Summary
本协议描述了iPSC来源心肌细胞（iPSC-CMs）中触发细胞活性的全光学控制和观察，用于高通量药物筛选和毒性测试。显示了时间和空间上表型模式的多参数量化。证明了药物在数小时内的长期影响，或数天的顺序测量。
Abstract
了解可兴奋细胞如何在健康和疾病中发挥作用，以及小分子或基因操作如何改变这种行为非常重要。具有多个发射窗口的基因编码钙指示剂（GECIs）可以组合（例如，用于同时观察不同的亚细胞事件）或与可兴奋细胞中的其他光依赖性致动器一起用于扩展应用（例如，将基因编码的光遗传学控制与光谱兼容的钙指示剂相结合）。这种方法已被用于原代或干细胞衍生的神经元、心肌细胞和胰腺β细胞。然而，由于仪器、分析软件、指示剂性能和基因递送效率的限制，增加这些方法的通量或观察持续时间一直具有挑战性。 在这里，高性能绿色GECI，mNeonGreen-GECO（mNG-GECO）和红移GECI，K-GECO与光遗传学控制相结合，使用高内涵成像系统以高通量成像格式实现细胞活动的全光学控制和可视化。显示了使用健康和患者来源的iPSC-CM进行心脏毒性测试和表型药物筛查的应用。此外，iPSC-CM模型还证明了使用光谱和钙亲和力指示剂变体（NIR-GECO，LAR-GECO和mtGCEPIA或Orai1-G-GECO）组合的多参数评估仅限于不同的细胞区室。
Introduction
基于人类的诱导多能干细胞（iPSC）衍生模型被认为是动物研究3R目标（替换，减少和改进）的有希望的解决方案1，2。iPSC来源的心肌细胞已被用于疾病建模和药物发现，因为它们概括了人类生物学的基本方面3。钙成像，通常使用化学染料，已被用于观察药物治疗前后的细胞活性4，5。然而，基于化学染料的钙传感探针直接抑制Na，K-ATP酶并破坏细胞功能6。因此，当使用化学染料时，在数小时或数天内跟踪相同的细胞一直是有问题的。在这里，一系列基因编码的钙指示剂（GECIs）7，8，9，10在广泛的激发/发射和钙亲和谱中被利用，形成一个心脏毒性测试平台，提供长时间的实时多细胞器测量11。
为了在iPSC-CM模型中进一步发展基于钙的高通量筛选概念，超越先前证明的学术环境，使用基因编码工具进行光学控制和钙成像，通过红移钙指示剂R-GECO或K-GECO与光遗传学工具共表达，ChR212，13，已经生成了现成的病毒试剂盒。通过将成像转换为配备自动微流体系统的高内涵仪器，化合物添加的单通道移液在活细胞成像之上分层。最后，实验途径的两个关键方面，图像处理和分析都得到了改进和自动化。
Protocol
左心室不致密化心肌病（LVNC）患者iPSC来源心肌细胞（iPSC-CM）由国立台湾大学医院提供。收集患者样本以重新编程为iPSC和用于研究目的的维持方案14 遵循WMA赫尔辛基宣言（涉及人类受试者的医学研究的伦理原则），并得到机构审查委员会：NTUH研究伦理委员会办公室（#201612099RINC）的批准。其他iPSC-CM是从商业供应商处获得的。使用iPSC衍生物不需要我们机构的特定许可。
1. iPSC来源的心肌细胞制备
- 在将iPSC-CM从冷藏库中取出进行解冻之前准备多孔板。用 100 μL 50 μg/mL 纤连蛋白/0.2% 明胶溶液（参见 材料表）涂覆 96 孔微孔板的每个孔，以彻底覆盖所有表面。
- 将板在37°C下在加湿培养箱中孵育1小时。
- 在细胞解冻之前将培养基（参见 材料表）加热至室温30分钟。
注意：本协议将室温描述为25°C。 - 将iPSC-CM从液氮储罐转移到37°C水浴中。
注意：iPS-CM通常由学术或商业来源在干冰上运输。它们在收到后转移到液氮储存中，直到使用。 - 在冰完全融化之前取出小瓶，并用75%乙醇喷洒小瓶。
- 将小瓶带到II类生物安全柜中，轻轻地将内容物转移到含有9 mL室温培养基的新15 mL锥形管中。
- 在室温下以200× g 离心细胞3分钟。
- 通过移液管弃去上清液，并将细胞轻轻重悬于1mL培养基中，并含有10μMROCK抑制剂（Y27632）（参见 材料表）。
注意：避免重复移液解冻的细胞，以确保最大的细胞回收率。 - 从孔中取出包衣溶液，快速加入 50 μL 培养基和 10 μM ROCK 抑制剂。
- 使用台盼蓝排除方法和血细胞计数器15确认活细胞的数量。
- 根据制造商的说明，将细胞以100，000-150，000细胞/厘米的密度在包被的96孔板中板2。
- 24小时后，确保附着在板表面的细胞与其他细胞接触。
注意：单细胞在长期培养中存活不良，通常表现更多样化。 - 每 2 天更换一次预热的维护介质。
注意：对于长期药物治疗，LVNC iPSC-CM每2天更换一次半培养基，用或不更换小分子药物。
2. 基因编码钙指示剂的表达
- 将细胞铺板72小时后，在冰上解冻GECIs病毒试剂盒（参见 材料表）。
- 用维持培养基制备 2x 病毒试剂盒储备溶液。
- 通过将培养基体积调节至每孔 100 μL 来准备感染细胞。加入100μL预混合病毒溶液，并在37°C下孵育8-16小时。
- 孵育后用 200 μL 预热培养基替换。
- 使用成像系统可视化转导后24小时的GECIs表达（参见 材料表）。
注意：表达水平在转导后48-72小时达到最大值。可以从24小时时间点对细胞进行成像。然而，从GECI获得的信号持续了一个多月。 - 在进行功能测定之前，将细胞保持在加湿的培养箱中。
- 在分化后第25天使用感染方案（步骤2.1-2.6）用ChR2-K-GECO病毒试剂盒（参见 材料表）感染iPSC-CMs（LVNC患者来源的iPSC-CMs）。
3. 使用Fluo-4进行基于染料的钙成像
- 将Fluo-4粉末（见 材料表）溶解在DMSO中作为储备溶液（5mM）。
- 将储备溶液稀释至Tyrode缓冲液中的10μM Fluo-4浓度。
注意：Tyrode的缓冲液由1.0克/升碳酸氢钠，0.2克/升氯化钙，0.1克/升氯化镁，0.2克/升氯化钾，8.0克/升氯化钠，0.05克/升磷酸钠一元和1.0克/升D-葡萄糖组成。 - 用10μM的Fluo-4溶液（最终浓度为5μM）替换半培养基。
- 将细胞在37°C孵育30分钟。
- 用预热的Tyrode缓冲液洗涤细胞，并在图像采集前用培养基替换它们。
- 使用流采集协议开始录制。
注意：流采集是连续采集图像，没有间隔时间。iPSC-CM的跳动频率约为1 Hz，该流采集协议用于采集跳动模式。
4. 用于毒性试验和表型筛选的图像采集和功能分析
- 打开高内涵成像系统的所有设备（参见 材料表）。
- 验证腔室温度是否达到 37 °C，并补充 5% CO2 。在图像采集前保持系统平衡2小时。
注意：热漂移是长期活细胞观察的一个重大问题，1°C可以将焦平面改变~1μm，因此在图像采集之前，允许镜头和载物台达到目标温度至关重要。 - 打开成像软件（参见 材料表）并选择96孔板的板设置。
- 将无盖的 96 孔板放入腔室中，并在顶部装载活细胞密封环。
注意：活细胞密封圈是用于达到环境平衡的适配器。 - 根据所需的空间分辨率选择20x（图1和图2）、60x（图3和图4）和20x（图5）水浸物镜。
- 在实验采集之前调整焦点以拍摄清晰的图像。
- 每孔随机选择3-5个区域进行钙活性记录。
注意：每个区域必须至少包含 20 个单元格（n ≥ 20）。 - 为不同的指标选择合适的过滤器。FITC 475/536 用于 mNG-GECO、mtGCEPIA3 和 Oria1-G-GECO;Cy5 631/692 用于近红外-GECO2;ER 530/593 用于 ER-LAR-GECO;德州红 560/624 用于 K-GECO。
- 为使用的每个成像通道设置适当的发光二极管 （LED） 功率。
注意：当通过信号（检测到的物体强度）与噪声（检测到的背景强度）的比率优化LED功率以进行成像采集时，信噪比应高于2。在该协议中，10% 的 LED 功率用于 TRITC 和 FITC;Cy5的20%是典型的。 - 将相机曝光时间设置为最长 40 毫秒 （25 Hz），记录持续时间为 30 秒，用于流采集，以观察心肌细胞中表达的 mNG-GECO 和 K-GECO 探针报告的钙瞬变（图 1-3 和图 5）。如果信号/噪声在较高帧速率下为 <2，则增加 LED 功率。
- 对于光遗传学刺激（图2和图3C，D），优化1 Hz时蓝光的功率（通常为5%-10%）和频率。
注意：一般来说，人类iPSC-CM在~1赫兹附近自发跳动，操作者需要比自发速率更快的节奏。 - 如果计划进行顺序（图3）或扩展（图4）测量，请不惜一切代价避免光毒性。这可能意味着降低照明功率强度，并通过增加相机曝光时间（例如，使用用于亚细胞Ca2+ 信号的三通道实时观察的延时协议增加到100 ms）来补偿这一点（图4）。
- 使用异步分配方案通过自动微流体系统 添加 10 mM咖啡因（参见 材料表）（图4）。
注意：异步分配方案允许在添加咖啡因等药物的同时进行图像采集，图像之间没有间隙。 - 开始收购。
5. 小分子制备
- 将 E4031、多非利特和维拉帕米重悬于 DMSO 中，并用 Tyrode 缓冲液稀释。培养基中DMSO的最终浓度为0.1%（v / v）。
- 以所需工作浓度的两倍（即2x）制备化合物溶液，并在加入前在37°C下平衡。
注意：由于收缩性与温度有关，并且温度变化的影响很快，因此最大限度地减少添加介质后的温度波动至关重要。 - 将化合物排列到相应的靶标孔中。
- 通过自动微流体系统（参见材料表）将 100 μL 双倍强度 （2x） 化合物加入孔中，并在所需（通常为 15 分钟）孵育期后开始采集。
6. 成像处理和分析
- 通过使用软件自动检测脉冲随时间旋转的特征，将信号区域与背景隔离开来。
- 使用钙峰分析软件（见 材料表）分析跳动频率（BPM）、峰值信号（振幅）、钙瞬态持续时间50%（CTD50）、钙瞬态持续时间90%（CTD90）、上升时间和衰减时间（图1C）。
注意：在这些设置中，光漂白在前10秒内很明显，之后信号稳定。因此，在11-30 s期间分析钙峰。在三通道记录（图4）中，手动标记细胞轮廓以测量强度变化。
Representative Results
图1和动画视频1展示了在有或没有药物治疗的情况下，由iPSC衍生的心肌细胞（iPSC-CMs）表达的mNG-GECO10中自发钙振荡的观察结果。使用mNG-GECO获得的动力学迹线显示，小分子离子通道抑制剂维拉帕米，多非利特和E4031如预期的那样影响钙瞬变（图1B）。图1C所示的典型钙瞬态可以通过钙峰分析软件进行分析，得出峰值信号（幅度）、钙瞬态持续时间50%（CTD50）、钙瞬态持续时间90%（CTD90）、上升时间和衰减时间。维拉帕米是一种L型钙阻滞剂17，如预期的那样完全抑制细胞中的钙内流（图1B）。多非利特和E4031是hERG通道抑制剂18，19，20，被列为实验性III类抗心律失常药物。与载体组相比，多非利特（p < 0.05）和E4031处理（p < 0.001）的衰变时间延长。与仅载体相比，使用E4031治疗观察到CTD50（p < 0.01）和CTD90（p < 0.001）的延长（表1），这些结果与报告的对QT间期的影响一致，这是从Q波开始到T波结束之间很长一段时间的表面心电图确定的临床相关复极测量， 在以前的研究中12，21。
在自发跳动细胞中评估CTD的一个困难是CTD的变异性搏动率。对于iPSC-CM模型来说，这是一个特殊的问题，其中96孔板的每个孔都可以有自己的跳动率，即使所有细胞都来自同一个母瓶。可以通过光学或电气起搏来施加节拍率。为了评估E4031在标准化起搏条件下的剂量反应，使用1 Hz 470 nm光脉冲对表达iPSC-CMs的ChR2和K-GECO7进行光学控制，并使用红色K-GECO信号进行观察（图2A和补充图1）。随着E4031浓度的增加，钙瞬变的峰值振幅（p < 0.01）和衰减时间（p < 0.05）逐渐降低（图2B1）。E4031的剂量依赖性效应对于峰振幅的降低最为明显（图2B1，B2）。
虽然持续几分钟的短期研究通常用于心脏毒性评估，但慢性毒性评估存在盲点，它将患者在数周、数月或数年内暴露于药物平行。在反映与临床实践相关的治疗持续时间的时间间隔内研究疾病或毒性影响将是有利的。我们利用我们的全光学控制和检测系统研究了左心室不致密化（LVNC）患者的iPSC来源心肌细胞。分化后第25天用K-GECO病毒试剂盒（步骤2.2-2.6）转导iPSC-CMs。然后在同一孔中每1-2周跟踪一次K-GECO信号，有或没有额外的药物治疗。使用高内涵成像系统（步骤4.1-4.12）获得自发钙活性（图3A，3B）和光学起搏下的钙动力学（图3C，D，步骤4.11），并通过钙峰分析软件（步骤6）进行处理。如图3A，C所示，在病毒转导一个月后，无论是否使用用于光学起搏的额外光，钙瞬变仍然可见。这项工作在LVNC iPSC-CM模型中发现了一种似乎可以增加搏动率，规范收缩间隔并增加瞬时钙振幅的药物（图3A，B）。从这些数据中可以得出两个重要的观察结果。首先，从治疗的角度来看，药物效果在第63天和第70天的时间点似乎持久。其次，与通常测定较早时间点（通常<50天）短暂窗口（<1分钟）复合效应的领域相关;该化合物的疾病表型修饰作用仅在第60天后才明显，这表明可能很容易忽视标准筛选方案中作用机制缓慢的药物。
搏动频率的可变性，以及随后对钙瞬时持续时间的影响，不仅仅是任何给定时间点的井间问题。随着iPSC-CM在培养中的维持，它也发生了变化，这在孔内随时间而变化（图3B）。为了在顺序实验中保持一致性，可以在有或没有药物治疗的情况下应用1 Hz光学起搏（图3C，D）。在这里，尽管第63天的结果显示了钙瞬变的令人鼓舞的趋势，其振幅明显更高，CTD90更短，衰变时间更短;到70天的时间点 - 并表明在罕见病药物筛选过程中需要进行长期评估 - 在检测到去极化（EAD）后早期。通过比较图3B，D中所示的搏搏率，钙瞬态振幅，CTD90和衰减时间的结果，可以定性评估在疾病表型或小分子评估中添加起搏方案的价值。
与化学染料相比，基于GECI的钙瞬态可视化方法的一个优点是能够将探针限制在细胞内的特定隔室。这可以通过在单个细胞中多重复用多种颜色和/或亲和力变体来进一步扩展。因此，已经开发了几种GECI，包括ER-LAR-GECO9，mtGCEPIA 22，23（或Oria1-G-GECO）和NIR-GECO28，24，用于在细胞模型中单独或组合表达，用于实时钙活性测量分别在内质网/肌质网（ER / SR），线粒体（或CRAC通道）和细胞质中产生的实时钙活性测量。它们可以在iPSC-CM模型中组合（图4A，C）以研究不同细胞内钙储存之间的相互作用。例如，10 mM咖啡因治疗可用于清空SR钙储存。在这里，ER-LAR-GECO信号的降低（指示SR钙的损失）与NIR-GECO信号的下降（指示胞质钙浓度的增加）如预期的那样平行。其他细胞内区室如何受到这些波动的影响尚未得到很好的研究。尽管如此，包含绿色线粒体靶向的mtGCEPIA3表明，在这些条件下，线粒体中会发生钙摄取（图4A，B）。
同样，通过包括探针Orai1-G-GECO25来揭示钙释放激活通道（CRAC）Ca 2+ 电流，可以看到不同钙电流之间的相互作用（图4C，D）。在iPSC-CM模型中，该信号随着自发胞质钙瞬时而增加（图4D1，D2）。与此一致，用咖啡因治疗在细胞质和Orai1通道中都会引起大的钙瞬时。
众所周知，心肌细胞模型中的大多数钙瞬时成像都是使用钙染料26确定的。将基因编码的钙指示剂与iPSC来源的心肌细胞模型中的化学染料进行比较，以便并排比较不同的钙成像方法。表达iPSC-CMs的K-GECO与Fluo-4上载细胞一起成像。表达K-GECO的心肌细胞随着时间的推移表现出一致的跳动行为（图5A，C）。然而，Fluo-4负载影响了该模型中的搏动频率和CTD（图5B，C），这表明Fluo-4本身可能会影响此类实验的结果。在长期暴露于成像探针后尤其如此，如果每孔停留一分钟进行逐井成像，则可能会以多壁成像格式发生。
图 1：应用于 iPSC 衍生心肌细胞的小分子离子通道抑制剂。 （A-B）在25 Hz下拍摄的表达mNG-GECO的iPSC-CM的延时图像。 比例尺 = 50 μm。 （B）化合物添加后代表性的Ca2+振荡。从表达mNG-GECO的细胞获得的荧光信号表示为荧光比F / F0，其中F0定义为基础强度，F定义为在每个时间点检测到的强度。（C）钙峰分析软件可以提取参数，包括半最大宽度（CTD50），90%瞬态持续时间（CTD 90），上升时间和衰减时间。请点击此处查看此图的大图。
图 2：在光学起搏系统中使用 hERG 抑制剂 E4031 的剂量反应示例。 （A）不同浓度的E4031中10%蓝光的光刺激痕迹。在25 Hz下拍摄的表达K-GECO的iPSC来源心肌细胞的延时图像。 （B1）用不同化合物剂量获得的钙瞬变的代表性痕迹。E4031在幅度（B2）和衰减时间（B3）中的峰值分析和剂量反应。蓝条表示 1 Hz 470 nm 脉冲光刺激。 请点击此处查看此图的大图。
图3：应用于LVNC患者源性心肌细胞长期药物表型筛选的全光平台 。 （A）患者来源心肌细胞（分化后第70天）自发跳动活性的代表性痕迹，有（红色）或不带（蓝色）5μM药物治疗。（B）有或没有5μM药物治疗的自发跳动活性的峰值分析。（C）1 Hz光刺激下患者来源的iPSC-CM中药物反应的强度痕迹。（D）用1 Hz光刺激对患者来源的心肌细胞进行峰值分析。 请点击此处查看此图的大图。
图 4：iPSC-CM 模型中的三通道亚细胞 Ca 2+ 成像。 （A-B） iPSC-CMs用亚细胞钙探针转导细胞质，NIR-GECO2（红色），内质网ER-LAR-GECO（黄色）和mtGCEPIA3（青色），线粒体Ca2+指示剂。（B）10 mM咖啡因治疗前后的三通道延时钙成像。（C-D）用细胞质转导的iPSC-CMs，NIR-GECO2（红色），内质网ER-LAR-GECO（黄色）和CRAC通道指示剂Orai1-G-GECO（青色）被可视化。（D）捕获三通道延时钙成像。（第1点）NIR-GECO2和Orai1-G-GECO观察到自发的逐搏活动。（D2）来自ER的钙外排（ER-LAR-GECO信号降低）伴随着咖啡因治疗后胞质钙信号的增加。请点击此处查看此图的大图。
图 5：iPSC-CM 中基因编码钙指示剂 （K-GECO） 与化学钙敏感染料 （Fluo-4） 的比较。 （A-B） 随着时间的推移，K-GECO （A） 和 Fluo-4 （B） 的代表性钙痕量。（C）K-GECO转导或Fluo-4负载iPSC-CM的钙瞬时分析。请点击此处查看此图的大图。
| BPM | CTD50 （秒） | CTD90 （秒） | 振幅 （F/F0） | 上升时间 | 衰减时间 （s） | |
| 车辆（0.1% DMSO） | 112.3657+/-10.95 | 0.25+/-0.04 | 0.41+/-0.01 | 1.99+/-0.02 | 0.07+/-0.01 | 0.28+/-0.01 |
| 维拉帕米（1 uM） | 0 | - | - | - | - | - |
| 多非利特 （5 nM） | 103.42+/-9.87** | 0.23+/-0.03 | 0.46+/-0.03 | 1.91+/-0.03 | 0.07+/-0.01 | 0.35+/-0.02* |
| E4031 （30 纳米） | 75.73+/-12.08*** | 0.37+/-0.04** | 0.58+/-0.08*** | 1.55+/-0.02** | 0.11+/-0.04*** | 0.35+/-0.07** |
表1：iPSC-CM模型中化合物添加对瞬时钙参数的影响。显著性值由 *（p ≤ 0.05）、**（p < 0.01） 和 ***（p < 0.001） 表示。
动画视频1：mNG-GECO在仅使用载体的iPSC来源心肌细胞中观察到自发钙活性。提供灰度图像的伪彩色电影。 请点击此处下载此视频。
补充图1：腺病毒载体的示意图。这包括通道视紫红质ChR2作为致动器，红色荧光钙指示剂K-GECO作为全光学测定的钙报告基因。光敏离子通道允许可激发细胞被可见光谱蓝绿色范围内的光去偏振。在这些实验中使用了470nm光。可兴奋细胞中的钙瞬变可以同时由K-GECO成像，K-GECO需要绿色激发光，产生红色发射。 请点击此处下载此文件。
Discussion
为了成功进行高通量筛选，信号必须均匀分布在培养容器中，以确保在成像采集过程中可以自动应用随机选择的感兴趣区域（ROI）。尽管化学钙指示剂很容易满足这一要求，但基因编码探针历来会产生限制其使用的信号斑块，而不是片状。与传统转染方法相比，使用病毒转导系统可在靶细胞中提供多种指标的高27.28和等效表达水平。不同的细胞类型可能需要不同的启动子，基因递送系统的选择可能需要相应地改变29，30，31。在异质细胞模型中，特定细胞类型的转导和表达效率可能不同。一方面，这可能将应用限制在特定细胞上，但是可以利用该现象来区分共培养系统中的特定细胞32。
这种方法的主要影响是通过自动化从实验者和样品之间的一对一关系中解放出来。在标准的多孔实验中，为了在单个孔内的四个位置收集数据，我们估计在显微镜下从96孔板收集30秒视频大约需要15小时。在自动化系统中，这需要~4小时。此外，手动分析数据比数据采集花费的时间要长得多。这里使用的分析系统比手动分析系统快约200倍。最终结果是改进了工作流程，节省了大量成本和时间。
与加载钙染料的原代心肌细胞相比，通过病毒递送系统 在 iPSC-CM中表达的GECI可以在实验模型中产生存活数月的信号。这些模型可以以多孔格式进行维护，并同时跟踪，以便在为小分子筛选开发的高内涵成像系统中进行连续分析。这产生了一个简单的人体实验平台，可以在更接近患者经历的持续时间（数周或数月）内测试药物效果，而不是毒理学测定中通常使用的分钟数。
该系统可以扩展为提供多参数测量，包括具有从绿色到近红外的不同发射特性的GECI。此类实验需要在实验设计中使用适当的激发光和滤光片组，以保持信号分离。除了药物分配之外，在药物筛选环境中的广泛应用还需要强大而高效的分析平台。虽然这里描述的模型侧重于使用多个动态钙指示剂，但可以将其修改为细胞形式或功能的结构标记。这些通常更容易可视化，因为与细胞内钙浓度的百倍变化相比，它们显示出很小的逐搏变异性。这种方法对于罕见疾病可能特别有价值，其中来自患者的iPSC中间体可能包含特定病症的所有遗传驱动因素和修饰因子，这些驱动因素和修饰因子可以保存在可缩放的细胞模型中，从而促进基于细胞表型的各种疾病的药物发现，这些表型可以独立于可能难以阐明的基础生物学机制进行可视化。
Disclosures
LumiSTAR已为K-GECO，NIR-GECO和LAR-GECO的使用申请专利保护。
Acknowledgments
我们感谢东京大学的罗伯特·坎贝尔教授分享材料和有价值的讨论;何嘉林博士在分子器件部门提供技术支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 96-well plate | Perkin Elmer | 6055302 | |
| auto microfluidic system | Molecular Device | A device has a single channel pipetter that can be used to add compound automatically | |
| Caffeine | Sigma-Aldrich | C0750 | |
| Cardiosight-S l iPSC derived cardiomyocytes | NEXEL | C-002 | |
| Dimethyl sulfoxide | Millipore Sigma | 1096780100 | |
| Dofetilide | Sigma-Aldrich | PZ0016 | |
| E4031 | Tocris | 1808 | |
| ER-LAR-GECO viral kit | LumiSTAR | AA001a | Red-shifted GECI packed into adeno-viral vector |
| Fibronectin | Sigma-Aldrich | F1141 | |
| Fluo-4 AM | Invitrogen | F14201 | Chmical calcium sensitive dye |
| Gelatin | Sigma-Aldrich | G1890 | |
| ImageXpress Micro Confocal High-Content Imaging System | Molecular Device | ||
| iPSC-CMs Maintenance Medium | NEXEL | CMS-002 | iPSC-CMs Medium (Cardiosight-S medium) + Cardiosight-S Supplement |
| iPSC-CMs Medium (Cardiosight-S medium) | NEXEL | CMS-002 | |
| K-GECO viral kit | LumiSTAR | AA005a | Red-shifted GECI packed into adeno-viral vector |
| LumiCAL software | LumiSTAR | LUCS01a | Software for analysis of calcium peak in cardiomyocytes |
| mNG-GECO viral kit | LumiSTAR | AL008a | Brighter green GECI packed into lenti-viral vector |
| mt-GCEPIA3 viral kit | LumiSTAR | AL011a | GECI targgeting on mitochondria packed into lenti-viral vector |
| NIR-GECO viral kit | LumiSTAR | AV004a | Near infrared GECI packed into viral vector |
| Orai1-GGECO viral kit | LumiSTAR | AL010a | GECI targgeting on Orai1 packed into lenti-viral vector |
| Tyrode's salts | Sigma-Aldrich | T2145 | |
| Verapamil hydrochloride | Sigma-Aldrich | V4629 | |
| Y-27632 dihydrochloride | Tocris | 1254 |
References
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