde celler i den fuktede inkubatoren før funksjonelle analyser utføres.
- Infiser iPSC-CMs (LVNC pasientavledede iPSC-CMs) med ChR2-K-GECO viral kit (se Materialfortegnelse) på dag 25 etter differensiering ved bruk av infeksjonsprotokollen (trinn 2.1-2.6).
3. Fargebasert kalsiumavbildning ved bruk av Fluo-4
- Fluo-4 pulver (se materialfortegnelse) i DMSO som stamløsning (5 mM).
- Fortynn stamløsningen til en konsentrasjon på 10 μM Fluo-4 i Tyrodes buffer.
MERK: Tyrodes buffer består av 1,0 g / l natriumbikarbonat, 0,2 g / l kalsiumklorid, 0,1 g / l magnesiumklorid, 0,2 g / l kaliumklorid, 8,0 g / l natriumklorid, 0,05 g / l natriumfosfat monobasisk og 1,0 g / l D-glukose. - Bytt ut halvmedium med 10 μM Fluo-4-løsning (gir en endelig konsentrasjon på 5 μM).
- Inkuber cellene ved 37 °C i 30 minutter.
- Vask cellene med forvarmet Tyrodes buffer og erstatt dem med mediet før bildeopptak.
- Start opptaket med protokollen for innsamling av strømmer.
MERK: Stream acquisition henter kontinuerlig bilder uten intervalltid. Beatfrekvensen til iPSC-CM er omtrent 1 Hz, og denne strøminnsamlingsprotokollen brukes til å samle slagmønstre.
4. Bildeoppkjøp og funksjonelle analyser for toksisitetstest og fenotypisk screening
- Slå på alle enhetene i High-Content Imaging System (se Materialfortegnelse).
- Kontroller at kammertemperaturen når 37 °C, med 5 % CO2-tilskudd . Hold systemet i likevekt i 2 timer før bildeopptak.
MERK: Termisk drift er et betydelig problem for langsiktige levende celleobservasjoner, 1 ° C kan endre fokalplanet med ~ 1 μm, så det er viktig å la linsen og scenen nå måltemperaturen før bildeopptak. - Åpne bildebehandlingsprogramvaren (se Materialfortegnelse) og velg plateinnstillingen for en plate med 96 brønner.
- Plasser en ulokket 96-brønnplate inn i kammeret og last med strømførende celleforseglingsring på toppen.
MERK: Den levende celleforseglingsringen er en adapter for å nå miljølikevekt. - Velg 20x (figur 1 og figur 2), 60x (figur 3 og figur 4) og 20x (figur 5) vanninnlevelsesobjektiv i henhold til den romlige oppløsningen som kreves.
- Juster fokuset for å ta klare bilder før eksperimentell innsamling.
- Velg 3-5 regioner tilfeldig per brønn for kalsiumaktivitetsopptak.
MERK: Hver region må inneholde minst 20 celler (n ≥ 20). - Velg passende filtre for ulike indikatorer. FITC 475/536 for mNG-GECO, mtGCEPIA3 og Oria1-G-GECO; Cy5 631/692 for NIR-GECO2; ER 530/593 for ER-LAR-GECO; Texas Rød 560/624 for K-GECO.
- Still inn riktig LED-strøm (Light-emitting Diode) for hver bildekanal som brukes.
MERK: Når du optimaliserer LED-strøm for bildeopptak ved signal (oppdaget intensitet av objekt) til støy (oppdaget intensitet av bakgrunn) forhold, bør S / N-forholdet være høyere enn 2. I denne protokollen, 10% LED-strøm for TRITC og FITC; 20% for Cy5 var typisk. - Still kameraets eksponeringstid til maksimalt 40 ms (25 Hz) og en opptaksvarighet på 30 sfor strømopptak for å observere kalsiumtransienter rapportert av mNG-GECO- og K-GECO-prober uttrykt i kardiomyocytter (figur 1-3 og figur 5). Øk LED-effekten hvis signalet/støyen er <2 ved høyere bildefrekvens.
- For optogenetisk stimulering (figur 2 og figur 3C, D), optimaliser effekten (vanligvis 5% -10%) og frekvensen av blått lys ved 1 Hz.
MERK: Generelt slår menneskelig iPSC-CM spontant rundt ~ 1 Hz, og operatøren må tempo raskere enn spontan hastighet. - Hvis sekvensielle (figur 3) eller utvidede (figur 4) målinger er planlagt, unngå fototoksisitet for enhver pris. Dette kan bety å redusere belysningseffektintensiteten og kompensere for dette ved å øke kameraets eksponeringstid, for eksempel til 100 ms med time-lapse-protokollen som brukes til trekanals sanntidsobservasjon av subcellulære Ca2+ -signaler (figur 4).
- Bruk den asynkrone dispenserprotokollen for 10 mM koffeintilsetning via automikrofluidikksystemet (se materialtabell) (figur 4).
MERK: Den asynkrone dispenserprotokollen tillater bildeinnhenting å skje mens stoffer som koffein tilsettes, uten mellomrom mellom bildene. - Start oppkjøpet.
5. Preparat av små molekyler
- Resuspend E4031, dofetilide og verapamil i DMSO og fortynn dem med Tyrodes buffer. Den endelige konsentrasjonen av DMSO i mediet var 0,1 % (v/v).
- Klargjør de sammensatte oppløsningene ved dobbel (dvs. 2x) ønsket arbeidskonsentrasjon og likevekt ved 37 °C før tilsetning.
MERK: Minimering av temperatursvingninger etter middels tilsetning er viktig da kontraktilitet er temperaturavhengig, og effekten av å endre temperatur er rask. - Ordne forbindelser til det tilsvarende målet godt.
- Tilsett 100 μL av forbindelsene med dobbel styrke (2x) via automikrofluidikksystemet (se materialtabell) i brønnene og start innsamlingen etter ønsket (typisk 15 min) inkubasjonsperiode.
6. Bildebehandling og analyse
- Isoler signalområdet fra bakgrunnen ved å oppdage funksjonen til pulsen over tidsrevolusjon automatisk med programvaren.
- Bruk programvaren Kalsiumtoppanalyse (se Materialfortegnelse) til å analysere slagfrekvens (BPM), toppsignal (amplitude), kalsiumforbigående varighet 50 % (CTD50), kalsiumforbigående varighet 90 % (CTD90), stigningstid og henfallstid (figur 1C).
MERK: I disse innstillingene var fotobleking tydelig over de første 10 s, og signalene stabiliseres etter det. Dermed ble kalsiumtoppen analysert fra 11-30 s. I trekanalsopptak (figur 4) kantes cellekonturen manuelt for måling av intensitetsendring.
Representative Results
Observasjon av spontan kalsiumoscillasjon i mNG-GECO10 uttrykt ved iPSC-avledede kardiomyocytter (iPSC-CMs) med eller uten medikamentell behandling er vist i figur 1 og animert video 1. Kinetiske spor oppnådd ved bruk av mNG-GECO viser at små molekylære ionekanalhemmere, verapamil, dofetilid og E4031, påvirket kalsiumtransienter (figur 1B) som forventet. Den typiske kalsiumtransienten vist i figur 1C kan analyseres med kalsiumtoppanalyseprogramvare for å utlede toppsignal (amplitude), kalsiumforbigående varighet 50% (CTD50), kalsiumforbigående varighet 90% (CTD90), stigningstid og forfallstid. Verapamil, en L-type kalsiumblokker17, hemmer fullstendig kalsiumtilstrømningen i cellene som forventet (figur 1B). Dofetilid og E4031 er hERG-kanalhemmere18,19,20, oppført som eksperimentelle antiarytmiske legemidler i klasse III. Nedbrytningstiden forlenges med både Dofetilide (p < 0,05) og E4031 behandling (p < 0,001) sammenlignet med kjøretøygruppen. Forlengelse av CTD50 (p < 0,01) og CTD90 (p < 0,001) med E4031-behandling ble observert sammenlignet med kun vehikke (tabell 1), disse resultatene er i samsvar med rapporterte effekter på QT-intervallet, en klinisk relevant måling av repolarisering bestemt fra overflateelektrokardiogrammet fra lang tid mellom starten av Q-bølgen og slutten av T-bølgen, i tidligere studier 12,21.
En vanskelighet med CTD-vurdering ved spontant å slå celler er variabilitetsrytmen som pålegges CTD. Dette er et spesielt problem for iPSC-CM-modellen, der hver brønn i en 96-brønnplate kan ha sin egen slaghastighet, selv om alle cellene kommer fra samme foreldrehetteglass. Det er mulig å pålegge en slaghastighet ved optisk eller elektrisk pacing. For å evaluere dose-responsen til E4031 under standardiserte paced-forhold, ble ChR2 og K-GECO7 som uttrykker iPSC-CM optisk kontrollert ved hjelp av 1 Hz 470 nm lyspulser og observert ved hjelp av det røde K-GECO-signalet (figur 2A og supplerende figur 1). Progressiv reduksjon av maksimal amplitude (p < 0,01) og økning i henfallstid (p < 0,05) av kalsiumtransientene forekommer med økende konsentrasjoner av E4031 (figur 2B1). En doseavhengig effekt av E4031 var mest tydelig for reduksjonene i maksimal amplitude (figur 2B1, B2).
Selv om kortsiktige studier som varer minutter vanligvis brukes til kardiotoksisitetsvurderinger, er det en blind flekk for kroniske toksisitetsvurderinger som parallelle pasienteksponeringer for legemidler over uker, måneder eller år. Det vil være en fordel å studere sykdoms- eller toksisitetseffekter over intervallene som gjenspeiler behandlingsvarighetene som er relevante for klinisk praksis. Vi brukte vårt all-optiske kontroll- og deteksjonssystem for å studere iPSC-avledede kardiomyocytter fra en pasient med venstre ventrikkel ikke-komprimering (LVNC). iPSC-CMs ble transdusert med et K-GECO viralt sett (trinn 2.2-2.6) etter differensiering Dag 25. K-GECO-signalet ble deretter sporet hver 1-2 uke i de samme brønnene, med eller uten ytterligere medikamentelle behandlinger. Både spontan kalsiumaktivitet (figur 3A,3B) og kalsiumdynamikk under optisk pacing (figur 3C,D, trinn 4.11) ble oppnådd ved bruk av high-Content Imaging System (trinn 4.1-4.12) og behandlet med kalsiumtoppanalyseprogramvare (trinn 6). Som vist i figur 3A, C, forblir klare kalsiumtransienter synlige en måned etter viral transduksjon, med eller uten det ekstra lyset som brukes til optisk pacing. Dette arbeidet identifiserte et medikament som ser ut til å øke beatfrekvensen, regulere kontraksjonsintervallet og øke den forbigående kalsiumamplituden i LVNC iPSC-CM-modellen (figur 3A, B). Det er to viktige observasjoner å gjøre fra disse dataene. For det første, fra terapeutisk perspektiv, virker legemiddeleffekten holdbar på dag 63 og dag 70-tidspunkter. For det andre, og av relevans for et felt som generelt analyserer sammensatte effekter under korte vinduer (<1 min) på tidligere tidspunkter (typisk <50 dager); sykdomsfenotypemodifiserende effekter av forbindelsen er først tydelig etter dag 60, noe som tyder på at det kan være lett å diskontere legemidler som har langsomme virkningsmekanismer i standard screeningprotokoller.
Variasjonen i slagfrekvens, og den påfølgende innvirkningen på kalsiumtransientvarighet, er ikke bare et godt til brønnproblem på et gitt tidspunkt. Det endres også ettersom iPSC-CM opprettholdes i kultur, som varierer innen en brønn over tid (figur 3B). For å pålegge konsistens i sekvensielle eksperimenter, kan 1 Hz optisk pacing brukes med eller uten medikamentell behandling (figur 3C, D). Her selv om dag 63-resultatene viser de oppmuntrende trendene i kalsiumtransienten med en betydelig høyere amplitude, kortere CTD90 og kortere forfallstid; innen 70 dagers tidspunkt - og indikerer behovet for kroniske vurderinger under legemiddelscreeningsprosessen for sjeldne sykdommer - tidlig etter at depolariseringer (EAD) er oppdaget. Verdien av å legge til en pacing-protokoll til sykdomsfenotyping, eller evaluering av små molekyler, kan kvalitativt vurderes ved sammenligning av resultatene presentert i figur 3B, D for beat rate, kalsiumforbigående amplitude, CTD90 og henfallstid.
En fordel med en GECI, sammenlignet med kjemisk fargestoff, basert metodikk for å visualisere kalsiumtransienten, er evnen til å begrense sonden til et bestemt rom i en celle. Dette kan utvides ytterligere ved å multiplekse flere farge- og/eller affinitetsvarianter i enkeltceller. Derfor er flere GECIer, inkludert ER-LAR-GECO9, mtGCEPIA 22,23 (eller Oria1-G-GECO) og NIR-GECO2 8,24, utviklet for ekspresjon enkeltvis eller i kombinasjon i cellemodeller for sanntids kalsiumaktivitetsmåling som oppstår i henholdsvis endoplasmatisk retikulum / sarkoplasmatisk retikulum (ER / SR), mitokondrier (eller CRAC-kanal) og cytosol. De kan kombineres i iPSC-CM-modellen (figur 4A, C) for å studere samspillet mellom forskjellige intracellulære kalsiumbutikker. For eksempel kan 10 mM koffeinbehandling brukes til å tømme SR-kalsiumlageret. Her var en reduksjon av ER-LAR-GECO-signalet (indikativ for tap av kalsium fra SR) parallelt med en nedgang i NIR-GECO-signalet (indikativ for en økning i cytosolisk kalsiumkonsentrasjon) som forventet. Hvordan andre intracellulære rom påvirkes av disse svingningene, er ikke godt studert. Likevel viser inkluderingen av en grønn mitokondriemålrettet mtGCEPIA3 at kalsiumopptak forekommer i mitokondrier under disse forholdene (figur 4A, B).
På samme måte kan visualisering av samspillet mellom forskjellige kalsiumstrømmer ses ved å inkludere en sonde, Orai1-G-GECO25, for å avsløre kalsiumfrigivelsesaktivert kanal (CRAC) Ca2+ strøm (figur 4C, D). I iPSC-CM-modellen øker dette signalet med det spontane cytosoliske kalsiumet forbigående (figur 4D1, D2). I tråd med dette fremkaller koffeinbehandling en stor kalsiumforbigående i både cytosolen og fra Orai1-kanalen.
Det er anerkjent at de fleste kalsiumtransientavbildning i kardiomyocyttmodeller er bestemt ved bruk av kalsiumfargestoffer26. En genetisk kodet kalsiumindikator ble sammenlignet med et kjemisk fargestoff i den iPSC-avledede kardiomyocyttmodellen for å muliggjøre en side-ved-side-sammenligning av forskjellige kalsiumavbildningsmetoder. K-GECO som uttrykker iPSC-CMs ble avbildet sammen med Fluo-4 lastede celler. K-GECO som uttrykker kardiomyocytter viste konsistent slagadferd over tid (figur 5A, C). Imidlertid påvirket Fluo-4-belastning både beatfrekvensen og CTD i denne modellen (figur 5B, C), noe som tyder på at Fluo-4 selv kan påvirke resultatene av slike eksperimenter. Dette vil være spesielt sant etter langvarig eksponering for bildesonden, som kan forekomme i multiwall-bildeformatet hvis brønn-for-brønn-avbildning oppstår med et minutts oppholdstid per brønn.
Figur 1: Små molekylionekanalhemmere påført iPSC-avledede kardiomyocytter . (A-B) Time-lapse-bilder av iPSC-CM som uttrykker mNG-GECO tatt ved 25 Hz. Skala bar = 50 μm. (B) Representative Ca2+ svingninger etter sammensatt addisjon. Fluorescerende signaler hentet fra mNG-GECO uttrykkende celler presenteres som et fluorescensforhold F / F0, hvor F0 er definert som basal intensitet og F intensiteten oppdaget ved hvert tidspunkt. (C) Kalsiumtoppanalyseprogramvare kan trekke ut parametere, inkludert halv maksimal bredde (CTD50), 90% forbigående varighet (CTD 90), stigningstid og forfallstid. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: Eksempel på dose-respons ved bruk av hERG-hemmeren E4031 i et optisk pacing-system. (A) Spor av optisk stimulering med 10% blått lys i forskjellige konsentrasjoner av E4031. Time-lapse-bilder av iPSC-avledede kardiomyocytter som uttrykker K-GECO tatt ved 25 Hz. (B1) Representative spor av kalsiumtransienter oppnådd med forskjellige sammensatte doser. Maksimal analyse og dose-respons av E4031 i amplitude (B2) og henfallstid (B3). Blå søyler indikerer 1 Hz 470 nm pulslysstimulering. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: All-optisk plattform anvendt for langvarig legemiddelfenotypisk screening i LVNC pasientavledede kardiomyocytter. (A) Representativt spor av spontan slagaktivitet i pasientavledede kardiomyocytter (etter differensiering dag 70) med (rød) eller uten (blå) 5 μM medikamentell behandling. (B) Toppanalyse av spontan slagaktivitet med eller uten 5 μM medikamentell behandling. (C) Intensitetsspor av legemiddelrespons i pasientavledet iPSC-CM under 1 Hz optisk stimulering. (D) Toppanalyse av pasientavledede kardiomyocytter med 1 Hz optisk stimulering. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: Tre kanaler subcellulær Ca 2+ avbildning i iPSC-CM-modellen. (A-B) iPSC-CM ble transdusert med subcellulære kalsiumprober for cytoplasma, NIR-GECO2 (rød), endoplasmatisk retikulum ER-LAR-GECO (gul) og mtGCEPIA3 (cyan), en mitokondriell Ca2+ indikator. (B) Trekanals time-lapse kalsiumavbildning før og etter 10 mM koffeinbehandling. (C-D) iPSC-CMs transducert med cytoplasmatisk, NIR-GECO2 (rød), endoplasmatisk retikulum ER-LAR-GECO (gul) og CRAC-kanalindikatorer Orai1-G-GECO (cyan) ble visualisert. (D) Trekanals time-lapse kalsiumavbildning ble tatt. (D1) Spontan beat-to-beat-aktivitet ble observert med NIR-GECO2 og Orai1-G-GECO. (D2) Kalsiumutstrømning fra ER (reduksjon av ER-LAR-GECO-signal) ledsaget en økning i det cytosoliske kalsiumsignalet ved koffeinbehandling. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5: Sammenligning av den genetisk kodede kalsiumindikatoren (K-GECO) med det kjemiske kalsiumfølsomme fargestoffet (Fluo-4) i iPSC-CMs. (A-B) Representative kalsiumspor av K-GECO (A) og Fluo-4 (B) presenteres over tid. (C) Kalsium forbigående analyse av K-GECO transduced, eller Fluo-4 lastet iPSC-CM. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| BPM | CTD50 (er) | CTD90 (er) | Amplitude (F/F0) | Stigetid | Forfallstid(er) | |
| Kjøretøy (0,1 % DMSO) | 112.3657+/-10.95 | 0.25+/-0.04 | 0.41+/-0.01 | 1.99+/-0.02 | 0.07+/-0.01 | 0.28+/-0.01 |
| Verapamil (1 uM) | 0 | - | - | - | - | - |
| Dofetilid (5 nM) | 103.42+/-9.87** | 0.23+/-0.03 | 0.46+/-0.03 | 1.91+/-0.03 | 0.07+/-0.01 | 0.35+/-0.02* |
| E4031 (30 nM) | 75.73+/-12.08*** | 0.37+/-0.04** | 0.58+/-0.08*** | 1.55+/-0.02** | 0.11+/-0.04*** | 0.35+/-0.07** |
Tabell 1: Effekter av sammensatt tillegg til forbigående kalsiumparametre i iPSC-CM-modellen. Signifikansverdier angis med *(p ≤ 0,05), **(p < 0,01) og ***(p < 0,001).
Animert video 1: Spontan kalsiumaktivitet ble observert av mNG-GECO kun i iPSC-avledede kardiomyocytter med vehikkel. En Pseudo-farget film av et grått bilde er gitt. Vennligst klikk her for å laste ned denne videoen.
Supplerende figur 1: Skjematisk fremstilling av adenoviralvektoren. Dette inkluderer kanal rhodopsin ChR2 som aktuator, med en rød fluorescerende kalsiumindikator K-GECO som kalsiumreporter for en all-optisk analyse. Den lysfølsomme ionkanalen gjør at spennende celler kan depolariseres av lys i det blågrønne området av det synlige spektret. 470 nm lys ble brukt i disse forsøkene. Kalsiumtransienter i eksitable celler kan samtidig avbildes av K-GECO, som krever grønt eksitasjonslys, noe som gir røde utslipp. Vennligst klikk her for å laste ned denne filen.
Discussion
For å kunne utføre screening med høy gjennomstrømning, må signalene fordeles jevnt over kulturfartøyet, noe som garanterer at tilfeldig utvalgte interesseområder (ROIer) kan brukes automatisk under bildeopptak. Selv om kjemiske kalsiumindikatorer lett oppfyller dette kravet, har genetisk kodede sonder historisk produsert patcher, i stedet for ark, av signal som begrenser bruken av dem. Bruken av et viralt transduksjonssystem gir høye27,28 og ekvivalente uttrykksnivåer av flere indikatorer blant målcellene sammenlignet med konvensjonelle transfeksjonsmetoder. Ulike celletyper kan kreve forskjellige promotorer, og valget av genleveringssystem må kanskje endres tilsvarende 29,30,31. I heterogene cellemodeller kan transduksjon og ekspresjonseffektivitet være forskjellig i spesifikke celletyper. På den ene siden kan dette begrense anvendelsen til bestemte celler, men fenomenet kan utnyttes til å skille bestemte celler i et samkultursystem32.
Hovedvirkningen av denne tilnærmingen er frigjøringen fra en-til-en-forholdet mellom eksperimentøren og prøven ved automatisering. I et standard flerbrønnseksperiment, for å samle inn data på fire posisjoner i en enkelt brønn, anslår vi at det tar omtrent 15 timer ved mikroskopet å samle 30 s-videoer fra en 96-brønnplate. I det automatiserte systemet tar dette ~ 4 timer. Videre tar analyse av dataene manuelt langt lengre tid enn datainnsamling. Analysesystemet som brukes her er omtrent 200 ganger raskere enn den manuelle ekvivalenten. Nettoresultatet er en forbedret arbeidsflyt og høye kostnads- og tidsbesparelser.
I motsetning til primære kardiomyocytter lastet med kalsiumfargestoffer som overlever i størrelsesorden timer, kan GECIer uttrykt i iPSC-CM via virale leveringssystemer gi et signal i en eksperimentell modell som lever i noen måneder. Disse modellene kan vedlikeholdes i et flerbrønnsformat og spores samtidig for seriell analyse i bildesystemer med høyt innhold utviklet for screening av små molekyler. Dette gir en enkel menneskelig eksperimentell plattform for å teste legemiddeleffekter over varigheter nærmere de som oppleves av pasienter (uker eller måneder) i stedet for minuttene som vanligvis brukes i toksikologiske analyser.
Systemet kan utvides til å levere multiparametermålinger ved å inkludere GECIer med distinkte utslippsegenskaper fra grønt til nær infrarødt. Slike eksperimenter krever riktig eksitasjonslys og filtersett i eksperimentell design for å holde signaler atskilt. Bred anvendelse i rusmiddelscreening krever robuste og effektive analyseplattformer i tillegg til legemiddelutlevering. Selv om modellen beskrevet her fokuserer på bruk av flere dynamiske kalsiumindikatorer, kan dette modifiseres til strukturelle markører for celleform eller funksjon. Disse er vanligvis lettere å visualisere da de viser liten beat-to-beat-variabilitet sammenlignet med den hundre ganger variasjonen i intracellulær kalsiumkonsentrasjon. Denne tilnærmingen kan være spesielt verdifull for sjeldne sykdommer der iPSC-intermediæret avledet fra pasienter kan inneholde alle genetiske drivere og modifikatorer av en bestemt tilstand som kan bevares i en skalerbar cellemodell, noe som letter legemiddeloppdagelse i ulike sykdommer basert på cellulære fenotyper som kan visualiseres uavhengig av den underliggende biologiske mekanismen som kan være utfordrende å belyse.
Disclosures
LumiSTAR har søkt om patentbeskyttelse for bruk av K-GECO, NIR-GECO og LAR-GECO.
Acknowledgments
Vi takker professor Robert Campbell ved University of Tokyo for å dele materialet og verdifull diskusjon; Dr. Chia-Lin Ho i Molecular Device for teknisk støtte.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 96-well plate | Perkin Elmer | 6055302 | |
| auto microfluidic system | Molecular Device | A device has a single channel pipetter that can be used to add compound automatically | |
| Caffeine | Sigma-Aldrich | C0750 | |
| Cardiosight-S l iPSC derived cardiomyocytes | NEXEL | C-002 | |
| Dimethyl sulfoxide | Millipore Sigma | 1096780100 | |
| Dofetilide | Sigma-Aldrich | PZ0016 | |
| E4031 | Tocris | 1808 | |
| ER-LAR-GECO viral kit | LumiSTAR | AA001a | Red-shifted GECI packed into adeno-viral vector |
| Fibronectin | Sigma-Aldrich | F1141 | |
| Fluo-4 AM | Invitrogen | F14201 | Chmical calcium sensitive dye |
| Gelatin | Sigma-Aldrich | G1890 | |
| ImageXpress Micro Confocal High-Content Imaging System | Molecular Device | ||
| iPSC-CMs Maintenance Medium | NEXEL | CMS-002 | iPSC-CMs Medium (Cardiosight-S medium) + Cardiosight-S Supplement |
| iPSC-CMs Medium (Cardiosight-S medium) | NEXEL | CMS-002 | |
| K-GECO viral kit | LumiSTAR | AA005a | Red-shifted GECI packed into adeno-viral vector |
| LumiCAL software | LumiSTAR | LUCS01a | Software for analysis of calcium peak in cardiomyocytes |
| mNG-GECO viral kit | LumiSTAR | AL008a | Brighter green GECI packed into lenti-viral vector |
| mt-GCEPIA3 viral kit | LumiSTAR | AL011a | GECI targgeting on mitochondria packed into lenti-viral vector |
| NIR-GECO viral kit | LumiSTAR | AV004a | Near infrared GECI packed into viral vector |
| Orai1-GGECO viral kit | LumiSTAR | AL010a | GECI targgeting on Orai1 packed into lenti-viral vector |
| Tyrode's salts | Sigma-Aldrich | T2145 | |
| Verapamil hydrochloride | Sigma-Aldrich | V4629 | |
| Y-27632 dihydrochloride | Tocris | 1254 |
References
- O'Connor, M. D. The 3R principle: Advancing clinical application of human pluripotent stem cells. Stem Cell Research & Therapy. 4 (2), 21 (2013).
- Ebert, A. D., Liang, P., Wu, J. C. Induced pluripotent stem cells as a disease modeling and drug screening platform. Journal of Cardiovascular Pharmacology. 60 (4), 408-416 (2012).
- Ovics, P., et al. Drug development and the use of induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes for disease modeling and drug toxicity screening. International Journal of Molecular Sciences. 21 (19), 7320 (2020).
- Paredes, R. M., Etzler, J. C., Watts, L. T., Zheng, W., Lechleiter, J. D.
- Takahashi, A., Camacho, P., Lechleiter, J. D., Herman, B.
- Smith, N. A., et al. Fluorescent Ca(2+) indicators directly inhibit the Na,K-ATPase and disrupt cellular functions. Science Signaling. 11 (515), (2018).
- Shen, Y., et al. A genetically encoded Ca2+ indicator based on circularly permutated sea anemone red fluorescent protein eqFP578. BMC Biology. 16 (1), 9 (2018).
- Qian, Y., et al. A genetically encoded near-infrared fluorescent calcium ion indicator. Nature Methods. 16 (2), 171-174 (2019).
- Wu, J., et al. Red fluorescent genetically encoded Ca2+ indicators for use in mitochondria and endoplasmic reticulum. Biochemical Journal. 464 (1), 13-22 (2014).
- Zarowny, L., et al. and high-performance genetically encoded Ca2+ indicator based on mneongreen fluorescent protein. ACS Sensors. 5 (7), 1959-1968 (2020).
- Potekhina, E. S., et al. Drug screening with genetically encoded fluorescent sensors: today and tomorrow. International Journal of Molecular Sciences. 22 (1), 148 (2021).
- Chang, Y. -F., et al. Non-invasive phenotyping and drug testing in single cardiomyocytes or beta-cells by calcium imaging and optogenetics. PLoS One. 12 (4), 0174181 (2017).
- Chang, Y. -F., Arai, Y., Nagai, T. Optogenetic activation during detector "dead time" enables compatible real-time fluorescence imaging. Neuroscience Research. 73 (4), 341-347 (2012).
- Chen, G., et al. Chemically defined conditions for human iPSC derivation and culture. Nature Methods. 8 (5), 424-429 (2011).
- Strober, W. Trypan blue exclusion test of cell viability. Current Protocols in Immunology. 111, 1-3 (2015).
- Jang, Y., et al. Modulating cardiomyocyte and fibroblast interaction using layer-by-layer deposition facilitates synchronisation of cardiac macro tissues. Soft Matter. 16 (2), 428-434 (2020).
- Leonard, R. G., Talbert, R. L.
- Sanguinetti, M. C., Jurkiewicz, N. K. Two components of cardiac delayed rectifier K+ current. Differential sensitivity to block by class III antiarrhythmic agents. The Journal of General Physiology. 96 (1), 195-215 (1990).
- Lees-Miller, J. P., Duan, Y., Teng, G. Q., Duff, H. J. Molecular determinant of high-affinity dofetilide binding to HERG1 expressed in Xenopus oocytes: Involvement of S6 sites. Molecular Pharmacology. 57 (2), 367-374 (2000).
- Kamiya, K., Niwa, R., Mitcheson, J. S., Sanguinetti, M. C. Molecular determinants of HERG channel block. Molecular Pharmacology. 69 (5), 1709-1716 (2006).
- Fukushima, H., et al. Specific induction and long-term maintenance of high purity ventricular cardiomyocytes from human induced pluripotent stem cells. PLoS One. 15 (11), 0241287 (2020).
- Suzuki, J., Kanemaru, K., Iino, M. Genetically encoded fluorescent indicators for organellar calcium imaging. Biophysical Journal. 111 (6), 1119-1131 (2016).
- Suzuki, J., et al. Imaging intraorganellar Ca2+ at subcellular resolution using CEPIA. Nature Communications. 5, 4153 (2014).
- Qian, Y., et al. Improved genetically encoded near-infrared fluorescent calcium ion indicators for in vivo imaging. PLoS Biology. 18 (11), 3000965 (2020).
- Dynes, J. L., Amcheslavsky, A., Cahalan, M. D. Genetically targeted single-channel optical recording reveals multiple Orai1 gating states and oscillations in calcium influx. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (2), 440-445 (2016).
- Broyles, C. N., Robinson, P., Daniels, M. J. Fluorescent, bioluminescent, and optogenetic approaches to study excitable physiology in the single cardiomyocyte. Cells. 7 (6), 51 (2018).
- Cao, F., et al. Comparison of gene-transfer efficiency in human embryonic stem cells. Molecular Imaging and Biology. 12 (1), 15-24 (2010).
- Ma, Y., Ramezani, A., Lewis, R., Hawley, R. G., Thomson, J. A. High-level sustained transgene expression in human embryonic stem cells using lentiviral vectors. Stem Cells. 21 (1), 111-117 (2003).
- Haery, L., et al. Adeno-associated virus technologies and methods for targeted neuronal manipulation. Frontiers in Neuroanatomy. 13, 93 (2019).
- Nieuwenhuis, B., et al. Optimization of adeno-associated viral vector-mediated transduction of the corticospinal tract: Comparison of four promoters. Gene Therapy. 28 (1), 56-74 (2021).
- Smith, R. L., et al. Characterization of promoter function and cell-type-specific expression from viral vectors in the nervous system. Journal of Virology. 74 (23), 11254-11261 (2000).
- Fang, Y., et al. Safety and efficacy of an immune cell-specific chimeric promoter in regulating anti-PD-1 antibody expression in. CAR T cells. Molecular Therapy - Methods & Clinical Development. 19, 14-23 (2020).
