Summary
Mevcut protokol, yüksek verimli ilaç taraması ve toksisite testi için iPSC kaynaklı kardiyomiyositlerde (iPSC-CM'ler) tetiklenen hücresel aktivitenin tüm optik kontrolünü ve gözlemini açıklamaktadır. Zaman ve uzaydaki fenotipik kalıpların multi-parametrik nicelleştirilmesi gösterilmiştir. İlaçların saatler boyunca uzun vadeli etkileri veya günler boyunca sıralı ölçümler gösterilmiştir.
Abstract
Uyarılabilir hücrelerin sağlık ve hastalıkta nasıl çalıştığını ve bu davranışın küçük moleküller veya genetik manipülasyon tarafından nasıl değiştirilebileceğini anlamak önemlidir. Birden fazla emisyon penceresine sahip genetik olarak kodlanmış kalsiyum göstergeleri (GECI'ler) birleştirilebilir (örneğin, farklı hücre altı olayların eşzamanlı gözlemlenmesi için) veya uyarılabilir hücrelerdeki diğer ışığa bağımlı aktüatörlerle genişletilmiş uygulamalarda kullanılabilir (örneğin, genetik olarak kodlanmış optogenetik kontrolün spektral olarak uyumlu kalsiyum göstergeleriyle birleştirilmesi). Bu tür yaklaşımlar primer veya kök hücre kaynaklı nöronlarda, kardiyomiyositlerde ve pankreas beta hücrelerinde kullanılmıştır. Bununla birlikte, cihazların, analiz yazılımının, gösterge performansının ve gen dağıtım verimliliğinin sınırlamaları nedeniyle bu tür yaklaşımların verimini veya gözlem süresini artırmak zor olmuştur. Burada, yüksek performanslı yeşil GECI, mNeonGreen-GECO (mNG-GECO) ve kırmızıya kaymış GECI, K-GECO, Yüksek İçerikli Görüntüleme Sistemi kullanılarak hücresel aktivitenin tamamen optik kontrolünü ve görselleştirmesini sağlamak için optogenetik kontrol ile birleştirilmiştir. Sağlıklı ve hasta kaynaklı iPSC-CM'ler ile kardiyotoksisite testi ve fenotipik ilaç taramasını gösteren uygulamalar gösterilmiştir. Ek olarak, spektral ve kalsiyum afinite göstergesi varyantlarının (NIR-GECO, LAR-GECO ve mtGCEPIA veya Orai1-G-GECO) kombinasyonlarını kullanan multi-parametrik değerlendirmeler de iPSC-CM modelinde farklı hücresel bölmelerle sınırlıdır.
Introduction
İnsan kaynaklı indüklenmiş pluripotent kök hücreler (iPSC) türevi modeller, hayvan çalışmaları için belirlenen 3Rs hedeflerine (Değiştirme, Azaltma ve İyileştirme) umut verici bir çözüm olarak kabul edilir 1,2. iPSC türevi kardiyomiyositler, insan biyolojisinin temel yönlerini özetledikleri için hastalık modellemesi ve ilaç keşfi için kullanılmıştır3. Kalsiyum görüntüleme, tipik olarak kimyasal boyalarla, ilaç tedavisinden önce ve sonra hücresel aktiviteyi gözlemlemek için kullanılmıştır 4,5. Bununla birlikte, kimyasal boya bazlı kalsiyum algılayıcı problar Na, K-ATPaz'ı doğrudan inhibe eder ve hücresel fonksiyonu bozar6. Bu nedenle, aynı hücrelerin saatler veya günler boyunca izlenmesi, kimyasal boyalar kullanıldığında sorunlu olmuştur. Burada, genetik olarak kodlanmış bir dizi kalsiyum göstergesi (GECI) 7,8,9,10, uzun süreler boyunca gerçek zamanlı çoklu organel ölçümleri sunan bir kardiyak toksisite test platformu oluşturmak için geniş bir uyarma / emisyon ve kalsiyum afinite spektrumunda kullanılmaktadır 11.
iPSC-CM modelindeki yüksek verimli kalsiyum bazlı tarama konseptini, kırmızıya kaymış bir kalsiyum göstergesinin birlikte ekspresyonu ile optik kontrol ve kalsiyum görüntüleme için genetik olarak kodlanmış araçlar kullanarak daha önce gösterilen akademik bağlamın ötesinde daha da geliştirmek için, R-GECO veya K-GECO, optogenetik bir araç olan ChR212,13, kullanıma hazır viral kitler üretilmiştir. Görüntülemeyi oto-mikroakışkan bir sistemle donatılmış yüksek içerikli bir cihaza dönüştürerek, bileşik ilavesinin tek kanallı pipetlenmesi, canlı hücre görüntülemenin üzerine katmanlanır. Son olarak, deneysel yolun her iki önemli yönü, görüntü işleme ve analiz de geliştirildi ve otomatikleştirildi.
Protocol
Sol ventrikül non-kompaksiyonlu kardiyomiyopati (LVNC) hastası iPSC kaynaklı kardiyomiyositler (iPSC-CM) Ulusal Tayvan Üniversitesi Hastanesi tarafından sağlandı. iPSC'ye yeniden programlamak için hasta örneklerinin toplanması ve araştırma amaçlı bakım protokolleri14 , WMA Helsinki Deklarasyonu'nu (insan denekleri içeren tıbbi araştırmalar için etik ilkeler) takip etti ve Kurumsal İnceleme Kurulu: NTUH'deki Araştırma Etik Komitesi Ofisi (#201612099RINC) tarafından onaylandı. Diğer iPSC-CM'ler ticari satıcılardan temin edildi. iPSC türevlerinin kullanımı kurumumuzda belirli izinler gerektirmez.
1. iPSC türevi kardiyomiyositlerin hazırlanması
- iPSC-CM çözülmek üzere soğuk hava deposundan çıkarılmadan önce çok kuyulu plakayı hazırlayın. 96 delikli mikro plakanın her bir oluğunu, tüm yüzeyleri iyice kaplamak için 100 μL 50 μg / mL fibronektin / % 0.2 jelatin çözeltisi ile kaplayın ( Malzeme Tablosuna bakınız).
- Plakayı nemlendirilmiş bir inkübatörde 1 saat boyunca 37 ° C'de inkübe edin.
- Hücre çözülmeden önce ortamı ( Malzeme Tablosuna bakınız) oda sıcaklığına 30 dakika ısıtın.
NOT: Mevcut protokol oda sıcaklığını 25 °C olarak tanımlamaktadır. - iPSC-CM'yi sıvı azot depolama tankından 37 °C'lik bir su banyosuna aktarın.
NOT: iPS-CM'ler genellikle akademik veya ticari kaynaklar tarafından kuru buz üzerinde gönderilir. Alındıktan sonra kullanıma kadar sıvı azot deposuna aktarılırlar. - Buz tamamen erimeden önce şişeyi çıkarın ve% 75 etanol ile şişeyi püskürtün.
- Şişeyi bir Sınıf II biyogüvenlik kabinine alın ve içeriği 9 mL oda sıcaklığında ortam içeren yeni bir 15 mL konik tüpe yavaşça aktarın.
- Hücreleri oda sıcaklığında 3 dakika boyunca 200 x g'de santrifüj yapın.
- Süpernatantı pipetle atın ve hücreleri 10 μM ROCK inhibitörü (Y27632) ile 1 mL ortamda yavaşça yeniden askıya alın (bkz.
NOT: Maksimum hücre geri kazanımı sağlamak için çözülmüş hücrelerin tekrar tekrar pipetlenmesinden kaçının. - Kaplama çözeltisini kuyudan çıkarın ve hızlı bir şekilde 10 μM ROCK inhibitörü ile 50 μL ortam ekleyin.
- Bir hemositometre15 ile tripan mavisi dışlama yöntemini kullanarak canlı hücrelerin sayısını onaylayın.
- Üreticinin talimatlarına göre 100.000-150.000 hücre /cm2 yoğunlukta kaplanmış 96 delikli plakadaki plaka hücreleri16.
- 24 saat sonra, plakanın yüzeyine tutturulmuş hücrelerin diğer hücrelerle temas halinde olduğundan emin olun.
NOT: Tek hücreler uzun süreli kültürde zayıf bir şekilde hayatta kalır ve tipik olarak daha değişken davranırlar. - Önceden ısıtılmış bakım ortamını her 2 günde bir değiştirin.
NOT: Uzun süreli ilaç tedavisi için, LVNC iPSC-CM, her 2 günde bir küçük moleküllü ilaçlarla veya küçük moleküllü ilaçlar olmadan yarım orta replasmanlarla değiştirildi.
2. Genetik olarak kodlanmış kalsiyum göstergelerinin ekspresyonu
- Hücreleri 72 saat boyunca kapladıktan sonra, GECI'nin viral kitlerini ( bakınız Malzeme Tablosu) buz üzerinde çözün.
- Bakım ortamı ile 2x viral kit stok çözümü hazırlayın.
- Orta hacmi kuyucuk başına 100 μL'ye ayarlayarak hücreleri enfeksiyona hazırlayın. Önceden karıştırılmış viral çözeltiden 100 μL ekleyin ve 37 ° C'de 8-16 saat boyunca inkübe edin.
- Kuluçkadan sonra 200 μL önceden ısıtılmış ortam ile değiştirin.
- GECI'lerin transdüksiyon sonrası 24 saat ifadesini bir görüntüleme sistemi kullanarak görselleştirin (bkz.
NOT: İfade düzeyi, iletim sonrası 48-72 saatte maksimuma ulaşır. Hücreler 24 saatlik zaman noktasından görüntülenebilir. Bununla birlikte, GECI'lerden elde edilen sinyaller bir aydan fazla sürer. - Fonksiyonel testler yapılmadan önce nemlendirilmiş inkübatördeki hücreleri koruyun.
- iPSC-CM'leri (LVNC hasta kaynaklı iPSC-CM'ler) ChR2-K-GECO viral kiti ile enfekte edin (bakınız Malzeme Tablosu) enfeksiyon protokolünü kullanarak farklılaşma sonrası 25. günde (adım 2.1-2.6).
3. Fluo-4 kullanarak boya bazlı kalsiyum görüntüleme
- Fluo-4 tozunu (bakınız Malzeme Tablosu) DMSO'da bir stok çözeltisi (5 mM) olarak çözün.
- Stok çözeltisini Tyrode tamponunda 10 μM Fluo-4 konsantrasyonuna kadar seyreltin.
NOT: Tirod tamponu 1.0 g / L sodyum bikarbonat, 0.2 g / L kalsiyum klorür, 0.1 g / L magnezyum klorür, 0.2 g / L potasyum klorür, 8.0 g / L sodyum klorür, 0.05 g / L sodyum fosfat monobazik ve 1.0 g / L D-glikozdan oluşur. - Yarım ortamı 10 μM Fluo-4 çözeltisi ile değiştirin (5 μM'lik bir nihai konsantrasyon verir).
- Hücreleri 30 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe edin.
- Hücreleri önceden ısıtılmış Tyrode tamponuyla yıkayın ve görüntü almadan önce ortamla değiştirin.
- Akış alma protokolüyle kayda başlayın.
NOT: Akış alımı, aralık süresi olmadan sürekli olarak görüntü elde etmektir. iPSC-CM'nin atma frekansı yaklaşık 1 Hz'dir ve bu akış edinme protokolü dayak modellerini toplamak için kullanılır.
4. Toksisite testi ve fenotipik tarama için görüntü toplama ve fonksiyonel testler
- Yüksek İçerikli Görüntüleme Sistemi'nin tüm cihazlarını açın (bkz.
- Oda sıcaklığının% 5 CO2 takviyesi ile 37 ° C'ye ulaştığını doğrulayın. Görüntü yakalamadan önce sistemi 2 saat boyunca dengede tutun.
NOT: Termal sürüklenme, uzun süreli canlı hücre gözlemleri için önemli bir sorundur, 1 ° C, odak düzlemini ~ 1 μm değiştirebilir, bu nedenle lensin ve sahnenin hedef sıcaklığa ulaşmasına izin vermek görüntü elde etmeden önce çok önemlidir. - Görüntüleme yazılımını açın (bkz . Malzeme Tablosu) ve 96 delikli bir plaka için plaka ayarını seçin.
- Odaya kapaksız 96 delikli bir plaka yerleştirin ve üstüne canlı hücre sızdırmazlık halkası ile yükleyin.
NOT: Canlı hücre sızdırmazlık halkası, çevresel dengeye ulaşmak için kullanılan bir adaptördür. - Gerekli uzamsal çözünürlüğe göre 20x (Şekil 1 ve Şekil 2), 60x (Şekil 3 ve Şekil 4) ve 20x (Şekil 5) suya daldırma objektif lensini seçin.
- Deneysel elde etmeden önce net görüntüler çekmek için odağı ayarlayın.
- Kalsiyum aktivitesi kaydı için kuyu başına rastgele 3-5 bölge seçin.
NOT: Her bölge en az 20 hücre içermelidir (n ≥ 20). - Farklı göstergeler için uygun filtreleri seçin. mNG-GECO, mtGCEPIA3 ve Oria1-G-GECO için FITC 475/536; NIR-GECO2 için Cy5 631/692; ER-LAR-GECO IÇIN ER 530/593; K-GECO için Texas Red 560/624.
- Kullanılan her görüntüleme kanalı için uygun ışık yayan diyot (LED) gücünü ayarlayın.
NOT: LED gücünü, sinyal (nesnenin algılanan yoğunluğu) ile gürültü (arka planın algılanan yoğunluğu) oranıyla görüntüleme elde etmek için optimize ederken, S/N oranı 2'den yüksek olmalıdır. Bu protokolde TRITC ve FITC için %10 LED gücü; Cy5 için% 20 tipikti. - Kardiyomiyositlerde eksprese edilen mNG-GECO ve K-GECO probları tarafından bildirilen kalsiyum geçicilerini gözlemlemek için kamera pozlama süresini maksimum 40 ms (25 Hz) ve 30 sfor stream edinimi kayıt süresine ayarlayın (Şekil 1-3 ve Şekil 5). Sinyal/gürültü daha yüksek kare hızlarında <2 ise LED gücünü artırın.
- Optogenetik stimülasyon için (Şekil 2 ve Şekil 3C, D), 1 Hz'de mavi ışığın gücünü (tipik olarak% 5-10) ve frekansını optimize edin.
NOT: Genel olarak, insan iPSC-CM'si ~ 1 Hz civarında kendiliğinden atar ve operatörün kendiliğinden hızdan daha hızlı adım atması gerekir. - Sıralı (Şekil 3) veya genişletilmiş (Şekil 4) ölçümler planlanıyorsa, ne pahasına olursa olsun fototoksisiteden kaçının. Bu, aydınlatma gücü yoğunluğunu azaltmak ve kamera pozlama süresini, örneğin hücre altı Ca2+ sinyallerinin üç kanallı gerçek zamanlı gözlemi için kullanılan hızlandırılmış protokolle 100 ms'ye çıkararak bunu telafi etmek anlamına gelebilir (Şekil 4).
- Otomatik mikroakışkanlar sistemi aracılığıyla 10 mM kafein ilavesi için asenkron dağıtım protokolünü kullanın (bkz.
NOT: Asenkron dağıtım protokolü, kafein gibi ilaçlar eklenirken, görüntüler arasında boşluk olmadan görüntü elde etmenin gerçekleşmesine izin verir. - Satın almaya başlayın.
5. Küçük molekül hazırlama
- DMSO'da E4031, dofetilide ve verapamil'i yeniden askıya alın ve Tyrode tamponuyla seyreltin. DMSO'nun ortamdaki son konsantrasyonu %0.1 (v/v) idi.
- Bileşik çözeltileri, istenen çalışma konsantrasyonunun iki katında (yani 2x) hazırlayın ve eklemeden önce 37 ° C'de dengeleyin.
NOT: Orta ilaveyi takiben sıcaklık dalgalanmalarını en aza indirmek, kontraktilitenin sıcaklığa bağlı olması ve değişen sıcaklığın etkisinin hızlı olması nedeniyle hayati önem taşır. - Bileşikleri karşılık gelen hedefe iyi yerleştirin.
- Otomatik mikroakışkan sistemi aracılığıyla çift mukavemetli (2x) bileşiklerin 100 μL'sini kuyucuklara ekleyin ( Malzeme Tablosuna bakınız) ve istenen (tipik olarak 15 dakika) inkübasyon süresinden sonra edinime başlayın.
6. Görüntüleme işleme ve analizi
- Yazılım ile zaman devrimi boyunca darbenin özelliğini otomatik olarak algılayarak sinyal alanını arka plandan izole edin.
- Vuruş sıklığını (BPM), Tepe sinyalini (Genlik), Kalsiyum geçici süresi% 50 (CTD50), Kalsiyum geçici süresi% 90 (CTD90), yükselme süresini ve bozunma süresini (Şekil 1C) analiz etmek için Kalsiyum pik analiz yazılımını (Malzeme Tablosuna bakınız) kullanın.
NOT: Bu ayarlarda, fotobeyazlatma ilk 10 sn üzerinde belirgindi ve sinyaller bundan sonra stabilize edildi. Böylece, kalsiyum zirvesi 11-30 s'den analiz edildi. Üç kanallı kayıtlarda (Şekil 4), hücre konturu yoğunluk değişimini ölçmek için manuel olarak sınırlanmıştır.
Representative Results
İlaç tedavileri olsun veya olmasın, iPSC kaynaklı kardiyomiyositler (iPSC-CM'ler) tarafından eksprese edilen mNG-GECO10'daki spontan kalsiyum salınımının gözlemlenmesi Şekil 1 ve Animasyonlu Video 1'de gösterilmiştir. mNG-GECO kullanılarak elde edilen kinetik izler, küçük moleküler iyon kanalı inhibitörleri verapamil, dofetilit ve E4031'in kalsiyum geçicilerini beklendiği gibi etkilediğini göstermektedir (Şekil 1B). Şekil 1C'de gösterilen tipik kalsiyum geçicisi, Peak sinyali (Genlik), Kalsiyum geçici süresi% 50 (CTD50), Kalsiyum geçici süresi% 90 (CTD90), yükselme süresi ve bozunma süresi elde etmek için Kalsiyum pik analiz yazılımı ile analiz edilebilir. L-tipi bir kalsiyum blokeri17 olan Verapamil, hücrelerdeki kalsiyum akışını beklendiği gibi tamamen inhibe eder (Şekil 1B). Dofetilide ve E4031, deneysel sınıf III antiaritmik ilaçlar olarak listelenen hERG kanal inhibitörleri 18,19,20'dir. Bozunma süresi, araç grubuyla karşılaştırıldığında hem Dofetilide (p < 0.05) hem de E4031 tedavisi (p < 0.001) ile uzar. CTD50 (p < 0.01) ve CTD90'ın (p < 0.001) E4031 tedavisi ile uzaması, sadece araçla karşılaştırıldığında gözlenmiştir (Tablo 1), bu sonuçlar, Q-dalgasının başlangıcı ile T dalgasının sonu arasındaki uzun bir süre boyunca yüzey elektrokardiyogramından belirlenen klinik olarak ilgili bir repolarizasyon ölçümü olan QT aralığı üzerinde bildirilen etkilerle tutarlıdır. önceki çalışmalarda 12,21.
Spontan dövülen hücrelerde CTD değerlendirmesinin zorluğu, CTD'ye dayatılan değişkenlik atış hızıdır. Bu, iPSC-CM modeli için özel bir sorundur; burada 96 kuyu plakasının her bir kuyusu, tüm hücreler aynı ana şişeden gelse bile kendi vuruş hızına sahip olabilir. Optik veya elektriksel hız ile bir vuruş hızı empoze etmek mümkündür. E4031'in doz-yanıtını standartlaştırılmış tempolu koşullar altında değerlendirmek için, iPSC-CM'leri ifade eden ChR2 ve K-GECO7, 1 Hz 470 nm ışık darbesi kullanılarak optik olarak kontrol edildi ve kırmızı K-GECO sinyali kullanılarak gözlemlendi (Şekil 2A ve Ek Şekil 1). Kalsiyum geçicilerinin pik genliğinde ilerleyici azalmalar (p < 0.01) ve çürüme süresinde artış (p < 0.05) artan E4031 konsantrasyonları ile ortaya çıkar (Şekil 2B1). E4031'in doza bağımlı etkisi, pik genlikteki azalmalar için en belirgin olanıydı (Şekil 2B1, B2).
Dakikalar süren kısa süreli çalışmalar tipik olarak kardiyotoksisite değerlendirmeleri için kullanılsa da, kronik toksisite değerlendirmeleri için hastanın haftalar, aylar veya yıllar boyunca ilaçlara maruz kalmasına paralel olarak kör bir nokta vardır. Klinik uygulama ile ilgili tedavi sürelerini yansıtan aralıklar boyunca hastalık veya toksisite etkilerini incelemek avantajlı olacaktır. Sol ventrikül sıkıştırmasız (LVNC) olan bir hastadan iPSC türevi kardiyomiyositleri incelemek için tamamen optik kontrol ve algılama sistemimizi kullandık. iPSC-CM'ler, farklılaşma Günü 25. Günden sonra bir K-GECO viral kiti (adım 2.2-2.6) ile dönüştürüldü. K-GECO sinyali daha sonra her 1-2 haftada bir, ek ilaç tedavileri olsun veya olmasın, aynı kuyucuklarda izlendi. Hem spontan kalsiyum aktivitesi (Şekil 3A,3B) hem de optik pacing altındaki kalsiyum dinamiği (Şekil 3C,D, adım 4.11) yüksek içerikli Görüntüleme Sistemi (adım 4.1-4.12) kullanılarak elde edilmiş ve kalsiyum tepe analiz yazılımı (adım 6) ile işlenmiştir. Şekil 3A, C'de gösterildiği gibi, berrak kalsiyum geçicileri, viral transdüksiyondan bir ay sonra, optik pacing için kullanılan ek ışıkla veya ışık olmadan görünür kalır. Bu çalışma, LVNC iPSC-CM modelinde atım hızını arttıran, kasılma aralığını düzenleyen ve geçici kalsiyum genliğini artıran bir ilacı tanımlamıştır (Şekil 3A, B). Bu verilerden yapılacak iki önemli gözlem vardır. İlk olarak, terapötik perspektiften bakıldığında, ilaç etkisi Gün 63 ve Gün 70 zaman noktalarında dayanıklı görünmektedir. İkincisi ve genel olarak kısa pencereler (<1 dakika) sırasında daha önceki zaman noktalarında (tipik olarak <50 gün) bileşik etkileri tahlil eden bir alanla ilgilidir; Bileşiğin hastalık fenotipi modifiye edici etkileri ancak 60. günden sonra belirgindir, bu da standart tarama protokollerinde yavaş etki mekanizmalarına sahip ilaçların indirgenmesinin kolay olabileceğini düşündürmektedir.
Vuruş frekansının değişkenliği ve ardından kalsiyum geçici süresi üzerindeki etkisi, herhangi bir zaman noktasında sadece iyiden iyiye bir problem değildir. Aynı zamanda iPSC-CM kültürde muhafaza edildikçe de değişir, bu da zamanla bir kuyu içinde değişir (Şekil 3B). Sıralı deneylerde tutarlılık sağlamak için, ilaç tedavisi ile veya ilaç tedavisi olmadan 1 Hz optik pacing uygulanabilir (Şekil 3C, D). Burada, Gün 63 sonuçları, kalsiyum geçicisinde önemli ölçüde daha yüksek genlik, daha kısa CTD90 ve daha kısa bozunma süresi ile cesaret verici eğilimler göstermesine rağmen; 70 günlük zaman dilimine göre - ve nadir hastalıklar için ilaç tarama sürecinde kronik değerlendirmelere duyulan ihtiyacın göstergesi - depolarizasyonlardan (EAD) sonra erken tespit edilir. Hastalık fenotiplemesine veya küçük molekül değerlendirmesine bir pacing protokolü eklemenin değeri, Şekil 3B, D'de beat hızı, kalsiyum geçici genliği, CTD90 ve bozunma süresi için sunulan sonuçların karşılaştırılmasıyla nitel olarak değerlendirilebilir.
Bir GECI'nin, kalsiyum geçicisini görselleştirmek için kimyasal boyaya kıyasla, metodolojiye dayalı bir avantajı, probu bir hücre içindeki belirli bir bölmeyle sınırlama yeteneğidir. Bu, tek hücrelerde birden fazla renk ve / veya afinite varyantını çoğaltarak daha da genişletilebilir. Bu nedenle, sırasıyla endoplazmik retikulum / sarkoplazmik retikulum (ER / SR), mitokondri (veya CRAC kanalı) ve sitozolde ortaya çıkan gerçek zamanlı kalsiyum aktivitesi ölçümü için hücre modellerinde ER-LAR-GECO9, mtGCEPIA 22,23 (veya Oria1-G-GECO) ve NIR-GECO2 8,24 dahil olmak üzere çeşitli GECI'ler geliştirilmiştir. Farklı hücre içi kalsiyum depoları arasındaki etkileşimi incelemek için iPSC-CM modelinde (Şekil 4A, C) birleştirilebilirler. Örneğin, SR kalsiyum deposunu boşaltmak için 10 mM kafein tedavisi kullanılabilir. Burada ER-LAR-GECO sinyalinin azalması (SR'den kalsiyum kaybının göstergesi), beklendiği gibi NIR-GECO sinyalinin (sitozolik kalsiyum konsantrasyonundaki artışın göstergesi) düşüşüne paraleldir. Diğer hücre içi bölmelerin bu dalgalanmalardan nasıl etkilendiği iyi çalışılmamıştır. Yine de, yeşil bir mitokondriyal hedefli mtGCEPIA3'ün dahil edilmesi, bu koşullarda mitokondride kalsiyum alımının meydana geldiğini göstermektedir (Şekil 4A, B).
Benzer şekilde, farklı kalsiyum akımları arasındaki etkileşimin görselleştirilmesi, kalsiyum salınımıyla aktive edilen kanal (CRAC) Ca 2+ akımını ortaya çıkarmak için bir prob olan Orai1-G-GECO25'in dahil edilmesiyle görülebilir (Şekil 4C, D). iPSC-CM modelinde bu sinyal spontan sitozolik kalsiyum geçici ile artar (Şekil 4D1,D2). Buna uygun olarak, kafein ile tedavi hem sitosolde hem de Orai1 kanalından büyük bir kalsiyum geçici uyarır.
Kardiyomiyosit modellerinde kalsiyum geçici görüntülemenin çoğunun kalsiyum boyaları kullanılarak belirlendiği kabul edilmektedir26. Genetik olarak kodlanmış bir kalsiyum göstergesi, farklı kalsiyum görüntüleme yaklaşımlarının yan yana karşılaştırılmasını sağlamak için iPSC türevi kardiyomiyosit modelindeki kimyasal bir boya ile karşılaştırıldı. iPSC-CM'leri eksprese eden K-GECO, Fluo-4 yüklü hücrelerle birlikte görüntülendi. Kardiyomiyositleri eksprese eden K-GECO zaman içinde tutarlı dayak davranışı göstermiştir (Şekil 5A,C). Bununla birlikte, Fluo-4 yüklemesi bu modelde hem vuruş frekansını hem de CTD'yi etkilemiştir (Şekil 5B, C), Fluo-4'ün kendisinin bu tür deneylerin sonuçlarını etkileyebileceğini düşündürmektedir. Bu, özellikle görüntüleme probuna uzun süre maruz kaldıktan sonra geçerli olacaktır; bu, kuyu başına bir dakikalık bekleme süresiyle iyi görüntüleme gerçekleşirse, çok duvarlı görüntüleme formatında ortaya çıkabilir.
Şekil 1: iPSC türevi kardiyomiyositlere uygulanan küçük moleküllü iyon kanalı inhibitörleri. (A-B) IPSC-CM'nin mNG-GECO'yu eksprese eden hızlandırılmış görüntüleri 25 Hz. Ölçek çubuğu = 50 μm. (B) Bileşik ilavesinden sonra temsili Ca2+ salınımları. mNG-GECO eksprese eden hücrelerden elde edilen floresan sinyalleri, F0'ın bazal yoğunluk ve F'nin her zaman noktasında tespit edilen yoğunluk olarak tanımlandığı bir floresan oranı F / F0 olarak sunulur. (C) Kalsiyum pik analiz yazılımı, yarım maksimum genişlik (CTD50), %90 geçici süre (CTD 90), yükselme süresi ve bozunma süresi gibi parametreleri çıkarabilir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Bir optik pacing sistemi içinde hERG inhibitörü E4031'i kullanan doz-yanıt örneği. (A) E4031'in farklı konsantrasyonlarında% 10 mavi ışıkla optik stimülasyon izleri. 25 Hz'de alınan K-GECO'yu eksprese eden iPSC türevli kardiyomiyositlerin hızlandırılmış görüntüleri. (B1) Farklı bileşik dozlarla elde edilen kalsiyum geçicilerinin temsili izleri. E4031'in genlik (B2) ve Bozunma süresinde (B3) pik analizi ve doz-yanıtı. Mavi çubuklar 1 Hz 470 nm darbe ışığı stimülasyonunu gösterir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: LVNC hasta kaynaklı kardiyomiyositlerde uzun süreli ilaç fenotipik taraması için uygulanan tüm optik platform . (A) Hasta kaynaklı kardiyomiyositlerde (farklılaşma sonrası Gün 70) spontan dayak aktivitesinin temsili izi (kırmızı) veya (mavi) 5 μM ilaç tedavisi olmadan. (B) 5 μM ilaç tedavisi olsun veya olmasın spontan dayak aktivitesinin tepe analizi. (C) 1 Hz optik stimülasyon altında hasta kaynaklı iPSC-CM'de ilaç yanıtının yoğunluk izleri. (D) 1 Hz optik stimülasyon ile hasta kaynaklı kardiyomiyositlerin pik analizi. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: iPSC-CM modelinde üç kanallı hücre altı Ca 2+ görüntüleme. (A-B) iPSC-CM'ler, sitoplazma için hücre altı kalsiyum probları, NIR-GECO2 (kırmızı), endoplazmik retikulum ER-LAR-GECO (sarı) ve mitokondriyal Ca2+ göstergesi olan mtGCEPIA3 (camgöbeği) ile transdüke edildi. (B) 10 mM kafein tedavisinden önce ve sonra üç kanallı hızlandırılmış kalsiyum görüntüleme. Sitoplazmik, NIR-GECO2 (kırmızı), endoplazmik retikulum ER-LAR-GECO (sarı) ve CRAC kanal göstergeleri Orai1-G-GECO (camgöbeği) ile transdüke edilen (C-D) iPSC-CM'ler görselleştirildi. (D) Üç kanallı hızlandırılmış kalsiyum görüntüleme yakalandı. (D1) NIR-GECO2 ve Orai1-G-GECO ile spontan atımdan atağa aktivite gözlendi. (D2) ER'den gelen kalsiyum efflux (ER-LAR-GECO sinyalinin azalması), kafein tedavisi üzerine sitozolik kalsiyum sinyalinde bir artışa eşlik etti. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5: Genetik olarak kodlanmış kalsiyum göstergesinin (K-GECO) iPSC-CM'lerdeki kimyasal kalsiyuma duyarlı boya (Fluo-4) ile karşılaştırılması. (A-B) K-GECO (A) ve Fluo-4 (B)'nin temsili kalsiyum izleri zaman içinde sunulmuştur. (C) K-GECO transdüe edilmiş veya Fluo-4 yüklü iPSC-CM'nin kalsiyum geçici analizi. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
| Cesaret | CTD50 (ler) | CTD90 (lar) | Genlik (F/F0) | Yükselme zamanı | Bozunma süresi (ler) | |
| Araç (%0.1 DMSO) | 112.3657+/-10.95 | 0.25+/-0.04 | 0.41+/-0.01 | 1.99+/-0.02 | 0.07+/-0.01 | 0.28+/-0.01 |
| Verapamil (1 uM) | 0 | - | - | - | - | - |
| Dofetilide (5 nM) | 103.42+/-9.87** | 0.23+/-0.03 | 0.46+/-0.03 | 1.91+/-0.03 | 0.07+/-0.01 | 0.35+/-0.02* |
| E4031 (30 nM) | 75.73+/-12.08*** | 0.37+/-0.04** | 0.58+/-0.08*** | 1.55+/-0.02** | 0.11+/-0.04*** | 0.35+/-0.07** |
Tablo 1: iPSC-CM modelinde geçici kalsiyum parametrelerine bileşik ilavesinin etkileri. Anlamlılık değerleri *(p ≤ 0.05), **(p < 0.01) ve ***(p < 0.001) ile gösterilir.
Animasyonlu Video 1: mNG-GECO tarafından iPSC türevi kardiyomiyositlerde spontan kalsiyum aktivitesi sadece araçla gözlendi. Gri tonlamalı bir görüntünün sahte renkli bir filmi sağlanır. Bu videoyu indirmek için lütfen tıklayınız.
Ek Şekil 1: Adenoviral-vektörün şematik gösterimi. Bu, bir aktüatör olarak kanal rodopsin ChR2'yi, tamamen optik bir tahlil için kalsiyum raportörü olarak kırmızı floresan kalsiyum göstergesi K-GECO'yu içerir. Işığa duyarlı iyon kanalı, uyarılabilir hücrelerin görünür spektrumun mavi-yeşil aralığındaki ışık tarafından depolarize edilmesini sağlar. Bu deneylerde 470 nm ışık kullanılmıştır. Uyarılabilir hücrelerdeki kalsiyum geçicileri, yeşil uyarma ışığı gerektiren ve kırmızı emisyonlar üreten K-GECO tarafından aynı anda görüntülenebilir. Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.
Discussion
Yüksek verimli taramayı başarılı bir şekilde gerçekleştirmek için, sinyaller kültür kabı boyunca eşit olarak dağıtılmalı ve rastgele seçilen ilgi alanlarının (ROI'ler) görüntüleme edinimi sırasında otomatik olarak uygulanabileceğini garanti etmelidir. Kimyasal kalsiyum göstergeleri bu gereksinimi kolayca karşılasa da, genetik olarak kodlanmış problar, kullanımlarını sınırlayan sinyal tabakaları yerine tarihsel olarak yamalar üretmiştir. Bir viral transdüksiyon sisteminin kullanılması, geleneksel transfeksiyon yöntemlerine kıyasla hedef hücreler arasında yüksek 27,28 ve eşdeğer çoklu göstergelerin ekspresyon seviyelerini sağlar. Farklı hücre tipleri farklı promotörler gerektirebilir ve gen dağıtım sisteminin seçiminin buna göre değişmesi gerekebilir 29,30,31. Heterojen hücre modellerinde, transdüksiyon ve ekspresyon verimliliği spesifik hücre tiplerinde farklı olabilir. Bir yandan, bu uygulamayı belirli hücrelerle sınırlayabilir, ancak fenomen bir ko-kültür sistemindeki belirli hücreleri ayırt etmek için kullanılabilir32.
Bu yaklaşımın temel etkisi, deneyci ile numune arasındaki bire bir ilişkiden otomasyon yoluyla kurtulmasıdır. Standart bir çok kuyulu deneyde, tek bir kuyu içinde dört konumda veri toplamak için, 96 kuyu plakasından 30 s video toplamanın mikroskopta yaklaşık 15 saat sürdüğünü tahmin ediyoruz. Otomatik sistemde, bu ~ 4 saat sürer. Ayrıca, verilerin manuel olarak analizi, veri toplamadan çok daha uzun sürer. Burada kullanılan analiz sistemi, manuel eşdeğerinden yaklaşık 200 kat daha hızlıdır. Net sonuç, geliştirilmiş bir iş akışı ve yüksek maliyet ve zaman tasarrufudur.
Saatlerce hayatta kalan kalsiyum boyaları ile yüklü birincil kardiyomiyositlerin aksine, viral dağıtım sistemleri aracılığıyla iPSC-CM'lerde eksprese edilen GECI'ler, birkaç ay boyunca yaşayan deneysel bir modelde bir sinyal verebilir. Bu modeller çok kuyulu bir formatta tutulabilir ve küçük molekül taraması için geliştirilen yüksek içerikli görüntüleme sistemlerinde seri analiz için aynı anda izlenebilir. Bu, toksikoloji tahlillerinde tipik olarak kullanılan dakikalardan ziyade, hastaların yaşadıklarına (haftalar veya aylar) daha yakın süreler boyunca ilaç etkilerini test etmek için basit bir insan deney platformu üretir.
Sistem, yeşilden yakın kızılötesine kadar farklı emisyon özelliklerine sahip GECI'leri dahil ederek çok parametreli ölçümler sunacak şekilde genişletilebilir. Bu tür deneyler, sinyalleri ayrı tutmak için deneysel tasarımda uygun uyarma ışığı ve filtre setleri gerektirir. İlaç tarama bağlamında geniş uygulama, ilaç dağıtımına ek olarak sağlam ve verimli analiz platformları gerektirir. Burada açıklanan model, çoklu dinamik kalsiyum göstergelerinin kullanımına odaklansa da, bu, hücre formunun veya fonksiyonunun yapısal belirteçlerine değiştirilebilir. Bunların, hücre içi kalsiyum konsantrasyonundaki yüz kat varyasyona kıyasla çok az vuruştan atıma değişkenlik gösterdikleri için görselleştirmesi genellikle daha kolaydır. Bu yaklaşım, hastalardan türetilen iPSC ara ürününün ölçeklenebilir bir hücre modelinde korunabilen belirli bir durumun tüm genetik sürücülerini ve değiştiricilerini içerebileceği, aydınlatılması zor olabilecek destekleyici biyolojik mekanizmadan bağımsız olarak görselleştirilebilen hücresel fenotiplere dayanan çeşitli hastalıklarda ilaç keşfini kolaylaştırabileceği nadir hastalıklar için özellikle değerli olabilir.
Disclosures
LumiSTAR, K-GECO, NIR-GECO ve LAR-GECO kullanımının patent koruması için başvuruda bulunmuştur.
Acknowledgments
Tokyo Üniversitesi'nden Prof. Robert Campbell'a materyali ve değerli tartışmayı paylaştığı için teşekkür ederiz; Teknik destek için Moleküler Cihaz'da Dr. Chia-Lin Ho.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 96-well plate | Perkin Elmer | 6055302 | |
| auto microfluidic system | Molecular Device | A device has a single channel pipetter that can be used to add compound automatically | |
| Caffeine | Sigma-Aldrich | C0750 | |
| Cardiosight-S l iPSC derived cardiomyocytes | NEXEL | C-002 | |
| Dimethyl sulfoxide | Millipore Sigma | 1096780100 | |
| Dofetilide | Sigma-Aldrich | PZ0016 | |
| E4031 | Tocris | 1808 | |
| ER-LAR-GECO viral kit | LumiSTAR | AA001a | Red-shifted GECI packed into adeno-viral vector |
| Fibronectin | Sigma-Aldrich | F1141 | |
| Fluo-4 AM | Invitrogen | F14201 | Chmical calcium sensitive dye |
| Gelatin | Sigma-Aldrich | G1890 | |
| ImageXpress Micro Confocal High-Content Imaging System | Molecular Device | ||
| iPSC-CMs Maintenance Medium | NEXEL | CMS-002 | iPSC-CMs Medium (Cardiosight-S medium) + Cardiosight-S Supplement |
| iPSC-CMs Medium (Cardiosight-S medium) | NEXEL | CMS-002 | |
| K-GECO viral kit | LumiSTAR | AA005a | Red-shifted GECI packed into adeno-viral vector |
| LumiCAL software | LumiSTAR | LUCS01a | Software for analysis of calcium peak in cardiomyocytes |
| mNG-GECO viral kit | LumiSTAR | AL008a | Brighter green GECI packed into lenti-viral vector |
| mt-GCEPIA3 viral kit | LumiSTAR | AL011a | GECI targgeting on mitochondria packed into lenti-viral vector |
| NIR-GECO viral kit | LumiSTAR | AV004a | Near infrared GECI packed into viral vector |
| Orai1-GGECO viral kit | LumiSTAR | AL010a | GECI targgeting on Orai1 packed into lenti-viral vector |
| Tyrode's salts | Sigma-Aldrich | T2145 | |
| Verapamil hydrochloride | Sigma-Aldrich | V4629 | |
| Y-27632 dihydrochloride | Tocris | 1254 |
References
- O'Connor, M. D. The 3R principle: Advancing clinical application of human pluripotent stem cells. Stem Cell Research & Therapy. 4 (2), 21 (2013).
- Ebert, A. D., Liang, P., Wu, J. C. Induced pluripotent stem cells as a disease modeling and drug screening platform. Journal of Cardiovascular Pharmacology. 60 (4), 408-416 (2012).
- Ovics, P., et al. Drug development and the use of induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes for disease modeling and drug toxicity screening. International Journal of Molecular Sciences. 21 (19), 7320 (2020).
- Paredes, R. M., Etzler, J. C., Watts, L. T., Zheng, W., Lechleiter, J. D.
- Takahashi, A., Camacho, P., Lechleiter, J. D., Herman, B.
- Smith, N. A., et al. Fluorescent Ca(2+) indicators directly inhibit the Na,K-ATPase and disrupt cellular functions. Science Signaling. 11 (515), (2018).
- Shen, Y., et al. A genetically encoded Ca2+ indicator based on circularly permutated sea anemone red fluorescent protein eqFP578. BMC Biology. 16 (1), 9 (2018).
- Qian, Y., et al. A genetically encoded near-infrared fluorescent calcium ion indicator. Nature Methods. 16 (2), 171-174 (2019).
- Wu, J., et al. Red fluorescent genetically encoded Ca2+ indicators for use in mitochondria and endoplasmic reticulum. Biochemical Journal. 464 (1), 13-22 (2014).
- Zarowny, L., et al. and high-performance genetically encoded Ca2+ indicator based on mneongreen fluorescent protein. ACS Sensors. 5 (7), 1959-1968 (2020).
- Potekhina, E. S., et al. Drug screening with genetically encoded fluorescent sensors: today and tomorrow. International Journal of Molecular Sciences. 22 (1), 148 (2021).
- Chang, Y. -F., et al. Non-invasive phenotyping and drug testing in single cardiomyocytes or beta-cells by calcium imaging and optogenetics. PLoS One. 12 (4), 0174181 (2017).
- Chang, Y. -F., Arai, Y., Nagai, T. Optogenetic activation during detector "dead time" enables compatible real-time fluorescence imaging. Neuroscience Research. 73 (4), 341-347 (2012).
- Chen, G., et al. Chemically defined conditions for human iPSC derivation and culture. Nature Methods. 8 (5), 424-429 (2011).
- Strober, W. Trypan blue exclusion test of cell viability. Current Protocols in Immunology. 111, 1-3 (2015).
- Jang, Y., et al. Modulating cardiomyocyte and fibroblast interaction using layer-by-layer deposition facilitates synchronisation of cardiac macro tissues. Soft Matter. 16 (2), 428-434 (2020).
- Leonard, R. G., Talbert, R. L.
- Sanguinetti, M. C., Jurkiewicz, N. K. Two components of cardiac delayed rectifier K+ current. Differential sensitivity to block by class III antiarrhythmic agents. The Journal of General Physiology. 96 (1), 195-215 (1990).
- Lees-Miller, J. P., Duan, Y., Teng, G. Q., Duff, H. J. Molecular determinant of high-affinity dofetilide binding to HERG1 expressed in Xenopus oocytes: Involvement of S6 sites. Molecular Pharmacology. 57 (2), 367-374 (2000).
- Kamiya, K., Niwa, R., Mitcheson, J. S., Sanguinetti, M. C. Molecular determinants of HERG channel block. Molecular Pharmacology. 69 (5), 1709-1716 (2006).
- Fukushima, H., et al. Specific induction and long-term maintenance of high purity ventricular cardiomyocytes from human induced pluripotent stem cells. PLoS One. 15 (11), 0241287 (2020).
- Suzuki, J., Kanemaru, K., Iino, M. Genetically encoded fluorescent indicators for organellar calcium imaging. Biophysical Journal. 111 (6), 1119-1131 (2016).
- Suzuki, J., et al. Imaging intraorganellar Ca2+ at subcellular resolution using CEPIA. Nature Communications. 5, 4153 (2014).
- Qian, Y., et al. Improved genetically encoded near-infrared fluorescent calcium ion indicators for in vivo imaging. PLoS Biology. 18 (11), 3000965 (2020).
- Dynes, J. L., Amcheslavsky, A., Cahalan, M. D. Genetically targeted single-channel optical recording reveals multiple Orai1 gating states and oscillations in calcium influx. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (2), 440-445 (2016).
- Broyles, C. N., Robinson, P., Daniels, M. J. Fluorescent, bioluminescent, and optogenetic approaches to study excitable physiology in the single cardiomyocyte. Cells. 7 (6), 51 (2018).
- Cao, F., et al. Comparison of gene-transfer efficiency in human embryonic stem cells. Molecular Imaging and Biology. 12 (1), 15-24 (2010).
- Ma, Y., Ramezani, A., Lewis, R., Hawley, R. G., Thomson, J. A. High-level sustained transgene expression in human embryonic stem cells using lentiviral vectors. Stem Cells. 21 (1), 111-117 (2003).
- Haery, L., et al. Adeno-associated virus technologies and methods for targeted neuronal manipulation. Frontiers in Neuroanatomy. 13, 93 (2019).
- Nieuwenhuis, B., et al. Optimization of adeno-associated viral vector-mediated transduction of the corticospinal tract: Comparison of four promoters. Gene Therapy. 28 (1), 56-74 (2021).
- Smith, R. L., et al. Characterization of promoter function and cell-type-specific expression from viral vectors in the nervous system. Journal of Virology. 74 (23), 11254-11261 (2000).
- Fang, Y., et al. Safety and efficacy of an immune cell-specific chimeric promoter in regulating anti-PD-1 antibody expression in. CAR T cells. Molecular Therapy - Methods & Clinical Development. 19, 14-23 (2020).
