Summary
Настоящий протокол описывает полностью оптический контроль и наблюдение за триггерной клеточной активностью в кардиомиоцитах, полученных из iPSC (iPSC-CM), для высокопроизводительного скрининга лекарств и тестирования токсичности. Показана многопараметрическая количественная оценка фенотипических закономерностей во времени и пространстве. Демонстрируются долгосрочные эффекты лекарств в течение нескольких часов или последовательные измерения в течение нескольких дней.
Abstract
Важно понять, как возбудимые клетки работают в здоровье и болезни и как это поведение может быть изменено небольшими молекулами или генетическими манипуляциями. Генетически закодированные индикаторы кальция (GECI) с несколькими эмиссионными окнами могут быть объединены (например, для одновременного наблюдения различных субклеточных событий) или использованы в расширенных приложениях с другими светозависимыми исполнительными механизмами в возбудимых клетках (например, комбинируя генетически закодированный оптогенетический контроль со спектрально совместимыми показателями кальция). Такие подходы были использованы в первичных или стволовых нейронах, кардиомиоцитах и бета-клетках поджелудочной железы. Тем не менее, было сложно увеличить пропускную способность или продолжительность наблюдения таких подходов из-за ограничений инструментов, аналитического программного обеспечения, производительности индикаторов и эффективности доставки генов. Здесь высокопроизводительный зеленый GECI, mNeonGreen-GECO (mNG-GECO) и GECI с красным смещением, K-GECO, сочетаются с оптогенетическим контролем для достижения полностью оптического контроля и визуализации клеточной активности в высокопроизводительном формате визуализации с использованием системы визуализации с высоким содержанием. Показаны приложения, демонстрирующие тестирование кардиотоксичности и фенотипический скрининг лекарств со здоровыми и полученными от пациента iPSC-CMs. Кроме того, в модели iPSC-CM также демонстрируются многопараметрические оценки с использованием комбинаций спектральных и кальциевых вариантов показателей сродства к кальцию (NIR-GECO, LAR-GECO и mtGCEPIA или Orai1-G-GECO), ограниченные различными клеточными компартментами.
Introduction
Модели, полученные из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (iPSC), на основе человека, считаются многообещающим решением целей 3R (замена, сокращение и уточнение), изложенных для исследований на животных 1,2. Кардиомиоциты, полученные из iPSC, использовались для моделирования заболеваний и открытия лекарств, поскольку они резюмируют основные аспекты биологии человека3. Кальциевая визуализация, как правило, с химическими красителями, использовалась для наблюдения клеточной активности до и послемедикаментозного лечения 4,5. Однако химические датчики кальция на основе красителей непосредственно ингибируют Na, K-АТФазу и нарушают клеточную функцию6. Таким образом, отслеживание одних и тех же клеток в течение нескольких часов или дней было проблематичным при использовании химических красителей. Здесь ряд генетически закодированных показателей кальция (GECI)7,8,9,10 используется в широком спектре возбуждения/излучения и сродства кальция для формирования платформы для тестирования сердечной токсичности, предлагающей измерения мультиорганелл в режиме реального времени в течение длительных периодов времени11.
Для дальнейшего развития концепции высокопроизводительного скрининга на основе кальция в модели iPSC-CM за пределами ранее продемонстрированного академического контекста с использованием генетически закодированных инструментов для оптического контроля и визуализации кальция путем совместной экспрессии индикатора кальция с красным смещением, R-GECO или K-GECO с оптогенетическим инструментом, ChR2 12,13, были созданы готовые вирусные наборы. При преобразовании визуализации в инструмент с высоким содержанием, оснащенный автомикрофлюидной системой, одноканальное пипетирование добавления соединений наслаивается поверх визуализации живых клеток. Наконец, оба важнейших аспекта экспериментального пути, обработка изображений и анализ улучшаются и автоматизируются.
Protocol
Кардиомиоциты левого желудочка без уплотнения (LVNC) пациенту с iPSC-производными кардиомиоцитами (iPSC-CM) были предоставлены Национальной университетской больницей Тайваня. Сбор образцов пациентов для перепрограммирования в iPSC и протоколы обслуживания14 для исследовательских целей последовали Хельсинкской декларации WMA (этические принципы для медицинских исследований с участием людей) и были одобрены Институциональным наблюдательным советом: Бюро Комитета по этике исследований в NTUH (#201612099RINC). Другие iPSC-CM были получены от коммерческих поставщиков. Использование производных iPSC не требует специальных разрешений в нашем учреждении.
1. Препарат кардиомиоцитов на основе iPSC
- Подготовьте многолуночную пластину перед тем, как iPSC-CM будет извлечен из холодного хранилища для размораживания. Покройте каждую лунку 96-луночной микропластины 100 мкл 50 мкг/мл фибронектина/0,2% раствора желатина (см. Таблицу материалов) для тщательного покрытия всех поверхностей.
- Инкубируют пластину при 37 °C в течение 1 ч в увлажненном инкубаторе.
- Нагревайте среду (см. Таблицу материалов) до комнатной температуры в течение 30 мин перед размораживанием клеток.
ПРИМЕЧАНИЕ: Настоящий протокол описывает комнатную температуру как 25°C. - Перенесите iPSC-CM из резервуара для хранения жидкого азота на водяную баню с температурой 37 °C.
ПРИМЕЧАНИЕ: iPS-CM обычно поставляются на сухом льду академическими или коммерческими источниками. Они переносятся в хранилище жидкого азота при получении до использования. - Удалите флакон до того, как лед полностью растает, и опрыскайте флакон 75% этанолом.
- Отнесите флакон в шкаф биобезопасности класса II и аккуратно перенесите содержимое в новую коническую трубку объемом 15 мл, содержащую 9 мл среды комнатной температуры.
- Центрифугировать ячейки при 200 х г в течение 3 мин при комнатной температуре.
- Выбросьте супернатант пипеткой и осторожно повторно суспендируйте клетки в 1 мл среды с 10 мкМ ингибитора ROCK (Y27632) (см. Таблицу материалов).
ПРИМЕЧАНИЕ: Избегайте повторного пипетирования размороженных клеток, чтобы обеспечить максимальное восстановление клеток. - Извлеките раствор покрытия из скважины и быстро добавьте 50 мкл среды с 10 мкМ ингибитора ROCK.
- Подтвердить количество жизнеспособных клеток можно с помощью метода исключения трипан-синего с помощью гемоцитометра15.
- Пластинчатые ячейки в 96-луночной пластине с покрытием при плотности 100 000-150 000 ячеек/см2 в соответствии с инструкциями производителя16.
- Через 24 ч убедитесь, что ячейки, прикрепленные к поверхности пластины, находятся в контакте с другими клетками.
ПРИМЕЧАНИЕ: Одиночные клетки плохо выживают в долгосрочной культуре и обычно ведут себя более изменчиво. - Заменяйте предварительно нагретую поддерживающую среду каждые 2 дня.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для длительного медикаментозного лечения LVNC iPSC-CM меняли половинными средними заменителями с низкомолекулярными препаратами или без них каждые 2 дня.
2. Экспрессия генетически закодированных показателей кальция
- После покрытия клеток в течение 72 ч разморозьте вирусные наборы GECI (см. Таблицу материалов) на льду.
- Подготовьте 2-кратный вирусный набор для приготовления раствора со средой для обслуживания.
- Подготовьте клетки к инфекции, регулируя объем среды до 100 мкл на лунку. Добавляют 100 мкл предварительно смешанного вирусного раствора и инкубируют в течение 8-16 ч при 37 °С.
- Замените 200 мкл предварительно нагретой средой после инкубации.
- Визуализируйте выражение GECI через 24 ч после трансдукции с помощью системы визуализации (см. Таблицу материалов).
ПРИМЕЧАНИЕ: Уровень экспрессии достигает максимума через 48-72 ч после трансдукции. Ячейки могут быть визуализированы с 24-часовой точки времени. Тем не менее, сигналы, полученные от GECI, сохраняются более одного месяца. - Поддерживайте клетки в увлажненном инкубаторе перед проведением функциональных анализов.
- Инфицировать iPSC-CMs (LVNC, полученные из пациента iPSC-CMs) вирусным набором ChR2-K-GECO (см. Таблицу материалов) на 25-й день после дифференциации с использованием протокола инфекции (этап 2.1-2.6).
3. Визуализация кальция на основе красителей с использованием Fluo-4
- Растворить порошок Флюо-4 (см. Таблицу материалов) в ДМСО в виде исходного раствора (5 мМ).
- Разбавить исходный раствор до концентрации 10 мкМ Fluo-4 в буфере Тирода.
ПРИМЕЧАНИЕ: Буфер Тирода состоит из 1,0 г/л бикарбоната натрия, 0,2 г/л хлорида кальция, 0,1 г/л хлорида магния, 0,2 г/л хлорида калия, 8,0 г/л хлорида натрия, 0,05 г/л моноосновного фосфата натрия и 1,0 г/л D-глюкозы. - Заменить половину среды 10 мкМ раствора Fluo-4 (давая конечную концентрацию 5 мкМ).
- Инкубируют клетки при 37 °C в течение 30 мин.
- Промыть ячейки предварительно нагретым буфером Tyrode и заменить их средой перед получением изображения.
- Начните запись с помощью протокола сбора потока.
ПРИМЕЧАНИЕ: Потоковое получение - это непрерывное получение изображений без интервального времени. Частота биения iPSC-CM составляет около 1 Гц, и этот протокол сбора потока используется для сбора паттернов биения.
4. Получение изображений и функциональные анализы для испытания на токсичность и фенотипического скрининга
- Включите все устройства системы визуализации с высоким содержанием (см. оглавление материалов).
- Убедитесь, что температура в камере достигает 37 °C, с добавлением 5% CO2 . Держите систему в равновесии в течение 2 ч до получения изображения.
ПРИМЕЧАНИЕ: Тепловой дрейф является серьезной проблемой для долгосрочных наблюдений за живыми клетками, 1 ° C может изменить фокальную плоскость на ~ 1 мкм, поэтому необходимо позволить линзе и ступени достичь целевой температуры до получения изображения. - Откройте программное обеспечение для визуализации (см. Таблица материалов) и выберите настройку пластины для пластины с 96 скважинами.
- Поместите нескользящую 96-луночную пластину в камеру и загрузите сверху уплотнительное кольцо с живыми ячейками.
ПРИМЕЧАНИЕ: Уплотнительное кольцо с живыми ячейками является адаптером для достижения экологического равновесия. - Выберите объектив 20x (рисунок 1 и рисунок 2), 60x (рисунок 3 и рисунок 4) и 20x (рисунок 5) с погружением в воду в соответствии с требуемым пространственным разрешением.
- Настройте фокус, чтобы сделать четкие изображения перед экспериментальным получением.
- Выберите 3-5 областей случайным образом на скважину для регистрации активности кальция.
ПРИМЕЧАНИЕ: Каждая область должна включать не менее 20 ячеек (n ≥ 20). - Выберите подходящие фильтры для разных индикаторов. FITC 475/536 для mNG-GECO, mtGCEPIA3 и Oria1-G-GECO; Cy5 631/692 для NIR-GECO2; ER 530/593 для ER-LAR-GECO; Texas Red 560/624 для K-GECO.
- Установите соответствующую мощность светодиода (LED) для каждого используемого канала изображения.
ПРИМЕЧАНИЕ: При оптимизации мощности светодиодов для получения изображения по соотношению сигнал (определяемая интенсивность объекта) к шуму (обнаруженная интенсивность фона) отношение сигнал/шум должно быть выше 2. В этом протоколе 10% мощности светодиодов для TRITC и FITC; 20% для Cy5 было типичным. - Установите время экспозиции камеры максимум на 40 мс (25 Гц) и продолжительность записи 30 sfor stream для наблюдения переходных процессов кальция, сообщаемых зондами mNG-GECO и K-GECO, экспрессируемыми в кардиомиоцитах (рисунок 1-3 и рисунок 5). Увеличьте мощность светодиода, если сигнал/шум <2 при более высокой частоте кадров.
- Для оптогенетической стимуляции (рисунок 2 и рисунок 3C,D) оптимизируйте мощность (обычно 5%-10%) и частоту синего света при 1 Гц.
ПРИМЕЧАНИЕ: Как правило, человеческий iPSC-CM бьет спонтанно около ~ 1 Гц, и оператор должен двигаться быстрее, чем спонтанная скорость. - Если запланированы последовательные (рисунок 3) или расширенные (рисунок 4) измерения, избегайте фототоксичности любой ценой. Это может означать снижение интенсивности освещения и компенсацию этого за счет увеличения времени экспозиции камеры, например, до 100 мс с помощью протокола time-lapse, используемого для трехканального наблюдения в реальном времени субклеточных сигналов Ca2+ (рисунок 4).
- Используйте протокол асинхронного дозирования для добавления кофеина 10 мМ через систему автоматической микрофлюидики (см. Таблицу материалов) (рисунок 4).
ПРИМЕЧАНИЕ: Протокол асинхронного дозирования позволяет получать изображения при добавлении таких препаратов, как кофеин, без разрывов между изображениями. - Начните приобретение.
5. Получение малых молекул
- Повторно суспендируйте E4031, дофетилид и верапамил в DMSO и разбавьте их буфером Tyrode. Конечная концентрация ДМСО в среде составила 0,1% (v/v).
- Готовят растворы соединений при удвоенной (т.е. 2х) требуемой рабочей концентрации и уравновешивают при 37 °С перед добавлением.
ПРИМЕЧАНИЕ: Минимизация колебаний температуры после добавления среды имеет жизненно важное значение, поскольку сократимость зависит от температуры, а эффект изменения температуры является быстрым. - Хорошо расположите соединения к соответствующей мишени.
- Добавьте 100 мкл соединений двойной прочности (2x) через систему автомикрофлюидики (см. Таблицу материалов) в скважины и начните сбор после желаемого (обычно 15 мин) инкубационного периода.
6. Обработка и анализ изображений
- Изолируйте область сигнала от фона, автоматически обнаружив особенность импульса с течением времени с помощью программного обеспечения.
- Используйте программное обеспечение для анализа пиков кальция (см. Таблицу материалов) для анализа частоты биения (BPM), пикового сигнала (амплитуда), длительности переходного процесса кальция 50% (CTD50), длительности переходного процесса кальция 90% (CTD90), времени нарастания и времени распада (рисунок 1C).
ПРИМЕЧАНИЕ: В этих настройках фотоотбеливание было очевидным в течение первых 10 с, и после этого сигналы стабилизируются. Таким образом, пик кальция анализировали с 11-30 с. В трехканальных записях (рисунок 4) контур ячейки окаймляется вручную для измерения изменения интенсивности.
Representative Results
Наблюдение спонтанного колебания кальция в mNG-GECO10, экспрессируемого кардиомиоцитами, полученными из iPSC (iPSC-CMs) с медикаментозным лечением или без него, продемонстрировано на рисунке 1 и анимационном видео 1. Кинетические следы, полученные с помощью mNG-GECO, показывают, что ингибиторы малых молекулярных ионных каналов, верапамил, дофетилид и E4031, влияли на переходные процессы кальция (рисунок 1B), как и ожидалось. Типичный переходный процесс кальция, показанный на рисунке 1C, может быть проанализирован программным обеспечением для анализа пика кальция для получения пикового сигнала (амплитуда), длительности переходного процесса кальция 50% (CTD50), длительности переходного периода кальция 90% (CTD90), времени нарастания и времени распада. Верапамил, блокатор кальция L-типа17, полностью ингибирует приток кальция в клетках, как и ожидалось (рисунок 1B). Дофетилид и Е4031 являются ингибиторами каналов hERG 18,19,20, перечисленными как экспериментальные антиаритмические препараты III класса. Время распада продлевается как при обработке дофетилидом (p < 0,05), так и при обработке E4031 (p < 0,001) по сравнению с группой транспортных средств. Удлинение CTD50 (p < 0,01) и CTD90 (p < 0,001) при лечении E4031 наблюдалось по сравнению только с транспортным средством (таблица 1), эти результаты согласуются с сообщенными эффектами на интервал QT, клинически значимым измерением реполяризации, определенным по поверхностной электрокардиограмме за длительное время между началом Q-волны и концом Т-волны, в предыдущих исследованиях12,21.
Сложность оценки CTD в спонтанно бьющихся клетках заключается в вариабельности скорости биения, налагаемой на CTD. Это особая проблема для модели iPSC-CM, где каждая скважина пластины из 96 лунок может иметь свою собственную скорость биения, даже если все клетки происходят из одного и того же родительского флакона. Можно наложить скорость биения с помощью оптического или электрического темпа. Для оценки дозы-отклика E4031 в стандартизированных условиях ChR2 и K-GECO7, экспрессирующие iPSC-CM, оптически контролировались с использованием световых импульсов 1 Гц 470 нм и наблюдались с использованием красного сигнала K-GECO (рисунок 2A и дополнительный рисунок 1). Прогрессирующее уменьшение пиковой амплитуды (p < 0,01) и увеличение времени распада (p < 0,05) переходных процессов кальция происходит при увеличении концентраций E4031 (рисунок 2B1). Дозозависимый эффект E4031 был наиболее очевиден для снижения пиковой амплитуды (рисунок 2B1,B2).
Хотя краткосрочные исследования продолжительностью в минуты обычно используются для оценки кардиотоксичности, существует слепое пятно для оценки хронической токсичности, которая параллельна воздействию лекарств на пациентов в течение недель, месяцев или лет. Было бы предпочтительно изучать эффекты болезни или токсичности в течение интервалов, отражающих продолжительность лечения, относящуюся к клинической практике. Мы использовали нашу полностью оптическую систему контроля и обнаружения для изучения кардиомиоцитов, полученных из iPSC, у пациента с неуплотнением левого желудочка (LVNC). iPSC-CM трансдуцировали вирусным набором K-GECO (шаг 2.2-2.6) после дифференциации День 25. Затем сигнал K-GECO отслеживался каждые 1-2 недели в тех же лунках, с дополнительным медикаментозным лечением или без него. Как спонтанная активность кальция (рисунок 3A,3B), так и динамика кальция при оптическом темпе (рисунок 3C,D, этап 4.11) были получены с использованием системы визуализации с высоким содержанием (этап 4.1-4.12) и обработаны программным обеспечением для анализа пиков кальция (этап 6). Как показано на рисунке 3A,C, прозрачные переходные процессы кальция остаются видимыми через месяц после вирусной трансдукции, с дополнительным светом, используемым для оптического кардиостимуляции, или без него. Эта работа идентифицировала препарат, который, по-видимому, увеличивает скорость биения, регуляризирует интервал сокращения и увеличивает переходную амплитуду кальция в модели LVNC iPSC-CM (рисунок 3A, B). Есть два важных наблюдения, которые можно сделать из этих данных. Во-первых, с терапевтической точки зрения эффект препарата кажется стойким на 63-й день и 70-й день. Во-вторых, и имеет отношение к области, которая в целом анализирует сложные эффекты во время коротких окон (<1 мин) в более ранние моменты времени (обычно <50 дней); фенотип заболевания, модифицирующее эффекты соединения, проявляются только после 60-го дня, что говорит о том, что может быть легко дисконтировать препараты, которые имеют медленные механизмы действия в стандартных протоколах скрининга.
Изменчивость частоты ударов и последующее влияние на временную продолжительность кальция — это не просто проблема скважины в любой данный момент времени. Он также изменяется по мере того, как iPSC-CM поддерживаются в культуре, которая изменяется в течение значительного времени (рисунок 3B). Для обеспечения согласованности в последовательных экспериментах может применяться оптический темп 1 Гц с медикаментозной обработкой или без нее (рисунок 3C, D). Здесь, хотя результаты Дня 63 показывают обнадеживающие тенденции в переходном кальции со значительно более высокой амплитудой, более коротким CTD90 и более коротким временем распада; к 70-дневному сроку - и свидетельствует о необходимости хронических оценок в процессе скрининга лекарств на редкие заболевания - на ранних стадиях после деполяризации (EAD). Ценность добавления протокола кардиостимуляции к фенотипированию заболевания или оценке малых молекул может быть качественно оценена путем сравнения результатов, представленных на рисунке 3B, D для скорости биения, амплитуды переходного процесса кальция, CTD90 и времени распада.
Преимуществом методологии GECI по сравнению с химическим красителем, основанной на визуализации переходного кальция, является способность ограничивать зонд определенным отсеком в клетке. Это может быть дополнительно расширено путем мультиплексирования нескольких цветовых и/или аффинных вариантов в отдельных ячейках. Следовательно, несколько GECI, включая ER-LAR-GECO9, mtGCEPIA22,23 (или Oria1-G-GECO) и NIR-GECO2 8,24, были разработаны для экспрессии по отдельности или в комбинации в клеточных моделях для измерения активности кальция в реальном времени, возникающей в эндоплазматическом ретикулуме / саркоплазматическом ретикулуме (ER / SR), митохондриях (или канале CRAC) и цитозоле, соответственно. Они могут быть объединены в модель iPSC-CM (рисунок 4A, C) для изучения взаимодействия между различными внутриклеточными запасами кальция. Например, 10 мМ кофеина может быть использовано для опорожнения запаса кальция SR. Здесь снижение сигнала ER-LAR-GECO (указывающее на потерю кальция из SR) сопровождалось снижением сигнала NIR-GECO (свидетельствующим об увеличении концентрации цитозольного кальция), как и ожидалось. То, как другие внутриклеточные компартменты подвержены влиянию этих колебаний, не очень хорошо изучено. Тем не менее, включение зеленого митохондриально-целевого mtGCEPIA3 показывает, что поглощение кальция происходит в митохондриях в этих условиях (рисунок 4A, B).
Аналогичным образом, визуализацию взаимодействия между различными токами кальция можно увидеть, включив зонд Orai1-G-GECO25, чтобы выявить ток Ca2+, активированный высвобождением кальция (CRAC) (рисунок 4C, D). В модели iPSC-CM этот сигнал увеличивается со спонтанным цитозольным переходным процессом кальция (рисунок 4D1,D2). В соответствии с этим, лечение кофеином вызывает большой переходный кальций как в цитозоле, так и в канале Orai1.
Признано, что большинство преходящих изображений кальция в моделях кардиомиоцитов были определены с использованием красителей кальция26. Генетически закодированный индикатор кальция сравнивали с химическим красителем в модели кардиомиоцитов, полученной из iPSC, чтобы обеспечить параллельное сравнение различных подходов к визуализации кальция. K-GECO, экспрессирующие iPSC-CM, были сфотографированы вместе с вложенными клетками Fluo-4. K-GECO экспрессирующие кардиомиоциты показали последовательное поведение биения с течением времени (рисунок 5A,C). Однако нагрузка Fluo-4 повлияла как на частоту биения, так и на CTD в этой модели (рисунок 5B, C), предполагая, что сам Fluo-4 может влиять на результаты таких экспериментов. Это будет особенно верно после длительного воздействия на зонд визуализации, которое может произойти в формате многостенной визуализации, если визуализация скважины происходит с минутным временем выдержки на скважину.
Рисунок 1: Низкомолекулярные ингибиторы ионных каналов, применяемые к кардиомиоцитам, полученным из iPSC. (A-B) Покадровые изображения iPSC-CM, экспрессирующих mNG-GECO, полученные при 25 Гц. Шкала бар = 50 мкм. (B) Репрезентативные колебания Ca2+ после добавления соединения. Флуоресцентные сигналы, полученные от mNG-GECO экспрессирующих клеток, представлены в виде коэффициента флуоресценции F/F0, где F0 определяется как базальная интенсивность, а F — как интенсивность, обнаруженная в каждой точке времени. (C) Программное обеспечение для анализа пиков кальция может извлекать параметры, включая половинную максимальную ширину (CTD50), 90% переходную продолжительность (CTD 90), время нарастания и время распада. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Пример "доза-реакция" с использованием ингибитора hERG E4031 в рамках оптической системы кардиостимуляции. (A) Следы оптической стимуляции 10% синим светом в различных концентрациях E4031. Покадровые снимки кардиомиоцитов, полученных из iPSC, экспрессирующих K-GECO, взятые при 25 Гц. (B1) Репрезентативные следы переходных процессов кальция, полученные с различными дозами соединений. Пиковый анализ и доза-реакция Е4031 в амплитуде (В2) и времени распада (В3). Синие полосы указывают на импульсную световую стимуляцию 1 Гц 470 нм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Полностью оптическая платформа, применяемая для долгосрочного фенотипического скрининга лекарственных средств в кардиомиоцитах, полученных от пациента LVNC. (A) Репрезентативный след спонтанной биения активности в кардиомиоцитах, полученных от пациента (после дифференцировки День 70) с (красным) или без (синим) 5 мкМ лекарственного лечения. (B) Пиковый анализ спонтанной бьющей активности с медикаментозным лечением 5 мкМ или без него. (C) Интенсивность следов лекарственного ответа при iPSC-CM пациента при оптической стимуляции 1 Гц. (D) Пиковый анализ кардиомиоцитов, полученных от пациента, с оптической стимуляцией 1 Гц. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: Три канала субклеточной визуализации Ca2+ в модели iPSC-CM. (A-B) iPSC-CMs были трансдуцированы субклеточными кальциевыми зондами для цитоплазмы, NIR-GECO2 (красный), эндоплазматический ретикулум ER-LAR-GECO (желтый) и mtGCEPIA3 (голубой), митохондриальный индикатор Ca2+ . (B) Трехканальная покадровая визуализация кальция до и после лечения кофеином 10 мМ. (C-D) iPSC-CMs, трансдуцированные цитоплазматическими, NIR-GECO2 (красный), эндоплазматическими ретикулумными ER-LAR-GECO (желтыми) и CRAC индикаторами канала Orai1-G-GECO (голубой). (D) Была получена трехканальная покадровая визуализация кальция. (Д1) Спонтанная активность от удара к удару наблюдалась при NIR-GECO2 и Orai1-G-GECO. (Д2) Отток кальция из ER (снижение сигнала ER-LAR-GECO) сопровождался увеличением цитозольного сигнала кальция при лечении кофеином. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 5: Сравнение генетически закодированного показателя кальция (K-GECO) с химическим кальциечувствительным красителем (Fluo-4) в iPSC-CMs. (A-B) Репрезентативные кальциевые следы K-GECO (A) и Fluo-4 (B) представлены с течением времени. (C) Кальциевый переходный анализ K-GECO трансдуцированного, или Fluo-4 нагруженного iPSC-CM. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
| БПМ | CTD50 (с) | CTD90 (с) | Амплитуда (F/F0) | Время нарастания | Время распада (с) | |
| Автомобиль (0,1% DMSO) | 112.3657+/-10.95 | 0.25+/-0.04 | 0.41+/-0.01 | 1.99+/-0.02 | 0.07+/-0.01 | 0.28+/-0.01 |
| Верапамил (1 мкМ) | 0 | - | - | - | - | - |
| Дофетилид (5 нМ) | 103.42+/-9.87** | 0.23+/-0.03 | 0.46+/-0.03 | 1.91+/-0.03 | 0.07+/-0.01 | 0.35+/-0.02* |
| E4031 (30 нМ) | 75.73+/-12.08*** | 0.37+/-0.04** | 0.58+/-0.08*** | 1.55+/-0.02** | 0.11+/-0.04*** | 0.35+/-0.07** |
Таблица 1: Влияние добавления соединения на переходные параметры кальция в модели iPSC-CM. Значения значимости обозначаются *(p ≤ 0,05), **(p < 0,01) и ***(p < 0,001).
Анимационное видео 1: Спонтанная активность кальция наблюдалась mNG-GECO в кардиомиоцитах, полученных из iPSC, только с носителем. Предоставляется псевдоцветный фильм изображения в оттенке серого. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить это видео.
Дополнительный рисунок 1: Схематическое изображение аденовирусного вектора. Это включает в себя канальный родопсин ChR2 в качестве привода с красным флуоресцентным индикатором кальция K-GECO в качестве репортера кальция для полностью оптического анализа. Светочувствительный ионный канал позволяет возбудимым клеткам деполяризоваться светом в сине-зеленом диапазоне видимого спектра. В этих экспериментах использовался свет 470 нм. Переходные процессы кальция в возбудимых клетках могут одновременно визуализироваться K-GECO, который требует зеленого света возбуждения, производя красные излучения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Discussion
Для успешного выполнения высокопроизводительного скрининга сигналы должны быть равномерно распределены по сосуду культуры, гарантируя, что случайно выбранные области интереса (ROI) могут быть применены автоматически во время получения изображений. Хотя химические показатели кальция легко удовлетворяют этому требованию, генетически закодированные зонды исторически производили пятна, а не листы сигнала, ограничивающие их использование. Использование системы вирусной трансдукции обеспечивает высокие27,28 и эквивалентные уровни экспрессии множественных индикаторов среди клеток-мишеней по сравнению с обычными методами трансфекции. Различные типы клеток могут требовать разных промоторов, и выбор системы доставки генов может потребоваться соответственноизменить 29,30,31. В гетерогенных клеточных моделях эффективность трансдукции и экспрессии могут быть различными в определенных типах клеток. С одной стороны, это может ограничить применение к конкретным клеткам, но это явление может быть использовано для различения конкретных клеток в системе32 совместной культивирования.
Основное влияние этого подхода заключается в освобождении от отношений один к одному между экспериментатором и образцом с помощью автоматизации. В стандартном эксперименте с несколькими скважинами для сбора данных в четырех позициях в пределах одной скважины мы оцениваем, что для сбора видео 30 с из 96 лунок требуется около 15 часов под микроскопом. В автоматизированной системе это занимает ~4 ч. Кроме того, анализ данных вручную занимает гораздо больше времени, чем сбор данных. Используемая здесь система анализа примерно в 200 раз быстрее ручного эквивалента. Конечным результатом является улучшенный рабочий процесс и высокая экономия средств и времени.
В отличие от первичных кардиомиоцитов, загруженных красителями кальция, которые выживают в порядке часов, GECI, выраженные в iPSC-CM через вирусные системы доставки, могут давать сигнал в экспериментальной модели, которая живет в течение нескольких месяцев. Эти модели могут поддерживаться в формате с несколькими скважинами и отслеживаться одновременно для последовательного анализа в системах визуализации с высоким содержанием, разработанных для скрининга малых молекул. Это создает простую экспериментальную платформу для человека для проверки эффектов лекарств в течение длительностей, близких к тем, которые испытывают пациенты (недели или месяцы), а не минуты, обычно используемые в токсикологических анализах.
Система может быть расширена для обеспечения многопараметрических измерений путем включения GECI с различными свойствами выбросов от зеленого до почти инфракрасного. Такие эксперименты требуют надлежащего света возбуждения и наборов фильтров в экспериментальной конструкции для разделения сигналов. Широкое применение в контексте скрининга лекарств требует надежных и эффективных аналитических платформ в дополнение к дозированию лекарств. Хотя модель, описанная здесь, фокусируется на использовании нескольких динамических показателей кальция, она может быть изменена на структурные маркеры клеточной формы или функции. Их, как правило, легче визуализировать, поскольку они показывают небольшую изменчивость по сравнению со стократным изменением внутриклеточной концентрации кальция. Этот подход может быть особенно ценным для редких заболеваний, когда промежуточный iPSC, полученный от пациентов, может содержать все генетические драйверы и модификаторы конкретного состояния, которые могут быть сохранены в масштабируемой клеточной модели, способствуя открытию лекарств при различных заболеваниях на основе клеточных фенотипов, которые могут быть визуализированы независимо от лежащего в основе биологического механизма, который может быть трудно выяснить.
Disclosures
LumiSTAR подала заявку на патентную защиту использования K-GECO, NIR-GECO и LAR-GECO.
Acknowledgments
Мы благодарим профессора Роберта Кэмпбелла из Токийского университета за обмен материалами и ценную дискуссию; Доктор Чиа-Лин Хо в Molecular Device для технической поддержки.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 96-well plate | Perkin Elmer | 6055302 | |
| auto microfluidic system | Molecular Device | A device has a single channel pipetter that can be used to add compound automatically | |
| Caffeine | Sigma-Aldrich | C0750 | |
| Cardiosight-S l iPSC derived cardiomyocytes | NEXEL | C-002 | |
| Dimethyl sulfoxide | Millipore Sigma | 1096780100 | |
| Dofetilide | Sigma-Aldrich | PZ0016 | |
| E4031 | Tocris | 1808 | |
| ER-LAR-GECO viral kit | LumiSTAR | AA001a | Red-shifted GECI packed into adeno-viral vector |
| Fibronectin | Sigma-Aldrich | F1141 | |
| Fluo-4 AM | Invitrogen | F14201 | Chmical calcium sensitive dye |
| Gelatin | Sigma-Aldrich | G1890 | |
| ImageXpress Micro Confocal High-Content Imaging System | Molecular Device | ||
| iPSC-CMs Maintenance Medium | NEXEL | CMS-002 | iPSC-CMs Medium (Cardiosight-S medium) + Cardiosight-S Supplement |
| iPSC-CMs Medium (Cardiosight-S medium) | NEXEL | CMS-002 | |
| K-GECO viral kit | LumiSTAR | AA005a | Red-shifted GECI packed into adeno-viral vector |
| LumiCAL software | LumiSTAR | LUCS01a | Software for analysis of calcium peak in cardiomyocytes |
| mNG-GECO viral kit | LumiSTAR | AL008a | Brighter green GECI packed into lenti-viral vector |
| mt-GCEPIA3 viral kit | LumiSTAR | AL011a | GECI targgeting on mitochondria packed into lenti-viral vector |
| NIR-GECO viral kit | LumiSTAR | AV004a | Near infrared GECI packed into viral vector |
| Orai1-GGECO viral kit | LumiSTAR | AL010a | GECI targgeting on Orai1 packed into lenti-viral vector |
| Tyrode's salts | Sigma-Aldrich | T2145 | |
| Verapamil hydrochloride | Sigma-Aldrich | V4629 | |
| Y-27632 dihydrochloride | Tocris | 1254 |
References
- O'Connor, M. D. The 3R principle: Advancing clinical application of human pluripotent stem cells. Stem Cell Research & Therapy. 4 (2), 21 (2013).
- Ebert, A. D., Liang, P., Wu, J. C. Induced pluripotent stem cells as a disease modeling and drug screening platform. Journal of Cardiovascular Pharmacology. 60 (4), 408-416 (2012).
- Ovics, P., et al. Drug development and the use of induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes for disease modeling and drug toxicity screening. International Journal of Molecular Sciences. 21 (19), 7320 (2020).
- Paredes, R. M., Etzler, J. C., Watts, L. T., Zheng, W., Lechleiter, J. D.
- Takahashi, A., Camacho, P., Lechleiter, J. D., Herman, B.
- Smith, N. A., et al. Fluorescent Ca(2+) indicators directly inhibit the Na,K-ATPase and disrupt cellular functions. Science Signaling. 11 (515), (2018).
- Shen, Y., et al. A genetically encoded Ca2+ indicator based on circularly permutated sea anemone red fluorescent protein eqFP578. BMC Biology. 16 (1), 9 (2018).
- Qian, Y., et al. A genetically encoded near-infrared fluorescent calcium ion indicator. Nature Methods. 16 (2), 171-174 (2019).
- Wu, J., et al. Red fluorescent genetically encoded Ca2+ indicators for use in mitochondria and endoplasmic reticulum. Biochemical Journal. 464 (1), 13-22 (2014).
- Zarowny, L., et al. and high-performance genetically encoded Ca2+ indicator based on mneongreen fluorescent protein. ACS Sensors. 5 (7), 1959-1968 (2020).
- Potekhina, E. S., et al. Drug screening with genetically encoded fluorescent sensors: today and tomorrow. International Journal of Molecular Sciences. 22 (1), 148 (2021).
- Chang, Y. -F., et al. Non-invasive phenotyping and drug testing in single cardiomyocytes or beta-cells by calcium imaging and optogenetics. PLoS One. 12 (4), 0174181 (2017).
- Chang, Y. -F., Arai, Y., Nagai, T. Optogenetic activation during detector "dead time" enables compatible real-time fluorescence imaging. Neuroscience Research. 73 (4), 341-347 (2012).
- Chen, G., et al. Chemically defined conditions for human iPSC derivation and culture. Nature Methods. 8 (5), 424-429 (2011).
- Strober, W. Trypan blue exclusion test of cell viability. Current Protocols in Immunology. 111, 1-3 (2015).
- Jang, Y., et al. Modulating cardiomyocyte and fibroblast interaction using layer-by-layer deposition facilitates synchronisation of cardiac macro tissues. Soft Matter. 16 (2), 428-434 (2020).
- Leonard, R. G., Talbert, R. L.
- Sanguinetti, M. C., Jurkiewicz, N. K. Two components of cardiac delayed rectifier K+ current. Differential sensitivity to block by class III antiarrhythmic agents. The Journal of General Physiology. 96 (1), 195-215 (1990).
- Lees-Miller, J. P., Duan, Y., Teng, G. Q., Duff, H. J. Molecular determinant of high-affinity dofetilide binding to HERG1 expressed in Xenopus oocytes: Involvement of S6 sites. Molecular Pharmacology. 57 (2), 367-374 (2000).
- Kamiya, K., Niwa, R., Mitcheson, J. S., Sanguinetti, M. C. Molecular determinants of HERG channel block. Molecular Pharmacology. 69 (5), 1709-1716 (2006).
- Fukushima, H., et al. Specific induction and long-term maintenance of high purity ventricular cardiomyocytes from human induced pluripotent stem cells. PLoS One. 15 (11), 0241287 (2020).
- Suzuki, J., Kanemaru, K., Iino, M. Genetically encoded fluorescent indicators for organellar calcium imaging. Biophysical Journal. 111 (6), 1119-1131 (2016).
- Suzuki, J., et al. Imaging intraorganellar Ca2+ at subcellular resolution using CEPIA. Nature Communications. 5, 4153 (2014).
- Qian, Y., et al. Improved genetically encoded near-infrared fluorescent calcium ion indicators for in vivo imaging. PLoS Biology. 18 (11), 3000965 (2020).
- Dynes, J. L., Amcheslavsky, A., Cahalan, M. D. Genetically targeted single-channel optical recording reveals multiple Orai1 gating states and oscillations in calcium influx. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (2), 440-445 (2016).
- Broyles, C. N., Robinson, P., Daniels, M. J. Fluorescent, bioluminescent, and optogenetic approaches to study excitable physiology in the single cardiomyocyte. Cells. 7 (6), 51 (2018).
- Cao, F., et al. Comparison of gene-transfer efficiency in human embryonic stem cells. Molecular Imaging and Biology. 12 (1), 15-24 (2010).
- Ma, Y., Ramezani, A., Lewis, R., Hawley, R. G., Thomson, J. A. High-level sustained transgene expression in human embryonic stem cells using lentiviral vectors. Stem Cells. 21 (1), 111-117 (2003).
- Haery, L., et al. Adeno-associated virus technologies and methods for targeted neuronal manipulation. Frontiers in Neuroanatomy. 13, 93 (2019).
- Nieuwenhuis, B., et al. Optimization of adeno-associated viral vector-mediated transduction of the corticospinal tract: Comparison of four promoters. Gene Therapy. 28 (1), 56-74 (2021).
- Smith, R. L., et al. Characterization of promoter function and cell-type-specific expression from viral vectors in the nervous system. Journal of Virology. 74 (23), 11254-11261 (2000).
- Fang, Y., et al. Safety and efficacy of an immune cell-specific chimeric promoter in regulating anti-PD-1 antibody expression in. CAR T cells. Molecular Therapy - Methods & Clinical Development. 19, 14-23 (2020).
