Summary
Os organoides derivados do paciente (PDOs) são uma ferramenta poderosa na pesquisa de câncer translacional, refletindo tanto a heterogeneidade genética e fenotípica da doença quanto a resposta a terapias anticânculas personalizadas. Aqui, um protocolo consolidado para gerar PDOs de câncer de bexiga primário humano em preparação para a avaliação de análises fenotípicas e respostas medicamentosas é detalhado.
Abstract
As plataformas atuais de testes terapêuticos in vitro carecem de relevância para a fisiopatologia tumoral, tipicamente empregando linhas de células cancerígenas estabelecidas como culturas bidimensionais (2D) no plástico da cultura tecidual. Há uma necessidade crítica de modelos mais representativos de complexidade tumoral que possam prever com precisão a resposta terapêutica e a sensibilidade. O desenvolvimento da cultura ex vivo tridimensional (3D) de organoides derivados do paciente (PDOs), derivados de tecidos tumorais frescos, visa supridamente essas deficiências. Culturas organoides podem ser utilizadas como substitutos tumorais em paralelo ao manejo clínico de rotina para informar decisões terapêuticas, identificando possíveis intervenções eficazes e indicando terapias que podem ser fúteis. Aqui, este procedimento visa descrever estratégias e um protocolo passo a passo detalhado para estabelecer PDOs de câncer de bexiga a partir de tecido clínico fresco e viável. Nossos protocolos bem estabelecidos e otimizados são práticos para configurar culturas 3D para experimentos usando material inicial limitado e diversificado diretamente de pacientes ou material tumorado de xenoenxerto derivado do paciente (PDX). Este procedimento também pode ser empregado pela maioria dos laboratórios equipados com equipamentos de cultura de tecido padrão. Os organoides gerados usando este protocolo podem ser usados como substitutos ex vivo para entender tanto os mecanismos moleculares que sustentam a patologia do câncer urológico quanto para avaliar tratamentos para informar o manejo clínico.
Introduction
O câncer de bexiga é o câncer do trato urinário mais prevalente e a décima malignidade humana mais comum em todo o mundo1. Engloba um espectro geneticamente diverso e fenotipicamente complexo da doença2. As formas não musculares invasivas de câncer de bexiga (NMIBC) são os diagnósticos mais comuns de câncer de bexiga (70%-80%), e esses cânceres apresentam heterogeneidade biológica considerável e desfechos clínicos variáveis 2,3,4. Pacientes com NMIBC normalmente experimentam um alto risco de recidiva da doença (50-70%) e um terço dos cânceres progredirá e se desenvolverá em câncer de bexiga músculo-invasivo significativamente mais agressivo (MIBC)2. Embora as taxas de sobrevivência de 5 anos para o NMIBC sejam altas (>90%), esses pacientes devem passar por um gerenciamento clínico de longo prazo5. Por outro lado, o MIBC localmente avançado (não ressecável) ou metastático é geralmente considerado incurável6. Consequentemente, o câncer de bexiga tem um dos maiores custos de tratamento ao longo da vida dentro do tratamento do câncer e é um fardo significativo tanto para o indivíduo quanto para o sistema de saúde 3,7. As aberrações genéticas subjacentes em doenças avançadas tornam o manejo terapêutico do câncer de bexiga um desafio clínico, e as opções terapêuticas para tumores uroteliais invasivos só melhoraram recentemente desde a aprovação de imunoterápicos para nmibc 8,9 avançados e de alto risco. Atualmente, a tomada de decisão clínica tem sido guiada por características clínicas e histopatológicas convencionais, apesar dos tumores individuais de câncer de bexiga mostrarem grandes diferenças na agressividade da doença e na resposta à terapia10. É urgente acelerar a pesquisa em modelos clinicamente úteis para melhorar a previsão do prognóstico individual do paciente e a identificação de tratamentos eficazes.
Organoides tridimensionais (3D) mostram grande potencial como modelos tumorais devido à sua capacidade de auto-organizar e recapitular a arquitetura intrínseca in vivo do tumor original e o perfil farmacogenômico, e sua capacidade de espelhar a funcionalidade celular nativa do tecido original do qual foram derivados 11,12,13 . Embora as linhas de células cancerígenas de bexiga estabelecidas estejam prontamente disponíveis, relativamente econômicas, escaláveis e simples de manipular, as linhas celulares in vitro não conseguem imitar em grande parte o espectro de diversas alterações genéticas e epigenéticas observadas em cânceres clínicos de bexiga12,14 e foram todas estabelecidas e mantidas sob condições de cultura 2D e aderentes. Além disso, as linhas celulares derivadas de tumores primários e metastáticos da bexiga abrigam divergência genética significativa do material tumoral original. 8,15.
Uma abordagem alternativa é usar modelos de camundongos geneticamente modificados e induzidos por carcinógenos. No entanto, enquanto esses modelos recapitulam algumas das cascatas oncogênicas naturais envolvidas na neoplasia humana (revisadas em refs 16,17,18), elas não têm heterogeneidade tumoral, são caras, representam mal câncer de bexiga invasivo e metastático, e não são viáveis para testes medicamentos rápidos, pois tumores podem levar muitos meses para desenvolver 14,19 . Modelos derivados do câncer (incluindo organoides, cultura celular primária reprogramada condicionalmente e xenoenxertos) fornecem oportunidades inestimáveis para entender os efeitos do tratamento medicamentoso antes do tratamento clínico20. Apesar disso, poucos grupos usam rotineiramente esses modelos paciente-proximal devido ao acesso limitado ao tecido primário fresco do paciente e à ampla otimização necessária para gerar de forma reproduzivelmente as condições de cultura organoide (PDO) derivadas do paciente. Em um ambiente in vivo, as células oncogênicas podem interagir e se comunicar com várias composições dos constituintes circundantes, incluindo células estromais, células imunes infiltradas em tecidos e matriz12. Da mesma forma, para PDOs cultivados em formato 3D, a complexidade celular/matriz pode ser personalizada para incluir outros componentes relevantes. Os PDOs podem ser rapidamente gerados e muitas vezes são capazes de serem passagens extensivamente ou criopreservadas para uso posterior, apesar de terem uma vida útil finita 21,22,23. A farmacodinâmica (ou seja, resposta a uma droga) pode ser avaliada usando leituras múltiplas, incluindo viabilidade organoide e morfologia, e caracterização de alvos imunohistoquímicos ou alterações transcricionais.
Aqui, são descritos os procedimentos para o estabelecimento de organoides de câncer de bexiga a partir de material de paciente coletado da ressecção transuretral do tumor da bexiga (TURBT) ou remoção cirúrgica da bexiga (cistectomia radical). O método de geração de PDOs é ilustrado, utilizando materiais e ferramentas de laboratório molhadas prontamente disponíveis. Os pontos finais incluem alterações nas características morfológicas celulares e viabilidade. Estes foram medidos por meio de microscopia de fluorescência, viabilidade in vitro (integridade metabólica e integridade da membrana celular) e análise histopatológica. A Figura 1 mostra o fluxo de trabalho para o estabelecimento de PDOs de câncer de bexiga humana a partir de material clínico obtido durante a cirurgia eletiva.
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Protocol
Os pacientes consentiram com este estudo após sua internação sob a equipe de Urologia no Hospital Princess Alexandra, brisbane, Austrália. Este estudo foi realizado de acordo com os princípios da Declaração de Helsinque e dentro das diretrizes éticas e institucionais (número de ética HREC/05/QPAH/95, QUT 1000001165).
NOTA: Como critérios de elegibilidade, os pacientes tinham idade ≥ 18 anos com câncer, e capazes de entender e fornecer consentimento. Foram excluídos aqueles que não puderam dar consentimento informado. Aqueles que tinham uma língua primária diferente do inglês foram excluídos, pois a provisão de intérpretes não foi possível devido a considerações logísticas e orçamentárias. Também foram excluídos pacientes cujos tumores não estavam acessíveis à biópsia ou improváveis de estarem disponíveis em quantidade adequada após a patologia de rotina.
1. Preparação do Meio Organoide
NOTA: O meio organoide do câncer de bexiga humano requer fatores de crescimento que auxiliam na sobrevivência, crescimento e expansão contínua de organoides derivados de material clínico dissociado (Tabela 1). Para obter detalhes completos de cada suplemento utilizado neste procedimento, consulte a Tabela de Materiais.
- Descongele ingredientes congelados no gelo ou em uma geladeira a 2-8 °C. Evite ciclos repetidos de congelamento/degelo e trabalhe a partir de alíquotas congeladas (armazenadas a -20 °C).
- Meio basal: Prepare o meio basal suplementando o Avançado Dulbecco's Modified Eagle Medium/Ham's F-12 (adDMEM/F12) com HEPES (10 mM) e glutamina (2 mM). Isso também é usado como meio de transporte, e durante as etapas de lavagem organoide.
NOTA: O DMEM/F-12 avançado é utilizado como meio basal para auxiliar na expansão de organoides na presença de soro limitado; no entanto, requer suplementação com HEPES e L-glutamina. - Brevemente, o fator de crescimento do fibroblasto 10 (FGF-10), o fator de crescimento do fibroblasto 2 (FGF-2), o fator de crescimento epitelial (EGF), o SB202190, a prostaglandina E2 (PGE2) e o A 83-01 antes de abrir para garantir que os componentes estejam na parte inferior do frasco.
- Meio organoide completo: Meio basal suplementar com noggin humano e R-spondin 1-conditioned media em uma concentração final de 5% v/v, EGF humano (50 ng/mL), FGF-2 humano (5 ng/mL), FGF-10 humano (20 ng/mL), A 83-01 (500 n M), SB202190 (10 μM), B27 (1x), nicotinamida (10 mM), N-acetilcisteína (1,25 mM), Y-27632 (10 μM), PGE2 (1 μM) e formação de antibióticos de amplo espectro na concentração indicada pelo fabricante.
- Armazene a mídia organoide a 4 °C no escuro e use-a dentro de 2 semanas (1 mês no máximo). Não congele. Evite exposição prolongada a fontes de luz.
NOTA: O meio organoide é preparado sem soro; no entanto, o soro e a penicilina/estreptomicina podem ser suplementados de usuário para usuário, conforme necessário.
2. Um dia antes do procedimento descrito em 3
- Fator de crescimento do degelo reduziu a membrana do porão (BME; ver Tabela de Materiais) durante a noite por pelo menos 12 h antes de ser usado em uma geladeira de 4 °C ou sala fria. Se necessário, dispense o BME em alíquotas de 1 mL em um tubo de uso único de polipropileno de 1,5 mL para evitar ciclos de congelamento.
- Coloque as pontas filtradas de pipeta em uma geladeira de 4 °C ou fria.
NOTA: Esta seção refere-se às pontas de pipeta que serão usadas ao manusear o BME para evitar a polimerização prematura e reduzir o revestimento de BME na superfície das pontas. - Esterilize todos os equipamentos cirúrgicos necessários para o procedimento.
3. Geração de organoides tumorais da bexiga
NOTA: Este é um passo inicial para o estabelecimento de PDO a partir de tumores primários do paciente. Este procedimento é adaptado para tecidos de câncer de bexiga a partir de métodos estabelecidos por Gao et al.24.
- Use um capuz de risco biológico classe II para preparar o espécime. Recuperar gelo seco e úmido e imprimir folha de processamento de amostras do paciente (Arquivo Suplementar).
- Chame o pessoal da pesquisa para a sala de cirurgia quando a ressecção cirúrgica estiver quase completa.
NOTA: Confirme se o paciente preenche os critérios de elegibilidade e assinou o termo de consentimento do participante. O tecido só é fornecido para pesquisa se excedente aos requisitos para avaliação histopatológica clínica. - Colete uma nova amostra de tumor macroscopicamente viável da cirurgia. Certifique-se de que a amostra está submersa em meio de transporte (1x adDMEM/F12 ou 1x Linha salina tamponada de fosfato de Dulbecco (DPBS) em um tubo cônico estéril de 50 mL ou frasco de amostra de urina durante o trânsito.
NOTA: Em alguns centros clínicos, o tecido pode precisar ser transportado para um laboratório de patologia para ser alocado para pesquisa. Nestas circunstâncias, recomenda-se que antibióticos e antimípticos sejam adicionados ao meio de transporte. O tecido pode ser armazenado a 4 °C em meio basal por até 24 horas após a cirurgia e ainda gerar culturas organoides viáveis. - Registos da amostra, incluindo peso tecidual (g ou mg), descrição da amostra e detalhes sobre quaisquer amostras de sangue e urina na Folha de Processamento de Amostras do Paciente (Arquivo Suplementar).
- Remova cuidadosamente o meio de transporte e substitua-o por 10 mL de mídia basal. Permita que o tecido tumoral se acalme pela gravidade.
NOTA: O meio de transporte é considerado resíduo clínico e deve ser coletado em um recipiente de resíduos devidamente rotulado em uma quantidade adequada de solução de descontaminação. Uma vez que o líquido tenha sido quimicamente descontaminado, ele pode ser descartado de acordo com as diretrizes institucionais para resíduos perigosos. - Remova o tecido tumoral com fórceps e coloque-o em uma placa de Petri estéril de 90 mm (Figura 2A). Registo o peso do tecido em mg ou g na folha de processamento de amostras clínicas e grade de dissecção (Figura 2B).
- Remova tecido não canceroso (incluindo tecido adiposo) e regiões necrosadas macroscopicamente visíveis usando fórceps estéreis e lâmina de bisturi descartável montada na alça do bisturi (Figura 2C). Lave as peças tumorais 1-2 vezes com 1x de DPBS frios. Colete as peças do tumor e transfira-as para uma nova placa de Petri de 90 mm estéril.
NOTA: Como as lâminas do bisturi são afiadas, tome cuidado ao cortar manualmente. O tecido adiposo adjacente ao tumor pode ser identificado por áreas distintamente macias, gelatinosas e pálidas imediatamente adjacentes ao perímetro visual do tumor. Tecido adiposo macroscópico e regiões focalmente escuras representando áreas de necrose exigirão julgamento pessoal ao dissecar de uma biópsia de tumor da bexiga excisional. - Tire uma foto, desenhe um diagrama de tecido e planeje a dissecção tecidual em uma grade de processamento clínico (Figura 2B e Figura 2C).
NOTA: É importante manter um registro visual e um esboço áspero das características individuais do tumor macroscópico e dissecção para cada caso específico. - Disseque pedaços de tecido tumoral e aloque para análises histopatológicas (Figura 2D) e molecular (Figura 2E).
- Para análises histológicas: Coloque aproximadamente 50 mg de tecido tumoral em um de histologia de plástico descartável rotulado (Figura 2D). Submerse o de histologia em um recipiente com volume de 5x a 10x de formalina tamponada 10% neutra (NBF). Incubar durante a noite na RT.
- Retire 10% de NBF e substitua por 70% (w/w) etanol no dia seguinte para armazenamento a 4 °C até que o tecido possa ser processado usando protocolo de processamento de tecido de rotina
- Para análises moleculares: Congele pelo menos uma peça de tumor de 1-3 mm3 em um criovial de 1,5 mL livre de RNase/DNase usando nitrogênio líquido e armazene a -80 °C (Figura 2E).
- Dispense 5 mL de meio organoide (Tabela 1) na placa de Petri de 90 mm contendo as peças tumorais restantes.
- Tecido mecanicamente picado o mais fino possível (0,5-1 mm3 pedaços ou menor) com uma lâmina de bisturi #10 estéril.
NOTA: Fragmentos maiores ou pedaços inteiros de tecido (>3 mm3) levarão consideravelmente mais tempo para digerir e diminuirão a viabilidade da amostra. Omita o passo acima se o tecido estiver desagregado e os fragmentos forem pequenos o suficiente para pipetar com uma ponta de pipeta sorológica de 5 mL. - Transfira tecido finamente picado para um tubo cônico de 50 mL e adicione 4 mL de meio organoide, 1 mL de colagenase/hyaluronidase de 0,1 mg/mL para evitar a aglomeração celular.
NOTA: A solução de enzimas deve ser preparada de novo a cada vez. Aumente o volume do meio para aproximadamente 10x a quantidade visível dos fragmentos tumorais para amostras grandes. - Incubar o tecido tumoral picado e a solução enzimática por 1-2 h em um agitador orbital ou rotador (150 rpm) em uma incubadora (37 °C, 5% CO2) para dissociar fragmentos em uma suspensão celular e quebrar collagens. Isso pode ser verificado com análise histológica (Figura 3A).
NOTA: Se a quantidade de tecido for grande ou nenhuma dissociação óbvia for observada após 1-1,5 h, aumente o tempo de incubação verificando o nível de dissociação a cada 30 minutos. O tempo para esta etapa depende da amostra e deve ser determinado empiricamente cada vez. Uma solução visivelmente mais clara com fragmentos de tecido indiscerníveis ao olho (ou muito poucos fragmentos) indica uma digestão bem sucedida. - Termine a digestão com a adição de 2x de volume (20 mL) de meio basal à amostra.
- Centrifugar a amostra a 261 x g por 5 min à temperatura ambiente (RT), aspirar e descartar o supernatante.
- Para contaminar os glóbulos vermelhos (RBCs), resuspenque a pelota obtida do passo acima em 5 mL de tampão de amônio-cloreto-potássio (ACK). Incubar o tubo em RT por 3 minutos ou até que alise completa dos RBCs seja vista (a suspensão fica clara).
NOTA: Se os RBCs não forem observados como uma pequena moita vermelha na pelota, esta etapa pode ser omitida. - Adicione 20 mL do meio basal no tubo. Centrifugar o tubo a 261 x g por 5 min no RT e aspirar o supernasal.
- Nesta etapa, coloque uma alíquota de 10 mL de 2x e 1x de meio organoide em um banho de água de 37 °C para aquecer.
- Filtre a amostra através de um coador reversível pré-molhado de 100 μm em um novo tubo de 50 mL para remover um grande material insolúvel.
NOTA: O material grande e não digerido (>100 μm) coletado pelo filtro pode conter células de interesse e pode ser cultivado em placa de Petri de 90 mm ou placa de cultura celular de 6 poços em culturas organoides para derivar culturas 2D (Figura 1 (passo 5) e Figura 3B). - Filtre o elunato através de um coador reversível pré-molhado de 37 μm para coletar células únicas e pequenos aglomerados para isolamento de células monoceláveis e imunes (Tubo 37-1; Figura 1 (etapa 6) e Figura 3B).
NOTA: O rendimento das células tumorais durante esta etapa pode ser aumentado passando a suspensão celular filtrada através do coador novamente. - Inverta o coador de 37 μm e use 10 mL de mídia basal para coletar aglomerados pequenos e de tamanho moderado (37-100 μm) (tubo 70-1; Figura 3B).
- Cubra cada um dos novos tubos de 50 mL (tubos 70-1 e 37-1) com DPBS a 40 mL. Centrifugar a suspensão a 261 x g por 5 min na RT. Aspire e descarte o supernatante.
- Adicione 10 mL de mídia basal ao tubo 37-1 e conte as células usando corante de exclusão azul trypan e um contador automático de células (de acordo com as especificações do fabricante). Determine o número do celular e a viabilidade das células.
- Centrifugar o restante da amostra a 261 x g por 5 min na RT. Aspire o meio e substitua-o por solução de congelamento celular ou mídia basal contendo 10% de soro bovino fetal (FBS), 1% penicilina/estreptomicina e 10% sulfoxida de dimetil (DMSO).
- Coloque amostras em criovials de 1,5 mL e armazene-as em um recipiente de congelamento de células. Transfira imediatamente o recipiente para um congelador de -80 °C para uma taxa ideal de resfriamento. Após o armazenamento durante a noite no congelador a -80 °C, transfira os criovials para armazenamento em fase de líquido criogênico ou de ar (-196 °C) para armazenamento a longo prazo.
- Células resuspendas do tubo 70-1 com 500 μL de meio organoide 2x pré-aquecido.
NOTA: A densidade de semeadura deve ser alta para a propagação organoide bem sucedida. O volume do meio organoide e, posteriormente, o BME devem ser alterados empiricamente no número de células isoladas da etapa de filtragem. Esta etapa fornece um ponto de partida relevante com base em estudos em nosso laboratório. - Adicione BME às células (em uma proporção de 1:1 com meio organoide 2x) com pontas de pipeta de filtro estéril P1000 estéreis estéreis e misture delicadamente para suspender as células. De forma rápida e cuidadosa pipeta 100 μL de células reconstituídas/ mistura BME a poços de uma placa de fundo plano de fundo plano ultra-baixa de 96 poços. Coloque a placa de 96 poços em uma incubadora (37 °C, 5% CO2) por 20-30 min para solidificar.
- Adicione 1:2% do meio organoide 1x em cima da suspensão celular BME, dependendo do volume avaliado empiricamente. No ponto de partida relevante, adicione 50 μL de mídia média organoide 1x em cima de 100 μL de células reconstituídas/ mistura BME.
- Coloque a placa de 96 poços em uma incubadora (37 °C, 5% DE CO2) por 20 minutos para equilibrar.
- Tire a placa de cultura celular da incubadora e monte-a em um porta-espécimes no palco de um microscópio. Avalie os organoides visualmente sob contraste de fase ou configurações de campo brilhante.
NOTA: As imagens são melhor adquiridas por um microscópio de contraste de fase invertido equipado com óptica de interferência diferencial (DIC), câmera digital e software associado para observar a formação de PDOs esféricos em preparação para análise de ponto final.- Se os clusters distintos forem visíveis, coloque a placa de cultura celular em uma câmara de microscópio aquecida eletronicamente no palco (37 °C, 5% CO2) para imagens de células vivas durante as primeiras 24-72 h.
- Certifique-se de que a coleira aquecida flexível esteja presa à lente para reduzir a deriva térmica e o umidificador esteja preenchido com dH2O.
- Realize a imagem inicial usando uma lente objetiva de 4x ou 10x (N.A. 0,30, W.D. 15,2 mm). Lapso de tempo a cada 5-10 min na configuração de contraste de fase.
- Verifique o isolamento bem sucedido caracterizado pelo aparecimento de organoides auto-organizados >10 por poço após um período de 24-72 h.
- Permitir que as culturas continuem por até duas semanas se os números organoides estiverem baixos (Figura 3C).
- Cubra o meio a cada 2-3 dias usando 50 μL de meio organoide pré-aquecido para repor fatores de crescimento esgotados e volume geral.
- Adquira imagens (conforme descrito na etapa 3.30) nos dias 1, 2 e 3 (séries de lapso de tempo), e nos dias 5, 7 e 10 antes da passagem (se aplicável).
NOTA: Os organoides (observados como estruturas geralmente redondas onde você não pode ver as bordas de células individuais) são tipicamente passados de 7 a 10 dias após a configuração, dependendo do sucesso do isolamento. Antes ou depois da passagem, os organoides podem ser tratados com citotóxicos ou agentes terapêuticos por até 6 dias e resposta a medicamentos medidos usando viabilidade celular e ensaios de citotoxicidade. Alternativamente, os organoides podem ser recuperados do BME (utilizando dispase de 1 mg/mL) e criopreservados (biobancar), preparados para testes moleculares, ou incorporados e avaliados histologicamente (Figura 4).
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Representative Results
Organoides 3D foram estabelecidos com sucesso a partir do paciente com câncer de bexiga humana TURBT e tecidos de cistectomia. Resumidamente, esta técnica destaca uma rápida formação de estruturas multicelulares 3D que são viáveis e adequadas para outras análises de ponto final, como avaliação histológica, caracterização molecular (por imunohistoquímica ou PCR quantitativo em tempo real) e triagem de medicamentos. Durante o procedimento (Figura 1), os vários elunatos durante nossas fases de filtragem (Figura 1, etapas 1-6) poderiam ser aproveitados para criopreservar células únicas para isolamento de células imunes infiltradas por tumores (TILs) e geração de um único biobanco celular. O procedimento permite que múltiplos aspectos de um tumor primário heterogêneo sejam biobancarizados adequadamente e de forma a ser rastreado entre pacientes (Figura 2A,B), incluindo histologia (Figura 2C,D) e amostras congeladas frescas (Figura 2E).
Uma digestão de 2 h com colagenase/hyaluronidase e DNase 1 permite a digestão suficiente de 0,5-1 mm3 peças do tecido de biópsia de cistectomia mais complexa, incluindo as células neoplásicas dentro da propria lamina e camadas musculares da bexiga (Figura 3A). Fragmentos pós-digestão maiores (>100 mícrons) provaram ser adequados para a cultura em placas de cultura de tecido padrão de qualquer tamanho para o isolamento de novas culturas 2D (Figura 3B). No entanto, a caracterização molecular extensiva é necessária para validar a origem do câncer dessas linhas celulares. Os organoides gerados com sucesso com este protocolo passam por processos de automontagem dinâmica, incluindo fases de agregação, compactação e formação final, pelas quais se formam em estruturas celulares apertadas (Figura 3C) que podem ser avaliadas para resposta a terapias padrão de cuidado. A Figura 3C destaca as eficientes propriedades de automontagem dos organoides. Histologicamente, essas estruturas recapitulam o tumor original do paciente (Figura 4). Os organoides gerados neste procedimento são adequados para uma infinidade de propósitos, incluindo mais caracterização, biobanco e testes de eficácia de medicamentos (Figura 5).
Figura 1: Representação esquemática da cultura do tecido organoide desde a coleta de amostras de tumores da cirurgia até análises de ponto final. URN, número de registro unitário; TIL, linfócito infiltrado em tumores. (1) O tecido é picado mecanicamente em uma placa de petri de 90 mm tão finamente quanto possível com uma lâmina de bisturi estéril (0,5-1 mm3 peças). (2) As peças tumorais são resuspengiadas em um meio de dissociação enzimática constituído pelo meio organoide, colagenase/hyaluronidase e DNase 1. (3) Tecido tumoral picado e solução enzimática são incubados por 1-2 h em uma incubadora de rotadora (150 rpm, 37 °C, 5% CO2) e posteriormente pelotas (4) para dissociar fragmentos em uma suspensão celular mais fina. A amostra sofre filtração através de reversíveis pré-molhados (5) 100 μm e (6) 37 μm de coador em novos tubos de 50 mL para remover grandes materiais insolúveis e isolar aglomerados de 37-100 μm. Após (7) centrifugação da fração isolada do inverso do coador de 37 μm, os aglomerados celulares são suspensos em (8) mídia BME e organoide antes (9) de imagens de células vivas. Criado com BioRender.com. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Manuseio estéril do tecido tumoral para estabelecimento organoide. (A) Após a excisão e transporte para o laboratório, o espécime é colocado em uma placa de petri estéril, pesado e posteriormente dissecado. (B) Uma grade de dissecção de amostras é usada para marcar a amostra para vários processos. Um exemplo de dissecção é mostrado em (C) onde amostras são retiradas da periferia do tumor o máximo possível para evitar áreas de necrose central e anotadas (inset) antes (D) de escavejamento do tecido antes da fixação tecidual. Barra de escala: 6 mm. Barra de escala de entrada: 4 mm. (E) Pequenos fragmentos frescos são levados para congelamento e biobanco subsequente. Barra de escala: 5 mm. Elementos dessa imagem foram criados com BioRender.com. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Derivação enzimática e montagem dinâmica de organoides tumorais da bexiga. (A) Fotos representativas de hematoxilina e eosina (H&E) mancharam tecido de câncer de bexiga parental (patologia revisada como T3bN0) sobre fixação imediata (esquerda) e pós-digestão de 2h com colagenase/ hialuronidase (direita). Barra de escala: 500 μm. Barra de escala de entrada: 50 μm. (B) Imagens representativas dos isolamentos >100 μm, 37-1 e 70-1 (dia 2). As barras de escala são indicadas dentro da imagem. (C) Imagens representativas são mostradas para o isolamento organoide do câncer de bexiga acima de 48 h e 7 dias de coloração organoide H&E. Barra de escala: 50 μm. Barra de escala para a imagem no inset: 20 μm. DIC: contraste de interferência diferencial. Elementos desta imagem foram criados com BioRender.com Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Culturas organoides derivadas do câncer de bexiga mantêm a arquitetura histológica dos tumores parentais. Imagem representativa de H&E de câncer de bexiga de baixo grau (Ta) e imagem de campo brilhante correspondente de organoide no 7º dia de cultura. O painel de extrema-direita mostra a coloração associada de H&E do dia 7 organoide. As barras de escala são indicadas na figura. LG: baixo grau, BC: câncer de bexiga, H&E: hematomatoxilina e eosina, e DIC: contraste de interferência diferencial. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: Aplicações a jusante com organoides derivados do paciente com câncer de bexiga. Criado com BioRender.com. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Aditivo | Conc Final. | Stock Conc. | Solvente | |
| Mídia Basal | Glutamax | 2 mM | 1 M | NaCl |
| HEPES | 10 mM | 1 M | Solução tamponada NaCl/NaHPO4 | |
| Suplementos para mídia completa | R-spondin 1 mídia condicionada | 5% v/v | Mídia condicionada | DMEM avançado/F-12 |
| Mídia condicionada de Noggin | 5% v/v | Mídia condicionada | DMEM avançado/F-12 | |
| EGF | 50 ng/mL | 0,5 mg/mL | PBS/0,1% BSA | |
| FGF-10 | 20 ng/mL | 100 μg/mL | PBS/0,1% BSA | |
| FGF-2 | 5 ng/mL | 50 μg/mL | PBS/0,1% BSA | |
| Nicotinamida | 10 mM | 1 M | 1 g em 8,2 mL ddH20 | |
| N-acetil-L-cisteína | 1,25 mM | 500 mM | 40 mL ddH20 | |
| Um 83-01 | 0,5 μM | 50 mM | DMSO | |
| SB202190 | 10 μM | 50 mM | DMSO | |
| Y27632 | 10 μM | 100 mM | ddH20 | |
| Aditivo B-27 | 1X | 50x | ||
| Prostaglandina E2 | 1 μM | 10 mM | DMSO | |
| Primocina | 100 μg/mL | 50mg/mL | ||
Tabela 1: Suplementos usados para mídia basal e organoide completa
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Discussion
Embora os protocolos organoides 3D derivados do tecido do câncer de bexiga ainda estejam em sua infância, eles são uma área de pesquisa ativa e investigação clínica. Aqui, um protocolo otimizado para estabelecer com sucesso PDOs de câncer de bexiga adequados para amostras de NMIBC e MIBC é detalhado. Este fluxo de trabalho se integra paralelamente a ensaios clínicos hospitalares e considera o acúmulo de amostras de biobancos, incluindo processamento de amostras histológicas e banco de tecidos congelados frescos, o que é uma importante consideração para os gasodutos organoides clínicos. Este protocolo baseia-se nos métodos existentes e fornece uma metodologia consolidada para a construção de um pipeline de medicina de precisão organoide.
A taxa de sucesso atual deste protocolo - como outros - é de aproximadamente 70%25. Espera-se que isso melhore à medida que as técnicas de isolamento e caracterização do microambiente tumor de câncer de bexiga evoluam. Como esperado, a qualidade do espécime inicial influencia a taxa de sucesso e é um passo limitante importante. Os espécimes obtidos a partir de pacientes ingênuos da quimioterapia fornecem a maior taxa de sucesso, enquanto aqueles de pacientes que receberam quimioterapia neoadjuvante podem ter um número reduzido de células viáveis26,27. Normalmente, os espécimes de câncer de bexiga (tanto do TURBT quanto das cistectomias) fornecem uma ampla quantidade de amostras com alta celularidade tumoral. Isso permite uma geração robusta de organoides variando entre 30-100 μm dentro de um período de crescimento de 24-72 horas (dado que alguns clusters de < 40 μm são mantidos nas etapas de filtragem). É importante ressaltar que a heterogeneidade observada em amostras organoides (ou seja, formações císticas e estruturas mais densas) indica que este protocolo fornece condições adequadas para derivar populações de células tumorais heterogêneas.
Nosso protocolo otimizado pode ser realizado em material inicial limitado (como é o caso de algumas cirurgias eletivas, incluindo procedimentos TURBT ou espécimes adquiridos de pacientes em um ensaio clínico), permitindo a incorporação de múltiplas análises para maximizar o valor da amostra. Este protocolo inclui métodos para descrever etapas para crescer a cultura 2D a partir de células tumorais extrainas de interesse que podem residir em grandes tecidos insolúveis processados durante a etapa inicial de filtragem. Como outros grupos de pesquisa que sugerem o processamento de amostras dentro de 24 horas após a cirurgia28,29, observa-se que a hipóxia tecidual que ocorre dentro desse prazo não impede a geração de organoides viáveis. A otimização é necessária para determinar a densidade da semeadura celular (clusters nativos) por poço. Em nossa experiência, um número excessivo de aglomerados pode resultar em um fraco crescimento das culturas, enquanto culturas de baixa densidade visual podem levar à morte celular. Isso pode ser determinado pelo usuário empiricamente no contexto de seus volumes que podem ser diluídos dentro de um intervalo conforme necessário. Além disso, os espécimes turbt frequentemente contêm bordas queimadas devido ao processo de ressecção, que são aparentes como regiões necrosadas proeminentes. Um passo crítico é o isolamento cuidadoso do tecido tumoral macroscópico e a dissecção subsequente. Isso é primordial para a deriva de culturas viáveis e precisa ser comunicado com a equipe cirúrgica. Em alguns casos, isso pode ser uma limitação inicial ao procedimento.
Uma limitação adicional à técnica atual é a ausência do microambiente tumoral paralelo aos organoides. Um desenvolvimento necessário serão futuros sistemas de cocultura para aumentar a complexidade celular e fornecer outros componentes do microambiente tumoral (ou seja, estroma e células imunes). À medida que os organoides são definidos como estruturas auto-organizadas com a capacidade de auto-perpetuar seu crescimento, mais trabalhos serão necessários para elucidar as células-tronco de câncer discretas (como CD44 e CD49) que podem permitir a melhoria das características de crescimento in vitro 31,32,33. Estabelecer com certeza que os PDOs se originam do tecido tumoral é fundamental, pois a contribuição das células urteliais normais em análises funcionais e moleculares confundirá investigações sobre a resistência a medicamentos. Às vezes, a origem tumoral das células urotelial nos PDOs é clara devido ao uso de tecido metastático ou tumores papilares (como é o caso aqui; ver Figura 4), mas quando o tecido de origem é extirpado da mucosa da bexiga e, portanto, contém margens do urotélio benigno, é fundamental confirmar que os PDOs resultantes são compostos por células tumorais usando técnicas moleculares. Assim, são necessárias comparações imunohistoquímicas e genômicas entre os organoides estabelecidos e o tumor primário do qual foram derivados30.
Quanto às distribuições numélicas e dimensionamentos dos organoides por poço, é difícil manter a densidade uniforme de plating de organoides 3D para análise de citotoxicidade. Isso é ligeiramente mitigado pela isolação de faixas definidas usando os filtros, mas ainda é uma limitação se pequenos clusters e organoides maiores forem isolados no mesmo poço. Grandes classificadores de partículas podem mitigar esse problema, mas não estão amplamente disponíveis em laboratórios de pesquisa médica. No entanto, técnicas que medem sinais de viabilidade antes e depois do tratamento têm sido utilizadas com sucesso em organoides de câncerde bexiga 34. À medida que essa tecnologia avança, isso permitirá que os pesquisadores desenvolvam uma biblioteca de PDOs de câncer de bexiga com perfis genômicos variados e respostas farmacodinâmicas que podem ser exploradas para investigar novas terapias. Além disso, o procedimento de coleta e dissociação da amostra descrito aqui permitem preparações simultâneas para o perfil espacial do tumor, citometria de fluxo multiparamétrico e sequenciamento de RNA unicelular. Em conjunto, isso permite uma variedade diversificada de pontos finais poderosos que podem ser reunidos para explorar a heterogeneidade tumoral do paciente e a aplicabilidade de drogas como imunoterápicos.
Em resumo, descrevemos um protocolo para estabelecer e avaliar culturas de organoides de câncer de bexiga derivados do paciente 3D no advento de pontos finais de medicina de precisão. É importante notar que as etapas e notas descritas aqui são abordagens rotineiras usadas para isolar PDOs de câncer de bexiga em nosso laboratório. O meio de cultura utilizado em nosso procedimento foi originalmente descrito para células cancerígenas da próstata e agora tem sido provado ser adequado para a cultura do câncer de bexiga. É importante ressaltar que este protocolo é centralizado, adequado para uso rotineiro em laboratórios, e amplamente aplicável em todos os tipos de câncer urológico. Em combinação com fenotipagem molecular de alta fidelidade e pontos finais de resposta a medicamentos, esta técnica fornecerá uma ferramenta útil para explorar rapidamente o manejo terapêutico preciso de pacientes com câncer de bexiga.
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Disclosures
Os autores não têm conflitos de interesse.
Acknowledgments
Reconhecemos a assistência técnica do núcleo de Histologia do Instituto de Pesquisa Translacional e da Instalação de Recursos Biológicos. Esta pesquisa foi apoiada por financiamento do prêmio Da Fundação de Pesquisa Princesa Alexandra (I.V., E.D.W.), e do Programa de Tradução rápida de pesquisa aplicada do Fundo de Pesquisa Médica (MRFF) (Centre for Personalized Analysis of Cancers( CPAC); E.D.W., I.V.). O Instituto de Pesquisa Translacional recebe apoio do governo australiano.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.2 mL cryogenic vial | Corning | 430487 | |
| 1.5 mL Eppendorf tubes | Sigma-Aldrich | T9661-500EA | polypropylene single-use tube |
| 100 µM reversible strainer | STEMCELL Technologies | #27270 | |
| 100 mm Petri dish | Corning | 430167 | |
| 10x Collagenase/ Hyaluronidase | STEMCELL Technologies | #07912 | |
| 37 µM reversible strainer | STEMCELL Technologies | #27250 | |
| 37°C incubator | |||
| 37°C water bath | |||
| 50 mL falcon tube | Corning | CLS430829-500EA | |
| 6-well plate | Corning | CLS3516 | |
| 70% (w/w) ethanol | |||
| -80°C freezer | |||
| 96 well ultra low attachment plate (Black) | Sigma-Aldrich | CLS3474-24EA | |
| A 83-01 | BioScientific | 2939 | Prevents the growth-inhibitory effects of TGF-β |
| ACK lysis buffer | STEMCELL Technologies | #07850 | |
| adDMEM/F-12 | Thermo Fisher Scientific | 12634028 | Base medium |
| Animal-free recombinant EGF | Sigma-Aldrich | 518179 | Growth factor |
| Automated cell counter (TC20) | Bio-rad | 1450102 | |
| B27 additive | Gibco | 17504044 | Increases sphere-forming efficiency |
| Cell Counting Slides | Bio-rad | 1450015 | |
| Centrifuge | Eppendorf | EP022628188 | |
| Computer system | |||
| CryoStor CS10 | STEMCELL Technologies | #07930 | Cell freezing solution |
| Dispase II, powder | Thermofisher | 17105041 | To enzymatically disrupt Matrigel |
| DNAse 1 | STEMCELL Technologies | #07900 | |
| DPBS | Thermofisher | 14190144 | |
| Dry and wet ice | |||
| Esky | |||
| Farmdyne (Iodine 16g/L) | Ecolab | ||
| Formalin solution, neutral buffered, 10% | Sigma | HT501128 | Histological tissue fixative |
| Glutamax (L-alanine-L-glutamine) | Invitrogen | 35050061 | Source of nitrogen for the synthesis of proteins, nucleic acids |
| HEPES | Gibco | 15630-080 | All-purpose buffer |
| Histology cassette | ProSciTech | RCH44-W | |
| Human FGF-10 | Peprotech | 100-26-25 | Growth factor |
| Human FGF-2 | Peprotech | 100-18B-50 | Growth factor |
| Liquid nitrogen | |||
| Matrigel (Growth Factor Reduced (GFR), phenol red-free, LDEV free) | In Vitro Technologies | 356231 | Basement membrane extract (BME) |
| Mr. Frosty freezing container | ThermoFisher | 5100-0001 | cell freezing container |
| N-acetyl-L-cysteine (NAC) | Sigma | A7250 | Anti-oxidant required to protect against ROS-induced cytotoxicity |
| Nicotinamide | Sigma | N0636-100G | SIRT-1 inhibitor |
| NikonTs2U inverted microscope | Nikon | MFA510BB | |
| NIS-Elements Advanced Research | Nikon | MQS31000 | |
| Noggin conditioned media | In-house | BMP inhibitor | |
| Pipetboy acu 2 | Integra | 155000 | |
| Pipettes (p20, p100, p1000) with tips | |||
| Primocin | Jomar Bioscience | ant-pm2 | Combination of antibacterial and antifungal compounds to protect cell cultures from contaminations |
| Prostaglandin E2 (PGE2) | Tocris | 2296 | support proliferation of cells |
| Rotary tube mixer | Ratek | RSM7DC | |
| R-spondin 1 conditioned media | In-house | WNT signalling regulator | |
| SB202190 | Jomar Bioscience | s1077-25mg | Selective p38 MAP kinase inhibitor |
| Scale | |||
| Scalpel handle | Livingstone | WBLDHDL03 | |
| Scalpels, #11 blade | Medical and Surgical Requisites | EU-211-1 | |
| Serological pipettes (5, 10, 25 mL) | |||
| Specimen Waste Bags | Medical Search | SU09125X16 | |
| Urine specimen jar | |||
| Y27632 | Jomar Bioscience | s1049-10mg | Selective ROCK inhibitor. Increases survival of dissociated epithelial cells |
References
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