Summary
Les organoïdes dérivés du patient (AOP) sont un outil puissant dans la recherche translationnelle sur le cancer, reflétant à la fois l’hétérogénéité génétique et phénotypique de la maladie et la réponse aux thérapies anticancéreuses personnalisées. Ici, un protocole consolidé pour générer des AOP pour le cancer primaire de la vessie humaine en préparation de l’évaluation des analyses phénotypiques et des réponses médicamenteuses est détaillé.
Abstract
Les plateformes actuelles de tests thérapeutiques in vitro manquent de pertinence pour la physiopathologie tumorale, utilisant généralement des lignées cellulaires cancéreuses établies sous forme de cultures bidimensionnelles (2D) sur du plastique de culture tissulaire. Il existe un besoin critique de modèles plus représentatifs de la complexité tumorale capables de prédire avec précision la réponse thérapeutique et la sensibilité. Le développement de la culture ex vivo tridimensionnelle (3D) d’organoïdes dérivés de patients (PDO), dérivés de tissus tumoraux frais, vise à remédier à ces lacunes. Les cultures organoïdes peuvent être utilisées comme substituts de tumeurs parallèlement à la prise en charge clinique de routine pour éclairer les décisions thérapeutiques en identifiant les interventions efficaces potentielles et en indiquant les thérapies qui peuvent être futiles. Ici, cette procédure vise à décrire des stratégies et un protocole détaillé étape par étape pour établir des PDO pour le cancer de la vessie à partir de tissus cliniques frais et viables. Nos protocoles bien établis et optimisés sont pratiques pour mettre en place des cultures 3D pour des expériences utilisant du matériel de départ limité et diversifié directement à partir de patients ou de matériel tumoral de xénogreffe dérivé du patient (PDX). Cette procédure peut également être utilisée par la plupart des laboratoires équipés d’équipements de culture tissulaire standard. Les organoïdes générés à l’aide de ce protocole peuvent être utilisés comme substituts ex vivo pour comprendre à la fois les mécanismes moléculaires qui sous-tendent la pathologie urologique du cancer et pour évaluer les traitements afin d’éclairer la prise en charge clinique.
Introduction
Le cancer de la vessie est le cancer des voies urinaires le plus répandu et la dixième tumeur maligne humaine la plus courante dans le monde1. Il englobe un spectre génétiquement diversifié et phénotypiquement complexe de la maladie2. Les formes urothéliales non invasives de cancer de la vessie (NMIBC) sont les diagnostics de cancer de la vessie les plus courants (70 % à 80 %), et ces cancers présentent une hétérogénéité biologique considérable et des résultats cliniques variables 2,3,4. Les patients atteints de NMIBC présentent généralement un risque élevé de récidive de la maladie (50-70%) et un tiers des cancers progresseront et se développeront en un cancer de la vessie invasif musculaire (MIBC) significativement plus agressif2. Bien que les taux de survie à 5 ans pour NMIBC soient élevés (>90%), ces patients doivent subir une prise en charge clinique à long terme5. D’autre part, le MIBC localement avancé (non résécable) ou métastatique est généralement considéré comme incurable6. Par conséquent, le cancer de la vessie a l’un des coûts de traitement à vie les plus élevés dans les soins contre le cancer et représente un fardeau important pour l’individu et le système de santé 3,7. Les aberrations génétiques sous-jacentes dans la maladie avancée font de la prise en charge thérapeutique du cancer de la vessie un défi clinique, et les options thérapeutiques pour les tumeurs urothéliales invasives ne se sont améliorées que récemment depuis l’approbation des immunothérapies pour le NMIBC 8,9 avancé et à haut risque. Actuellement, la prise de décision clinique a été guidée par des caractéristiques cliniques et histopathologiques conventionnelles, malgré les tumeurs individuelles du cancer de la vessie montrant de grandes différences dans l’agressivité de la maladie et la réponse au traitement10. Il est urgent d’accélérer la recherche sur des modèles cliniquement utiles pour améliorer la prédiction du pronostic individuel des patients et l’identification de traitements efficaces.
Les organoïdes tridimensionnels (3D) présentent un grand potentiel en tant que modèles tumoraux en raison de leur capacité à auto-organiser et à récapituler l’architecture in vivo intrinsèque et le profil pharmacogénomique de la tumeur d’origine, et de leur capacité à refléter la fonctionnalité cellulaire native du tissu d’origine à partir duquel ils ont été dérivés 11,12,13 . Bien que les lignées cellulaires établies de cancer de la vessie soient facilement disponibles, relativement rentables, évolutives et simples à manipuler, les lignées cellulaires in vitro ne parviennent en grande partie pas à imiter le spectre de diverses altérations génétiques et épigénétiques observées dans les cancers cliniques de la vessie 12,14 et ont toutes été établies et maintenues dans des conditions de culture adhérente 2D. De plus, les lignées cellulaires dérivées de tumeurs primaires et métastatiques de la vessie présentent une divergence génétique importante par rapport au matériel tumoral d’origine. 8,15.
Une autre approche consiste à utiliser des modèles murins génétiquement modifiés et cancérigènes. Cependant, bien que ces modèles récapitulent certaines des cascades oncogènes naturelles impliquées dans la néoplasie humaine (examinées dans les refs 16,17,18), ils manquent d’hétérogénéité tumorale, sont coûteux, représentent mal le cancer de la vessie invasif et métastatique et ne sont pas viables pour les tests de dépistage rapide des médicaments à terme, car les tumeurs peuvent prendre plusieurs mois à se développer 14,19 . Les modèles de cancer dérivés de patients (y compris les organoïdes, la culture cellulaire primaire reprogrammée conditionnellement et les xénogreffes) offrent des occasions inestimables de comprendre les effets du traitement médicamenteux avant le traitement clinique20. Malgré cela, peu de groupes utilisent systématiquement ces modèles proximaux du patient en raison de l’accès limité aux tissus primaires frais du patient et de l’optimisation étendue nécessaire pour générer de manière reproductible des conditions de culture organoïdes dérivées du patient (AOP). Dans un contexte in vivo, les cellules oncogènes peuvent interagir et communiquer avec diverses compositions des constituants environnants, y compris les cellules stromales, les cellules immunitaires infiltrant les tissus et la matrice12. De même, pour les PDO développés dans un format 3D, la complexité cellulaire/matricielle peut être personnalisée pour inclure d’autres composants pertinents. Les PDO peuvent être générés rapidement et peuvent souvent être largement passés ou cryoconservés pour une utilisation ultérieure, malgré une durée de vie limitéede 21,22,23. La pharmacodynamique (c.-à-d. la réponse à un médicament) peut être évaluée à l’aide de plusieurs lectures, y compris la viabilité et la morphologie organoïdes, et la caractérisation des cibles immunohistochimiques ou des changements transcriptionnels.
Ici, les procédures pour l’établissement d’organoïdes du cancer de la vessie à partir de matériel patient collecté lors de la résection transurétrale de la tumeur de la vessie (TURBT) ou de l’ablation chirurgicale de la vessie (cystectomie radicale) sont décrites. La méthode de génération des AOP est illustrée à l’aide de matériaux et d’outils de laboratoire humides facilement disponibles. Les critères d’évaluation comprennent les changements dans les caractéristiques morphologiques et la viabilité des cellules. Ceux-ci ont été mesurés à l’aide de la microscopie à fluorescence, de tests de viabilité in vitro (intégrité métabolique et de la membrane cellulaire) et d’analyses histopathologiques. La figure 1 montre le flux de travail pour établir les AOP du cancer de la vessie humaine à partir du matériel clinique obtenu lors d’une chirurgie élective.
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Protocol
Les patients ont consenti à cette étude après leur admission sous l’équipe d’urologie de l’hôpital Princess Alexandra, à Brisbane, en Australie. Cette étude a été réalisée conformément aux principes de la Déclaration d’Helsinki et dans le cadre des directives éthiques et institutionnelles (numéro d’éthique HREC/05/QPAH/95, QUT 1000001165).
REMARQUE : Comme critère d’admissibilité, les patients étaient âgés de ≥ 18 ans atteints d’un cancer et étaient capables de comprendre et de donner leur consentement. Ceux qui n’étaient pas en mesure de donner leur consentement éclairé ont été exclus. Ceux qui avaient une langue principale autre que l’anglais ont été exclus car la mise à disposition d’interprètes n’était pas possible pour des raisons logistiques et budgétaires. Ont également été exclus les patients dont les tumeurs n’étaient pas accessibles à la biopsie ou peu susceptibles d’être disponibles en quantité suffisante après une pathologie de routine.
1. Préparation du milieu organoïde
REMARQUE : Le milieu organoïde du cancer de la vessie humaine nécessite des facteurs de croissance qui contribuent à la survie, à la croissance et à l’expansion continue des organoïdes dérivés de matériel clinique dissocié (tableau 1). Pour plus de détails sur chaque supplément utilisé dans cette procédure, veuillez vous référer à la Table des matériaux.
- Décongeler les ingrédients congelés sur de la glace ou au réfrigérateur à 2-8 °C. Évitez les cycles répétés de congélation/décongélation et travaillez à partir d’aliquotes congelées (entreposées à -20 °C).
- Milieu basal : Préparez le milieu basal en complétant le Milieu Eagle Modifié de Dulbecco avancé/F-12 de Ham (adDMEM/F12) avec du HEPES (10 mM) et de la glutamine (2 mM). Ceci est également utilisé comme moyen de transport, et pendant les étapes de lavage organoïde.
REMARQUE: Le DMEM / F-12 avancé est utilisé comme milieu basal pour aider à l’expansion des organoïdes en présence de sérum limité; cependant, il nécessite une supplémentation en HEPES et en L-glutamine. - Centrifugez brièvement le facteur de croissance des fibroblastes 10 (FGF-10), le facteur de croissance des fibroblastes 2 (FGF-2), le facteur de croissance épithélial (EGF), SB202190, la prostaglandine E2 (PGE2) et A 83-01 avant de s’ouvrir pour s’assurer que les composants sont au fond du flacon.
- Milieu organoïde complet : Compléter le milieu basal avec des milieux humains conditionnés par la noggin et la R-spondine 1 à une concentration finale de 5 % v/v, eGF humain (50 ng/mL), FGF-2 humain (5 ng/mL), FGF-10 humain (20 ng/mL), A 83-01 (500 nM), SB202190 (10 μM), B27 (1x), nicotinamide (10 mM), N-acétylcystéine (1,25 mM), Y-27632 (10 μM), PGE2 (1 μM) et une formation antibiotique à large spectre à la concentration indiquée par le fabricant.
- Conservez les milieux organoïdes à 4 °C dans l’obscurité et utilisez-les dans les 2 semaines (1 mois au maximum). Ne pas congeler. Évitez l’exposition prolongée aux sources lumineuses.
REMARQUE: Le milieu organoïde est préparé sans sérum; toutefois, le sérum et la pénicilline/streptomycine pourraient être complétés d’utilisateur à utilisateur au besoin.
2. Un jour avant la procédure décrite au point 3
- Membrane basale réduite du facteur de croissance du dégel (EMB; voir tableau des matériaux) pendant au moins 12 h avant utilisation dans un réfrigérateur ou une chambre froide à 4 °C. Au besoin, distribuer le BME dans des aliquotes de 1 mL dans un tube à usage unique en polypropylène de 1,5 mL pour éviter les cycles de gel-dégel.
- Placez les embouts de pipette filtrés dans un réfrigérateur à 4 °C ou une chambre froide.
REMARQUE: Cette section fait référence aux embouts de pipette qui seront utilisés lors de la manipulation de BME pour prévenir la polymérisation prématurée et réduire le revêtement de BME sur la surface des embouts. - Stériliser tout l’équipement chirurgical requis pour la procédure.
3. Génération d’organoïdes tumoraux de la vessie
REMARQUE: Il s’agit d’une première étape pour l’établissement de l’AOP à partir de tumeurs de patients primaires. Cette procédure est adaptée aux tissus cancéreux de la vessie à partir des méthodes établies par Gao et al.24.
- Utilisez une hotte à risque biologique de classe II pour préparer l’échantillon. Récupérez la glace sèche et humide et imprimez la feuille de traitement de l’échantillon du patient (dossier supplémentaire).
- Appelez le personnel de recherche à la salle d’opération lorsque la résection chirurgicale est presque terminée.
REMARQUE : Confirmez que le patient répond aux critères d’admissibilité et qu’il a signé le formulaire de consentement du participant. Les tissus ne sont fournis pour la recherche que s’ils sont excédentaires par rapport aux besoins de l’évaluation histopathologique clinique. - Prélever un échantillon de tumeur fraîchement macroscopiquement viable de la chirurgie. S’assurer que l’échantillon est immergé dans un milieu de transport (soit 1x adDMEM/F12 ou 1x solution saline tamponnée au phosphate (DPBS) de Dulbecco) dans un tube conique stérile de 50 mL ou un pot d’échantillon d’urine pendant le transport.
REMARQUE: Dans certains centres cliniques, les tissus peuvent devoir être transportés vers un laboratoire de pathologie pour être affectés à la recherche. Dans ces circonstances, il est recommandé d’ajouter des antibiotiques et des antimycotiques au milieu de transport. Les tissus peuvent être conservés à 4 °C dans un milieu basal jusqu’à 24 heures après la chirurgie tout en générant des cultures organoïdes viables. - Enregistrer les détails de l’échantillon, y compris le poids des tissus (g ou mg), la description de l’échantillon et les détails concernant les échantillons de sang et d’urine sur la feuille de traitement de l’échantillon du patient (dossier supplémentaire).
- Retirez soigneusement le milieu de transport et remplacez-le par 10 mL de milieu basal. Laissez le tissu tumoral se déposer par gravité.
NOTE: Le milieu de transport est considéré comme un déchet clinique et doit être collecté dans un conteneur à déchets étiqueté de manière appropriée dans une quantité appropriée de solution de décontamination. Une fois que le liquide a été décontaminé chimiquement, il peut être éliminé conformément aux directives institutionnelles pour les déchets dangereux. - Retirez le tissu tumoral avec une pince et placez-le dans une boîte de Petri stérile de 90 mm (Figure 2A). Enregistrer le poids du tissu en mg ou g sur la feuille de traitement de l’échantillon clinique et la grille de dissection (figure 2B).
- Enlever les tissus non cancéreux (y compris les tissus adipeux) et les régions nécrotiques macroscopiquement visibles à l’aide d’une pince stérile et d’une lame de scalpel jetable montée sur le manche du scalpel (Figure 2C). Lavez les morceaux de tumeur 1-2 fois avec du DPBS froid. Collectez les morceaux de tumeur et transférez-les dans une nouvelle boîte de Petri stérile de 90 mm.
REMARQUE: Comme les lames de scalpel sont tranchantes, soyez prudent lorsque vous coupez manuellement. Le tissu adipeux adjacent à la tumeur peut être identifié par des zones distinctement molles, gélatineuses et pâles immédiatement adjacentes au périmètre visuel de la tumeur. Le tissu adipeux macroscopique et les régions focalement sombres représentant des zones de nécrose nécessiteront un jugement personnel lors de la dissection d’une biopsie excisionnelle de la tumeur de la vessie. - Prenez une photo, dessinez un diagramme de tissu et planifiez la dissection tissulaire sur une grille de traitement clinique (Figure 2B et Figure 2C).
REMARQUE: Il est important de conserver un enregistrement visuel et un croquis approximatif des caractéristiques et de la dissection individuelles de la tumeur macroscopique pour chaque cas spécifique. - Disséquer des morceaux de tissu tumoral et allouer pour des analyses histopathologiques (Figure 2D) et moléculaires (Figure 2E).
- Pour les analyses histologiques : Placer environ 50 mg de tissu tumoral dans une cassette d’histologie en plastique jetable étiquetée (Figure 2D). Immergez la cassette d’histologie dans un récipient avec un volume de 5x à 10x de formol tamponné neutre (NBF) à 10%. Incuber pendant la nuit à RT.
- Retirer 10 % de FBN et remplacer par de l’éthanol à 70 % (p/p) le lendemain pour le stockage à 4 °C jusqu’à ce que les tissus puissent être traités à l’aide d’un protocole de traitement des tissus de routine.
- Pour les analyses moléculaires : Congeler au moins un morceau tumoral de 1 à3 mm 3 dans un cryovial de 1,5 mL sans RNase/DNase à l’aide d’azote liquide et stocker à -80 °C (Figure 2E).
- Distribuer 5 mL de milieu organoïde (tableau 1) dans la boîte de Petri de 90 mm contenant le(s) morceau(x) tumoral(s) restant(s).
- Hacher mécaniquement le tissu aussi finement que possible (0,5-1 mm3 pièces ou moins) avec une lame de scalpel stérile #10.
REMARQUE: Des fragments plus gros ou des morceaux entiers de tissu (>3 mm3) prendront beaucoup plus de temps à digérer et diminueront la viabilité de l’échantillon. Omettez l’étape ci-dessus si le tissu est désagrégé et que les fragments sont suffisamment petits pour être pipetés avec une pointe de pipette sérologique de 5 mL. - Transférer le tissu finement haché dans un tube conique de 50 mL et ajouter 4 mL de milieu organoïde, 1 mL de collagène/hyaluronidase 10x et 0,1 mg/mL de désoxyribonucléase 1 (DNase 1) pour éviter l’agglutination cellulaire.
REMARQUE: La solution enzymatique doit être fraîchement préparée à chaque fois. Augmentez le volume du milieu pour qu’il soit d’environ 10 fois la quantité visible de fragments tumoraux pour les grands échantillons. - Incuber le tissu tumoral haché et la solution enzymatique pendant 1-2 h sur un agitateur orbital ou un rotateur (150 tr / min) dans un incubateur (37 ° C, 5% de CO2) pour dissocier les fragments en une suspension cellulaire et décomposer les collagènes. Cela peut être vérifié par une analyse histologique (Figure 3A).
REMARQUE: Si la quantité de tissu est importante ou si aucune dissociation évidente n’est observée après 1-1,5 h, augmentez le temps d’incubation en vérifiant le niveau de dissociation toutes les 30 minutes. Le moment de cette étape dépend de l’échantillon et doit être déterminé empiriquement à chaque fois. Une solution nettement plus claire avec des fragments de tissu indiscernables à l’œil (ou très peu de fragments) indique une digestion réussie. - Terminez la digestion avec l’ajout de 2x volume (20 mL) de milieu basal à l’échantillon.
- Centrifuger l’échantillon à 261 x g pendant 5 min à température ambiante (RT), aspirer et jeter le surnageant.
- Pour lyser les globules rouges (GR) contaminants, remettez en suspension la pastille obtenue à partir de l’étape ci-dessus dans 5 mL de tampon ammonium-chlorure-potassium (ACK). Incuber le tube à TA pendant 3 min ou jusqu’à ce que la lyse complète des globules rouges soit visible (la suspension devient claire).
REMARQUE: Si les globules rouges ne sont pas observés comme une petite touffe rouge dans la pastille, cette étape peut être omise. - Ajouter 20 mL du milieu basal dans le tube. Centrifugez le tube à 261 x g pendant 5 min à RT et aspirez le surnageant.
- À cette étape, placez une aliquote de 10 mL de milieu organoïde 2x et 1x dans un bain-marie à 37 °C pour vous réchauffer.
- Filtrer l’échantillon à travers une passoire réversible pré-humide de 100 μm dans un nouveau tube de 50 mL pour éliminer les gros matériaux insolubles.
REMARQUE : Un gros matériau non digéré (>100 μm) recueilli par le filtre peut contenir des cellules d’intérêt et peut être cultivé dans une boîte de Petri de 90 mm ou une plaque de culture cellulaire à 6 puits en milieu organoïde pour dériver des cultures 2D (Figure 1 (étape 5) et Figure 3B). - Filtrer l’éluat à l’aide d’une passoire réversible pré-humide de 37 μm pour recueillir des cellules individuelles et de petits amas pour l’isolement des cellules individuelles et immunitaires (tube 37-1; Figure 1 (étape 6) et Figure 3B).
REMARQUE: Le rendement des cellules tumorales au cours de cette étape peut être augmenté en passant à nouveau la suspension cellulaire filtrée à travers la passoire. - Inverser la passoire de 37 μm et utiliser 10 mL de milieu basal pour recueillir des grappes de petite et moyenne taille (37-100 μm) (tube 70-1; Figure 3B).
- Rechargez chacun des nouveaux tubes de 50 mL (tubes 70-1 et 37-1) avec DPBS à 40 mL. Centrifuger la suspension à 261 x g pendant 5 min à RT. Aspirer et jeter le surnageant.
- Ajouter 10 mL de milieu basal au tube 37-1 et compter les cellules à l’aide d’un colorant d’exclusion bleu trypan et d’un compteur de cellules automatisé (selon les spécifications du fabricant). Déterminer le nombre de cellules et la viabilité des cellules.
- Centrifuger le reste de l’échantillon à 261 x g pendant 5 min à TA. Aspirer le milieu et le remplacer par une solution de congélation cellulaire ou un milieu basal contenant 10 % de sérum fœtal bovin (FBS), 1 % de pénicilline/streptomycine et 10 % de diméthylsulfoxyde (DMSO).
- Placer les échantillons dans des cryoviales de 1,5 mL et les conserver dans un récipient de congélation cellulaire. Transférer immédiatement le récipient dans un congélateur à -80 °C pour un taux de refroidissement optimal. Après un stockage de nuit au congélateur à -80 °C, transférer les cryoviaux dans un stockage cryogénique en phase liquide ou en phase d’air (-196 °C) pour un stockage à long terme.
- Remettre en suspension les cellules du tube 70-1 avec 500 μL de milieu organoïde 2x préchauffé.
REMARQUE: La densité d’ensemencement doit être élevée pour une propagation organoïde réussie. Le volume du milieu organoïde et, par la suite, de l’EMB doit être modifié empiriquement en fonction du nombre de cellules isolées de l’étape de filtration. Cette étape fournit un point de départ pertinent basé sur des études dans notre laboratoire. - Ajouter le BME aux cellules (à un rapport de 1:1 avec 2x milieu organoïde) avec des embouts de pipette filtrante stérile P1000 glacés et mélanger doucement pour suspendre les cellules. Pipeter rapidement et soigneusement 100 μL de cellules reconstituées / mélange BME dans des puits d’une plaque à fond plat à très faible fixation de 96 puits. Placer la plaque de 96 puits dans un incubateur (37 °C, 5 % de CO2) pendant 20 à 30 min pour se solidifier.
- Ajouter un rapport de 1:2 de 1x milieu organoïde sur la suspension de cellules BME en fonction du volume évalué empiriquement. Dans le point de départ pertinent, ajouter 50 μL de milieu organoïde 1x en plus de 100 μL de mélange cellules reconstituées/BME.
- Placer la plaque de 96 puits dans un incubateur (37 °C, 5 % de CO2) pendant 20 min pour équilibrer.
- Sortez la plaque de culture cellulaire de l’incubateur et assemblez-la sur un porte-spécimen sur la scène d’un microscope. Évaluez visuellement les organoïdes dans des paramètres de contraste de phase ou de champ lumineux.
REMARQUE: Les images sont mieux acquises par un microscope à contraste de phase inversé équipé d’une optique d’interférence différentielle (DIC), d’un appareil photo numérique et d’un logiciel associé pour observer la formation de PDO sphériques en préparation de l’analyse des points de terminaison.- Si des amas distincts sont visibles, placez la plaque de culture cellulaire dans une chambre de microscope chauffée électroniquement sur scène (37 °C, 5 % de CO2) pour l’imagerie des cellules vivantes au cours des 24 à 72 premières heures.
- Assurez-vous que le collier chauffant flexible est fixé à la lentille pour réduire la dérive thermique et que l’humidificateur est rempli de dH2O.
- Effectuez l’imagerie initiale à l’aide d’un objectif 4x ou 10x (N.A. 0,30, L.D. 15,2 mm). Time-lapse toutes les 5-10 minutes sur le réglage de contraste de phase.
- Vérifiez l’isolement réussi caractérisé par l’apparition d’organoïdes auto-organisés >10 par puits après une période de 24 à 72 heures.
- Permettre aux cultures de se poursuivre jusqu’à deux semaines si le nombre d’organoïdes est faible (figure 3C).
- Rechargez le milieu tous les 2-3 jours en utilisant 50 μL de milieu organoïde préchauffé pour reconstituer les facteurs de croissance épuisés et le volume global.
- Acquérir des images (comme décrit à l’étape 3.30) les jours 1, 2 et 3 (séries time-lapse) et les jours 5, 7 et 10 avant le passage (le cas échéant).
REMARQUE: Les organoïdes (observés comme des structures généralement rondes où vous ne pouvez pas voir les bords des cellules individuelles) sont généralement passés 7 à 10 jours après la configuration, en fonction du succès de l’isolement. Avant ou après le passage, les organoïdes peuvent être traités avec des cytotoxiques ou des agents thérapeutiques jusqu’à 6 jours et la réponse médicamenteuse mesurée à l’aide de tests de viabilité cellulaire et de cytotoxicité. Alternativement, les organoïdes peuvent être prélevés dans le BME (à l’aide de 1 mg/mL de dispase) et cryoconservés (biobanqués), préparés pour des tests moléculaires ou incorporés et évalués histologiquement (Figure 4).
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Representative Results
Des organoïdes 3D ont été établis avec succès à partir de tissus TURBT et de cystectomie de patients atteints d’un cancer de la vessie humaine. En bref, cette technique met en évidence une formation rapide de structures multicellulaires 3D qui sont à la fois viables et adaptées à d’autres analyses de critères d’évaluation telles que l’évaluation histologique, la caractérisation moléculaire (par immunohistochimie ou PCR quantitative en temps réel) et le dépistage de médicaments. Au cours de la procédure (Figure 1), les différents éluats au cours de nos phases de filtration (Figure 1, étapes 1 à 6) ont pu être exploités pour cryoconserver des cellules individuelles pour l’isolement des cellules immunitaires infiltrant les tumeurs (TIL) et la génération d’une biobanque à cellules uniques. La procédure permet de biobanquer de multiples aspects d’une tumeur primaire hétérogène de manière appropriée et d’une manière qui peut être suivie chez les patients (Figure 2A, B), y compris l’histologie (Figure 2C, D) et les échantillons frais congelés (Figure 2E).
Une digestion de 2 h avec de la collagénase/hyaluronidase disponible dans le commerce et de la DNase 1 permet une digestion suffisante de 0,5 à 1 mm3 morceaux du tissu de biopsie de cystectomie plus complexe, y compris les cellules néoplasiques dans la lamina propria et les couches musculaires de la vessie (Figure 3A). Des fragments post-digestion plus grands (>100 microns) se sont révélés adaptés à la culture dans des plaques de culture tissulaire standard de toute taille pour l’isolement de nouvelles cultures 2D (Figure 3B). Cependant, une caractérisation moléculaire approfondie est nécessaire pour valider l’origine cancéreuse de ces lignées cellulaires. Les organoïdes qui sont générés avec succès avec ce protocole subissent des processus d’auto-assemblage dynamique, y compris des phases d’agrégation, de compactage et de formation finale, par lesquels ils se forment en structures cellulaires serrées (Figure 3C) qui peuvent être évaluées pour la réponse aux thérapies standard. La figure 3C met en évidence les propriétés d’auto-assemblage efficaces des organoïdes. Histologiquement, ces structures récapitulent la tumeur du patient d’origine (Figure 4). Les organoïdes générés dans le cadre de cette procédure conviennent à une multitude de fins, y compris la caractérisation plus poussée, la biobanque et les tests d’efficacité des médicaments (figure 5).
Figure 1 : Représentation schématique de la culture de tissu organoïde à partir de la collecte d’échantillons tumoraux de la chirurgie aux analyses finales. URN, numéro d’enregistrement de l’unité; TIL, lymphocyte infiltrant la tumeur. (1) Le tissu est haché mécaniquement dans une boîte de Pétri de 90 mm aussi finement que possible avec une lame de scalpel stérile (0,5-1 mm3 pièces). (2) Les morceaux tumoraux sont remis en suspension dans un milieu de dissociation enzymatique composé du milieu organoïde, de la collagénase/hyaluronidase et de la DNase 1. (3) Le tissu tumoral haché et la solution enzymatique sont incubés pendant 1-2 h sur un incubateur rotateur (150 tr/min, 37 °C, 5% de CO2) puis agglomérés (4) pour dissocier les fragments en une suspension cellulaire plus fine. L’échantillon subit une filtration à travers des passoires réversibles pré-humides (5) de 100 μm et (6) 37 μm dans de nouveaux tubes de 50 mL pour éliminer les gros matériaux insolubles et isoler les grappes de 37 à 100 μm. Après (7) la centrifugation de la fraction isolée de l’inverse de la passoire de 37 μm, les amas cellulaires sont suspendus dans (8) BME et milieux organoïdes avant (9) l’imagerie des cellules vivantes. Créé avec BioRender.com. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2: Manipulation du tissu tumoral stérile pour l’établissement organoïde. (A) Lors de l’excision et du transport au laboratoire, l’échantillon est placé dans une boîte de Pétri stérile, pesé et ensuite disséqué. (B) Une grille de dissection d’échantillon est utilisée pour marquer l’échantillon pour divers processus. Un exemple de dissection est montré en (C) où des échantillons sont prélevés à la périphérie de la tumeur autant que possible pour éviter les zones de nécrose centrale et annotés (encart) avant (D) grossir le tissu avant la fixation du tissu. Barre d’échelle: 6 mm. Barre d’échelle encastrée: 4 mm. (E) De petits fragments frais sont prélevés pour congélation ultérieure et biobanque. Barre d’échelle: 5 mm. Les éléments de cette image ont été créés avec BioRender.com. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Dérivation enzymatique et assemblage dynamique d’organoïdes tumoraux de la vessie. (A) Images représentatives de tissus cancéreux parentaux de la vessie colorés à l’hématoxyline et à l’éosine (H&E) (pathologie revue en T3bN0) à la fixation immédiate (à gauche) et 2 h après la digestion avec 1x collagénase / hyaluronidase (droite). Barre d’échelle: 500 μm. Barre d’échelle en médaillon : 50 μm. (B) Images représentatives des isolements >100 μm, 37-1 et 70-1 (jour 2). Les barres d’échelle sont indiquées dans l’image. (C) Des images représentatives sont montrées pour l’isolement organoïde du cancer de la vessie sur 48 h et la coloration organoïde H & E du jour 7. Barre d’échelle: 50 μm. Barre d’échelle pour l’image dans l’encart: 20 μm. DIC: contraste d’interférence différentiel. Les éléments de cette image ont été créés avec BioRender.com Veuillez cliquer ici pour agrandir cette figure.
Figure 4 : Les cultures organoïdes dérivées du cancer de la vessie maintiennent l’architecture histologique des tumeurs parentales. Image H&E représentative du cancer de la vessie de bas grade (Ta) et image correspondante en champ lumineux d’organoïde au jour 7 de la culture. Le panneau d’extrême droite montre la coloration H&E associée de l’organoïde du jour 7. Les barres d’échelle sont indiquées dans la figure. LG: bas grade, BC: cancer de la vessie, H & E: hématoxyline et éosine, et DIC: contraste d’interférence différentielle. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 5 : Applications en aval avec des organoïdes dérivés de patients atteints de cancer de la vessie. Créé avec BioRender.com. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
| Additif | Final Conc. | Stock Conc. | Solvant | |
| Milieux basaux | Glutamax | 2 mM | 1 M | NaCl |
| HEPES | 10 mM | 1 M | Solution tamponnée NaCl/NaHPO4 | |
| Suppléments pour supports complets | R-spondin 1 milieu conditionné | 5 % v/v | Supports conditionnés | DMEM/F-12 avancé |
| Milieu conditionné Noggin | 5 % v/v | Supports conditionnés | DMEM/F-12 avancé | |
| Le FEM | 50 ng/mL | 0,5 mg/mL | PBS/0,1 % BSA | |
| FGF-10 | 20 ng/mL | 100 μg/mL | PBS/0,1 % BSA | |
| FGF-2 | 5 ng/mL | 50 μg/mL | PBS/0,1 % BSA | |
| Nicotinamide | 10 mM | 1 M | 1 g dans 8,2 mL ddH20 | |
| N-acétyl-L-cystéine | 1,25 mM | 500 mM | 40 mL ddH20 | |
| A 83-01 | 0,5 μM | 50 mM | DMSO | |
| SB202190 | 10 μM | 50 mM | DMSO | |
| Y27632 | 10 μM | 100 mM | ddH20 | |
| Additif B-27 | 1X | 50x | ||
| Prostaglandine E2 | 1 μM | 10 mM | DMSO | |
| Primocine | 100 μg/mL | 50 mg/mL | ||
Tableau 1 : Suppléments utilisés pour les milieux organoïdes basaux et complets
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Discussion
Bien que les protocoles organoïdes 3D dérivés du tissu cancéreux de la vessie en soient encore à leurs balbutiements, ils constituent un domaine de recherche active et d’investigation clinique. Ici, un protocole optimisé pour établir avec succès des AOP pour le cancer de la vessie qui conviennent à la fois aux échantillons NMIBC et MIBC est détaillé. Ce flux de travail s’intègre parallèlement aux essais cliniques en milieu hospitalier et tient compte de l’accumulation d’échantillons de biobanques, y compris le traitement des échantillons histologiques et les banques de tissus frais congelés, ce qui est une considération importante pour les pipelines d’organoïdes cliniques. Ce protocole s’appuie sur les méthodes existantes et fournit une méthodologie consolidée pour construire un pipeline de médecine de précision organoïde.
Le taux de réussite actuel de ce protocole - comme d’autres - est d’environ 70%25. On s’attend à ce que cela s’améliore à mesure que les techniques d’isolement et la caractérisation du microenvironnement tumoral du cancer de la vessie évoluent. Comme prévu, la qualité de l’échantillon initial influence le taux de réussite et constitue une étape limitative importante. Les échantillons obtenus de patients naïfs de chimiothérapie offrent le taux de réussite le plus élevé, tandis que ceux de patients ayant reçu une chimiothérapie néoadjuvante peuvent avoir un nombre réduit de cellules viables26,27. En règle générale, les échantillons de cancer de la vessie (provenant à la fois de TURBT et de cystectomies) fournissent une grande quantité d’échantillons avec une cellularité tumorale élevée. Cela permet une génération robuste d’organoïdes allant de 30 à 100 μm dans une période de croissance de 24 à 72 h (étant donné que certains amas de < 40 μm sont retenus dans les étapes de filtration). Il est important de noter que l’hétérogénéité observée dans les échantillons organoïdes (c’est-à-dire les formations kystiques et les structures plus denses) indique que ce protocole fournit des conditions propices à la dérive de populations de cellules tumorales hétérogènes.
Notre protocole optimisé peut être réalisé sur du matériel de départ limité (comme c’est le cas pour certaines chirurgies électives, y compris les procédures TURBT ou les échantillons acquis auprès de patients lors d’un essai clinique), ce qui permet l’incorporation de plusieurs analyses pour maximiser la valeur de l’échantillon. Ce protocole comprend des méthodes pour décrire les étapes de culture 2D à partir de cellules tumorales étrangères d’intérêt qui peuvent résider dans de grands tissus insolubles traités au cours de l’étape de filtration initiale. Comme d’autres groupes de recherche qui suggèrent de traiter des échantillons dans les 24 heures suivant la chirurgie28,29, on observe que l’hypoxie tissulaire qui se produit dans ce délai n’empêche pas de générer des organoïdes viables. Une optimisation est nécessaire pour déterminer la densité d’ensemencement de cellules (grappes natives) par puits. D’après notre expérience, un nombre excessif de grappes peut entraîner une mauvaise croissance des cultures, tandis que les cultures à faible densité visuelle peuvent entraîner la mort cellulaire. Cela peut être déterminé empiriquement par l’utilisateur dans le contexte de ses volumes qui peuvent être dilués dans une plage si nécessaire. De plus, les échantillons de TURBT contiennent souvent des bords brûlés en raison du processus de résection, qui sont apparents comme des régions nécrotiques proéminentes. Une étape critique est l’isolement soigneux du tissu tumoral macroscopique et la dissection ultérieure. Ceci est primordial pour dériver des cultures viables et doit être communiqué avec l’équipe chirurgicale. Dans certains cas, il peut s’agir d’une limitation initiale de la procédure.
Une limitation supplémentaire à la technique actuelle est l’absence du microenvironnement tumoral parallèle aux organoïdes. Un développement nécessaire sera les futurs systèmes de co-culture pour augmenter la complexité cellulaire et fournir d’autres composants du microenvironnement tumoral (c’est-à-dire le stroma et les cellules immunitaires). Comme les organoïdes sont définis comme des structures auto-organisatrices ayant la capacité de perpétuer leur croissance, des travaux supplémentaires seront nécessaires pour élucider les cellules souches cancéreuses discrètes (telles que CD44 et CD49), ce qui pourrait permettre d’améliorer les caractéristiques de croissance in vitro 31,32,33. Il est essentiel d’établir avec certitude que les AOP proviennent du tissu tumoral, car la contribution des cellules urothéliales normales dans les analyses fonctionnelles et moléculaires confondra les recherches sur la résistance aux médicaments. Parfois, l’origine tumorale des cellules urothéliales dans les PDO est claire en raison de l’utilisation de tissu métastatique ou de tumeurs papillaires (comme c’est le cas ici; voir la figure 4), mais lorsque le tissu source est excisé de la muqueuse de la vessie et contient donc des marges de l’urothélium bénin, il est essentiel de confirmer que les PDO résultants sont constitués de cellules tumorales à l’aide de techniques moléculaires. Ainsi, des comparaisons immunohistochimiques et génomiques sont nécessaires entre les organoïdes établis et la tumeur primaire dont ils sont dérivés30.
En ce qui concerne le nombre et la distribution de taille des organoïdes par puits, il est difficile de maintenir une densité de placage uniforme des organoïdes 3D pour l’analyse de cytotoxicité. Ceci est légèrement atténué en isolant des plages définies à l’aide des filtres, mais c’est toujours une limitation si de petits amas et des organoïdes plus grands sont isolés dans le même puits. Les trieurs de grosses particules peuvent atténuer ce problème, mais ne sont pas largement disponibles dans les laboratoires de recherche médicale. Néanmoins, des techniques qui mesurent les signaux de viabilité avant et après le traitement ont été utilisées avec succès dans les organoïdes du cancer de la vessie34. Au fur et à mesure que cette technologie progressera, cela permettra aux chercheurs de développer une bibliothèque de PDO du cancer de la vessie avec des profils génomiques variés et des réponses pharmacodynamiques qui peuvent être explorées pour étudier de nouvelles thérapies. En outre, la procédure de prélèvement d’échantillons et la méthode de dissociation décrites ici permettent des préparations simultanées pour le profilage spatial tumoral, la cytométrie en flux multiparamétrique et le séquençage de l’ARN unicellulaire. Pris ensemble, cela permet un large éventail de critères d’évaluation puissants qui peuvent être réunis pour explorer l’hétérogénéité tumorale d’un patient et l’applicabilité de médicaments tels que les immunothérapies.
En résumé, nous décrivons un protocole pour établir et évaluer des cultures d’organoïdes 3D du cancer de la vessie dérivés de patients dans l’avènement des critères d’évaluation de la médecine de précision. Il est important de noter que les étapes et les notes décrites ici sont des approches de routine utilisées pour isoler les PDO du cancer de la vessie dans notre laboratoire. Le milieu de culture utilisé dans notre procédure a été décrit à l’origine pour les cellules cancéreuses de la prostate et il a maintenant été prouvé qu’il convient à la culture du cancer de la vessie. Il est important de noter que ce protocole est centralisé, adapté à une utilisation de routine dans les laboratoires et largement applicable à tous les types de cancer urologique. En combinaison avec le phénotypage moléculaire haute fidélité et les critères de réponse aux médicaments, cette technique fournira un outil utile pour explorer rapidement la prise en charge thérapeutique précise des patients atteints d’un cancer de la vessie.
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Disclosures
Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts.
Acknowledgments
Nous reconnaissons l’assistance technique du noyau de l’Institut de recherche translationnelle en histologie et de l’Installation de ressources biologiques. Cette recherche a été financée par une bourse de la Princess Alexandra Research Foundation (I.V., E.D.W.) et par le programme rapid de traduction en recherche appliquée du Medical Research Future Fund (MRFF) (Centre for Personalized Analysis of Cancers (CPAC; E.D.W., I.V.). Le Translational Research Institute reçoit le soutien du gouvernement australien.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.2 mL cryogenic vial | Corning | 430487 | |
| 1.5 mL Eppendorf tubes | Sigma-Aldrich | T9661-500EA | polypropylene single-use tube |
| 100 µM reversible strainer | STEMCELL Technologies | #27270 | |
| 100 mm Petri dish | Corning | 430167 | |
| 10x Collagenase/ Hyaluronidase | STEMCELL Technologies | #07912 | |
| 37 µM reversible strainer | STEMCELL Technologies | #27250 | |
| 37°C incubator | |||
| 37°C water bath | |||
| 50 mL falcon tube | Corning | CLS430829-500EA | |
| 6-well plate | Corning | CLS3516 | |
| 70% (w/w) ethanol | |||
| -80°C freezer | |||
| 96 well ultra low attachment plate (Black) | Sigma-Aldrich | CLS3474-24EA | |
| A 83-01 | BioScientific | 2939 | Prevents the growth-inhibitory effects of TGF-β |
| ACK lysis buffer | STEMCELL Technologies | #07850 | |
| adDMEM/F-12 | Thermo Fisher Scientific | 12634028 | Base medium |
| Animal-free recombinant EGF | Sigma-Aldrich | 518179 | Growth factor |
| Automated cell counter (TC20) | Bio-rad | 1450102 | |
| B27 additive | Gibco | 17504044 | Increases sphere-forming efficiency |
| Cell Counting Slides | Bio-rad | 1450015 | |
| Centrifuge | Eppendorf | EP022628188 | |
| Computer system | |||
| CryoStor CS10 | STEMCELL Technologies | #07930 | Cell freezing solution |
| Dispase II, powder | Thermofisher | 17105041 | To enzymatically disrupt Matrigel |
| DNAse 1 | STEMCELL Technologies | #07900 | |
| DPBS | Thermofisher | 14190144 | |
| Dry and wet ice | |||
| Esky | |||
| Farmdyne (Iodine 16g/L) | Ecolab | ||
| Formalin solution, neutral buffered, 10% | Sigma | HT501128 | Histological tissue fixative |
| Glutamax (L-alanine-L-glutamine) | Invitrogen | 35050061 | Source of nitrogen for the synthesis of proteins, nucleic acids |
| HEPES | Gibco | 15630-080 | All-purpose buffer |
| Histology cassette | ProSciTech | RCH44-W | |
| Human FGF-10 | Peprotech | 100-26-25 | Growth factor |
| Human FGF-2 | Peprotech | 100-18B-50 | Growth factor |
| Liquid nitrogen | |||
| Matrigel (Growth Factor Reduced (GFR), phenol red-free, LDEV free) | In Vitro Technologies | 356231 | Basement membrane extract (BME) |
| Mr. Frosty freezing container | ThermoFisher | 5100-0001 | cell freezing container |
| N-acetyl-L-cysteine (NAC) | Sigma | A7250 | Anti-oxidant required to protect against ROS-induced cytotoxicity |
| Nicotinamide | Sigma | N0636-100G | SIRT-1 inhibitor |
| NikonTs2U inverted microscope | Nikon | MFA510BB | |
| NIS-Elements Advanced Research | Nikon | MQS31000 | |
| Noggin conditioned media | In-house | BMP inhibitor | |
| Pipetboy acu 2 | Integra | 155000 | |
| Pipettes (p20, p100, p1000) with tips | |||
| Primocin | Jomar Bioscience | ant-pm2 | Combination of antibacterial and antifungal compounds to protect cell cultures from contaminations |
| Prostaglandin E2 (PGE2) | Tocris | 2296 | support proliferation of cells |
| Rotary tube mixer | Ratek | RSM7DC | |
| R-spondin 1 conditioned media | In-house | WNT signalling regulator | |
| SB202190 | Jomar Bioscience | s1077-25mg | Selective p38 MAP kinase inhibitor |
| Scale | |||
| Scalpel handle | Livingstone | WBLDHDL03 | |
| Scalpels, #11 blade | Medical and Surgical Requisites | EU-211-1 | |
| Serological pipettes (5, 10, 25 mL) | |||
| Specimen Waste Bags | Medical Search | SU09125X16 | |
| Urine specimen jar | |||
| Y27632 | Jomar Bioscience | s1049-10mg | Selective ROCK inhibitor. Increases survival of dissociated epithelial cells |
References
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