Summary
Das vorliegende Protokoll beschreibt die rein optische Kontrolle und Beobachtung der ausgelösten zellulären Aktivität in iPSC-abgeleiteten Kardiomyozyten (iPSC-CMs) für Hochdurchsatz-Wirkstoffscreening und Toxizitätstests. Multiparametrische Quantifizierung phänotypischer Muster in Zeit und Raum werden gezeigt. Langzeitwirkungen von Medikamenten über Stunden oder sequentielle Messungen über Tage werden nachgewiesen.
Abstract
Es ist wichtig zu verstehen, wie erregbare Zellen in Gesundheit und Krankheit funktionieren und wie dieses Verhalten durch kleine Moleküle oder genetische Manipulation verändert werden kann. Gentechnisch kodierte Kalziumindikatoren (GECIs) mit mehreren Emissionsfenstern können kombiniert (z. B. zur gleichzeitigen Beobachtung verschiedener subzellulärer Ereignisse) oder in erweiterten Anwendungen mit anderen lichtabhängigen Aktoren in erregbaren Zellen verwendet werden (z. B. Kombination genetisch kodierter optogenetischer Kontrolle mit spektral kompatiblen Kalziumindikatoren). Solche Ansätze wurden in primären oder Stammzell-abgeleiteten Neuronen, Kardiomyozyten und Pankreas-Beta-Zellen verwendet. Es war jedoch schwierig, den Durchsatz oder die Beobachtungsdauer solcher Ansätze aufgrund von Einschränkungen der Instrumente, der Analysesoftware, der Indikatorleistung und der Genabgabeeffizienz zu erhöhen. Hier werden ein hochleistungsfähiges grünes GECI, mNeonGreen-GECO (mNG-GECO), und ein rotverschobenes GECI, K-GECO, mit optogenetischer Kontrolle kombiniert, um eine vollständig optische Kontrolle und Visualisierung der zellulären Aktivität in einem Hochdurchsatz-Bildgebungsformat mit einem High-Content-Imaging-System zu erreichen. Es werden Anwendungen gezeigt, die Kardiotoxizitätstests und phänotypisches Arzneimittelscreening mit gesunden und patientenabgeleiteten iPSC-CMs demonstrieren. Darüber hinaus werden multiparametrische Bewertungen mit Kombinationen von spektralen und Kalziumaffinitätsindikatorvarianten (NIR-GECO, LAR-GECO und mtGCEPIA oder Orai1-G-GECO) auf verschiedene zelluläre Kompartimente im iPSC-CM-Modell demonstriert.
Introduction
Human-basierte induzierte pluripotente Stammzellen (iPSC)-abgeleitete Modelle gelten als vielversprechende Lösung für die 3R-Ziele (Replacement, Reduction, and Refinement), die für Tierstudien festgelegt wurden 1,2. iPSC-abgeleitete Kardiomyozyten wurden für die Krankheitsmodellierung und Wirkstoffforschung verwendet, da sie wesentliche Aspekte der menschlichen Biologie rekapitulieren3. Die Kalziumbildgebung, typischerweise mit chemischen Farbstoffen, wurde verwendet, um die zelluläre Aktivität vor und nach der medikamentösen Behandlung zu beobachten 4,5. Chemische Calcium-Sensorsonden auf Farbstoffbasis hemmen jedoch direkt die Na, K-ATPase und stören die zelluläre Funktion6. Daher war die Verfolgung derselben Zellen über Stunden oder Tage problematisch, wenn chemische Farbstoffe verwendet werden. Hier wird eine Reihe von genetisch kodierten Kalziumindikatoren (GECIs)7,8,9,10 über ein breites Anregungs-/Emissions- und Calciumaffinitätsspektrum verwendet, um eine Testplattform für kardiale Toxizität zu bilden, die Echtzeit-Multiorganellenmessungen über längere Zeiträume bietet 11.
Um das Hochdurchsatz-Calcium-basierte Screening-Konzept im iPSC-CM-Modell über den zuvor demonstrierten akademischen Kontext hinaus weiterzuentwickeln, wurden genetisch kodierte Werkzeuge für die optische Kontrolle und Kalziumbildgebung durch Co-Expression eines rotverschobenen Kalziumindikators, R-GECO oder K-GECO mit einem optogenetischen Werkzeug, ChR212,13, generiert. Durch den Übergang der Bildgebung in ein High-Content-Instrument, das mit einem automikrofluidischen System ausgestattet ist, wird das Einkanal-Pipettieren der Wirkstoffaddition auf die Lebendzellbildgebung geschichtet. Schließlich werden beide entscheidenden Aspekte des experimentellen Pfades, der Bildverarbeitung und der Analyse, verbessert und automatisiert.
Protocol
Linksventrikuläre Kardiomyopathie (LVNC) Patienten iPSC-abgeleitete Kardiomyozyten (iPSC-CM) wurden vom National Taiwan University Hospital zur Verfügung gestellt. Die Entnahme von Patientenproben für die Reprogrammierung auf iPSC und die Erhaltungsprotokolle14 zu Forschungszwecken folgten der WMA-Deklaration von Helsinki (ethische Grundsätze für die medizinische Forschung am Menschen) und wurden vom Institutional Review Board: Research Ethics Committee Office an der NTUH (#201612099RINC) genehmigt. Andere iPSC-CMs wurden von kommerziellen Anbietern bezogen. Die Verwendung von iPSC-Derivaten erfordert keine besonderen Genehmigungen in unserer Institution.
1. iPSC-abgeleitete Kardiomyozyten-Zubereitung
- Bereiten Sie die Multiwell-Platte vor, bevor iPSC-CM zum Auftauen aus dem Kühlhaus genommen wird. Beschichten Sie jede Vertiefung der 96-Well-Mikroplatte mit 100 μL 50 μg/ml Fibronektin/0,2% Gelatinelösung (siehe Materialtabelle), um alle Oberflächen gründlich abzudecken.
- Die Platte bei 37 °C für 1 h in einem befeuchteten Inkubator inkubieren.
- Erwärmen Sie das Medium (siehe Materialtabelle) vor dem Auftauen der Zelle 30 min lang auf Raumtemperatur.
HINWEIS: Das vorliegende Protokoll beschreibt die Raumtemperatur mit 25 °C. - Das iPSC-CM wird aus dem Flüssigstickstoffspeicher in ein 37 °C warmes Wasserbad überführt.
HINWEIS: iPS-CMs werden in der Regel von akademischen oder kommerziellen Quellen auf Trockeneis versandt. Sie werden nach Erhalt bis zur Verwendung in flüssigen Stickstoff gelagert. - Entfernen Sie die Durchstechflasche, bevor das Eis vollständig schmilzt, und besprühen Sie die Durchstechflasche mit 75% Ethanol.
- Bringen Sie die Durchstechflasche zu einer Biosicherheitswerkbank der Klasse II und geben Sie den Inhalt vorsichtig in ein neues 15-ml-konisches Röhrchen mit 9 ml Medium bei Raumtemperatur.
- Zentrifugieren Sie die Zellen bei 200 x g für 3 min bei Raumtemperatur.
- Verwerfen Sie den Überstand per Pipette und resuspendieren Sie die Zellen vorsichtig in 1 ml Medium mit 10 μM ROCK-Inhibitor (Y27632) (siehe Materialtabelle).
HINWEIS: Vermeiden Sie wiederholtes Pipettieren von aufgetauten Zellen, um eine maximale Zellerholung zu gewährleisten. - Entfernen Sie die Beschichtungslösung aus der Vertiefung und fügen Sie schnell 50 μL Medium mit 10 μM ROCK-Inhibitor hinzu.
- Bestätigen Sie die Anzahl der lebensfähigen Zellen mit der Trypanblau-Ausschlussmethode mit einem Hämozytometer15.
- Plattenzellen aus beschichteter 96-Well-Platte mit einer Dichte von 100.000-150.000 Zellen / cm2, gemäß den Anweisungen des Herstellers16.
- Stellen Sie nach 24 h sicher, dass die an der Oberfläche der Platte befestigten Zellen mit anderen Zellen in Kontakt stehen.
HINWEIS: Einzelne Zellen überleben in Langzeitkultur schlecht und verhalten sich typischerweise varianter. - Tauschen Sie das vorgewärmte Wartungsmedium alle 2 Tage aus.
HINWEIS: Für die langfristige medikamentöse Behandlung wurden die LVNC iPSC-CM alle 2 Tage mit halbem mittelschwerem Ersatz mit oder ohne niedermolekulare Medikamente gewechselt.
2. Expression genetisch kodierter Kalziumindikatoren
- Nach dem Plattieren der Zellen für 72 h tauen Sie die GECIs viralen Kits (siehe Materialtabelle) auf Eis auf.
- Bereiten Sie eine 2x virale Kit-Stammlösung mit dem Wartungsmedium vor.
- Bereiten Sie die Zellen auf die Infektion vor, indem Sie das mittlere Volumen auf 100 μL pro Vertiefung einstellen. 100 μL der vorgemischten Viruslösung zugeben und 8-16 h bei 37 °C inkubieren.
- Nach der Inkubation durch 200 μL vorgewärmtes Medium ersetzen.
- Visualisieren Sie die GECIs-Expression 24 Stunden nach der Transduktion mit einem Bildgebungssystem (siehe Materialtabelle).
HINWEIS: Das Expressionsniveau erreicht das Maximum bei 48-72 h nach der Transduktion. Zellen können vom 24-Stunden-Zeitpunkt aus abgebildet werden. Die von GECIs erhaltenen Signale halten jedoch länger als einen Monat an. - Halten Sie die Zellen im befeuchteten Inkubator, bevor funktionelle Assays durchgeführt werden.
- Infizieren Sie die iPSC-CMs (LVNC-patientenabgeleitete iPSC-CMs) mit dem ChR2-K-GECO-Viruskit (siehe Materialtabelle) am Tag 25 nach der Differenzierung unter Verwendung des Infektionsprotokolls (Schritt 2.1-2.6).
3. Farbstoffbasierte Calcium-Bildgebung mit Fluo-4
- Fluo-4-Pulver (siehe Materialtabelle) in DMSO als Stammlösung (5 mM) lösen.
- Die Stammlösung wird im Tyrode-Puffer auf eine Konzentration von 10 μM Fluo-4 verdünnt.
HINWEIS: Der Tyrode-Puffer besteht aus 1,0 g / L Natriumbicarbonat, 0,2 g / L Calciumchlorid, 0,1 g / L Magnesiumchlorid, 0,2 g / L Kaliumchlorid, 8,0 g / L Natriumchlorid, 0,05 g / L Natriumphosphat einbasisch und 1,0 g / L D-Glucose. - Ersetzen Sie das halbe Medium durch 10 μM Fluo-4-Lösung (ergibt eine Endkonzentration von 5 μM).
- Die Zellen bei 37 °C für 30 min inkubieren.
- Waschen Sie die Zellen mit vorgewärmtem Tyrode-Puffer und ersetzen Sie sie vor der Bildaufnahme durch das Medium.
- Starten Sie die Aufzeichnung mit dem Streamerfassungsprotokoll.
HINWEIS: Bei der Stream-Erfassung werden kontinuierlich Bilder ohne Intervallzeit erfasst. Die Schlagfrequenz von iPSC-CM beträgt etwa 1 Hz, und dieses Stream-Erfassungsprotokoll wird zum Sammeln von Schlagmustern verwendet.
4. Bildaufnahme und funktionelle Assays für Toxizitätstests und phänotypisches Screening
- Schalten Sie alle Geräte des High-Content Imaging Systems ein (siehe Materialtabelle).
- Stellen Sie sicher, dass die Kammertemperatur 37 °C erreicht, mit 5% CO2 -Ergänzung. Halten Sie das System vor der Bildaufnahme 2 h im Gleichgewicht.
HINWEIS: Die thermische Drift ist ein erhebliches Problem für langfristige Lebendzellenbeobachtungen, 1 ° C kann die Fokusebene um ~ 1 μm ändern, so dass es vor der Bildaufnahme unerlässlich ist, dass das Objektiv und der Tisch die Zieltemperatur erreichen können. - Öffnen Sie die Bildgebungssoftware (siehe Materialtabelle) und wählen Sie die Platteneinstellung für eine 96-Well-Platte.
- Legen Sie eine 96-Well-Platte ohne Deckel in die Kammer und laden Sie sie mit dem Dichtungsring der lebenden Zelle.
HINWEIS: Der Lebendzellen-Dichtungsring ist ein Adapter zum Erreichen des Umweltgleichgewichts. - Wählen Sie je nach erforderlicher räumlicher Auflösung das 20-fache (Abbildung 1 und Abbildung 2), das 60-fache (Abbildung 3 und Abbildung 4) und das 20-fache (Abbildung 5) Wasserimmersionsobjektiv aus.
- Passen Sie den Fokus an, um vor der experimentellen Aufnahme klare Bilder aufzunehmen.
- Wählen Sie 3-5 Regionen zufällig pro Vertiefung für die Aufzeichnung der Kalziumaktivität aus.
HINWEIS: Jede Region muss mindestens 20 Zellen (n ≥ 20) enthalten. - Wählen Sie geeignete Filter für verschiedene Indikatoren. FITC 475/536 für mNG-GECO, mtGCEPIA3 und Oria1-G-GECO; Cy5 631/692 für NIR-GECO2; ER 530/593 für ER-LAR-GECO; Texas Red 560/624 für K-GECO.
- Stellen Sie die entsprechende LED-Leistung (Light Emitting Diode) für jeden verwendeten Bildkanal ein.
HINWEIS: Bei der Optimierung der LED-Leistung für die Bilderfassung nach Signal- (erkannte Intensität des Objekts) zu Rauschverhältnis (erkannte Intensität des Hintergrunds) sollte das Signal-Rausch-Verhältnis höher als 2 sein. In diesem Protokoll, 10% LED-Leistung für TRITC und FITC; 20% für Cy5 waren typisch. - Stellen Sie die Belichtungszeit der Kamera auf maximal 40 ms (25 Hz) und eine Aufnahmedauer von 30 s für die Stromerfassung ein, um Kalziumtransienten zu beobachten, die von mNG-GECO- und K-GECO-Sonden in Kardiomyozyten berichtet werden (Abbildung 1-3 und Abbildung 5). Erhöhen Sie die LED-Leistung, wenn das Signal/Rauschen bei höheren Bildraten <2 beträgt.
- Für die optogenetische Stimulation (Abbildung 2 und Abbildung 3C,D) optimieren Sie die Leistung (typischerweise 5%-10%) und Frequenz des blauen Lichts bei 1 Hz.
HINWEIS: Im Allgemeinen schlägt menschliches iPSC-CM spontan um ~ 1 Hz, und der Bediener muss schneller als die spontane Rate sein. - Wenn sequentielle (Abbildung 3) oder erweiterte (Abbildung 4) Messungen geplant sind, vermeiden Sie Phototoxizität um jeden Preis. Dies kann bedeuten, die Beleuchtungsstärkeintensität zu reduzieren und dies zu kompensieren, indem die Belichtungszeit der Kamera beispielsweise mit dem Zeitrafferprotokoll für die dreikanalige Echtzeitbeobachtung subzellulärer Ca2+ -Signale auf 100 ms erhöht wird (Abbildung 4).
- Verwenden Sie das asynchrone Dosierprotokoll für die Zugabe von 10 mM Koffein über das automatische Mikrofluidiksystem (siehe Materialtabelle) (Abbildung 4).
HINWEIS: Das asynchrone Abgabeprotokoll ermöglicht die Bildaufnahme, während Medikamente wie Koffein hinzugefügt werden, ohne Lücken zwischen den Bildern. - Beginnen Sie mit der Akquise.
5. Herstellung kleiner Moleküle
- Resuspendieren Sie E4031, Dofetilid und Verapamil in DMSO und verdünnen Sie sie mit Tyrodes Puffer. Die Endkonzentration von DMSO im Medium betrug 0,1% (v/v).
- Die zusammengesetzten Lösungen werden bei der doppelten (d. h. 2x) Arbeitskonzentration hergestellt und vor der Zugabe bei 37 °C ausgeglichen.
HINWEIS: Die Minimierung von Temperaturschwankungen nach der Zugabe des Mediums ist von entscheidender Bedeutung, da die Kontraktilität temperaturabhängig ist und die Auswirkungen von Temperaturänderungen schnell sind. - Ordnen Sie Verbindungen an der entsprechenden Zielmulde an.
- Geben Sie 100 μL der doppelt starken (2x) Verbindungen über das Automikrofluidiksystem (siehe Materialtabelle) in die Vertiefungen und beginnen Sie mit der Akquisition nach der gewünschten (typischerweise 15 min) Inkubationszeit.
6. Bildgebende Verarbeitung und Analyse
- Isolieren Sie den Signalbereich vom Hintergrund, indem Sie die Funktion des Impulses über die Zeitumdrehung automatisch mit der Software erkennen.
- Verwenden Sie die Calcium-Peak-Analysesoftware (siehe Materialtabelle), um die Schlagfrequenz (BPM), das Spitzensignal (Amplitude), die transiente Kalziumdauer 50 % (CTD50), die vorübergehende Kalziumdauer 90 % (CTD90), die Anstiegszeit und die Zerfallszeit zu analysieren (Abbildung 1C).
HINWEIS: In diesen Einstellungen war Photobleaching über die ersten 10 s sichtbar, und die Signale werden danach stabilisiert. So wurde der Kalziumpeak von 11-30 s analysiert. Bei dreikanaligen Aufnahmen (Abbildung 4) wird die Zellkontur zur Messung der Intensitätsänderung manuell umrandet.
Representative Results
Die Beobachtung der spontanen Kalziumoszillation in mNG-GECO10, ausgedrückt durch iPSC-abgeleitete Kardiomyozyten (iPSC-CMs) mit oder ohne medikamentöse Behandlung, ist in Abbildung 1 und animiertem Video 1 dargestellt. Kinetische Spuren, die mit mNG-GECO erhalten wurden, zeigen, dass kleinmolekulare Ionenkanalinhibitoren, Verapamil, Dofetilid und E4031, Calciumtransienten wie erwartet beeinflussten (Abbildung 1B). Der typische Kalziumtransient in Abbildung 1C kann mit der Calcium-Peak-Analysesoftware analysiert werden, um das Peaksignal (Amplitude), die Calcium-Transientendauer 50% (CTD50), die Calcium-Transientendauer 90% (CTD90), die Anstiegszeit und die Zerfallszeit abzuleiten. Verapamil, ein L-Typ-Kalziumblocker17, hemmt den Kalziumeinstrom in die Zellen wie erwartet vollständig (Abbildung 1B). Dofetilid und E4031 sind hERG-Kanalhemmer18,19,20, die als experimentelle Antiarrhythmika der Klasse III aufgeführt sind. Die Abklingzeit verlängert sich sowohl mit Dofetilid (p < 0,05) als auch mit E4031 (p < 0,001) im Vergleich zur Vehikelgruppe. Eine Verlängerung von CTD50 (p < 0,01) und CTD90 (p < 0,001) mit E4031-Behandlung wurde nur im Vergleich zur Vehikelbehandlung beobachtet (Tabelle 1), diese Ergebnisse stimmen mit den berichteten Effekten auf das QT-Intervall überein, eine klinisch relevante Messung der Repolarisation, die aus dem Oberflächenelektrokardiogramm über eine lange Zeit zwischen dem Beginn der Q-Welle und dem Ende der T-Welle bestimmt wurde. in früheren Studien 12,21.
Eine Schwierigkeit der CTD-Bewertung bei spontan schlagenden Zellen ist die Variabilitätsschlagrate, die der CTD auferlegt wird. Dies ist ein besonderes Problem für das iPSC-CM-Modell, bei dem jede Vertiefung einer 96-Well-Platte ihre eigene Schlagrate haben kann, obwohl alle Zellen aus demselben Elternfläschchen stammen. Es ist möglich, eine Schlagrate durch optisches oder elektrisches Pacing zu erzwingen. Um die Dosis-Wirkungs-Beziehung von E4031 unter standardisierten Tempobedingungen zu bewerten, wurden ChR2 und K-GECO7 exprimierende iPSC-CMs mit 1 Hz 470 nm Lichtimpulsen optisch gesteuert und mit dem roten K-GECO-Signal beobachtet (Abbildung 2A und ergänzende Abbildung 1). Eine progressive Verringerung der Spitzenamplitude (p < 0,01) und eine Zunahme der Abklingzeit (p < 0,05) der Kalziumtransienten treten mit steigenden Konzentrationen von E4031 auf (Abbildung 2B1). Eine dosisabhängige Wirkung von E4031 zeigte sich am deutlichsten bei der Verringerung der Spitzenamplitude (Abbildung 2B1,B2).
Obwohl minutenlange Kurzzeitstudien typischerweise für Kardiotoxizitätsbewertungen verwendet werden, gibt es einen blinden Fleck für chronische Toxizitätsbewertungen, die die Exposition von Patienten gegenüber Medikamenten über Wochen, Monate oder Jahre hinweg parallelisieren. Es wäre vorteilhaft, die Auswirkungen von Krankheiten oder Toxizität über die Intervalle zu untersuchen, die die für die klinische Praxis relevante Behandlungsdauer widerspiegeln. Wir nutzten unser rein optisches Kontroll- und Detektionssystem, um die iPSC-abgeleiteten Kardiomyozyten eines Patienten mit linksventrikulärer Nichtverdichtung (LVNC) zu untersuchen. iPSC-CMs wurden mit einem K-GECO Viruskit (Schritt 2.2-2.6) nach der Differenzierung am 25. Tag transduziert. Das K-GECO-Signal wurde dann alle 1-2 Wochen in den gleichen Bohrlöchern verfolgt, mit oder ohne zusätzliche medikamentöse Behandlungen. Sowohl die spontane Kalziumaktivität (Abbildung 3A,3B) als auch die Kalziumdynamik unter optischem Pacing (Abbildung 3C,D, Schritt 4.11) wurden mit dem High-Content-Bildgebungssystem (Schritt 4.1-4.12) ermittelt und mit einer Kalziumpeak-Analysesoftware (Schritt 6) verarbeitet. Wie in Abbildung 3A,C gezeigt, bleiben klare Kalziumtransienten einen Monat nach der viralen Transduktion sichtbar, mit oder ohne das zusätzliche Licht, das für die optische Stimulation verwendet wird. Diese Arbeit identifizierte ein Medikament, das die Schlagrate zu erhöhen, das Kontraktionsintervall zu regulieren und die transiente Kalziumamplitude im LVNC iPSC-CM-Modell zu erhöhen scheint (Abbildung 3A, B). Aus diesen Daten lassen sich zwei wichtige Beobachtungen machen. Erstens scheint die Arzneimittelwirkung aus therapeutischer Sicht an Tag 63 und Tag 70 dauerhaft zu sein. Zweitens und von Relevanz für ein Gebiet, das im Allgemeinen zusammengesetzte Effekte während kurzer Zeitfenster (<1 min) zu früheren Zeitpunkten (typischerweise <50 Tage) untersucht; Die krankheitsphänotypmodifizierenden Wirkungen der Verbindung sind erst nach Tag 60 sichtbar, was darauf hindeutet, dass es leicht sein kann, Medikamente mit langsamen Wirkmechanismen in Standard-Screening-Protokollen zu diskreditieren.
Die Variabilität der Schlagfrequenz und der daraus resultierende Einfluss auf die vorübergehende Kalziumdauer ist nicht nur ein Well-to-Well-Problem zu einem bestimmten Zeitpunkt. Es ändert sich auch, wenn iPSC-CM in Kultur beibehalten werden, was sich im Laufe der Zeit innerhalb eines Prozesses ändert (Abbildung 3B). Um Konsistenz innerhalb sequentieller Experimente zu gewährleisten, kann die optische 1-Hz-Taktung mit oder ohne medikamentöse Behandlung angewendet werden (Abbildung 3C, D). Hier zeigen die Ergebnisse von Tag 63 zwar die ermutigenden Trends im Kalzium-Transienten mit einer signifikant höheren Amplitude, kürzerer CTD90 und kürzerer Zerfallszeit; Innerhalb des 70-Tage-Zeitpunkts - und ein Hinweis auf die Notwendigkeit chronischer Bewertungen während des Drogenscreenings für seltene Krankheiten - werden frühzeitig nach Depolarisationen (EAD) erkannt. Der Wert des Hinzufügens eines Pacing-Protokolls zur Krankheitsphänotypisierung oder zur Bewertung kleiner Moleküle kann qualitativ durch Vergleich der in Abbildung 3B, D dargestellten Ergebnisse für Schlagrate, Kalzium-Transientenamplitude, CTD90 und Zerfallszeit bewertet werden.
Ein Vorteil einer GECI im Vergleich zu chemischen Farbstoffen zur Visualisierung des Kalziumtransienten ist die Fähigkeit, die Sonde auf ein bestimmtes Kompartiment innerhalb einer Zelle zu beschränken. Dies kann durch Multiplexing mehrerer Farb- und/oder Affinitätsvarianten in einzelnen Zellen weiter ausgebaut werden. Daher wurden mehrere GECIs, darunter ER-LAR-GECO9, mtGCEPIA 22,23 (oder Oria1-G-GECO) und NIR-GECO2 8,24, für die Expression einzeln oder in Kombination in Zellmodellen zur Echtzeit-Calciumaktivitätsmessung im endoplasmatischen Retikulum / sarkoplasmatischen Retikulum (ER/SR), Mitochondrien (oder CRAC-Kanal) bzw. Zytosol entwickelt. Sie können im iPSC-CM-Modell (Abbildung 4A,C) kombiniert werden, um die Interaktion zwischen verschiedenen intrazellulären Kalziumspeichern zu untersuchen. Zum Beispiel kann eine 10 mM Koffeinbehandlung verwendet werden, um den SR-Kalziumspeicher zu entleeren. Hier ging eine Abnahme des ER-LAR-GECO-Signals (Hinweis auf einen Verlust von Kalzium aus der SR) wie erwartet mit einem Rückgang des NIR-GECO-Signals (Hinweis auf einen Anstieg der zytosolischen Calciumkonzentration) einher. Wie andere intrazelluläre Kompartimente von diesen Schwankungen betroffen sind, ist nicht gut untersucht. Dennoch zeigt die Einbeziehung eines grünen mitochondrialen mtGCEPIA3, dass die Kalziumaufnahme in Mitochondrien unter diesen Bedingungen erfolgt (Abbildung 4A,B).
In ähnlicher Weise kann die Visualisierung des Zusammenspiels zwischen verschiedenen Kalziumströmen durch die Einbeziehung einer Sonde, Orai1-G-GECO25, gesehen werden, um den Ca2+-Strom des durch die Kalziumfreisetzung aktivierten Kanals (CRAC) aufzudecken (Abbildung 4C, D). Im iPSC-CM-Modell nimmt dieses Signal mit dem spontanen zytosolischen Kalziumtransienten zu (Abbildung 4D1,D2). Dementsprechend ruft die Behandlung mit Koffein einen großen Kalzium-Transienten sowohl im Zytosol als auch aus dem Orai1-Kanal hervor.
Es wird anerkannt, dass der größte Teil der transienten Kalziumbildgebung in Kardiomyozytenmodellen unter Verwendung von Calciumfarbstoffen bestimmt wurde26. Ein genetisch kodierter Kalziumindikator wurde mit einem chemischen Farbstoff im iPSC-abgeleiteten Kardiomyozytenmodell verglichen, um einen direkten Vergleich verschiedener Calcium-Bildgebungsansätze zu ermöglichen. K-GECO exprimierende iPSC-CMs wurden neben Fluo-4-beladenen Zellen abgebildet. K-GECO-exprimierende Kardiomyozyten zeigten über die Zeit ein konsistentes Schlagverhalten (Abbildung 5A,C). Die Belastung von Fluo-4 beeinflusste jedoch sowohl die Schlagfrequenz als auch die CTD in diesem Modell (Abbildung 5B, C), was darauf hindeutet, dass Fluo-4 selbst die Ergebnisse solcher Experimente beeinflussen könnte. Dies gilt insbesondere nach einer Langzeitexposition gegenüber der bildgebenden Sonde, die im mehrwandigen Bildgebungsformat auftreten kann, wenn die Well-by-Well-Bildgebung mit einer winzigen Verweilzeit pro Bohrloch erfolgt.
Abbildung 1: Kleinmolekulare Ionenkanalinhibitoren, die auf iPSC-abgeleitete Kardiomyozyten angewendet werden . (A-B) Zeitrafferaufnahmen von iPSC-CM, die mNG-GECO exprimieren, aufgenommen bei 25 Hz. Maßstabsbalken = 50 μm. (B) Repräsentative Ca2+ Schwingungen nach Wirkstoffzusatz. Fluoreszierende Signale, die von mNG-GECO-exprimierenden Zellen erhalten werden, werden als Fluoreszenzverhältnis F / F0 dargestellt, wobei F0 als Basalintensität und F als die zu jedem Zeitpunkt detektierte Intensität definiert ist. (C) Die Kalziumpeak-Analysesoftware kann Parameter wie halbmaximale Breite (CTD50), 90% transiente Dauer (CTD 90), Anstiegszeit und Abklingzeit extrahieren. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 2: Dosis-Wirkungs-Beispiel mit dem hERG-Inhibitor E4031 innerhalb eines optischen Schrittmachersystems . (A) Spuren optischer Stimulation mit 10% blauem Licht in verschiedenen Konzentrationen von E4031. Zeitrafferbilder von iPSC-abgeleiteten Kardiomyozyten, die K-GECO exprimieren, aufgenommen bei 25 Hz. (B1) Repräsentative Spuren von Calciumtransienten, erhalten mit verschiedenen Verbindungsdosen. Peakanalyse und Dosis-Wirkungs-Verhältnis von E4031 in Amplitude (B2) und Abklingzeit (B3). Blaue Balken zeigen 1 Hz 470 nm Pulslichtstimulation an. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 3: Volloptische Plattform für das langfristige medikamentenphänotypische Screening in LVNC-Patienten-abgeleiteten Kardiomyozyten. (A) Repräsentative Spur spontaner Schlagaktivität in patientenabgeleiteten Kardiomyozyten (Postdifferenzierung Tag 70) mit (rot) oder ohne (blau) 5 μM medikamentöse Behandlung. (B) Peak-Analyse der spontanen Schlagaktivität mit oder ohne 5 μM medikamentöse Behandlung. (C) Intensitätsspuren der Arzneimittelreaktion bei patientenabgeleiteter iPSC-CM unter optischer Stimulation von 1 Hz. (D) Peakanalyse von kardiomyozyten aus dem Patienten mit optischer 1 Hz-Stimulation. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 4: Dreikanalige subzelluläreCa2 +-Bildgebung im iPSC-CM-Modell . (A-B) iPSC-CMs wurden mit subzellulären Calciumsonden für das Zytoplasma, NIR-GECO2 (rot), dem endoplasmatischen Retikulum ER-LAR-GECO (gelb) und mtGCEPIA3 (Cyan), einem mitochondrialen Ca2+ Indikator, transduziert. (B) Dreikanal-Zeitraffer-Calcium-Bildgebung vor und nach 10 mM Koffeinbehandlung. (C-D) iPSC-CMs, transduziert mit zytoplasmatischen, NIR-GECO2 (rot), endoplasmatischen Retikulum ER-LAR-GECO (gelb) und CRAC-Kanalindikatoren Orai1-G-GECO (Cyan) wurden visualisiert. (D) Es wurde eine dreikanalige Zeitraffer-Kalziumbildgebung aufgenommen. (D1) Spontane Beat-to-Beat-Aktivität wurde mit NIR-GECO2 und Orai1-G-GECO beobachtet. (D2) Calciumausfluss aus dem ER (Abnahme des ER-LAR-GECO-Signals) begleitete einen Anstieg des zytosolischen Kalziumsignals nach Coffeinbehandlung. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 5: Vergleich des genetisch kodierten Calciumindikators (K-GECO) mit dem chemischen Calciumsensitivfarbstoff (Fluo-4) in iPSC-CMs. (A-B) Repräsentative Calciumspuren von K-GECO (A) und Fluo-4 (B) werden über die Zeit dargestellt. (C) Calcium-Transientenanalyse von K-GECO-transduziertem oder Fluo-4-beladenem iPSC-CM. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
| BPM | CTD50 (s) | CTD90 (s) | Amplitude (f/f0) | Anstiegszeit | Abklingzeit(en) | |
| Fahrzeug (0,1% DMSO) | 112.3657+/-10.95 | 0.25+/-0.04 | 0.41+/-0.01 | 1.99+/-0.02 | 0.07+/-0.01 | 0.28+/-0.01 |
| Verapamil (1 uM) | 0 | - | - | - | - | - |
| Dofetilid (5 nM) | 103.42+/-9.87** | 0.23+/-0.03 | 0.46+/-0.03 | 1.91+/-0.03 | 0.07+/-0.01 | 0.35+/-0.02* |
| E4031 (30 nM) | 75.73+/-12.08*** | 0.37+/-0.04** | 0.58+/-0.08*** | 1.55+/-0.02** | 0.11+/-0.04*** | 0.35+/-0.07** |
Tabelle 1: Auswirkungen der Wirkstoffaddition auf transiente Calciumparameter im iPSC-CM-Modell. Signifikanzwerte werden durch *(p ≤ 0,05), **(p < 0,01) und ***(p < 0,001) angegeben.
Animiertes Video 1: Spontane Kalziumaktivität wurde von mNG-GECO in iPSC-abgeleiteten Kardiomyozyten nur mit Vehikel beobachtet. Ein pseudofarbiger Film eines Graustufenbildes wird zur Verfügung gestellt. Bitte klicken Sie hier, um dieses Video herunterzuladen.
Ergänzende Abbildung 1: Schematische Darstellung des adenoviralen Vektors. Dazu gehört Kanalrhodopsin ChR2 als Aktor, mit einem rot fluoreszierenden Kalziumindikator K-GECO als Kalziumreporter für einen rein optischen Assay. Der lichtempfindliche Ionenkanal ermöglicht die Depolarisierung erregbarer Zellen durch Licht im blau-grünen Bereich des sichtbaren Spektrums. In diesen Experimenten wurde 470 nm Licht verwendet. Kalziumtransienten in erregbaren Zellen können gleichzeitig von K-GECO abgebildet werden, was grünes Anregungslicht erfordert und rote Emissionen erzeugt. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
Discussion
Um ein Hochdurchsatz-Screening erfolgreich durchzuführen, müssen die Signale gleichmäßig über das Kulturgefäß verteilt werden, um sicherzustellen, dass zufällig ausgewählte Regionen von Interesse (ROIs) während der Bildgebungsaufnahme automatisch angewendet werden können. Obwohl chemische Kalziumindikatoren diese Anforderung leicht erfüllen, haben genetisch kodierte Sonden in der Vergangenheit eher Flecken als Blätter von Signalen produziert, die ihre Verwendung einschränken. Die Verwendung eines viralen Transduktionssystems liefert im Vergleich zu herkömmlichen Transfektionsmethoden hohe27,28 und äquivalente Expressionsniveaus mehrerer Indikatoren unter den Zielzellen. Verschiedene Zelltypen können unterschiedliche Promotoren erfordern, und die Wahl des Genabgabesystems muss möglicherweise entsprechend geändert werden 29,30,31. In heterogenen Zellmodellen können Transduktions- und Expressionseffizienz in bestimmten Zelltypen unterschiedlich sein. Einerseits kann dies die Anwendung auf bestimmte Zellen beschränken, aber das Phänomen kann ausgenutzt werden, um bestimmte Zellen in einem Kokultursystemzu unterscheiden 32.
Die Hauptwirkung dieses Ansatzes ist die Befreiung von der Eins-zu-Eins-Beziehung zwischen dem Experimentator und der Probe durch Automatisierung. In einem Standard-Multi-Well-Experiment, um Daten an vier Positionen innerhalb einer einzigen Vertiefung zu sammeln, schätzen wir, dass es am Mikroskop etwa 15 Stunden dauert, um 30-s-Videos von einer 96-Well-Platte zu sammeln. Im automatisierten System dauert dies ~4 h. Darüber hinaus dauert die manuelle Analyse der Daten weitaus länger als die Datenerfassung. Das hier verwendete Analysesystem ist etwa 200-mal schneller als das manuelle Äquivalent. Das Endergebnis ist ein verbesserter Workflow und hohe Kosten- und Zeiteinsparungen.
Im Gegensatz zu primären Kardiomyozyten, die mit Kalziumfarbstoffen beladen sind, die in der Größenordnung von Stunden überleben, können GECIs, die in iPSC-CMs über virale Verabreichungssysteme exprimiert werden, ein Signal in einem experimentellen Modell liefern, das einige Monate lebt. Diese Modelle können in einem Multi-Well-Format gepflegt und gleichzeitig für die Serienanalyse in High-Content-Bildgebungssystemen verfolgt werden, die für das Screening kleiner Moleküle entwickelt wurden. Dies führt zu einer einfachen experimentellen Plattform für den Menschen, um Arzneimittelwirkungen über Zeiträume zu testen, die näher an denen der Patienten liegen (Wochen oder Monate) und nicht über die Minuten, die typischerweise in toxikologischen Assays verwendet werden.
Das System kann erweitert werden, um Multiparametermessungen zu liefern, indem GECIs mit unterschiedlichen Emissionseigenschaften von Grün bis nahes Infrarot einbezogen werden. Solche Experimente erfordern geeignete Anregungslicht- und Filtersätze im experimentellen Design, um Signale getrennt zu halten. Eine breite Anwendung im Kontext des Drogenscreenings erfordert neben der Medikamentenabgabe robuste und effiziente Analyseplattformen. Obwohl sich das hier beschriebene Modell auf die Verwendung mehrerer dynamischer Kalziumindikatoren konzentriert, könnte dies zu strukturellen Markern der Zellform oder -funktion modifiziert werden. Diese sind in der Regel leichter zu visualisieren, da sie im Vergleich zur hundertfachen Variation der intrazellulären Kalziumkonzentration eine geringe Beat-to-Beat-Variabilität aufweisen. Dieser Ansatz kann besonders wertvoll für seltene Krankheiten sein, bei denen das von Patienten abgeleitete iPSC-Zwischenprodukt alle genetischen Treiber und Modifikatoren einer bestimmten Erkrankung enthalten kann, die in einem skalierbaren Zellmodell konserviert werden können, was die Arzneimittelentdeckung bei verschiedenen Krankheiten auf der Grundlage zellulärer Phänotypen erleichtert, die unabhängig vom zugrunde liegenden biologischen Mechanismus visualisiert werden können, der schwierig aufzuklären sein kann.
Disclosures
LumiSTAR hat die Verwendung von K-GECO, NIR-GECO und LAR-GECO zum Patent angemeldet.
Acknowledgments
Wir danken Prof. Robert Campbell von der Universität Tokio für das Teilen des Materials und der wertvollen Diskussion. Dr. Chia-Lin Ho in Molecular Device für technische Unterstützung.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 96-well plate | Perkin Elmer | 6055302 | |
| auto microfluidic system | Molecular Device | A device has a single channel pipetter that can be used to add compound automatically | |
| Caffeine | Sigma-Aldrich | C0750 | |
| Cardiosight-S l iPSC derived cardiomyocytes | NEXEL | C-002 | |
| Dimethyl sulfoxide | Millipore Sigma | 1096780100 | |
| Dofetilide | Sigma-Aldrich | PZ0016 | |
| E4031 | Tocris | 1808 | |
| ER-LAR-GECO viral kit | LumiSTAR | AA001a | Red-shifted GECI packed into adeno-viral vector |
| Fibronectin | Sigma-Aldrich | F1141 | |
| Fluo-4 AM | Invitrogen | F14201 | Chmical calcium sensitive dye |
| Gelatin | Sigma-Aldrich | G1890 | |
| ImageXpress Micro Confocal High-Content Imaging System | Molecular Device | ||
| iPSC-CMs Maintenance Medium | NEXEL | CMS-002 | iPSC-CMs Medium (Cardiosight-S medium) + Cardiosight-S Supplement |
| iPSC-CMs Medium (Cardiosight-S medium) | NEXEL | CMS-002 | |
| K-GECO viral kit | LumiSTAR | AA005a | Red-shifted GECI packed into adeno-viral vector |
| LumiCAL software | LumiSTAR | LUCS01a | Software for analysis of calcium peak in cardiomyocytes |
| mNG-GECO viral kit | LumiSTAR | AL008a | Brighter green GECI packed into lenti-viral vector |
| mt-GCEPIA3 viral kit | LumiSTAR | AL011a | GECI targgeting on mitochondria packed into lenti-viral vector |
| NIR-GECO viral kit | LumiSTAR | AV004a | Near infrared GECI packed into viral vector |
| Orai1-GGECO viral kit | LumiSTAR | AL010a | GECI targgeting on Orai1 packed into lenti-viral vector |
| Tyrode's salts | Sigma-Aldrich | T2145 | |
| Verapamil hydrochloride | Sigma-Aldrich | V4629 | |
| Y-27632 dihydrochloride | Tocris | 1254 |
References
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