Summary
वर्तमान प्रोटोकॉल उच्च थ्रूपुट ड्रग स्क्रीनिंग और विषाक्तता परीक्षण के लिए आईपीएससी-व्युत्पन्न कार्डियोमायोसाइट्स (आईपीएससी-सीएम) में ट्रिगर सेलुलर गतिविधि के ऑल-ऑप्टिकल नियंत्रण और अवलोकन का वर्णन करता है। समय और स्थान में फेनोटाइपिक पैटर्न का बहु-पैरामीट्रिक परिमाणीकरण दिखाया गया है। घंटों में दवाओं के दीर्घकालिक प्रभाव, या दिनों में अनुक्रमिक माप, प्रदर्शित किए जाते हैं।
Abstract
यह समझना कि स्वास्थ्य और बीमारी में उत्तेजित कोशिकाएं कैसे काम करती हैं और छोटे अणुओं या आनुवंशिक हेरफेर द्वारा उस व्यवहार को कैसे बदला जा सकता है, महत्वपूर्ण है। कई उत्सर्जन खिड़कियों के साथ आनुवंशिक रूप से एन्कोडेड कैल्शियम संकेतक (जीईसीआई) को जोड़ा जा सकता है (उदाहरण के लिए, अलग-अलग उपकोशिकीय घटनाओं के एक साथ अवलोकन के लिए) या उत्तेजित कोशिकाओं में अन्य प्रकाश-निर्भर एक्ट्यूएटर के साथ विस्तारित अनुप्रयोगों में उपयोग किया जा सकता है (उदाहरण के लिए, वर्णक्रमीय रूप से संगत कैल्शियम संकेतकों के साथ आनुवंशिक रूप से एन्कोडेड ऑप्टोजेनेटिक नियंत्रण का संयोजन)। इस तरह के दृष्टिकोण का उपयोग प्राथमिक या स्टेम सेल-व्युत्पन्न न्यूरॉन्स, कार्डियोमायोसाइट्स और अग्नाशयी बीटा-कोशिकाओं में किया गया है। हालांकि, उपकरणों, विश्लेषण सॉफ्टवेयर, संकेतक प्रदर्शन और जीन वितरण दक्षता की सीमाओं के कारण ऐसे दृष्टिकोणों के थ्रूपुट, या अवलोकन की अवधि को बढ़ाना चुनौतीपूर्ण रहा है। यहां, एक उच्च प्रदर्शन वाले हरे रंग के जीईसीआई, एमएनियोनग्रीन-जीईसीओ (एमएनजी-जीईसीओ), और लाल-स्थानांतरित जीईसीआई, के-जीईसीओ, को ऑप्टोजेनेटिक नियंत्रण के साथ जोड़ा जाता है ताकि उच्च-सामग्री इमेजिंग सिस्टम का उपयोग करके उच्च-थ्रूपुट इमेजिंग प्रारूप में सेलुलर गतिविधि के ऑल-ऑप्टिकल नियंत्रण और विज़ुअलाइज़ेशन को प्राप्त किया जा सके। स्वस्थ और रोगी-व्युत्पन्न आईपीएससी-सीएम के साथ कार्डियोटॉक्सिसिटी परीक्षण और फेनोटाइपिक दवा स्क्रीनिंग का प्रदर्शन करने वाले अनुप्रयोग दिखाए गए हैं। इसके अलावा, वर्णक्रमीय और कैल्शियम आत्मीयता संकेतक वेरिएंट (एनआईआर-जीईसीओ, एलएआर-जीईसीओ, और एमटीजीसीईपीआईए या ओराई 1-जी-जीईसीओ) के संयोजन का उपयोग करके बहु-पैरामीट्रिक आकलन भी आईपीएससी-सीएम मॉडल में विभिन्न सेलुलर डिब्बों तक ही सीमित हैं।
Introduction
मानव-आधारित प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल (आईपीएससी) -व्युत्पन्न मॉडल को पशु अध्ययन 1,2 के लिए निर्धारित 3आर उद्देश्यों (प्रतिस्थापन, कमी और शोधन) के लिए एक आशाजनक समाधान माना जाता है। आईपीएससी-व्युत्पन्न कार्डियोमायोसाइट्स का उपयोग रोग मॉडलिंग और दवा की खोज के लिए किया गया है क्योंकि वे मानव जीव विज्ञानके आवश्यक पहलुओं को पुन: परिभाषित करते हैं। कैल्शियम इमेजिंग, आमतौर पर रासायनिक रंगों के साथ, दवा उपचार से पहले और बाद में सेलुलर गतिविधि का निरीक्षण करनेके लिए उपयोग किया गया है। हालांकि, रासायनिक डाई-आधारित कैल्शियम-सेंसिंग जांच सीधे एनए, के-एटीपीस को रोकती है और सेलुलर फ़ंक्शन6 को बाधित करती है। इस प्रकार, घंटों या दिनों में एक ही कोशिकाओं को ट्रैक करना समस्याग्रस्त रहा है जब रासायनिक रंगों का उपयोग किया जाता है। यहां, आनुवंशिक रूप से एन्कोडेड कैल्शियम संकेतक (जीईसीआई) 7,8,9,10 की एक श्रृंखला का उपयोग एक व्यापक उत्तेजना / उत्सर्जन और कैल्शियम आत्मीयता स्पेक्ट्रम में किया जाता है ताकि कार्डियक विषाक्तता परीक्षण मंच बनाया जा सके जो11 की विस्तारित अवधि में वास्तविक समय बहु-ऑर्गेनेल माप प्रदान करता है।
लाल-स्थानांतरित कैल्शियम संकेतक की सह-अभिव्यक्ति द्वारा ऑप्टिकल नियंत्रण और कैल्शियम इमेजिंग के लिए आनुवंशिक रूप से एन्कोड किए गए उपकरणों का उपयोग करके आईपीएससी-सीएम मॉडल में उच्च-थ्रूपुट कैल्शियम-आधारित स्क्रीनिंग अवधारणा को पहले से प्रदर्शित शैक्षणिक संदर्भ से परे विकसित करने के लिए, आर-जीईसीओ या के-जीईसीओ के साथ एक ऑप्टोजेनेटिक टूल, सीएचआर2 12,13, ऑफ-द-शेल्फ वायरल किट उत्पन्न किए गए हैं। इमेजिंग को ऑटो-माइक्रोफ्लुइडिक सिस्टम से लैस एक उच्च-सामग्री उपकरण में संक्रमण करके, यौगिक जोड़ के एकल-चैनल पिपेटिंग को लाइव-सेल इमेजिंग के शीर्ष पर स्तरित किया जाता है। अंत में, प्रयोगात्मक मार्ग, छवि प्रसंस्करण और विश्लेषण के दोनों महत्वपूर्ण पहलुओं में सुधार और स्वचालित हैं।
Protocol
बाएं वेंट्रिकुलर गैर-संघनन कार्डियोमायोपैथी (एलवीएनसी) रोगी आईपीएससी-व्युत्पन्न कार्डियोमायोसाइट्स (आईपीएससी-सीएम) नेशनल ताइवान यूनिवर्सिटी अस्पताल द्वारा प्रदान किए गए थे। आईपीएससी के लिए पुन: प्रोग्रामिंग के लिए रोगी के नमूनों का संग्रह और अनुसंधान उद्देश्यों के लिए रखरखाव प्रोटोकॉल14 हेलसिंकी की डब्ल्यूएमए घोषणा (मानव विषयों से जुड़े चिकित्सा अनुसंधान के लिए नैतिक सिद्धांत) का पालन किया गया और संस्थागत समीक्षा बोर्ड द्वारा अनुमोदित किया गया: एनटीयूएच में अनुसंधान नैतिकता समिति कार्यालय (#201612099RINC)। अन्य आईपीएससी-सीएम वाणिज्यिक विक्रेताओं से प्राप्त किए गए थे। आईपीएससी डेरिवेटिव के उपयोग के लिए हमारे संस्थान में विशिष्ट अनुमतियों की आवश्यकता नहीं है।
1. आईपीएससी व्युत्पन्न कार्डियोमायोसाइट्स तैयारी
- पिघलने के लिए कोल्ड स्टोरेज से आईपीएससी-सीएम को हटाने से पहले मल्टी-वेल प्लेट तैयार करें। सभी सतहों को अच्छी तरह से कवर करने के लिए 96-वेल माइक्रोप्लेट के प्रत्येक कुएं को 50 μg / mL फाइब्रोनेक्टिन / 0.2% जिलेटिन समाधान ( सामग्री की तालिका देखें) के 100 μL के साथ कोट करें।
- एक ह्यूमिडिफायर इनक्यूबेटर में 1 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर प्लेट को इनक्यूबेट करें।
- सेल पिघलने से पहले 30 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर माध्यम को गर्म करें ( सामग्री की तालिका देखें)।
नोट: वर्तमान प्रोटोकॉल कमरे के तापमान को 25 डिग्री सेल्सियस के रूप में वर्णित करता है। - आईपीएससी-सीएम को तरल नाइट्रोजन भंडारण टैंक से 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में स्थानांतरित करें।
नोट: आईपीएस-सीएम आमतौर पर अकादमिक या वाणिज्यिक स्रोतों द्वारा सूखी बर्फ पर भेज दिए जाते हैं। उपयोग होने तक उन्हें प्राप्त होने पर तरल नाइट्रोजन भंडारण में स्थानांतरित कर दिया जाता है। - बर्फ के पूरी तरह से पिघलने से पहले शीशी को हटा दें और शीशी को 75% इथेनॉल के साथ स्प्रे करें।
- शीशी को क्लास II बायोसेफ्टी कैबिनेट में ले जाएं और धीरे से सामग्री को एक नए 15 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में स्थानांतरित करें जिसमें 9 एमएल कमरे का तापमान माध्यम होता है।
- कमरे के तापमान पर 3 मिनट के लिए 200 x g पर कोशिकाओं को सेंट्रीफ्यूज करें।
- पिपेट द्वारा सतह पर तैरने वाले को त्याग दें और धीरे से 10 μM रॉक अवरोधक (Y27632) के साथ 1 mL माध्यम में कोशिकाओं को पुन: निलंबित करें ( सामग्री की तालिका देखें)।
नोट: अधिकतम सेल रिकवरी सुनिश्चित करने के लिए पिघली हुई कोशिकाओं के बार-बार पाइपिंग से बचें। - कोटिंग घोल को कुएं से निकालें और 10 μM रॉक अवरोधक के साथ 50 μL माध्यम जोड़ें।
- हेमोसाइटोमीटर15 के साथ ट्रिपैन ब्लू बहिष्करण विधि का उपयोग करके व्यवहार्य कोशिकाओं की संख्या की पुष्टि करें।
- निर्माता के निर्देशों के अनुसार, 100,000-150,000 सेल / सेमी2 के घनत्व पर लेपित96-वेल प्लेट में प्लेट कोशिकाएं।
- 24 घंटे के बाद, सुनिश्चित करें कि प्लेट की सतह से जुड़ी कोशिकाएं अन्य कोशिकाओं के संपर्क में हैं।
नोट: एकल कोशिकाएं दीर्घकालिक संस्कृति में खराब रूप से जीवित रहती हैं और आमतौर पर अधिक परिवर्तनशील रूप से व्यवहार करती हैं। - हर 2 दिनों में पूर्व-गर्म रखरखाव माध्यम को बदलें।
नोट: दीर्घकालिक दवा उपचार के लिए, एलवीएनसी आईपीएससी-सीएम को हर 2 दिनों में छोटे अणु दवाओं के साथ या बिना आधे मध्यम प्रतिस्थापन के साथ बदल दिया गया था।
2. आनुवंशिक रूप से एन्कोडेड कैल्शियम संकेतकों की अभिव्यक्ति
- कोशिकाओं को 72 घंटे तक चढ़ाने के बाद, बर्फ पर जीईसीआई वायरल किट ( सामग्री की तालिका देखें) को पिघलाएं।
- रखरखाव माध्यम के साथ एक 2x वायरल किट स्टॉक समाधान तैयार करें।
- मध्यम मात्रा को 100 μL प्रति अच्छी तरह से समायोजित करके संक्रमण के लिए कोशिकाओं को तैयार करें। पूर्व-मिश्रित वायरल घोल के 100 μL जोड़ें और 37 डिग्री सेल्सियस पर 8-16 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें।
- इनक्यूबेशन के बाद 200 μL पूर्व-गर्म माध्यम से बदलें।
- इमेजिंग सिस्टम का उपयोग करके जीईसीआई अभिव्यक्ति 24 घंटे पोस्ट-ट्रांसडक्शन की कल्पना करें ( सामग्री की तालिका देखें)।
नोट: अभिव्यक्ति स्तर ट्रांसडक्शन के बाद 48-72 घंटे पर अधिकतम तक पहुंचता है। कोशिकाओं को 24 घंटे के समय-बिंदु से चित्रित किया जा सकता है। हालांकि, जीईसीआई से प्राप्त संकेत एक महीने से अधिक समय तक बने रहते हैं। - कार्यात्मक परख करने से पहले ह्यूमिडिफायर इनक्यूबेटर में कोशिकाओं को बनाए रखें।
- संक्रमण प्रोटोकॉल (चरण 2.1-2.6) का उपयोग करके भेदभाव के 25 वें दिन सीएचआर 2-के-जीईसीओ वायरल किट ( सामग्री की तालिका देखें) के साथ आईपीएससी-सीएम (एलवीएनसी रोगी-व्युत्पन्न आईपीएससी-सीएम) को संक्रमित करें।
3. फ्लूओ -4 का उपयोग कर डाई-आधारित कैल्शियम इमेजिंग
- स्टॉक समाधान (5 एमएम) के रूप में डीएमएसओ में फ्लूओ -4 पाउडर ( सामग्री की तालिका देखें) को भंग करें।
- टायरोड के बफर में स्टॉक समाधान को 10 μM Fluo-4 की एकाग्रता तक पतला करें।
नोट: टायरोड के बफर में सोडियम बाइकार्बोनेट का 1.0 ग्राम / एल, कैल्शियम क्लोराइड का 0.2 ग्राम / एल, मैग्नीशियम क्लोराइड का 0.1 ग्राम / एल, पोटेशियम क्लोराइड का 0.2 ग्राम / एल, सोडियम क्लोराइड का 8.0 ग्राम / एल, सोडियम क्लोराइड का 0.05 ग्राम / एल और डी-ग्लूकोज का 1.0 ग्राम / एल होता है। - आधे माध्यम को 10 μM के फ्लूओ -4 समाधान के साथ प्रतिस्थापित करें (5 μM की अंतिम एकाग्रता देते हुए)।
- कोशिकाओं को 30 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
- कोशिकाओं को पूर्व-गर्म टायरोड के बफर के साथ धोएं और छवि अधिग्रहण से पहले उन्हें माध्यम से बदलें।
- स्ट्रीम अधिग्रहण प्रोटोकॉल के साथ रिकॉर्डिंग शुरू करें।
नोट: स्ट्रीम अधिग्रहण अंतराल समय के बिना लगातार छवियां प्राप्त कर रहा है। आईपीएससी-सीएम की बीटिंग आवृत्ति लगभग 1 हर्ट्ज है, और इस स्ट्रीम अधिग्रहण प्रोटोकॉल का उपयोग बीटिंग पैटर्न एकत्र करने के लिए किया जाता है।
4. विषाक्तता परीक्षण और फेनोटाइपिक स्क्रीनिंग के लिए छवि अधिग्रहण और कार्यात्मक परख
- उच्च-सामग्री इमेजिंग सिस्टम के सभी उपकरणों पर स्विच करें ( सामग्री की तालिका देखें)।
- सत्यापित करें कि कक्ष का तापमान 5% सीओ2 पूरकता के साथ 37 डिग्री सेल्सियस तक पहुंच जाता है। छवि अधिग्रहण से पहले सिस्टम को 2 घंटे के लिए संतुलन में रखें।
नोट: थर्मल बहाव दीर्घकालिक लाइव-सेल अवलोकनों के लिए एक महत्वपूर्ण समस्या है, 1 डिग्री सेल्सियस फोकल प्लेन को ~ 1 μm तक बदल सकता है, इसलिए लेंस और चरण को लक्ष्य तापमान तक पहुंचने की अनुमति देना छवि अधिग्रहण से पहले आवश्यक है। - इमेजिंग सॉफ़्टवेयर खोलें ( सामग्री की तालिका देखें) और 96-वेल प्लेट के लिए प्लेट सेटिंग चुनें।
- कक्ष में एक अनलिडेड 96-वेल प्लेट रखें और शीर्ष पर लाइव-सेल सीलिंग रिंग के साथ लोड करें।
नोट: लाइव-सेल सीलिंग रिंग पर्यावरण संतुलन तक पहुंचने के लिए एक एडाप्टर है। - आवश्यक स्थानिक रिज़ॉल्यूशन के अनुसार 20x (चित्रा 1 और चित्रा 2), 60x (चित्रा 3 और चित्रा 4), और 20x (चित्रा 5) जल विसर्जन उद्देश्य लेंस चुनें।
- प्रयोगात्मक अधिग्रहण से पहले स्पष्ट छवियां लेने के लिए फ़ोकस समायोजित करें।
- कैल्शियम गतिविधि रिकॉर्डिंग के लिए यादृच्छिक रूप से प्रति कुएं 3-5 क्षेत्रों का चयन करें।
नोट: प्रत्येक क्षेत्र में कम से कम 20 कोशिकाएं शामिल होनी चाहिए (एन ≥ 20)। - विभिन्न संकेतकों के लिए उपयुक्त फ़िल्टर चुनें. एमएनजी-जीईसीओ, एमटीजीसीईपीआईए 3 और ओरिया 1-जी-जीईसीओ के लिए एफआईटीसी 475/536; एनआईआर-जीईसीओ 2 के लिए Cy5 631/692; ईआर-एलएआर-जीईसीओ के लिए ईआर 530/593; के-जीईसीओ के लिए टेक्सास रेड 560/624।
- उपयोग किए गए प्रत्येक इमेजिंग चैनल के लिए उपयुक्त प्रकाश उत्सर्जक डायोड (एलईडी) शक्ति सेट करें।
नोट: सिग्नल (ऑब्जेक्ट की ज्ञात तीव्रता) से शोर (पृष्ठभूमि की ज्ञात तीव्रता) अनुपात द्वारा इमेजिंग अधिग्रहण के लिए एलईडी पावर का अनुकूलन करते समय, एस / एन अनुपात 2 से अधिक होना चाहिए। इस प्रोटोकॉल में, TRITC और FITC के लिए 10% एलईडी पावर; Cy5 के लिए 20% विशिष्ट था। - कार्डियोमायोसाइट्स में व्यक्त एमएनजी-जीईसीओ और के-जीईसीओ जांच द्वारा रिपोर्ट किए गए कैल्शियम क्षणिकों का निरीक्षण करने के लिए कैमरा एक्सपोज़र समय को अधिकतम 40 एमएस (25 हर्ट्ज) और स्ट्रीम अधिग्रहण के लिए 30 सेकंड की रिकॉर्डिंग अवधि सेट करें (चित्रा 1-3 और चित्रा 5)। यदि सिग्नल /शोर उच्च फ्रेम दरों पर <2 है तो एलईडी पावर बढ़ाएं।
- ऑप्टोजेनेटिक उत्तेजना (चित्रा 2 और चित्रा 3 सी, डी) के लिए, 1 हर्ट्ज पर बिजली (आमतौर पर 5% -10%) और नीली रोशनी की आवृत्ति का अनुकूलन करें।
नोट: आम तौर पर, मानव आईपीएससी-सीएम अनायास ~ 1 हर्ट्ज के आसपास धड़कता है, और ऑपरेटर को सहज दर से तेज गति करने की आवश्यकता होती है। - यदि अनुक्रमिक (चित्रा 3) या विस्तारित (चित्रा 4) माप की योजना बनाई जाती है, तो हर कीमत पर फोटोटॉक्सिसिटी से बचें। इसका मतलब रोशनी की शक्ति की तीव्रता को कम करना और कैमरा एक्सपोजर समय को बढ़ाकर इसकी भरपाई करना हो सकता है, उदाहरण के लिए, उपकोशिकीय सीए2 + संकेतों के तीन-चैनल वास्तविक समय अवलोकन के लिए उपयोग किए जाने वाले टाइम-लैप्स प्रोटोकॉल के साथ 100 एमएस (चित्रा 4)।
- ऑटो माइक्रोफ्लुइडिक्स सिस्टम के माध्यम से 10 एमएम कैफीन जोड़ने के लिए अतुल्यकालिक डिस्पेंसर प्रोटोकॉल का उपयोग करें ( सामग्री की तालिका देखें) (चित्रा 4)।
नोट: अतुल्यकालिक डिस्पेंसर प्रोटोकॉल छवि अधिग्रहण की अनुमति देता है जबकि छवियों के बीच अंतराल के बिना कैफीन जैसी दवाओं को जोड़ा जाता है। - अधिग्रहण शुरू करें।
5. छोटे अणु तैयार करना
- डीएमएसओ में ई 4031, डोफेटिलाइड और वेरापामिल को फिर से निलंबित करें और उन्हें टायरोड के बफर के साथ पतला करें। माध्यम में डीएमएसओ की अंतिम एकाग्रता 0.1% (v/ v) थी।
- वांछित कार्य एकाग्रता के डबल (यानी, 2x) पर यौगिक समाधान तैयार करें और अतिरिक्त से पहले 37 डिग्री सेल्सियस पर समतुल्य करें।
नोट: मध्यम जोड़ के बाद तापमान में उतार-चढ़ाव को कम करना महत्वपूर्ण है क्योंकि सिकुड़न तापमान-निर्भर है, और बदलते तापमान का प्रभाव तेजी से होता है। - यौगिकों को संबंधित लक्ष्य पर अच्छी तरह से व्यवस्थित करें।
- ऑटो माइक्रोफ्लुइडिक्स सिस्टम के माध्यम से डबल स्ट्रेंथ (2x) यौगिकों के 100 μL को कुओं में जोड़ें ( सामग्री की तालिका देखें) और वांछित (आमतौर पर 15 मिनट) इनक्यूबेशन अवधि के बाद अधिग्रहण शुरू करें।
6. इमेजिंग प्रसंस्करण और विश्लेषण
- सॉफ्टवेयर के साथ स्वचालित रूप से समय-क्रांति पर पल्स की विशेषता का पता लगाकर पृष्ठभूमि से सिग्नल क्षेत्र को अलग करें।
- बीटिंग फ्रीक्वेंसी (बीपीएम), पीक सिग्नल (आयाम), कैल्शियम क्षणिक अवधि 50% (सीटीडी 50), कैल्शियम क्षणिक अवधि 90% (सीटीडी 90), वृद्धि समय और क्षय समय (चित्रा 1 सी) का विश्लेषण करने के लिए कैल्शियम पीक विश्लेषण सॉफ्टवेयर (सामग्री की तालिका देखें) का उपयोग करें।
नोट: इन सेटिंग्स में, पहले 10 सेकंड में फोटोब्लीचिंग स्पष्ट थी, और उसके बाद संकेत स्थिर हो जाते हैं। इस प्रकार, कैल्शियम शिखर का विश्लेषण 11-30 एस से किया गया था। तीन-चैनल रिकॉर्डिंग (चित्रा 4) में, तीव्रता परिवर्तन को मापने के लिए सेल कंटूर को मैन्युअल रूप से सीमाबद्ध किया जाता है।
Representative Results
दवा उपचार के साथ या उसके बिना आईपीएससी-व्युत्पन्न कार्डियोमायोसाइट्स (आईपीएससी-सीएम) द्वारा व्यक्त एमएनजी-जीईसीओ10 में सहज कैल्शियम दोलन का अवलोकन चित्रा 1 और एनिमेटेड वीडियो 1 में प्रदर्शित किया गया है। एमएनजी-जीईसीओ का उपयोग करके प्राप्त काइनेटिक निशान से पता चलता है कि छोटे आणविक आयन चैनल इनहिबिटर, वेरापामिल, डोफेटिलाइड और ई 4031, ने कैल्शियम ट्रांसिएंट्स (चित्रा 1 बी) को प्रभावित किया। चित्रा 1 सी में दिखाए गए विशिष्ट कैल्शियम क्षणिक का विश्लेषण कैल्शियम पीक विश्लेषण सॉफ्टवेयर द्वारा पीक सिग्नल (आयाम), कैल्शियम क्षणिक अवधि 50% (सीटीडी 50), कैल्शियम क्षणिक अवधि 90% (सीटीडी 90), वृद्धि समय और क्षय समय प्राप्त करने के लिए किया जा सकता है। वेरापामिल, एक एल-प्रकार कैल्शियम ब्लॉकर17, कोशिकाओं में कैल्शियम प्रवाह को पूरी तरह से रोकता है जैसा कि अपेक्षित है (चित्रा 1 बी)। डोफेटिलाइड और ई 4031 एचईआरजी चैनल इनहिबिटर 18,19,20 हैं, जिन्हें प्रयोगात्मक वर्ग III एंटीरैडमिक दवाओं के रूप में सूचीबद्ध किया गया है। वाहन समूह की तुलना में डोफेटिलाइड (पी < 0.05) और ई 4031 उपचार (पी < 0.001) दोनों के साथ क्षय का समय लंबा होता है। E4031 उपचार के साथ CTD50 (p < 0.01) और CTD90 (p < 0.001) की लंबाई केवल वाहन (तालिका 1) की तुलना में देखी गई थी, ये परिणाम क्यूटी अंतराल पर रिपोर्ट किए गए प्रभावों के अनुरूप हैं, जो क्यू-तरंग की शुरुआत और टी-तरंग के अंत के बीच लंबे समय तक सतह इलेक्ट्रोकार्डियोग्राम से निर्धारित पुन: ध्रुवीकरण का एक नैदानिक रूप से प्रासंगिक माप है। पिछले अध्ययनों में12,21।
अनायास बीट कोशिकाओं को पीटने में सीटीडी मूल्यांकन की एक कठिनाई सीटीडी पर लागू परिवर्तनशीलता बीट दर है। यह आईपीएससी-सीएम मॉडल के लिए एक विशेष समस्या है, जहां 96 वेल प्लेट के प्रत्येक कुएं की अपनी बीट दर हो सकती है, भले ही सभी कोशिकाएं एक ही मूल शीशी से आती हैं। ऑप्टिकल या इलेक्ट्रिकल पेसिंग द्वारा बीट दर लागू करना संभव है। मानकीकृत गति की स्थितियों के तहत ई 4031 की खुराक-प्रतिक्रिया का मूल्यांकन करने के लिए, आईपीएससी-सीएम को व्यक्त करने वाले सीएचआर 2 और के-जीईसीओ7 को प्रकाश के 1 हर्ट्ज 470 एनएम दालों का उपयोग करके ऑप्टिकल नियंत्रित किया गया था और लाल के-जीईसीओ सिग्नल (चित्रा 2 ए और पूरक चित्रा 1) का उपयोग करके देखा गया था। ई 4031 (चित्रा 2 बी 1) की बढ़ती सांद्रता के साथ कैल्शियम ट्रांसिएंट्स के चरम आयाम (पी < 0.01) और क्षय समय (पी < 0.05) में वृद्धि होती है। ई 4031 का एक खुराक-निर्भर प्रभाव चरम आयाम (चित्रा 2 बी 1, बी 2) में कटौती के लिए सबसे स्पष्ट था।
यद्यपि मिनटों तक चलने वाले अल्पकालिक अध्ययन आमतौर पर कार्डियोटॉक्सिसिटी आकलन के लिए उपयोग किए जाते हैं, पुरानी विषाक्तता आकलन के लिए एक अंधा स्थान है जो हफ्तों, महीनों या वर्षों में दवाओं के लिए रोगी के जोखिम को समानांतर करता है। नैदानिक अभ्यास के लिए प्रासंगिक उपचार अवधि को दर्शाते हुए अंतराल पर रोग, या विषाक्तता, प्रभावों का अध्ययन करना फायदेमंद होगा। हमने बाएं वेंट्रिकुलर गैर-संघनन (एलवीएनसी) वाले रोगी से आईपीएससी-व्युत्पन्न कार्डियोमायोसाइट्स का अध्ययन करने के लिए अपने ऑल-ऑप्टिकल नियंत्रण और पहचान प्रणाली का उपयोग किया। आईपीएससी-सीएम को भेदभाव दिवस 25 के बाद के-जीईसीओ वायरल किट (चरण 2.2-2.6) के साथ ट्रांसड्यूस किया गया था। के-जीईसीओ सिग्नल को तब अतिरिक्त दवा उपचार के साथ या बिना, उसी कुओं में हर 1-2 सप्ताह में ट्रैक किया गया था। ऑप्टिकल पेसिंग (चित्रा 3 सी, डी, चरण 4.11) के तहत सहज कैल्शियम गतिविधि (चित्रा 3 ए, 3 बी) और कैल्शियम गतिशीलता दोनों को उच्च-सामग्री इमेजिंग सिस्टम (चरण 4.1-4.12) का उपयोग करके प्राप्त किया गया था और कैल्शियम पीक विश्लेषण सॉफ्टवेयर (चरण 6) द्वारा संसाधित किया गया था। जैसा कि चित्रा 3 ए, सी में दिखाया गया है, ऑप्टिकल पेसिंग के लिए उपयोग किए जाने वाले अतिरिक्त प्रकाश के साथ या उसके बिना, वायरल ट्रांसडक्शन के एक महीने बाद स्पष्ट कैल्शियम क्षणिक दिखाई देते हैं। इस काम ने एक दवा की पहचान की जो बीट दर को बढ़ाती है, संकुचन अंतराल को नियमित करती है, और एलवीएनसी आईपीएससी-सीएम मॉडल (चित्रा 3 ए, बी) में क्षणिक कैल्शियम आयाम को बढ़ाती है। इस डेटा से दो महत्वपूर्ण अवलोकन किए जा सकते हैं। सबसे पहले, चिकित्सीय परिप्रेक्ष्य से, दवा प्रभाव दिन 63 और दिन 70-समय बिंदुओं पर टिकाऊ दिखाई देता है। दूसरा, और एक ऐसे क्षेत्र के लिए प्रासंगिक है जो सामान्य रूप से पहले के समय-बिंदुओं (आमतौर पर <50 दिन) पर संक्षिप्त खिड़कियों (<1 मिनट) के दौरान यौगिक प्रभावों का आकलन करता है; यौगिक के रोग फेनोटाइप संशोधित प्रभाव केवल 60 वें दिन के बाद स्पष्ट होते हैं, यह सुझाव देते हुए कि मानक स्क्रीनिंग प्रोटोकॉल में कार्रवाई के धीमे तंत्र वाली दवाओं को छूट देना आसान हो सकता है।
बीट आवृत्ति की परिवर्तनशीलता, और कैल्शियम क्षणिक अवधि पर बाद का प्रभाव, किसी भी समय बिंदु पर सिर्फ एक अच्छी तरह से अच्छी तरह से समस्या नहीं है। यह भी बदलता है क्योंकि आईपीएससी-सीएम को संस्कृति में बनाए रखा जाता है, जो समय के साथ एक अच्छी तरह से भिन्न होता है (चित्रा 3 बी)। अनुक्रमिक प्रयोगों के भीतर स्थिरता लागू करने के लिए, 1 हर्ट्ज ऑप्टिकल पेसिंग को दवा उपचार के साथ या उसके बिना लागू किया जा सकता है (चित्रा 3 सी, डी)। यहां हालांकि दिन 63 के परिणाम कैल्शियम क्षणिक में काफी अधिक आयाम, कम सीटीडी 90 और कम क्षय समय के साथ उत्साहजनक रुझान दिखाते हैं; 70 दिन के समय-बिंदु तक - और दुर्लभ बीमारी के लिए दवा स्क्रीनिंग प्रक्रिया के दौरान पुराने आकलन की आवश्यकता का संकेत - विध्रुवण (ईएडी) का पता चलने के तुरंत बाद। रोग फेनोटाइपिंग, या छोटे अणु मूल्यांकन के लिए पेसिंग प्रोटोकॉल जोड़ने का मूल्य, बीट दर, कैल्शियम क्षणिक आयाम, सीटीडी 90 और क्षय समय के लिए चित्रा 3 बी, डी में प्रस्तुत परिणामों की तुलना से गुणात्मक रूप से मूल्यांकन किया जा सकता है।
रासायनिक डाई की तुलना में जीईसीआई का एक लाभ, कैल्शियम क्षणिक की कल्पना करने के लिए आधारित पद्धति एक सेल के भीतर एक विशिष्ट डिब्बे में जांच को प्रतिबंधित करने की क्षमता है। इसे एकल कोशिकाओं में कई रंग और / या आत्मीयता वेरिएंट को मल्टीप्लेक्स करके आगे बढ़ाया जा सकता है। इसलिए, ईआर-एलएआर-जीईसीओ9, एमटीजीसीईपीआईए22,23 (या ओरिया 1-जी-जीईसीओ), और एनआईआर-जीईसीओ 2 8,24 सहित कई जीईसीआई को क्रमशः एंडोप्लाज्मिक रेटिकुलम / सारकोप्लाज्मिक रेटिकुलम (ईआर / एसआर), माइटोकॉन्ड्रिया (या सीआरएसी चैनल) और साइटोसोल में उत्पन्न होने वाले वास्तविक समय कैल्शियम गतिविधि माप के लिए सेल मॉडल में अभिव्यक्ति के लिए विकसित किया गया है। उन्हें विभिन्न इंट्रासेल्युलर कैल्शियम स्टोर के बीच बातचीत का अध्ययन करने के लिए आईपीएससी-सीएम मॉडल (चित्रा 4 ए, सी) में जोड़ा जा सकता है। उदाहरण के लिए, एसआर कैल्शियम स्टोर को खाली करने के लिए 10 एमएम कैफीन उपचार का उपयोग किया जा सकता है। यहां ईआर-एलएआर-जीईसीओ सिग्नल (एसआर से कैल्शियम के नुकसान का संकेत) की कमी ने एनआईआर-जीईसीओ सिग्नल (साइटोसोलिक कैल्शियम एकाग्रता में वृद्धि का संकेत) की गिरावट को समानांतर किया। इन उतार-चढ़ावों से अन्य इंट्रासेल्युलर डिब्बे कैसे प्रभावित होते हैं, इसका अच्छी तरह से अध्ययन नहीं किया गया है। फिर भी, एक हरे माइटोकॉन्ड्रियल-लक्षित एमटीजीसीईपीआईए 3 को शामिल करने से पता चलता है कि इन स्थितियों में माइटोकॉन्ड्रिया में कैल्शियम अपटेक होता है (चित्रा 4 ए, बी)।
इसी तरह, कैल्शियम रिलीज-एक्टिवेटेड चैनल (सीआरएसी) सीए 2 + करंट (चित्रा 4 सी, डी) को प्रकट करने के लिए एक जांच, ओराई 1-जी-जीईसीओ25 को शामिल करके विभिन्न कैल्शियमधाराओं के बीच परस्पर क्रिया की कल्पना की जा सकती है। आईपीएससी-सीएम मॉडल में, यह संकेत सहज साइटोसोलिक कैल्शियम क्षणिक (चित्रा 4 डी 1, डी 2) के साथ बढ़ता है। इसे ध्यान में रखते हुए, कैफीन के साथ उपचार साइटोसोल और ओराई 1 चैनल दोनों में एक बड़ा कैल्शियम क्षणिक पैदा करता है।
यह स्वीकार किया जाता है कि कार्डियोमायोसाइट मॉडल में अधिकांश कैल्शियम क्षणिक इमेजिंग कैल्शियम रंजक26 का उपयोग करके निर्धारित की गई है। एक आनुवंशिक रूप से एन्कोडेड कैल्शियम संकेतक की तुलना आईपीएससी-व्युत्पन्न कार्डियोमायोसाइट मॉडल में एक रासायनिक डाई से की गई थी ताकि विभिन्न कैल्शियम इमेजिंग दृष्टिकोणों की साइड-बाय-साइड तुलना को सक्षम किया जा सके। आईपीएससी-सीएम को व्यक्त करने वाले के-जीईसीओ को फ्लूओ -4 लोडेड कोशिकाओं के साथ चित्रित किया गया था। कार्डियोमायोसाइट्स को व्यक्त करने वाले के-जीईसीओ ने समय के साथ लगातार धड़कन व्यवहार दिखाया (चित्रा 5 ए, सी)। हालांकि, फ्लूओ -4 लोडिंग ने इस मॉडल (चित्रा 5 बी, सी) में बीट आवृत्ति और सीटीडी दोनों को प्रभावित किया, यह सुझाव देते हुए कि फ्लूओ -4 स्वयं ऐसे प्रयोगों के परिणामों को प्रभावित कर सकता है। इमेजिंग जांच के लंबे समय तक संपर्क के बाद यह विशेष रूप से सच होगा, जो मल्टीवॉल इमेजिंग प्रारूप में हो सकता है यदि अच्छी तरह से इमेजिंग प्रति मिनट के समय के साथ होती है।
चित्र 1: आईपीएससी-व्युत्पन्न कार्डियोमायोसाइट्स पर लागू छोटे अणु आयन चैनल अवरोधक। (A-B) iPSC-CM की समय-चूक छवियां जो mNG-GECO को 25 Hz पर व्यक्त करती हैं। स्केल बार = 50 μm. (B) यौगिक जोड़ के बाद प्रतिनिधि Ca2+ दोलन। एमएनजी-जीईसीओ व्यक्त करने वाली कोशिकाओं से प्राप्त फ्लोरोसेंट संकेतों को प्रतिदीप्ति अनुपात एफ / एफ 0 के रूप में प्रस्तुत किया जाता है, जहां एफ 0 को बेसल तीव्रता के रूप में परिभाषित किया जाता है और एफ प्रत्येक समय बिंदु पर पता लगाया जाता है। (सी) कैल्शियम पीक विश्लेषण सॉफ्टवेयर अर्ध-अधिकतम चौड़ाई (सीटीडी 50), 90% क्षणिक अवधि (सीटीडी 90), वृद्धि समय और क्षय समय सहित पैरामीटर निकाल सकता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्र 2: ऑप्टिकल पेसिंग सिस्टम के भीतर HERG अवरोधक E4031 का उपयोग करके खुराक-प्रतिक्रिया उदाहरण। (A) E4031 की विभिन्न सांद्रता में 10% नीली रोशनी के साथ ऑप्टिकल उत्तेजना के निशान। 25 हर्ट्ज पर लिए गए के-जीईसीओ को व्यक्त करने वाले आईपीएससी-व्युत्पन्न कार्डियोमायोसाइट्स की टाइम-लैप्स छवियां (बी 1) विभिन्न यौगिक खुराक के साथ प्राप्त कैल्शियम ट्रांसिएंट्स के प्रतिनिधि निशान। आयाम (बी 2) और क्षय समय (बी 3) में ई 4031 का पीक विश्लेषण और खुराक-प्रतिक्रिया। नीली सलाखों 1 हर्ट्ज 470 एनएम पल्स प्रकाश उत्तेजना का संकेत देती हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 3: एलवीएनसी रोगी-व्युत्पन्न कार्डियोमायोसाइट्स में दीर्घकालिक दवा फेनोटाइपिक स्क्रीनिंग के लिए लागू ऑल-ऑप्टिकल प्लेटफॉर्म। (ए) रोगी-व्युत्पन्न कार्डियोमायोसाइट्स (भेदभाव दिवस 70 के बाद) में सहज धड़कन गतिविधि का प्रतिनिधि निशान (लाल) या (नीला) के बिना (नीला) 5 μM दवा उपचार। (बी) 5 एसएम दवा उपचार के साथ या उसके बिना सहज पिटाई गतिविधि का चरम विश्लेषण। (सी) 1 हर्ट्ज ऑप्टिकल उत्तेजना के तहत रोगी-व्युत्पन्न आईपीएससी-सीएम में दवा प्रतिक्रिया के तीव्रता निशान। (डी) 1 हर्ट्ज ऑप्टिकल उत्तेजना के साथ रोगी-व्युत्पन्न कार्डियोमायोसाइट्स का पीक विश्लेषण। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
(ए-बी) आईपीएससी-सीएम को साइटोप्लाज्म, एनआईआर-जीईसीओ 2 (लाल), एंडोप्लाज्मिक रेटिकुलम ईआर-एलएआर-जीईसीओ (पीला), और एमटीजीसीईपीआईए 3 (सियान), एक माइटोकॉन्ड्रियल सीए2 + संकेतक के लिए उपकोशिकीय कैल्शियम जांच के साथ ट्रांसड्यूस किया गया था। (बी) 10 एमएम कैफीन उपचार से पहले और बाद में तीन-चैनल टाइम-लैप्स कैल्शियम इमेजिंग। (सी-डी) साइटोप्लाज्मिक, एनआईआर-जीईसीओ 2 (लाल), एंडोप्लाज्मिक रेटिकुलम ईआर-एलएआर-जीईसीओ (पीला), और सीआरएसी चैनल संकेतक ओराई 1-जी-जीईसीओ (सियान) के साथ ट्रांसड्यूस किए गए आईपीएससी-सीएम की कल्पना की गई थी। (डी) तीन-चैनल टाइम-लैप्स कैल्शियम इमेजिंग कैप्चर की गई थी। (D1) एनआईआर-जीईसीओ 2 और ओराई 1-जी-जीईसीओ के साथ सहज बीट-टू-बीट गतिविधि देखी गई। (D2) ईआर से कैल्शियम फ्लक्स (ईआर-एलएआर-जीईसीओ सिग्नल की कमी) कैफीन उपचार पर साइटोसोलिक कैल्शियम सिग्नल में वृद्धि के साथ। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 5: आनुवंशिक रूप से एन्कोडेड कैल्शियम संकेतक (के-जीईसीओ) की तुलना आईपीएससी-सीएम में रासायनिक कैल्शियम-संवेदनशील डाई (फ्लूओ -4) से की जाती है। (सी) के-जीईसीओ ट्रांसड्यूस्ड, या फ्लूओ -4 लोडेड आईपीएससी-सीएम का कैल्शियम क्षणिक विश्लेषण। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
| BPM | CTD50 (s) | CTD90 (s) | आयाम (F/F0) | वृद्धि का समय | क्षय समय (ओं) | |
| वाहन (0.1% डीएमएसओ) | 112.3657+/-10.95 | 0.25+/-0.04 | 0.41+/-0.01 | 1.99+/-0.02 | 0.07+/-0.01 | 0.28+/-0.01 |
| वेरापामिल (1 uM) | 0 | - | - | - | - | - |
| Dofetilide (5 nM) | 103.42+/-9.87** | 0.23+/-0.03 | 0.46+/-0.03 | 1.91+/-0.03 | 0.07+/-0.01 | 0.35+/-0.02* |
| E4031 (30 nM) | 75.73+/-12.08*** | 0.37+/-0.04** | 0.58+/-0.08*** | 1.55+/-0.02** | 0.11+/-0.04*** | 0.35+/-0.07** |
तालिका 1: आईपीएससी-सीएम मॉडल में क्षणिक कैल्शियम मापदंडों के लिए यौगिक जोड़ के प्रभाव। महत्व मान *(p ≤ 0.05), **(p < 0.01) और ***(p < 0.001) द्वारा इंगित किए जाते हैं।
एनिमेटेड वीडियो 1: केवल वाहन के साथ आईपीएससी-व्युत्पन्न कार्डियोमायोसाइट्स में एमएनजी-जीईसीओ द्वारा सहज कैल्शियम गतिविधि देखी गई थी। ग्रे-स्केल छवि की एक छद्म रंगीन फिल्म प्रदान की गई है। कृपया इस वीडियो को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।
पूरक चित्रा 1: एडेनोवायरल-वेक्टर का योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व। इसमें एक एक्ट्यूएटर के रूप में चैनल रोडोप्सिन सीएचआर 2 शामिल है, जिसमें एक लाल फ्लोरोसेंट कैल्शियम संकेतक के-जीईसीओ एक ऑल-ऑप्टिकल परख के लिए कैल्शियम रिपोर्टर के रूप में है। प्रकाश-संवेदनशील आयन चैनल दृश्यमान स्पेक्ट्रम की नीली-हरी सीमा में प्रकाश द्वारा उत्तेजक कोशिकाओं को विध्रुवीकृत करने की अनुमति देता है। इन प्रयोगों में 470 एनएम प्रकाश का उपयोग किया गया था। उत्तेजक कोशिकाओं में कैल्शियम क्षणिक को एक साथ के-जीईसीओ द्वारा चित्रित किया जा सकता है, जिसके लिए हरे रंग की उत्तेजना प्रकाश की आवश्यकता होती है, जो लाल उत्सर्जन का उत्पादन करती है। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.
Discussion
उच्च-थ्रूपुट स्क्रीनिंग को सफलतापूर्वक करने के लिए, संकेतों को संस्कृति पोत में समान रूप से वितरित किया जाना चाहिए, यह गारंटी देते हुए कि इमेजिंग अधिग्रहण के दौरान यादृच्छिक रूप से चयनित क्षेत्रों (आरओआई) को स्वचालित रूप से लागू किया जा सकता है। यद्यपि रासायनिक कैल्शियम संकेतक आसानी से इस आवश्यकता को पूरा करते हैं, आनुवंशिक रूप से एन्कोडेड जांच ने ऐतिहासिक रूप से शीट के बजाय पैच का उत्पादन किया है, जो उनके उपयोग को सीमित करते हैं। एक वायरल ट्रांसडक्शन सिस्टम का उपयोग पारंपरिक अभिकर्मक विधियों की तुलना में लक्ष्य कोशिकाओं के बीच कई संकेतकों के उच्च 27,28 और समकक्ष अभिव्यक्ति स्तर प्रदान करता है। विभिन्न सेल प्रकारों को अलग-अलग प्रमोटरों की आवश्यकता हो सकती है, और जीन वितरण प्रणाली की पसंद कोतदनुसार 29,30,31 बदलने की आवश्यकता हो सकती है। विषम सेल मॉडल में, ट्रांसडक्शन और अभिव्यक्ति दक्षता विशिष्ट सेल प्रकारों में भिन्न हो सकती है। एक ओर, यह विशेष कोशिकाओं के आवेदन को सीमित कर सकता है, लेकिन सह-संस्कृति प्रणाली32 में विशेष कोशिकाओं को अलग करने के लिए घटना का शोषण किया जा सकता है।
इस दृष्टिकोण का मुख्य प्रभाव स्वचालन द्वारा प्रयोगकर्ता और नमूने के बीच एक-से-एक संबंध से मुक्ति है। एक मानक बहु-कुएं के प्रयोग में, एक ही कुएं के भीतर चार पदों पर डेटा एकत्र करने के लिए, हमारा अनुमान है कि 96 वेल प्लेट से 30 एस वीडियो इकट्ठा करने के लिए माइक्रोस्कोप में लगभग 15 घंटे लगते हैं। स्वचालित प्रणाली में, इसमें ~ 4 घंटे लगते हैं। इसके अलावा, मैन्युअल रूप से डेटा का विश्लेषण डेटा अधिग्रहण की तुलना में कहीं अधिक समय लेता है। यहां उपयोग की जाने वाली विश्लेषण प्रणाली मैनुअल समकक्ष की तुलना में लगभग 200 गुना तेज है। शुद्ध परिणाम एक बेहतर वर्कफ़्लो और उच्च लागत और समय की बचत है।
कैल्शियम रंगों से भरे प्राथमिक कार्डियोमायोसाइट्स के विपरीत जो घंटों के क्रम में जीवित रहते हैं, वायरल डिलीवरी सिस्टम के माध्यम से आईपीएससी-सीएम में व्यक्त जीईसीआई एक प्रयोगात्मक मॉडल में एक संकेत दे सकते हैं जो कुछ महीनों तक रहता है। इन मॉडलों को एक बहु-अच्छी तरह से प्रारूप में बनाए रखा जा सकता है और छोटे अणु स्क्रीनिंग के लिए विकसित उच्च-सामग्री इमेजिंग सिस्टम में सीरियल विश्लेषण के लिए एक साथ ट्रैक किया जा सकता है। यह आमतौर पर विष विज्ञान परख में उपयोग किए जाने वाले मिनटों के बजाय रोगियों (सप्ताह या महीनों) द्वारा अनुभव किए गए अवधि में दवा प्रभावों का परीक्षण करने के लिए एक सरल मानव प्रयोगात्मक मंच का उत्पादन करता है।
प्रणाली को हरे से लेकर इन्फ्रा-रेड तक अलग-अलग उत्सर्जन गुणों वाले जीईसीआई को शामिल करके बहु-पैरामीटर माप प्रदान करने के लिए विस्तारित किया जा सकता है। इस तरह के प्रयोगों को संकेतों को अलग रखने के लिए प्रयोगात्मक डिजाइन में उचित उत्तेजना प्रकाश और फिल्टर सेट की आवश्यकता होती है। दवा स्क्रीनिंग संदर्भ में व्यापक अनुप्रयोग के लिए दवा वितरण के अलावा मजबूत और कुशल विश्लेषण प्लेटफार्मों की आवश्यकता होती है। यद्यपि यहां वर्णित मॉडल कई गतिशील कैल्शियम संकेतकों के उपयोग पर केंद्रित है, इसे सेल फॉर्म या फ़ंक्शन के संरचनात्मक मार्करों में संशोधित किया जा सकता है। ये आम तौर पर कल्पना करना आसान होता है क्योंकि वे इंट्रासेल्युलर कैल्शियम एकाग्रता में सौ गुना भिन्नता की तुलना में थोड़ा बीट-टू-बीट परिवर्तनशीलता दिखाते हैं। यह दृष्टिकोण दुर्लभ-बीमारी के लिए विशेष रूप से मूल्यवान हो सकता है जहां रोगियों से प्राप्त आईपीएससी मध्यवर्ती में एक विशेष स्थिति के सभी आनुवंशिक चालक और संशोधक शामिल हो सकते हैं जिन्हें एक स्केलेबल सेल मॉडल में संरक्षित किया जा सकता है, सेलुलर फेनोटाइप के आधार पर विभिन्न बीमारियों में दवा की खोज की सुविधा प्रदान की जा सकती है जिन्हें जैविक तंत्र के आधार पर स्वतंत्र रूप से देखा जा सकता है जिसे स्पष्ट करना चुनौतीपूर्ण हो सकता है।
Disclosures
लुमिस्टार ने के-जीईसीओ, एनआईआर-जीईसीओ और एलएआर-जीईसीओ के उपयोग के पेटेंट संरक्षण के लिए आवेदन किया है।
Acknowledgments
रॉबर्ट कैंपबेल को सामग्री और मूल्यवान चर्चा साझा करने के लिए टोक्यो विश्वविद्यालय में धन्यवाद देते हैं; तकनीकी सहायता के लिए आणविक उपकरण में डॉ चिया-लिन हो।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 96-well plate | Perkin Elmer | 6055302 | |
| auto microfluidic system | Molecular Device | A device has a single channel pipetter that can be used to add compound automatically | |
| Caffeine | Sigma-Aldrich | C0750 | |
| Cardiosight-S l iPSC derived cardiomyocytes | NEXEL | C-002 | |
| Dimethyl sulfoxide | Millipore Sigma | 1096780100 | |
| Dofetilide | Sigma-Aldrich | PZ0016 | |
| E4031 | Tocris | 1808 | |
| ER-LAR-GECO viral kit | LumiSTAR | AA001a | Red-shifted GECI packed into adeno-viral vector |
| Fibronectin | Sigma-Aldrich | F1141 | |
| Fluo-4 AM | Invitrogen | F14201 | Chmical calcium sensitive dye |
| Gelatin | Sigma-Aldrich | G1890 | |
| ImageXpress Micro Confocal High-Content Imaging System | Molecular Device | ||
| iPSC-CMs Maintenance Medium | NEXEL | CMS-002 | iPSC-CMs Medium (Cardiosight-S medium) + Cardiosight-S Supplement |
| iPSC-CMs Medium (Cardiosight-S medium) | NEXEL | CMS-002 | |
| K-GECO viral kit | LumiSTAR | AA005a | Red-shifted GECI packed into adeno-viral vector |
| LumiCAL software | LumiSTAR | LUCS01a | Software for analysis of calcium peak in cardiomyocytes |
| mNG-GECO viral kit | LumiSTAR | AL008a | Brighter green GECI packed into lenti-viral vector |
| mt-GCEPIA3 viral kit | LumiSTAR | AL011a | GECI targgeting on mitochondria packed into lenti-viral vector |
| NIR-GECO viral kit | LumiSTAR | AV004a | Near infrared GECI packed into viral vector |
| Orai1-GGECO viral kit | LumiSTAR | AL010a | GECI targgeting on Orai1 packed into lenti-viral vector |
| Tyrode's salts | Sigma-Aldrich | T2145 | |
| Verapamil hydrochloride | Sigma-Aldrich | V4629 | |
| Y-27632 dihydrochloride | Tocris | 1254 |
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