Summary
يصف هذا البروتوكول التحكم البصري الكامل ومراقبة النشاط الخلوي المثار في الخلايا العضلية القلبية المشتقة من iPSC (iPSC-CMs) لفحص الأدوية عالية الإنتاجية واختبار السمية. يتم عرض القياس الكمي متعدد المعلمات لأنماط النمط الظاهري في الزمان والمكان. يتم إثبات الآثار طويلة الأجل للعقاقير على مدى ساعات ، أو القياسات المتسلسلة على مدى أيام.
Abstract
من المهم فهم كيفية عمل الخلايا القابلة للإثارة في الصحة والمرض وكيف يمكن تغيير هذا السلوك بواسطة جزيئات صغيرة أو التلاعب الجيني. يمكن الجمع بين مؤشرات الكالسيوم المشفرة وراثيا (GECIs) مع نوافذ انبعاث متعددة (على سبيل المثال ، للمراقبة المتزامنة للأحداث دون الخلوية المتميزة) أو استخدامها في التطبيقات الموسعة مع المحركات الأخرى المعتمدة على الضوء في الخلايا القابلة للاستثارة (على سبيل المثال ، الجمع بين التحكم البصري الوراثي المشفر وراثيا مع مؤشرات الكالسيوم المتوافقة مع الطيف). وقد استخدمت هذه الأساليب في الخلايا العصبية الأولية أو المشتقة من الخلايا الجذعية، والخلايا العضلية القلبية، وخلايا بيتا البنكرياسية. ومع ذلك، كان من الصعب زيادة إنتاجية، أو مدة الملاحظة، لهذه النهج بسبب القيود المفروضة على الأدوات، وبرامج التحليل، وأداء المؤشرات، وكفاءة توصيل الجينات. هنا ، يتم الجمع بين GECI الأخضر عالي الأداء ، mNeonGreen-GECO (mNG-GECO) ، و GECI ، K-GECO ، ذو الانزياح الأحمر ، مع التحكم البصري الجيني لتحقيق التحكم البصري الكامل وتصور النشاط الخلوي بتنسيق تصوير عالي الإنتاجية باستخدام نظام تصوير عالي المحتوى. يتم عرض التطبيقات التي توضح اختبار السمية القلبية وفحص الأدوية المظهرية باستخدام iPSC-CMs الصحية والمشتقة من المريض. بالإضافة إلى ذلك ، تقتصر التقييمات متعددة المعلمات باستخدام مجموعات من متغيرات مؤشر التقارب الطيفي والكالسيوم (NIR-GECO ، LAR-GECO ، و MTGCEPIA أو Orai1-G-GECO) على مقصورات خلوية مختلفة كما يتم عرضها في نموذج iPSC-CM.
Introduction
تعتبر النماذج المشتقة من الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات (iPSC) القائمة على الإنسان حلا واعدا لأهداف 3Rs (الاستبدال والاختزال والصقل) المحددة للدراسات الحيوانية 1,2. تم استخدام الخلايا العضلية القلبية المشتقة من iPSC لنمذجة الأمراض واكتشاف الأدوية لأنها تلخص الجوانب الأساسية لعلم الأحياء البشري3. تم استخدام تصوير الكالسيوم ، عادة مع الأصباغ الكيميائية ، لمراقبة النشاط الخلوي قبل وبعد العلاج بالعقاقير 4,5. ومع ذلك ، فإن مجسات استشعار الكالسيوم القائمة على الصبغة الكيميائية تمنع مباشرة Na و K-ATPase وتعطل الوظيفة الخلوية6. وبالتالي ، فإن تتبع نفس الخلايا على مدار ساعات أو أيام كان مشكلة عند استخدام الأصباغ الكيميائية. هنا ، يتم استخدام مجموعة من مؤشرات الكالسيوم المشفرة وراثيا (GECIs) 7،8،9،10 عبر طيف واسع من الإثارة / الانبعاثات وتقارب الكالسيوم لتشكيل منصة اختبار سمية القلب التي تقدم قياسات متعددة العضيات في الوقت الفعلي على مدى فترات طويلة من الزمن11.
لمواصلة تطوير مفهوم الفحص القائم على الكالسيوم عالي الإنتاجية في نموذج iPSC-CM خارج السياق الأكاديمي الموضح سابقا باستخدام أدوات مشفرة وراثيا للتحكم البصري وتصوير الكالسيوم عن طريق التعبير المشترك عن مؤشر الكالسيوم ذي الانزياح الأحمر ، R-GECO أو K-GECO مع أداة وراثية بصرية ،ChR2 12,13 ، تم إنشاء مجموعات فيروسية جاهزة. من خلال نقل التصوير إلى أداة عالية المحتوى مجهزة بنظام تلقائي للسوائل الدقيقة ، يتم وضع طبقات من السحب أحادي القناة للإضافة المركبة فوق تصوير الخلايا الحية. وأخيرا ، يتم تحسين وأتمتة كلا الجانبين الحاسمين للمسار التجريبي ، ومعالجة الصور ، والتحليل.
Protocol
تم توفير اعتلال عضلة القلب غير المضغوط (LVNC) المريض iPSC المشتقة من الخلايا العضلية القلبية (iPSC-CM) من قبل مستشفى جامعة تايوان الوطنية. وجاء جمع عينات المرضى لإعادة برمجتها على iPSC وبروتوكولات الصيانة14 لأغراض البحث وفقا لإعلان هلسنكي الصادر عن الجمعية العالمية للأرصاد الجوية (المبادئ الأخلاقية للبحوث الطبية التي تشمل البشر) وتمت الموافقة عليها من قبل مجلس المراجعة المؤسسية: مكتب لجنة أخلاقيات البحث في NTUH (#201612099RINC). تم الحصول على iPSC-CM أخرى من البائعين التجاريين. لا يتطلب استخدام مشتقات iPSC أذونات محددة في مؤسستنا.
1. iPSC المستمدة من إعداد الخلايا العضلية القلبية
- قم بإعداد اللوحة متعددة الآبار قبل إزالة iPSC-CM من التخزين البارد للذوبان. قم بتغطية كل بئر من الصفيحة الدقيقة المكونة من 96 بئرا بمحلول 100 ميكرولتر من 50 ميكروغرام / مل من الفيبرونيكتين / 0.2٪ من الجيلاتين (انظر جدول المواد) لتغطية جميع الأسطح جيدا.
- احتضن اللوحة عند 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة في حاضنة رطبة.
- قم بتسخين الوسط (انظر جدول المواد) إلى درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة قبل ذوبان الخلايا.
ملاحظة: يصف هذا البروتوكول درجة حرارة الغرفة بأنها 25 درجة مئوية. - انقل iPSC-CM من خزان تخزين النيتروجين السائل إلى حمام مائي 37 درجة مئوية.
ملاحظة: عادة ما يتم شحن iPS-CMs على الثلج الجاف بواسطة مصادر أكاديمية أو تجارية. يتم نقلها إلى تخزين النيتروجين السائل عند الاستلام حتى الاستخدام. - قم بإزالة القارورة قبل أن يذوب الجليد بالكامل ورش القارورة بنسبة 75٪ من الإيثانول.
- خذ القارورة إلى خزانة السلامة الأحيائية من الفئة الثانية وانقل محتوياتها برفق إلى أنبوب مخروطي جديد سعة 15 مل يحتوي على 9 مل من وسط درجة حرارة الغرفة.
- الطرد المركزي للخلايا في 200 × غرام لمدة 3 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
- تخلص من المادة الفائقة بواسطة ماصة وأعد تعليق الخلايا بلطف في 1 مل من الوسط مع 10 ميكرومتر من مثبطات ROCK (Y27632) (انظر جدول المواد).
ملاحظة: تجنب السحب المتكرر للخلايا المذابة لضمان أقصى قدر من استعادة الخلايا. - قم بإزالة محلول الطلاء من البئر وأضف 50 ميكرولتر من الوسط مع 10 ميكرومتر من مثبط ROCK بسرعة.
- تأكد من عدد الخلايا القابلة للحياة باستخدام طريقة استبعاد التربان الأزرق باستخدام مقياس الدم15.
- خلايا اللوحة في لوحة مطلية 96 بئرا بكثافة 100,000-150,000 خلية / سم2 ، وفقا لتعليمات الشركة المصنعة16.
- بعد 24 ساعة ، تأكد من أن الخلايا المتصلة بسطح اللوحة على اتصال بالخلايا الأخرى.
ملاحظة: الخلايا المفردة تعيش بشكل سيئ في الثقافة طويلة الأجل وعادة ما تتصرف بشكل أكثر تباينا. - استبدال وسط الصيانة قبل التسخين كل 2 أيام.
ملاحظة: بالنسبة للعلاج الدوائي طويل الأجل ، تم تغيير LVNC iPSC-CM مع بدائل نصف متوسطة مع ، أو بدون ، أدوية جزيء صغير كل 2 أيام.
2. التعبير عن مؤشرات الكالسيوم المشفرة وراثيا
- بعد طلاء الخلايا لمدة 72 ساعة ، قم بإذابة مجموعات GECIs الفيروسية (انظر جدول المواد) على الجليد.
- قم بإعداد حل مخزون مجموعة فيروسية 2x مع وسيط الصيانة.
- تحضير الخلايا للعدوى عن طريق ضبط الحجم المتوسط إلى 100 ميكرولتر لكل بئر. أضف 100 ميكرولتر من المحلول الفيروسي المخلوط مسبقا واحتضنه لمدة 8-16 ساعة عند 37 درجة مئوية.
- استبدل بوسط 200 ميكرولتر تم تسخينه مسبقا بعد الحضانة.
- تصور تعبير GECIs 24 ساعة بعد النقل باستخدام نظام تصوير (انظر جدول المواد).
ملاحظة: يصل مستوى التعبير إلى الحد الأقصى عند 48-72 ساعة بعد النقل. يمكن تصوير الخلايا من النقطة الزمنية 24 ساعة. ومع ذلك ، فإن الإشارات التي تم الحصول عليها من GECIs تستمر لأكثر من شهر واحد. - الحفاظ على الخلايا في الحاضنة المرطبة قبل إجراء الفحوصات الوظيفية.
- إصابة iPSC-CMs (iPSC-CMs المشتقة من المريض من LVNC) بمجموعة فيروسية ChR2-K-GECO (انظر جدول المواد) في اليوم 25 بعد التمايز باستخدام بروتوكول العدوى (الخطوة 2.1-2.6).
3. تصوير الكالسيوم القائم على الصبغة باستخدام Fluo-4
- قم بإذابة مسحوق Fluo-4 (انظر جدول المواد) في DMSO كمحلول مخزون (5 mM).
- قم بتخفيف محلول المخزون إلى تركيز 10 ميكرومتر Fluo-4 في المخزن المؤقت ل Tyrode.
ملاحظة: يتكون المخزن المؤقت ل Tyrode من 1.0 جم / لتر من بيكربونات الصوديوم ، و 0.2 جم / لتر من كلوريد الكالسيوم ، و 0.1 جم / لتر من كلوريد المغنيسيوم ، و 0.2 جم / لتر من كلوريد البوتاسيوم ، و 8.0 جم / لتر من كلوريد الصوديوم ، و 0.05 جم / لتر من فوسفات الصوديوم أحادي القاعدة ، و 1.0 جم / لتر من D-glucose. - استبدل نصف الوسط ب 10 ميكرومتر من محلول Fluo-4 (مع إعطاء تركيز نهائي قدره 5 ميكرومتر).
- احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
- اغسل الخلايا باستخدام مخزن Tyrode العازل الذي تم تسخينه مسبقا واستبدله بالوسيط قبل الحصول على الصورة.
- ابدأ التسجيل باستخدام بروتوكول اكتساب البث.
ملاحظة: اكتساب الدفق هو الحصول على الصور باستمرار دون فاصل زمني. يبلغ تردد ضرب iPSC-CM حوالي 1 هرتز ، ويستخدم بروتوكول اكتساب التيار هذا لجمع أنماط الضرب.
4. الحصول على الصور والمقايسات الوظيفية لاختبار السمية وفحص النمط الظاهري
- قم بتشغيل جميع أجهزة نظام التصوير عالي المحتوى (انظر جدول المواد).
- تحقق من أن درجة حرارة الغرفة تصل إلى 37 درجة مئوية ، مع مكملات 5٪ CO2 . حافظ على توازن النظام لمدة 2 ساعة قبل الحصول على الصورة.
ملاحظة: الانجراف الحراري هو مشكلة كبيرة لملاحظات الخلايا الحية على المدى الطويل ، يمكن ل 1 درجة مئوية تغيير المستوى البؤري بمقدار ~ 1 ميكرومتر ، لذا فإن السماح للعدسة والمرحلة بالوصول إلى درجة الحرارة المستهدفة أمر ضروري قبل الحصول على الصورة. - افتح برنامج التصوير (انظر جدول المواد) واختر إعداد اللوحة للوحة 96 بئرا.
- ضع صفيحة غير مغطاة ب 96 بئرا في الغرفة وقم بتحميلها بحلقة مانعة لتسرب الخلايا الحية في الأعلى.
ملاحظة: حلقة ختم الخلايا الحية هي محول للوصول إلى التوازن البيئي. - اختر عدسة هدف الغمر المائي 20x (الشكل 1 والشكل 2) و 60x (الشكل 3 والشكل 4) و 20x (الشكل 5) وفقا للدقة المكانية المطلوبة.
- اضبط التركيز البؤري لالتقاط صور واضحة قبل الاكتساب التجريبي.
- حدد 3-5 مناطق عشوائيا لكل بئر لتسجيل نشاط الكالسيوم.
ملاحظة: يجب أن تتضمن كل منطقة 20 خلية على الأقل (n ≥ 20). - اختر الفلاتر المناسبة للمؤشرات المختلفة. FITC 475/536 ل mNG-GECO و mtGCEPIA3 و Oria1-G-GECO ؛ Cy5 631/692 ل NIR-GECO2 ؛ ER 530/593 ل ER-LAR-GECO ؛ تكساس الأحمر 560/624 ل K-GECO.
- اضبط طاقة الصمام الثنائي الباعث للضوء (LED) المناسبة لكل قناة تصوير مستخدمة.
ملاحظة: عند تحسين طاقة LED للحصول على التصوير بواسطة نسبة الإشارة (الكثافة المكتشفة للكائن) إلى نسبة الضوضاء (كثافة الخلفية المكتشفة)، يجب أن تكون نسبة S/N أعلى من 2. في هذا البروتوكول ، 10٪ من طاقة LED ل TRITC و FITC ؛ 20٪ ل Cy5 كان نموذجيا. - اضبط وقت التعرض للكاميرا على 40 مللي ثانية (25 هرتز) كحد أقصى ومدة تسجيل تبلغ 30 ثانية للحصول على تيار لمراقبة انتقالات الكالسيوم التي أبلغت عنها مجسات mNG-GECO و K-GECO المعبر عنها في الخلايا العضلية القلبية (الشكل 1-3 والشكل 5). قم بزيادة طاقة LED إذا كانت الإشارة/الضوضاء <2 بمعدلات إطارات أعلى.
- بالنسبة للتحفيز البصري الوراثي (الشكل 2 والشكل 3C ، D) ، قم بتحسين الطاقة (عادة 5٪ -10٪) وتردد الضوء الأزرق عند 1 هرتز.
ملاحظة: بشكل عام، يدق iPSC-CM البشري تلقائيا حول ~ 1 هرتز، ويحتاج المشغل إلى الوتيرة بشكل أسرع من المعدل التلقائي. - إذا تم التخطيط لقياسات متسلسلة (الشكل 3) أو موسعة (الشكل 4) ، فتجنب السمية الضوئية بأي ثمن. قد يعني هذا تقليل شدة طاقة الإضاءة والتعويض عن ذلك عن طريق زيادة وقت تعرض الكاميرا ، على سبيل المثال ، إلى 100 مللي ثانية باستخدام بروتوكول الفاصل الزمني المستخدم للمراقبة في الوقت الفعلي ثلاثي القنوات لإشارات Ca2 + تحت الخلوية (الشكل 4).
- استخدم بروتوكول الاستغناء غير المتزامن لإضافة الكافيين 10 mM عبر نظام الموائع الدقيقة التلقائي (انظر جدول المواد) (الشكل 4).
ملاحظة: يسمح بروتوكول التوزيع غير المتزامن بالحصول على الصور أثناء إضافة أدوية مثل الكافيين، دون وجود فجوات بين الصور. - ابدأ الاستحواذ.
5. إعداد جزيء صغير
- أعد تعليق E4031 و dofetilide و verapamil في DMSO وقم بتخفيفها باستخدام المخزن المؤقت ل Tyrode. كان التركيز النهائي ل DMSO في الوسط 0.1٪ (v / v).
- تحضير المحاليل المركبة عند تركيز العمل المطلوب (أي 2x) والتوازن عند 37 درجة مئوية قبل الإضافة.
ملاحظة: يعد تقليل تقلبات درجة الحرارة بعد الإضافة المتوسطة أمرا حيويا لأن الانقباض يعتمد على درجة الحرارة ، وتأثير تغير درجة الحرارة سريع. - ترتيب المركبات إلى الهدف المقابل جيدا.
- أضف 100 ميكرولتر من مركبات القوة المزدوجة (2x) عبر نظام الموائع الدقيقة التلقائي (انظر جدول المواد) إلى الآبار وابدأ في الاستحواذ بعد فترة الحضانة المطلوبة (عادة 15 دقيقة).
6. معالجة التصوير وتحليله
- اعزل منطقة الإشارة عن الخلفية عن طريق اكتشاف ميزة النبض بمرور الوقت تلقائيا باستخدام البرنامج.
- استخدم برنامج تحليل ذروة الكالسيوم (انظر جدول المواد) لتحليل تردد الضرب (BPM) ، إشارة الذروة (السعة) ، مدة الكالسيوم العابرة 50٪ (CTD50) ، مدة عبور الكالسيوم 90٪ (CTD90) ، وقت الارتفاع ، ووقت الاضمحلال (الشكل 1C).
ملاحظة: في هذه الإعدادات ، كان التبييض الضوئي واضحا خلال أول 10 ثوان ، ويتم تثبيت الإشارات بعد ذلك. وبالتالي ، تم تحليل ذروة الكالسيوم من 11-30 ثانية. في التسجيلات ثلاثية القنوات (الشكل 4) ، يتم تحديد محيط الخلية يدويا لقياس تغير الكثافة.
Representative Results
تظهر ملاحظة تذبذب الكالسيوم التلقائي في mNG-GECO10 المعبر عنه بالخلايا العضلية القلبية المشتقة من iPSC (iPSC-CMs) مع أو بدون علاجات دوائية في الشكل 1 والفيديو المتحرك 1. تظهر الآثار الحركية التي تم الحصول عليها باستخدام mNG-GECO أن مثبطات القنوات الأيونية الجزيئية الصغيرة ، فيراباميل ، دوفيتيليد ، و E4031 ، أثرت على انتقالات الكالسيوم (الشكل 1B) كما هو متوقع. يمكن تحليل عابر الكالسيوم النموذجي الموضح في الشكل 1C بواسطة برنامج تحليل ذروة الكالسيوم لاشتقاق إشارة الذروة (السعة) ، ومدة الكالسيوم العابرة 50٪ (CTD50) ، ومدة الكالسيوم العابرة 90٪ (CTD90) ، ووقت الارتفاع ، ووقت الاضمحلال. فيراباميل ، حاصرات الكالسيوم من النوع L17 ، تمنع تماما تدفق الكالسيوم في الخلايا كما هو متوقع (الشكل 1B). Dofetilide و E4031 هي مثبطات قناة hERG18،19،20 ، مدرجة كأدوية تجريبية مضادة لاضطراب النظم من الفئة الثالثة. يتم إطالة وقت الاضمحلال مع كل من علاج Dofetilide (p < 0.05) و E4031 (p < 0.001) عند مقارنته بمجموعة المركبات. لوحظ إطالة CTD50 (p < 0.01) و CTD90 (p < 0.001) مع علاج E4031 مقارنة مع السيارة فقط (الجدول 1) ، وهذه النتائج تتفق مع الآثار المبلغ عنها على فترة QT ، وهو قياس ذي صلة سريريا لإعادة الاستقطاب تم تحديده من مخطط كهربية القلب السطحي من وقت طويل بين بداية الموجة Q ونهاية الموجة T ، في الدراسات السابقة 12,21.
تتمثل صعوبة تقييم CTD في خلايا الضرب التلقائي في معدل ضربات التباين الذي يفرضه على CTD. هذه مشكلة خاصة لنموذج iPSC-CM ، حيث يمكن أن يكون لكل بئر من لوحة البئر 96 معدل ضربات خاص بها على الرغم من أن جميع الخلايا تأتي من نفس القارورة الأم. من الممكن فرض معدل ضربات عن طريق السرعة البصرية أو الكهربائية. لتقييم استجابة جرعة E4031 في ظل ظروف موحدة الإيقاع ، تم التحكم البصري في ChR2 و K-GECO7 اللذين يعبران عن iPSC-CMs باستخدام نبضات ضوء 1 هرتز 470 نانومتر وتمت ملاحظتهما باستخدام إشارة K-GECO الحمراء (الشكل 2A والشكل التكميلي 1). تحدث التخفيضات التدريجية في سعة الذروة (p < 0.01) وزيادة في وقت الاضمحلال (p < 0.05) لعابرات الكالسيوم مع زيادة تركيزات E4031 (الشكل 2B1). كان التأثير المعتمد على الجرعة ل E4031 أكثر وضوحا بالنسبة للتخفيضات في سعة الذروة (الشكل 2B1 ، B2).
على الرغم من أن الدراسات قصيرة الأجل التي تستغرق دقائق تستخدم عادة لتقييم سمية القلب ، إلا أن هناك نقطة عمياء لتقييم السمية المزمنة التي توازي تعرض المرضى للأدوية على مدار أسابيع أو أشهر أو سنوات. سيكون من المفيد دراسة آثار المرض أو السمية على فترات تعكس فترات العلاج ذات الصلة بالممارسة السريرية. استخدمنا نظام التحكم والكشف البصري بالكامل لدراسة الخلايا العضلية القلبية المشتقة من iPSC من مريض يعاني من عدم ضغط البطين الأيسر (LVNC). تم نقل iPSC-CMs باستخدام مجموعة فيروسية K-GECO (الخطوة 2.2-2.6) بعد يوم التمايز 25. ثم تم تتبع إشارة K-GECO كل 1-2 أسابيع في نفس الآبار ، مع أو بدون علاجات دوائية إضافية. تم الحصول على كل من نشاط الكالسيوم التلقائي (الشكل 3A ، 3B) وديناميات الكالسيوم تحت الوتيرة البصرية (الشكل 3C ، D ، الخطوة 4.11) باستخدام نظام التصوير عالي المحتوى (الخطوة 4.1-4.12) ومعالجتها بواسطة برنامج تحليل ذروة الكالسيوم (الخطوة 6). كما هو موضح في الشكل 3A ، C ، تظل عابرات الكالسيوم الواضحة مرئية بعد شهر من النقل الفيروسي ، مع أو بدون الضوء الإضافي المستخدم في الوتيرة البصرية. حدد هذا العمل دواء يبدو أنه يزيد من معدل الضربات ، وينظم فترة الانكماش ، ويزيد من سعة الكالسيوم العابرة في نموذج LVNC iPSC-CM (الشكل 3A ، B). هناك ملاحظتان مهمتان يجب إبداؤهما من هذه البيانات. أولا ، من المنظور العلاجي ، يبدو تأثير الدواء دائما في اليوم 63 واليوم 70 نقطة زمنية. ثانيا، وذات صلة بمجال يقوم عموما بمقايسة الآثار المركبة خلال نوافذ قصيرة (<1 دقيقة) في نقاط زمنية سابقة (عادة <50 يوما)؛ لا تظهر آثار تعديل النمط الظاهري للمرض للمركب إلا بعد اليوم 60 ، مما يشير إلى أنه قد يكون من السهل خصم الأدوية التي لديها آليات عمل بطيئة في بروتوكولات الفحص القياسية.
إن تباين تردد الضربات ، والتأثير اللاحق على مدة عبور الكالسيوم ، ليس مجرد مشكلة جيدة في أي وقت من الأوقات. كما أنه يتغير مع الحفاظ على iPSC-CM في الثقافة ، والتي تختلف داخل البئر بمرور الوقت (الشكل 3B). لفرض الاتساق داخل التجارب المتسلسلة ، يمكن تطبيق وتيرة بصرية 1 هرتز مع أو بدون علاج بالعقاقير (الشكل 3C ، D). هنا على الرغم من أن نتائج اليوم 63 تظهر الاتجاهات المشجعة في الكالسيوم العابر مع سعة أعلى بكثير ، وأقصر CTD90 ، ووقت اضمحلال أقصر. بحلول نقطة زمنية مدتها 70 يوما - وتدل على الحاجة إلى تقييمات مزمنة أثناء عملية فحص الأدوية للأمراض النادرة - في وقت مبكر بعد اكتشاف عمليات إزالة الاستقطاب (EAD). يمكن تقييم قيمة إضافة بروتوكول السرعة إلى النمط الظاهري للمرض ، أو تقييم الجزيئات الصغيرة ، نوعيا من خلال مقارنة النتائج المقدمة في الشكل 3B ، D لمعدل الضرب ، وسعة الكالسيوم العابرة ، CTD90 ، ووقت الاضمحلال.
ميزة GECI ، مقارنة بالصبغة الكيميائية ، القائمة على المنهجية لتصور الكالسيوم العابر هي القدرة على تقييد المسبار إلى حجرة معينة داخل الخلية. يمكن توسيع هذا عن طريق تعدد متغيرات الألوان و / أو التقارب المتعددة في خلايا واحدة. وبالتالي ، تم تطوير العديد من GECIs بما في ذلك ER-LAR-GECO9 و MTGCEPIA 22,23 (أو Oria1-G-GECO) و NIR-GECO2 8,24 للتعبير بشكل فردي ، أو مجتمعة ، في نماذج الخلايا لقياس نشاط الكالسيوم في الوقت الفعلي الناشئ في الشبكة الإندوبلازمية / الشبكة الساركوبلازمية (ER / SR) ، الميتوكوندريا (أو قناة CRAC) والسيتوسول ، على التوالي. يمكن دمجها في نموذج iPSC-CM (الشكل 4A ، C) لدراسة التفاعل بين مخازن الكالسيوم المختلفة داخل الخلايا. على سبيل المثال ، يمكن استخدام علاج الكافيين 10 mM لتفريغ مخزن الكالسيوم SR. هنا انخفاض إشارة ER-LAR-GECO (مؤشر على فقدان الكالسيوم من SR) يوازي انخفاض إشارة NIR-GECO (مما يدل على زيادة في تركيز الكالسيوم الخلوي) كما هو متوقع. كيف تتأثر المقصورات الأخرى داخل الخلايا بهذه التقلبات لم تتم دراستها جيدا. ومع ذلك، فإن إدراج mtGCEPIA3 الذي يستهدف الميتوكوندريا الخضراء يظهر أن امتصاص الكالسيوم يحدث في الميتوكوندريا في هذه الظروف (الشكل 4A، B).
وبالمثل ، يمكن رؤية تصور التفاعل بين تيارات الكالسيوم المختلفة من خلال تضمين مسبار ، Orai1-G-GECO25 ، للكشف عن القناة المنشطة لإطلاق الكالسيوم (CRAC) Ca2 + الحالية (الشكل 4C ، D). في نموذج iPSC-CM ، تزداد هذه الإشارة مع الكالسيوم الخلوي التلقائي العابر (الشكل 4D1 ، D2). تمشيا مع هذا ، فإن العلاج بالكافيين يثير عابرا كبيرا للكالسيوم في كل من السيتوسول ومن قناة Orai1.
من المسلم به أن معظم التصوير العابر للكالسيوم في نماذج الخلايا العضلية القلبية قد تم تحديده باستخدام أصباغ الكالسيوم26. تمت مقارنة مؤشر الكالسيوم المشفر وراثيا بصبغة كيميائية في نموذج الخلايا العضلية القلبية المشتقة من iPSC لتمكين مقارنة جنبا إلى جنب بين أساليب تصوير الكالسيوم المختلفة. تم تصوير K-GECO التي تعبر عن iPSC-CMs جنبا إلى جنب مع الخلايا المحملة ب Fluo-4. أظهر K-GECO الذي يعبر عن الخلايا العضلية القلبية سلوكا ثابتا للضرب بمرور الوقت (الشكل 5A ، C). ومع ذلك ، أثر تحميل Fluo-4 على كل من تردد الإيقاع و CTD في هذا النموذج (الشكل 5B ، C) ، مما يشير إلى أن Fluo-4 نفسه قد يؤثر على نتائج هذه التجارب. سيكون هذا صحيحا بشكل خاص بعد التعرض على المدى الطويل لمسبار التصوير ، والذي يمكن أن يحدث في تنسيق التصوير متعدد الجدران إذا حدث التصوير جيدا مع وقت إقامة دقيقة لكل بئر.
الشكل 1: مثبطات القنوات الأيونية للجزيء الصغير المطبقة على الخلايا العضلية القلبية المشتقة من iPSC. (A-B) صور الفاصل الزمني ل iPSC-CM التي تعبر عن mNG-GECO مأخوذة عند 25 هرتز. شريط المقياس = 50 ميكرومتر. (B) التذبذبات التمثيلية Ca2+ بعد إضافة المركب. يتم تقديم إشارات الفلورسنت التي تم الحصول عليها من الخلايا المعبرة عن mNG-GECO كنسبة تألق F / F0 ، حيث يتم تعريف F0 على أنها كثافة قاعدية و F الكثافة المكتشفة في كل نقطة زمنية. (ج) يمكن لبرنامج تحليل ذروة الكالسيوم استخراج المعلمات بما في ذلك العرض نصف الأقصى (CTD50) ، ومدة عابرة بنسبة 90٪ (CTD 90) ، ووقت الارتفاع ، ووقت الاضمحلال. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: مثال على الاستجابة للجرعة باستخدام مثبط hERG E4031 داخل نظام سرعة بصرية . (أ) آثار التحفيز البصري مع 10٪ من الضوء الأزرق بتركيزات مختلفة من E4031. صور الفاصل الزمني للخلايا العضلية القلبية المشتقة من iPSC التي تعبر عن K-GECO مأخوذة عند 25 هرتز. (B1) آثار تمثيلية لعابرات الكالسيوم التي تم الحصول عليها بجرعات مركبة مختلفة. تحليل الذروة واستجابة الجرعة من E4031 في السعة (B2) ووقت الاضمحلال (B3). تشير الأشرطة الزرقاء إلى تحفيز ضوء النبض 1 هرتز 470 نانومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: منصة بصرية بالكامل مطبقة لفحص النمط الظاهري للأدوية على المدى الطويل في الخلايا العضلية القلبية المشتقة من المريض LVNC. (أ) التتبع التمثيلي لنشاط الضرب التلقائي في الخلايا العضلية القلبية المشتقة من المريض (بعد التمايز اليوم 70) مع (أحمر) أو بدون (أزرق) 5 ميكرومتر العلاج الدوائي. (ب) تحليل الذروة لنشاط الضرب التلقائي مع أو بدون علاج دوائي 5 ميكرومتر. (ج) آثار شدة الاستجابة للأدوية في iPSC-CM المستمد من المريض تحت التحفيز البصري 1 هرتز. (د) تحليل الذروة للخلايا العضلية القلبية المشتقة من المريض مع التحفيز البصري 1 هرتز. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: تم نقل ثلاث قنوات تصوير تحت الخلايا Ca2+ في نموذج iPSC-CM. (A-B) iPSC-CMs مع مجسات الكالسيوم تحت الخلوية للسيتوبلازم ، NIR-GECO2 (الأحمر) ، الشبكة الإندوبلازمية ER-LAR-GECO (الأصفر) ، و mtGCEPIA3 (سماوي) ، وهو مؤشر الميتوكوندريا Ca2 + . (ب) تصوير الكالسيوم بفاصل زمني ثلاثي القنوات قبل وبعد معالجة الكافيين بسعة 10 مللي متر. (C-D) iPSC-CMs المحولة مع السيتوبلازم ، NIR-GECO2 (الأحمر) ، الشبكة الإندوبلازمية ER-LAR-GECO (الأصفر) ، ومؤشرات قناة CRAC Orai1-G-GECO (سماوي). (د) تم التقاط تصوير الكالسيوم بفاصل زمني ثلاثي القنوات. (دال-1) لوحظ نشاط عفوي من الضرب إلى الضرب مع NIR-GECO2 و Orai1-G-GECO. (دال-2) تدفق الكالسيوم من ER (انخفاض إشارة ER-LAR-GECO) رافق زيادة في إشارة الكالسيوم الخلوية عند علاج الكافيين. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5: مقارنة مؤشر الكالسيوم المشفر وراثيا (K-GECO) بالصبغة الكيميائية الحساسة للكالسيوم (Fluo-4) في iPSC-CMs. (A-B) يتم عرض آثار الكالسيوم التمثيلية ل K-GECO (A) و Fluo-4 (B) بمرور الوقت. (ج) تحليل الكالسيوم العابر ل K-GECO المنقول ، أو iPSC-CM المحمل ب Fluo-4. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
| بي بي إم | CTD50 (ق) | CTD90 (ق) | السعة (F/F0) | وقت الارتفاع | وقت (زمان) الاضمحلال | |
| السيارة (0.1٪ DMSO) | 112.3657+/-10.95 | 0.25+/-0.04 | 0.41+/-0.01 | 1.99+/-0.02 | 0.07+/-0.01 | 0.28+/-0.01 |
| فيراباميل (1 uM) | 0 | - | - | - | - | - |
| دوفيتيليد (5 نانومتر) | 103.42+/-9.87** | 0.23+/-0.03 | 0.46+/-0.03 | 1.91+/-0.03 | 0.07+/-0.01 | 0.35+/-0.02* |
| E4031 (30 نانومتر) | 75.73+/-12.08*** | 0.37+/-0.04** | 0.58+/-0.08*** | 1.55+/-0.02** | 0.11+/-0.04*** | 0.35+/-0.07** |
الجدول 1: آثار الإضافة المركبة إلى معلمات الكالسيوم العابرة في نموذج iPSC-CM. يشار إلى قيم الدلالة ب * (p ≤ 0.05) و ** (p < 0.01) و ***(p < 0.001).
فيديو متحرك 1: لوحظ نشاط الكالسيوم التلقائي بواسطة mNG-GECO في الخلايا العضلية القلبية المشتقة من iPSC مع السيارة فقط. يتم توفير فيلم زائف اللون لصورة رمادية. يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الفيديو.
الشكل التكميلي 1: التمثيل التخطيطي للناقل الغدي الفيروسي. ويشمل ذلك قناة رودوبسين ChR2 كمشغل ، مع مؤشر الكالسيوم الفلورسنت الأحمر K-GECO كمراسل كالسيوم لإجراء فحص بصري بالكامل. تسمح القناة الأيونية الحساسة للضوء بإزالة استقطاب الخلايا القابلة للإثارة بواسطة الضوء في النطاق الأزرق والأخضر من الطيف المرئي. تم استخدام ضوء 470 نانومتر في هذه التجارب. يمكن تصوير انتقالات الكالسيوم في الخلايا القابلة للإثارة في وقت واحد بواسطة K-GECO ، والتي تتطلب ضوء إثارة أخضر ، مما ينتج عنه انبعاثات حمراء. يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الملف.
Discussion
لإجراء فحص عالي الإنتاجية بنجاح، يجب توزيع الإشارات بالتساوي عبر وعاء الاستزراع، مما يضمن إمكانية تطبيق مناطق الاهتمام المختارة عشوائيا (ROIs) تلقائيا أثناء الحصول على التصوير. على الرغم من أن مؤشرات الكالسيوم الكيميائية تلبي هذا الشرط بسهولة ، إلا أن المجسات المشفرة وراثيا أنتجت تاريخيا بقع ، بدلا من صفائح ، من الإشارة التي تحد من استخدامها. يوفر استخدام نظام النقل الفيروسي مستويات تعبير عالية تبلغ27,28 ومستويات تعبير مكافئة لمؤشرات متعددة بين الخلايا المستهدفة مقارنة بطرق النقل التقليدية. قد تتطلب أنواع الخلايا المختلفة مروجين مختلفين ، وقد يحتاج اختيار نظام توصيل الجينات إلى التغيير وفقا لذلك29،30،31. في نماذج الخلايا غير المتجانسة، قد تختلف كفاءة النقل والتعبير في أنواع معينة من الخلايا. فمن ناحية، قد يحد هذا من التطبيق على خلايا معينة، ولكن يمكن استغلال هذه الظاهرة لتمييز خلايا معينة في نظام الزراعة المشتركة32.
التأثير الرئيسي لهذا النهج هو التحرر من العلاقة الفردية بين المجرب والعينة عن طريق الأتمتة. في تجربة قياسية متعددة الآبار ، لجمع البيانات في أربعة مواقع داخل بئر واحد ، نقدر أن الأمر يستغرق حوالي 15 ساعة في المجهر لجمع مقاطع فيديو 30 ثانية من لوحة بئر 96. في النظام الآلي ، يستغرق هذا ~ 4 ساعات. علاوة على ذلك ، يستغرق تحليل البيانات يدويا وقتا أطول بكثير من الحصول على البيانات. نظام التحليل المستخدم هنا أسرع بحوالي 200 مرة من المكافئ اليدوي. والنتيجة الصافية هي تحسين سير العمل وتوفير التكلفة والوقت بشكل كبير.
على النقيض من الخلايا العضلية القلبية الأولية المحملة بأصباغ الكالسيوم التي تبقى على قيد الحياة في حدود الساعات ، يمكن أن تسفر GECIs المعبر عنها في iPSC-CM عبر أنظمة التوصيل الفيروسي عن إشارة في نموذج تجريبي يعيش لبضعة أشهر. يمكن الحفاظ على هذه النماذج في شكل بئر متعددة وتتبعها في وقت واحد للتحليل التسلسلي في أنظمة التصوير عالية المحتوى التي تم تطويرها لفحص الجزيئات الصغيرة. ينتج عن ذلك منصة تجريبية بشرية بسيطة لاختبار تأثيرات الأدوية على مدى فترات أقرب إلى تلك التي يعاني منها المرضى (أسابيع أو أشهر) بدلا من الدقائق المستخدمة عادة في اختبارات السموم.
يمكن توسيع النظام لتقديم قياسات متعددة المعلمات من خلال تضمين GECIs ذات خصائص الانبعاثات المتميزة من الأخضر إلى الأشعة تحت الحمراء القريبة. تتطلب مثل هذه التجارب ضوء الإثارة المناسب ومجموعات المرشحات في التصميم التجريبي للحفاظ على الإشارات منفصلة. يتطلب التطبيق الواسع النطاق في سياق فحص الأدوية منصات تحليل قوية وفعالة بالإضافة إلى صرف الأدوية. على الرغم من أن النموذج الموصوف هنا يركز على استخدام مؤشرات الكالسيوم الديناميكية المتعددة ، إلا أنه يمكن تعديل ذلك إلى علامات هيكلية لشكل الخلية أو وظيفتها. عادة ما يكون من الأسهل تصورها لأنها تظهر القليل من التباين من نبض إلى فوز مقارنة بالتباين مائة ضعف في تركيز الكالسيوم داخل الخلايا. قد يكون هذا النهج ذا قيمة خاصة للأمراض النادرة حيث قد يحتوي وسيط iPSC المشتق من المرضى على جميع الدوافع الجينية والمعدلات لحالة معينة والتي يمكن الحفاظ عليها في نموذج خلية قابل للتطوير ، مما يسهل اكتشاف الأدوية في مختلف الأمراض القائمة على الأنماط الظاهرية الخلوية التي يمكن تصورها بشكل مستقل عن الآلية البيولوجية الأساسية التي قد يكون من الصعب توضيحها.
Disclosures
تقدمت LumiSTAR بطلب لحماية براءات الاختراع لاستخدام K-GECO ، NIR-GECO ، و LAR-GECO.
Acknowledgments
ونشكر البروفيسور روبرت كامبل من جامعة طوكيو على مشاطرته المواد والمناقشات القيمة؛ الدكتور شيا لين هو في الجهاز الجزيئي للدعم الفني.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 96-well plate | Perkin Elmer | 6055302 | |
| auto microfluidic system | Molecular Device | A device has a single channel pipetter that can be used to add compound automatically | |
| Caffeine | Sigma-Aldrich | C0750 | |
| Cardiosight-S l iPSC derived cardiomyocytes | NEXEL | C-002 | |
| Dimethyl sulfoxide | Millipore Sigma | 1096780100 | |
| Dofetilide | Sigma-Aldrich | PZ0016 | |
| E4031 | Tocris | 1808 | |
| ER-LAR-GECO viral kit | LumiSTAR | AA001a | Red-shifted GECI packed into adeno-viral vector |
| Fibronectin | Sigma-Aldrich | F1141 | |
| Fluo-4 AM | Invitrogen | F14201 | Chmical calcium sensitive dye |
| Gelatin | Sigma-Aldrich | G1890 | |
| ImageXpress Micro Confocal High-Content Imaging System | Molecular Device | ||
| iPSC-CMs Maintenance Medium | NEXEL | CMS-002 | iPSC-CMs Medium (Cardiosight-S medium) + Cardiosight-S Supplement |
| iPSC-CMs Medium (Cardiosight-S medium) | NEXEL | CMS-002 | |
| K-GECO viral kit | LumiSTAR | AA005a | Red-shifted GECI packed into adeno-viral vector |
| LumiCAL software | LumiSTAR | LUCS01a | Software for analysis of calcium peak in cardiomyocytes |
| mNG-GECO viral kit | LumiSTAR | AL008a | Brighter green GECI packed into lenti-viral vector |
| mt-GCEPIA3 viral kit | LumiSTAR | AL011a | GECI targgeting on mitochondria packed into lenti-viral vector |
| NIR-GECO viral kit | LumiSTAR | AV004a | Near infrared GECI packed into viral vector |
| Orai1-GGECO viral kit | LumiSTAR | AL010a | GECI targgeting on Orai1 packed into lenti-viral vector |
| Tyrode's salts | Sigma-Aldrich | T2145 | |
| Verapamil hydrochloride | Sigma-Aldrich | V4629 | |
| Y-27632 dihydrochloride | Tocris | 1254 |
References
- O'Connor, M. D. The 3R principle: Advancing clinical application of human pluripotent stem cells. Stem Cell Research & Therapy. 4 (2), 21 (2013).
- Ebert, A. D., Liang, P., Wu, J. C. Induced pluripotent stem cells as a disease modeling and drug screening platform. Journal of Cardiovascular Pharmacology. 60 (4), 408-416 (2012).
- Ovics, P., et al. Drug development and the use of induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes for disease modeling and drug toxicity screening. International Journal of Molecular Sciences. 21 (19), 7320 (2020).
- Paredes, R. M., Etzler, J. C., Watts, L. T., Zheng, W., Lechleiter, J. D.
- Takahashi, A., Camacho, P., Lechleiter, J. D., Herman, B.
- Smith, N. A., et al. Fluorescent Ca(2+) indicators directly inhibit the Na,K-ATPase and disrupt cellular functions. Science Signaling. 11 (515), (2018).
- Shen, Y., et al. A genetically encoded Ca2+ indicator based on circularly permutated sea anemone red fluorescent protein eqFP578. BMC Biology. 16 (1), 9 (2018).
- Qian, Y., et al. A genetically encoded near-infrared fluorescent calcium ion indicator. Nature Methods. 16 (2), 171-174 (2019).
- Wu, J., et al. Red fluorescent genetically encoded Ca2+ indicators for use in mitochondria and endoplasmic reticulum. Biochemical Journal. 464 (1), 13-22 (2014).
- Zarowny, L., et al. and high-performance genetically encoded Ca2+ indicator based on mneongreen fluorescent protein. ACS Sensors. 5 (7), 1959-1968 (2020).
- Potekhina, E. S., et al. Drug screening with genetically encoded fluorescent sensors: today and tomorrow. International Journal of Molecular Sciences. 22 (1), 148 (2021).
- Chang, Y. -F., et al. Non-invasive phenotyping and drug testing in single cardiomyocytes or beta-cells by calcium imaging and optogenetics. PLoS One. 12 (4), 0174181 (2017).
- Chang, Y. -F., Arai, Y., Nagai, T. Optogenetic activation during detector "dead time" enables compatible real-time fluorescence imaging. Neuroscience Research. 73 (4), 341-347 (2012).
- Chen, G., et al. Chemically defined conditions for human iPSC derivation and culture. Nature Methods. 8 (5), 424-429 (2011).
- Strober, W. Trypan blue exclusion test of cell viability. Current Protocols in Immunology. 111, 1-3 (2015).
- Jang, Y., et al. Modulating cardiomyocyte and fibroblast interaction using layer-by-layer deposition facilitates synchronisation of cardiac macro tissues. Soft Matter. 16 (2), 428-434 (2020).
- Leonard, R. G., Talbert, R. L.
- Sanguinetti, M. C., Jurkiewicz, N. K. Two components of cardiac delayed rectifier K+ current. Differential sensitivity to block by class III antiarrhythmic agents. The Journal of General Physiology. 96 (1), 195-215 (1990).
- Lees-Miller, J. P., Duan, Y., Teng, G. Q., Duff, H. J. Molecular determinant of high-affinity dofetilide binding to HERG1 expressed in Xenopus oocytes: Involvement of S6 sites. Molecular Pharmacology. 57 (2), 367-374 (2000).
- Kamiya, K., Niwa, R., Mitcheson, J. S., Sanguinetti, M. C. Molecular determinants of HERG channel block. Molecular Pharmacology. 69 (5), 1709-1716 (2006).
- Fukushima, H., et al. Specific induction and long-term maintenance of high purity ventricular cardiomyocytes from human induced pluripotent stem cells. PLoS One. 15 (11), 0241287 (2020).
- Suzuki, J., Kanemaru, K., Iino, M. Genetically encoded fluorescent indicators for organellar calcium imaging. Biophysical Journal. 111 (6), 1119-1131 (2016).
- Suzuki, J., et al. Imaging intraorganellar Ca2+ at subcellular resolution using CEPIA. Nature Communications. 5, 4153 (2014).
- Qian, Y., et al. Improved genetically encoded near-infrared fluorescent calcium ion indicators for in vivo imaging. PLoS Biology. 18 (11), 3000965 (2020).
- Dynes, J. L., Amcheslavsky, A., Cahalan, M. D. Genetically targeted single-channel optical recording reveals multiple Orai1 gating states and oscillations in calcium influx. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (2), 440-445 (2016).
- Broyles, C. N., Robinson, P., Daniels, M. J. Fluorescent, bioluminescent, and optogenetic approaches to study excitable physiology in the single cardiomyocyte. Cells. 7 (6), 51 (2018).
- Cao, F., et al. Comparison of gene-transfer efficiency in human embryonic stem cells. Molecular Imaging and Biology. 12 (1), 15-24 (2010).
- Ma, Y., Ramezani, A., Lewis, R., Hawley, R. G., Thomson, J. A. High-level sustained transgene expression in human embryonic stem cells using lentiviral vectors. Stem Cells. 21 (1), 111-117 (2003).
- Haery, L., et al. Adeno-associated virus technologies and methods for targeted neuronal manipulation. Frontiers in Neuroanatomy. 13, 93 (2019).
- Nieuwenhuis, B., et al. Optimization of adeno-associated viral vector-mediated transduction of the corticospinal tract: Comparison of four promoters. Gene Therapy. 28 (1), 56-74 (2021).
- Smith, R. L., et al. Characterization of promoter function and cell-type-specific expression from viral vectors in the nervous system. Journal of Virology. 74 (23), 11254-11261 (2000).
- Fang, Y., et al. Safety and efficacy of an immune cell-specific chimeric promoter in regulating anti-PD-1 antibody expression in. CAR T cells. Molecular Therapy - Methods & Clinical Development. 19, 14-23 (2020).
