Summary
Органоиды, полученные от пациентов (PDO), являются мощным инструментом в трансляционных исследованиях рака, отражая как генетическую, так и фенотипическую гетерогенность заболевания и реакцию на персонализированную противораковую терапию. Здесь подробно описан консолидированный протокол для генерации первичных PDO рака мочевого пузыря человека в рамках подготовки к оценке фенотипических анализов и ответов на лекарства.
Abstract
Современные платформы терапевтического тестирования in vitro не имеют отношения к патофизиологии опухолей, обычно используя линии раковых клеток, установленные как двумерные (2D) культуры на пластике тканевых культур. Существует острая потребность в более репрезентативных моделях сложности опухоли, которые могут точно предсказать терапевтический ответ и чувствительность. Разработка трехмерной (3D) культуры ex vivo органоидов пациента (PDO), полученных из свежих опухолевых тканей, направлена на устранение этих недостатков. Органоидные культуры могут использоваться в качестве суррогатов опухолей параллельно с рутинным клиническим лечением для информирования о терапевтических решениях путем выявления потенциальных эффективных вмешательств и указания методов лечения, которые могут быть бесполезными. Здесь эта процедура направлена на описание стратегий и подробного пошагового протокола для установления PDO рака мочевого пузыря из свежей, жизнеспособной клинической ткани. Наши устоявшиеся, оптимизированные протоколы практичны для создания 3D-культур для экспериментов с использованием ограниченного и разнообразного исходного материала непосредственно от пациентов или опухолевого материала ксенотрансплантата (PDX). Эта процедура также может быть использована большинством лабораторий, оснащенных стандартным оборудованием для посева тканей. Органоиды, полученные с использованием этого протокола, могут быть использованы в качестве суррогатов ex vivo для понимания как молекулярных механизмов, лежащих в основе урологической патологии рака, так и для оценки методов лечения для информирования клинического руководства.
Introduction
Рак мочевого пузыря является наиболее распространенным раком мочевыводящих путей и десятым наиболее распространенным злокачественным новообразованием человека во всем мире1. Он охватывает генетически разнообразный и фенотипически сложный спектр заболевания2. Уротелиальные немышечно-инвазивные формы рака мочевого пузыря (NMIBC) являются наиболее распространенными диагнозами рака мочевого пузыря (70%-80%), и эти виды рака демонстрируют значительную биологическую гетерогенность и переменные клинические исходы 2,3,4. Пациенты с NMIBC обычно испытывают высокий риск рецидива заболевания (50-70%), и одна треть раковых заболеваний прогрессирует и развивается в значительно более агрессивный мышечно-инвазивный рак мочевого пузыря (MIBC)2. Хотя 5-летняя выживаемость для NMIBC высока (>90%), эти пациенты должны проходить долгосрочное клиническое лечение5. С другой стороны, локально развитая (неоперабельная) или метастатическая MIBC обычно считается неизлечимой6. Следовательно, рак мочевого пузыря имеет одну из самых высоких затрат на пожизненное лечение в рамках лечения рака и является значительным бременем как для человека, так и для системы здравоохранения 3,7. Лежащие в основе генетические аберрации при прогрессирующем заболевании делают терапевтическое лечение рака мочевого пузыря клинической проблемой, а терапевтические варианты инвазивных уротелиальных опухолей только недавно улучшились с момента одобрения иммунотерапии как для прогрессирующего, так и для высокого риска NMIBC 8,9. В настоящее время принятие клинических решений руководствуется традиционными клиническими и гистопатологическими особенностями, несмотря на то, что отдельные опухоли рака мочевого пузыря демонстрируют большие различия в агрессивности заболевания и реакции на терапию10. Существует острая необходимость в ускорении исследований клинически полезных моделей для улучшения прогнозирования индивидуального прогноза пациента и определения эффективных методов лечения.
Трехмерные (3D) органоиды демонстрируют большой потенциал в качестве опухолевых моделей из-за их способности самоорганизовываться и рекапитулировать внутреннюю архитектуру in vivo и фармакогеномный профиль исходной опухоли, а также их способность отражать нативную клеточную функциональность исходной ткани, из которой они были получены 11,12,13 . Хотя установленные клеточные линии рака мочевого пузыря легко доступны, относительно экономичны, масштабируемы и просты в манипулировании, клеточные линии in vitro в значительной степени не могут имитировать спектр разнообразных генетических и эпигенетических изменений, наблюдаемых при клиническом раке мочевого пузыря12,14, и все они были установлены и поддерживались в условиях 2D, адгезивной культуры. Кроме того, клеточные линии, полученные из первичных и метастатических опухолей мочевого пузыря, имеют значительное генетическое расхождение с исходным опухолевым материалом. 8,15.
Альтернативным подходом является использование генетически модифицированных и канцерогенных моделей мышей. Однако, хотя эти модели повторяют некоторые из естественных онкогенных каскадов, участвующих в неоплазии человека (рассмотренных в ссылках 16,17,18), они не имеют гетерогенности опухоли, являются дорогостоящими, плохо представляют собой инвазивный и метастатический рак мочевого пузыря и не жизнеспособны для быстрого тестирования на наркотики, поскольку опухоли могут занять много месяцев для развития14,19 . Модели рака, полученные от пациентов (включая органоиды, условно перепрограммированные первичные клеточные культуры и ксенотрансплантаты), предоставляют бесценные возможности для понимания эффектов медикаментозного лечения до клинического лечения20. Несмотря на это, немногие группы обычно используют эти проксимальные модели пациента из-за ограниченного доступа к свежей первичной ткани пациента и обширной оптимизации, необходимой для воспроизводимого создания условий культуры органоидов пациента (PDO). В условиях in vivo онкогенные клетки могут взаимодействовать и взаимодействовать с различными композициями окружающих компонентов, включая стромальные клетки, ткани, инфильтрирующие иммунные клетки, и матрицу12. Аналогичным образом, для PDO, выращенных в 3D-формате, сложность сотовой / матричной может быть настроена для включения других соответствующих компонентов. PDO могут быть быстро сгенерированы и часто могут быть широко пройдены или криоконсервированы для последующего использования, несмотря на то, что имеют конечную продолжительность жизни 21,22,23. Фармакодинамика (т.е. реакция на лекарственное средство) может быть оценена с использованием множественных показаний, включая жизнеспособность и морфологию органоидов, а также характеристику мишеней иммуногистохимии или транскрипционных изменений.
Здесь описаны процедуры установления органоидов рака мочевого пузыря из материала пациента, собранного из трансуретральной резекции опухоли мочевого пузыря (TURBT) или хирургического удаления мочевого пузыря (радикальная цистэктомия). Метод создания PDO проиллюстрирован с использованием легкодоступных влажных лабораторных материалов и инструментов. Конечные точки включают изменения в морфологических характеристиках и жизнеспособности клеток. Они были измерены с использованием флуоресцентной микроскопии, анализов жизнеспособности in vitro (метаболической и целостности клеточных мембран) и гистопатологического анализа. На рисунке 1 показан рабочий процесс установления PDO рака мочевого пузыря человека из клинического материала, полученного во время плановой хирургии.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Пациенты согласились на это исследование после их поступления в группу урологов в больнице принцессы Александры, Брисбен, Австралия. Данное исследование проводилось в соответствии с принципами Хельсинкской декларации и в рамках этических и институциональных руководящих принципов (этический номер HREC/05/QPAH/95, QUT 1000001165).
ПРИМЕЧАНИЕ: В качестве критерия приемлемости пациенты были в возрасте ≥ 18 лет с раком и могли понять и предоставить согласие. Те, кто не смог дать информированное согласие, были исключены. Те, у кого был основной язык, отличный от английского, были исключены, поскольку предоставление устных переводчиков было невозможно из-за материально-технических и бюджетных соображений. Также были исключены пациенты, опухоли которых были недоступны для биопсии или вряд ли были доступны в достаточном количестве после рутинной патологии.
1. Подготовка органоидной среды
ПРИМЕЧАНИЕ: Органоидная среда рака мочевого пузыря человека требует факторов роста, которые помогают в выживании, росте и непрерывном расширении органоидов, полученных из диссоциированного клинического материала (таблица 1). Для получения полной информации о каждой добавке, используемой в этой процедуре, пожалуйста, обратитесь к Таблице материалов.
- Разморозьте замороженные ингредиенты на льду или в холодильнике при 2-8 °C. Избегайте повторяющихся циклов замораживания/оттаивания и работайте с замороженными аликвотами (хранятся при -20 °C).
- Базальная среда: Подготовьте базальную среду, дополнив усовершенствованный модифицированный орлиный медиум Dulbecco/Ham's F-12 (adDMEM/F12) HEPES (10 мМ) и глютамин (2 мМ). Это также используется как транспортная среда, так и во время этапов органоидного промывания.
ПРИМЕЧАНИЕ: Усовершенствованный DMEM/F-12 используется в качестве базальной среды для помощи в расширении органоидов в присутствии ограниченной сыворотки; однако он требует добавок с HEPES и L-глютамином. - Кратко центрифугируйте фактор роста фибробластов 10 (FGF-10), фактор роста фибробластов 2 (FGF-2), эпителиальный фактор роста (EGF), SB202190, простагландин E2 (PGE2) и A 83-01 перед открытием, чтобы убедиться, что компоненты находятся на дне флакона.
- Полная органоидная среда: Дополните базальную среду человеческими ноггин- и R-спондин-кондиционированными средами в конечной концентрации 5% v/v, человеческим EGF (50 нг/мл), человеческим FGF-2 (5 нг/мл), человеческим FGF-10 (20 нг/мл), A 83-01 (500 нМ), SB202190 (10 мкМ), B27 (1x), никотинамидом (10 мМ), N-ацетилцистеином (1,25 мМ), Y-27632 (10 мкМ), PGE2 (1 мкМ) и образованием антибиотиков широкого спектра действия в концентрации, указанной производителем.
- Храните органоидные среды при 4 °C в темноте и используйте их в течение 2 недель (не более 1 месяца). Не замораживать. Избегайте длительного воздействия источников света.
ПРИМЕЧАНИЕ: Органоидная среда готовится без сыворотки; однако сыворотка и пенициллин/стрептомицин могут быть дополнены на основе взаимодействия между пользователями по мере необходимости.
2. За день до процедуры, описанной в 3
- Фактор роста оттаивания снижает базальную мембрану (BME; см. Таблицу материалов) в течение ночи в течение не менее 12 ч перед использованием в холодильнике с температурой 4 °C или в холодильной камере. При необходимости дозируйте BME в 1 мл аликвот в одноразовой полипропиленовой трубке объемом 1,5 мл, чтобы избежать циклов замораживания-оттаивания.
- Поместите фильтрованные наконечники пипеток в холодильник с температурой 4 °C или в холодную камеру.
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот раздел относится к наконечникам пипеток, которые будут использоваться при обработке BME для предотвращения преждевременной полимеризации и уменьшения покрытия BME на поверхности наконечников. - Стерилизуйте все хирургическое оборудование, необходимое для процедуры.
3. Генерация органоидов опухоли мочевого пузыря
ПРИМЕЧАНИЕ: Это начальный этап для установления ПДО из опухолей первичного пациента. Эта процедура адаптирована для тканей рака мочевого пузыря из методов, установленных Gao et al.24.
- Используйте капюшон биологической опасности класса II для подготовки образца. Извлеките сухой и влажный лед и распечатайте лист обработки образцов пациента (дополнительный файл).
- Вызовите исследовательский персонал в операционную, когда хирургическая резекция близка к завершению.
ПРИМЕЧАНИЕ: Подтвердите, что пациент соответствует критериям приемлемости и подписал форму согласия участника. Ткань предоставляется для исследования только при превышении требований к клинической гистопатологической оценке. - Соберите свежий макроскопически жизнеспособный образец опухоли после операции. Убедитесь, что образец погружен в транспортную среду (либо 1x adDMEM/F12, либо 1x фосфатно-буферный физиологический раствор Dulbecco (DPBS)) в стерильную коническую трубку объемом 50 мл или банку для образцов мочи во время транспортировки.
ПРИМЕЧАНИЕ: В некоторых клинических центрах ткань может потребоваться транспортировать в лабораторию патологии для выделения для исследования. В этих условиях рекомендуется добавлять в транспортную среду антибиотики и антимикотики. Ткань может храниться при 4 °C в базальной среде до 24 часов после операции и по-прежнему генерировать жизнеспособные органоидные культуры. - Запишите детали образца, включая вес ткани (г или мг), описание образца и сведения о любых образцах крови и мочи в листе обработки образцов пациента (дополнительный файл).
- Осторожно удалите транспортную среду и замените ее 10 мл базальной среды. Позвольте опухолевой ткани осесть под действием силы тяжести.
ПРИМЕЧАНИЕ: Транспортная среда считается клиническими отходами и должна быть собрана в надлежащим образом маркированный контейнер для отходов в соответствующем количестве дезактивационного раствора. После того, как жидкость была химически обеззаражена, она может быть утилизирована в соответствии с институциональными руководящими принципами для опасных отходов. - Удалить опухолевую ткань щипцами и поместить ее в стерильную 90-миллиметровую чашку Петри (рисунок 2А). Запишите вес ткани в мг или г на листе обработки клинического образца и сетке рассечения (рисунок 2B).
- Удалите нераковую ткань (включая жировую ткань) и макроскопически видимые некротические области с помощью стерильных щипцов и одноразовых лезвий скальпеля, установленных на рукоятке скальпеля (рисунок 2C). Промыть опухолевые кусочки 1-2 раза холодным 1x DPBS. Соберите кусочки опухоли и перенесите их в новую стерильную 90 мм чашку Петри.
ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку лезвия скальпеля острые, будьте осторожны при ручной нарезке. Прилегающая к опухоли жировая ткань может быть идентифицирована по отчетливо мягким, желатиновым, бледным участкам, непосредственно прилегающим к визуальному периметру опухоли. Макроскопическая жировая ткань и очаговые темные области, представляющие области некроза, потребуют личного суждения при рассечении биопсии опухоли эксцизионного мочевого пузыря. - Сделайте фотографию, нарисуйте диаграмму ткани и спланируйте рассечение ткани на сетке клинической обработки (рисунок 2B и рисунок 2C).
ПРИМЕЧАНИЕ: Важно вести визуальный учет и приблизительный набросок отдельных макроскопических характеристик опухоли и рассечения для каждого конкретного случая. - Рассечение кусочков опухолевой ткани и выделение для гистопатологического (рисунок 2D) и молекулярного анализов (рисунок 2E).
- Для гистологического анализа: Поместите приблизительно 50 мг опухолевой ткани в меченую одноразовую пластиковую гистологическую кассету (рисунок 2D). Погрузите гистологическую кассету в контейнер с объемом от 5 до 10% нейтрального буферизованного формалина (NBF). Инкубируйте на ночь в RT.
- Удалить 10% NBF и заменить 70% (мас./мас.) этанолом на следующий день для хранения при 4 °C до тех пор, пока ткань не будет обработана с использованием обычного протокола обработки тканей
- Для молекулярного анализа: Заморозить по меньшей мере один кусок опухолиразмером 1-3 мм3 в криовиале без РНКазы/ДНКазы 1,5 мл с использованием жидкого азота и хранить при -80 °C (рисунок 2E).
- Дозировать 5 мл органоидной среды (таблица 1) в 90 мм чашку Петри, содержащую оставшийся опухолевый кусок (кусочки).
- Механически измельчите ткань как можно тоньше (0,5-1 мм3 штуки или меньше) стерильным лезвием скальпеля No10.
ПРИМЕЧАНИЕ: Более крупным фрагментам или целым кускам ткани (>3 мм3) потребуется значительно больше времени для переваривания и снизит жизнеспособность образца. Опустите вышеуказанный шаг, если ткань дезагрегирована и фрагменты достаточно малы, чтобы пипетку с серологическим наконечником пипетки объемом 5 мл. - Переложите мелко измельченную ткань в коническую трубку объемом 50 мл и добавьте 4 мл органоидной среды, 1 мл 10-кратной коллагеназы/гиалуронидазы и 0,1 мг/мл дезоксирибонуклеазы 1 (ДНКазы 1), чтобы избежать слипания клеток.
ПРИМЕЧАНИЕ: Раствор фермента должен быть свежеприготовлен каждый раз. Увеличьте объем среды примерно в 10 раз больше видимого количества фрагментов опухоли для больших образцов. - Инкубируют измельченную опухолевую ткань и раствор фермента в течение 1-2 ч на орбитальном шейкере или ротаторе (150 об/мин) в инкубаторе (37 °C, 5% CO2) для диссоциации фрагментов в клеточную суспензию и разрушения коллагенов. Это можно проверить с помощью гистологического анализа (рисунок 3А).
ПРИМЕЧАНИЕ: Если количество ткани велико или через 1-1,5 ч наблюдается явная диссоциация, увеличивайте время инкубации, проверяя уровень диссоциации каждые 30 мин. Сроки этого шага зависят от выборки и каждый раз должны определяться эмпирически. Заметно более прозрачный раствор с неразличимыми глазу фрагментами тканей (или очень небольшим количеством фрагментов) свидетельствует об успешном пищеварении. - Прекращают пищеварение добавлением к образцу 2x объема (20 мл) базальной среды.
- Центрифугируйте образец при 261 х г в течение 5 мин при комнатной температуре (RT), аспирируйте и выбросьте супернатант.
- Для лизирования загрязняющих эритроцитов (эритроцитов) повторно суспендируют гранулы, полученные на вышеуказанной стадии, в 5 мл аммоний-хлоридно-калийного (ACK) буфера. Инкубируйте трубку на RT в течение 3 мин или до тех пор, пока не будет виден полный лизис эритроцитов (суспензия станет прозрачной).
ПРИМЕЧАНИЕ: Если эритроциты не наблюдаются в виде небольшого красного комка в грануле, этот этап может быть опущен. - Добавьте в пробирку 20 мл базальной среды. Центрифугируйте трубку при 261 х г в течение 5 мин при РТ и аспирируйте супернатант.
- На этом этапе поместите 10 мл аликвоты 2x и 1x органоидной среды в водяную баню 37 °C для нагревания.
- Отфильтруйте образец через предварительно влажный реверсивный сетчатый фильтр 100 мкм в новую трубку объемом 50 мл для удаления крупного нерастворимого материала.
ПРИМЕЧАНИЕ: Большой непереваренный материал (>100 мкм), собранный фильтром, может содержать интересующие клетки и может быть культивирован в 90-миллиметровой чашке Петри или 6-луночной клеточной культуральной пластине в органоидной среде для получения 2D-культур (фиг.1 (этап 5) и фиг.3В). - Фильтруйте элюат через предварительно влажный обратимый сетчатый фильтр 37 мкм для сбора отдельных клеток и небольших кластеров для изоляции одноклеточных и иммунных клеток (трубка 37-1; Рисунок 1 (шаг 6) и рисунок 3B).
ПРИМЕЧАНИЕ: Выход опухолевых клеток на этом этапе может быть увеличен путем повторного пропускания фильтрованной клеточной суспензии через ситечко. - Переверните сетчатый фильтр 37 мкм и используйте 10 мл базальных сред для сбора кластеров малого и среднего размера (37-100 мкм) (трубка 70-1; Рисунок 3B).
- Доливайте каждую из новых 50 мл трубок (трубки 70-1 и 37-1) DPBS до 40 мл. Центрифугируют суспензию при 261 х г в течение 5 мин при РТ. Аспирируют и выбрасывают супернатант.
- Добавьте 10 мл базальной среды в трубку 37-1 и подсчитайте ячейки с помощью красителя трипанового синего исключения и автоматизированного счетчика клеток (в соответствии со спецификациями производителя). Определите количество клеток и жизнеспособность клеток.
- Центрифугируют оставшуюся часть образца при 261 х г в течение 5 мин при RT. Аспирируйте среду и замените ее клеточным замораживанием раствором или базальной средой, содержащей 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS), 1% пенициллина/стрептомицина и 10% диметилсульфоксида (DMSO).
- Поместите образцы в криовиалы объемом 1,5 мл и храните их в контейнере для замораживания клеток. Немедленно переложите контейнер в морозильную камеру с температурой -80 °C для оптимальной скорости охлаждения. После ночного хранения в морозильной камере при -80 °C переведите криовиалы в криогенную жидкость или хранение воздушной фазы (-196 °C) для длительного хранения.
- Повторное суспендирование клеток из трубки 70-1 с 500 мкл предварительно нагретой 2x органоидной среды.
ПРИМЕЧАНИЕ: Плотность посева должна быть высокой для успешного размножения органоидов. Объем органоидной среды и, следовательно, BME должны быть изменены эмпирически на количество клеток, выделенных из стадии фильтрации. Этот шаг обеспечивает соответствующую отправную точку, основанную на исследованиях в нашей лаборатории. - Добавьте BME к клеткам (в соотношении 1:1 с 2x органоидной средой) с помощью ледяных стерильных фильтрующих наконечников пипеток P1000 и осторожно перемешайте, чтобы суспендировать клетки. Быстро и осторожно пипетка 100 мкл восстановленных ячеек/смеси BME в скважины сверхнизкой прикрепленной плоскодонной 96-луночной пластины. Поместите 96-луночную пластину в инкубатор (37 °C, 5% CO2) на 20-30 мин для затвердевания.
- Добавьте соотношение 1:2 1x органоидной среды поверх суспензии клеток BME в зависимости от эмпирически оцененного объема. В соответствующей отправной точке добавляют 50 мкл 1x органоидной среды поверх 100 мкл восстановленных клеток/смеси BME.
- Поместите 96-луночную пластину в инкубатор (37 °C, 5% CO2) на 20 мин для уравновешивания.
- Достаньте пластинку для культивирования клеток из инкубатора и соберите ее на держателе образца на сцене микроскопа. Оцените органоиды визуально в условиях фазового контраста или яркого поля.
ПРИМЕЧАНИЕ: Изображения лучше всего получать с помощью перевернутого фазоконтрастного микроскопа, оснащенного дифференциальной интерференционной (DIC) оптикой, цифровой камерой и связанным с ней программным обеспечением для наблюдения за формированием сферических PDO при подготовке к анализу конечных точек.- Если видны отдельные кластеры, поместите пластину культуры клеток в камеру микроскопа с электронным нагревом на сцене (37 °C, 5% CO2) для визуализации живых клеток в течение первых 24-72 ч.
- Убедитесь, что гибкий нагреваемый воротник прикреплен к линзе, чтобы уменьшить тепловой дрейф, а увлажнитель заполнен dH2O.
- Выполните начальное изображение с помощью объектива 4x или 10x (N.A. 0.30, W.D. 15.2 мм). Замедленная съемка каждые 5-10 мин на фазоконтрастной установке.
- Проверьте успешность изоляции, характеризующейся появлением >10 самоорганизующихся органоидов через 24-72 ч.
- Позвольте культурам продолжаться до двух недель, если количество органоидов низкое (рисунок 3C).
- Доливайте среду каждые 2-3 дня, используя 50 мкл предварительно подогретой органоидной среды, чтобы восполнить истощенные факторы роста и общий объем.
- Получение изображений (как описано в шаге 3.30) в дни 1, 2 и 3 (покадровые ряды) и в дни 5, 7 и 10 перед прохождением (если применимо).
ПРИМЕЧАНИЕ: Органоиды (наблюдаемые как обычно круглые структуры, где вы не можете видеть края отдельных клеток) обычно проходят через 7-10 дней после установки, в зависимости от успеха изоляции. До или после пассажа органоиды можно лечить цитотоксиками или терапевтическими агентами в течение 6 дней, а реакцию на лекарство измерять с помощью анализов жизнеспособности клеток и цитотоксичности. Альтернативно, органоиды могут быть извлечены из BME (с использованием диспазы 1 мг / мл) и криоконсервированы (биобанк, подготовлены для молекулярного тестирования или внедрены и оценены гистологически (рисунок 4).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
3D-органоиды были успешно установлены из тканей TURBT и цистэктомии пациента с раком мочевого пузыря человека. Вкратце, этот метод подчеркивает быстрое формирование 3D-многоклеточных структур, которые являются жизнеспособными и подходящими для других анализов конечных точек, таких как гистологическая оценка, молекулярная характеристика (иммуногистохимия или количественная ПЦР в режиме реального времени) и скрининг лекарств. Во время процедуры (Рисунок 1) различные элюаты во время фаз фильтрации (Рисунок 1, этапы 1-6) могут быть использованы для криоконсервации отдельных клеток для выделения инфильтрирующих опухоль иммунных клеток (ТИЛ) и генерации биобанка одной клетки. Процедура позволяет соответствующим образом биобанкировать несколько аспектов гетерогенной первичной опухоли таким образом, чтобы их можно было отслеживать у пациентов (рисунок 2A, B), включая гистологию (рисунок 2C, D) и свежезамороженные образцы (рисунок 2E).
2-часовое переваривание с коммерчески доступной коллагеназой /гиалуронидазой и ДНКазой 1 позволяет обеспечить достаточное переваривание 0,5-1 мм3 кусочков более сложной ткани биопсии цистэктомии, включая опухолевые клетки в ламина проприи и мышечных слоях мочевого пузыря (рисунок 3А). Более крупные фрагменты после пищеварения (>100 мкм) оказались пригодными для культивирования в стандартных тканевых культуральных пластинах любого размера для выделения новых 2D-культур (рисунок 3B). Однако для подтверждения происхождения рака таких клеточных линий требуется обширная молекулярная характеристика. Органоиды, которые успешно генерируются с помощью этого протокола, подвергаются процессам динамической самосборки, включая фазы агрегации, уплотнения и окончательного формирования, в результате чего они формируются в плотные клеточные структуры (рисунок 3C), которые могут быть оценены для ответа на стандартную терапию. На рисунке 3C показаны эффективные свойства органоидов к самосборке. Гистологически эти структуры рекапитулируют исходную опухоль пациента (рисунок 4). Органоиды, полученные в этой процедуре, подходят для множества целей, включая дальнейшую характеристику, биобанкинг и тестирование эффективности лекарств (рисунок 5).
Рисунок 1: Схематическое изображение культуры органоидной ткани из коллекции образцов опухоли от операции до анализа конечных точек. URN, номер единицы записи; TIL, инфильтрирующий опухоль лимфоцит. (1) Ткань механически измельчается в 90 мм чашке Петри как можно тоньше стерильным лезвием скальпеля (0,5-1 мм3 штуки). (2) Опухолевые фрагменты повторно суспендируются в ферментативной диссоциационной среде, состоящей из органоидной среды, коллагеназы/гиалуронидазы и ДНКазы 1. (3) Измельченную опухолевую ткань и раствор фермента инкубируют в течение 1-2 ч на ротационном инкубаторе (150 об/мин, 37 °C, 5% CO2) и впоследствии гранулируют (4) для диссоциации фрагментов в более тонкую клеточную суспензию. Образец проходит фильтрацию через предварительно влажные обратимые (5) 100 мкм и (6) 37 мкм сетчатые фильтры в новые пробирки объемом 50 мл для удаления крупного нерастворимого материала и выделения кластеров 37-100 мкм. После (7) центрифугирования фракции, выделенной из обратной стороны 37-мкм сетчатого фильтра, клеточные кластеры суспендируют в (8) BME и органоидных средах перед (9) визуализацией живых клеток. Создано с помощью BioRender.com. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Обработка стерильной опухолевой ткани для органоидного учреждения. (А) После иссечения и транспортировки в лабораторию образец помещают в стерильную чашку Петри, взвешивают и впоследствии рассекают. (B) Для маркировки образца для различных процессов используется сетка для вскрытия образца. Пример рассечения показан в (С), где образцы берутся с периферии опухоли как можно больше, чтобы избежать областей центрального некроза и аннотируются (вставка) до (D) обнажения ткани до фиксации ткани. Шкала стержня: 6 мм. Вставка шкалы: 4 мм. (E) Небольшие свежие фрагменты берутся для последующего замораживания и биобанкинга. Шкала: 5 мм. Элементы этого образа были созданы с BioRender.com. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Ферментативное происхождение и динамическая сборка органоидов опухоли мочевого пузыря. (A) Репрезентативные изображения гематоксилина и эозина (H&E), окрашенных родительской тканью рака мочевого пузыря (патология, рассмотренная как T3bN0) при немедленной фиксации (слева) и 2 ч после пищеварения с 1x коллагеназой / гиалуронидазой (справа). Шкала: 500 мкм. Шкала вставки: 50 мкм. (B) Репрезентативные изображения изоляции >100 мкм, 37-1 и 70-1 (день 2). Шкалы указываются внутри изображения. (C) Репрезентативные изображения показаны для выделения органоидов рака мочевого пузыря в течение 48 ч и 7-го дня органоидного H&E окрашивания. Шкала: 50 мкм. Шкала для изображения во вставке: 20 мкм. DIC: дифференциальный интерференционный контраст. Элементы этого изображения были созданы с помощью BioRender.com Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: Органоидные культуры, полученные из рака мочевого пузыря, поддерживают гистологическую архитектуру родительских опухолей. Репрезентативное изображение H&E низкосортного рака мочевого пузыря (Ta) и соответствующее ярко-полевое изображение органоида на 7 день культуры. Крайняя правая панель показывает связанное с H&E окрашивание органоида 7-го дня. Шкалы обозначены на рисунке. LG: низкая степень, BC: рак мочевого пузыря, H&E: гематоксилин и эозин, и DIC: дифференциальный интерференционный контраст. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 5: Последующие применения с органоидами, полученными от рака мочевого пузыря. Создано с помощью BioRender.com. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
| Присадка | Финальный конк. | Сток Конк. | Растворитель | |
| Базальные медиа | Глутамакс | 2 мМ | 1 М | НаКл |
| ХЕПЕС | 10 мМ | 1 М | Буферизованный раствор NaCl/NaHPO4 | |
| Добавки для комплектных носителей | R-спондин 1 кондиционированный носитель | 5% v/v | Условные носители | Усовершенствованный DMEM/F-12 |
| Кондиционированные носители Noggin | 5% v/v | Условные носители | Усовершенствованный DMEM/F-12 | |
| ЭГФ | 50 нг/мл | 0,5 мг/мл | PBS/0,1% BSA | |
| ФГФ-10 | 20 нг/мл | 100 мкг/мл | PBS/0,1% BSA | |
| ФГФ-2 | 5 нг/мл | 50 мкг/мл | PBS/0,1% BSA | |
| Никотинамид | 10 мМ | 1 М | 1 г в 8,2 мл ddH20 | |
| N-ацетил-L-цистеин | 1.25 мМ | 500 мМ | 40 мл ddH20 | |
| А 83-01 | 0.5 мкМ | 50 мМ | ДМСО | |
| СБ202190 | 10 мкМ | 50 мМ | ДМСО | |
| Y27632 | 10 мкМ | 100 мМ | ддН20 | |
| Добавка Б-27 | в 1 раз | в 50 раз | ||
| Простагландин Е2 | 1 мкМ | 10 мМ | ДМСО | |
| Примоцин | 100 мкг/мл | 50мг/мл | ||
Таблица 1: Добавки, используемые для базальных и полных органоидных сред
Дополнительный файл: Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
В то время как 3D-органоидные протоколы, полученные из ткани рака мочевого пузыря, все еще находятся в зачаточном состоянии, они являются областью активных исследований и клинических исследований. Здесь подробно описан оптимизированный протокол для успешного установления PDO рака мочевого пузыря, которые подходят как для образцов NMIBC, так и для ОБРАЗЦОВ MIBC. Этот рабочий процесс параллельно интегрируется в клинические испытания в больницах и учитывает накопление образцов биобанка, включая гистологическую обработку образцов и банк свежезамороженных тканей, что является важным фактором для клинических органоидных конвейеров. Этот протокол основывается на существующих методах и обеспечивает консолидированную методологию для построения конвейера органоидной прецизионной медицины.
Текущий показатель успешности этого протокола, как и других, составляет примерно 70%25. Ожидается, что это улучшится по мере развития методов изоляции и характеристики микроокружения опухоли рака мочевого пузыря. Как и ожидалось, качество исходного образца влияет на успешность и является важным ограничивающим шагом. Образцы, полученные от наивных пациентов с химиотерапией, обеспечивают самый высокий показатель успеха, в то время как образцы от пациентов, которые получали неоадъювантную химиотерапию, могут иметь уменьшенное количество жизнеспособных клеток26,27. Как правило, образцы рака мочевого пузыря (как из TURBT, так и из цистектомии) обеспечивают достаточное количество образцов с высокой клеточностью опухоли. Это позволяет надежно генерировать органоиды в диапазоне от 30 до 100 мкм в течение периода роста 24-72 ч (учитывая, что некоторые кластеры <40 мкм сохраняются на этапах фильтрации). Важно отметить, что гетерогенность, наблюдаемая в органоидных образцах (т.е. кистозных образованиях и более плотных структурах), указывает на то, что этот протокол обеспечивает условия, подходящие для получения гетерогенных популяций опухолевых клеток.
Наш оптимизированный протокол может быть выполнен на ограниченном исходном материале (как в случае с некоторыми плановыми операциями, включая процедуры TURBT или образцы, полученные от пациентов в клиническом испытании), что позволяет включать несколько анализов для максимизации ценности образца. Этот протокол включает методы описания этапов выращивания 2D-культуры из посторонних опухолевых клеток, представляющих интерес, которые могут находиться в больших нерастворимых тканях, обработанных на начальном этапе фильтрации. Как и в других исследовательских группах, которые предлагают обрабатывать образцы в течение 24 часов после операции 28,29, наблюдается, что гипоксия тканей, которая возникает в течение этого периода времени, не препятствует генерации жизнеспособных органоидов. Оптимизация необходима для определения плотности посева ячеек (нативных кластеров) на скважину. По нашему опыту, чрезмерное количество кластеров может привести к плохому росту культур, в то время как культуры с низкой зрительной плотностью могут привести к гибели клеток. Это может быть определено пользователем эмпирически в контексте его объемов, которые могут быть разбавлены в пределах диапазона по мере необходимости. Кроме того, образцы TURBT часто содержат обожженные края из-за процесса резекции, которые проявляются как заметные некротические области. Критическим этапом является тщательное выделение макроскопической опухолевой ткани и последующее рассечение. Это имеет первостепенное значение для получения жизнеспособных культур и должно быть сообщено хирургической команде. В некоторых случаях это может быть первоначальным ограничением процедуры.
Дополнительным ограничением современной методики является отсутствие микроокружения опухоли параллельно органоидам. Необходимым развитием станут будущие кокультурные системы для увеличения клеточной сложности и обеспечения других компонентов микроокружения опухоли (т.е. стромы и иммунных клеток). Поскольку органоиды определяются как самоорганизующиеся структуры, способные самовоспроизводить свой рост, потребуется дальнейшая работа по выяснению дискретных раковых стволовых клеток (таких как CD44 и CD49), которые могут позволить улучшить характеристики роста in vitro 31,32,33. Установление с уверенностью, что PDO происходят из опухолевой ткани, имеет решающее значение, поскольку вклад нормальных уротелиальных клеток в функциональный и молекулярный анализ будет сбивать с толку исследования лекарственной устойчивости. Иногда опухолевое происхождение уротелиальных клеток в PDO ясно из-за использования метастатической ткани или папиллярных опухолей (как в данном случае; см. Рисунок 4), но когда исходная ткань иссекается из слизистой оболочки мочевого пузыря и, таким образом, содержит края доброкачественного уротелия, важно подтвердить, что полученные PDO состоят из опухолевых клеток с использованием молекулярных методов. Таким образом, необходимы иммуногистохимические и геномные сравнения между установленными органоидами и первичной опухолью, из которой они были получены30.
Что касается количества и распределения размеров органоидов на лунку, то для анализа цитотоксичности трудно поддерживать равномерную плотность покрытия 3D-органоидов. Это немного смягчается путем выделения определенных диапазонов с использованием фильтров, но это все еще ограничение, если небольшие кластеры и более крупные органоиды изолированы в одной и той же скважине. Крупные сортировщики частиц могут смягчить эту проблему, но не широко доступны в медицинских исследовательских лабораториях. Тем не менее, методы, которые измеряют сигналы жизнеспособности до и после лечения, были успешно использованы в органоидах рака мочевого пузыря34. По мере развития этой технологии это позволит исследователям разработать библиотеку PDO рака мочевого пузыря с различными геномными профилями и фармакодинамическими реакциями, которые могут быть изучены для изучения новых методов лечения. Кроме того, процедура сбора образцов и способ диссоциации, описанные в настоящем описании, позволяют одновременно проводить подготовку к пространственному профилированию опухоли, многопараметрической проточной цитометрии и секвенированию одноклеточной РНК. Взятые вместе, это позволяет создать широкий спектр мощных конечных точек, которые могут быть объединены для изучения гетерогенности опухоли пациента и применимости лекарств, таких как иммунотерапия.
Таким образом, мы описываем протокол для создания и оценки культур 3D-органоидов рака мочевого пузыря, полученных от пациента, в появлении конечных точек прецизионной медицины. Важно отметить, что шаги и примечания, описанные здесь, являются рутинными подходами, используемыми для выделения PDO рака мочевого пузыря в нашей лаборатории. Культуральная среда, используемая в нашей процедуре, была первоначально описана для клеток рака предстательной железы и теперь доказано, что она подходит для культуры рака мочевого пузыря. Важно отметить, что этот протокол централизован, подходит для рутинного использования в лабораториях и широко применим для всех типов урологического рака. В сочетании с высокоточным молекулярным фенотипированием и конечными точками лекарственного ответа этот метод обеспечит полезный инструмент для быстрого изучения точного терапевтического лечения пациентов с раком мочевого пузыря.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
У авторов нет конфликта интересов.
Acknowledgments
Мы выражаем признательность за техническую помощь Института трансляционных исследований гистологии и Фонда биологических ресурсов. Это исследование было поддержано финансированием из премии Исследовательского фонда принцессы Александры (I.V., E.D.W.) и Программы быстрого перевода прикладных исследований Фонда медицинских исследований будущего (MRFF) (Центр персонализированного анализа рака (CPAC; Е.Д.В., И.В.). Институт трансляционных исследований получает поддержку от правительства Австралии.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.2 mL cryogenic vial | Corning | 430487 | |
| 1.5 mL Eppendorf tubes | Sigma-Aldrich | T9661-500EA | polypropylene single-use tube |
| 100 µM reversible strainer | STEMCELL Technologies | #27270 | |
| 100 mm Petri dish | Corning | 430167 | |
| 10x Collagenase/ Hyaluronidase | STEMCELL Technologies | #07912 | |
| 37 µM reversible strainer | STEMCELL Technologies | #27250 | |
| 37°C incubator | |||
| 37°C water bath | |||
| 50 mL falcon tube | Corning | CLS430829-500EA | |
| 6-well plate | Corning | CLS3516 | |
| 70% (w/w) ethanol | |||
| -80°C freezer | |||
| 96 well ultra low attachment plate (Black) | Sigma-Aldrich | CLS3474-24EA | |
| A 83-01 | BioScientific | 2939 | Prevents the growth-inhibitory effects of TGF-β |
| ACK lysis buffer | STEMCELL Technologies | #07850 | |
| adDMEM/F-12 | Thermo Fisher Scientific | 12634028 | Base medium |
| Animal-free recombinant EGF | Sigma-Aldrich | 518179 | Growth factor |
| Automated cell counter (TC20) | Bio-rad | 1450102 | |
| B27 additive | Gibco | 17504044 | Increases sphere-forming efficiency |
| Cell Counting Slides | Bio-rad | 1450015 | |
| Centrifuge | Eppendorf | EP022628188 | |
| Computer system | |||
| CryoStor CS10 | STEMCELL Technologies | #07930 | Cell freezing solution |
| Dispase II, powder | Thermofisher | 17105041 | To enzymatically disrupt Matrigel |
| DNAse 1 | STEMCELL Technologies | #07900 | |
| DPBS | Thermofisher | 14190144 | |
| Dry and wet ice | |||
| Esky | |||
| Farmdyne (Iodine 16g/L) | Ecolab | ||
| Formalin solution, neutral buffered, 10% | Sigma | HT501128 | Histological tissue fixative |
| Glutamax (L-alanine-L-glutamine) | Invitrogen | 35050061 | Source of nitrogen for the synthesis of proteins, nucleic acids |
| HEPES | Gibco | 15630-080 | All-purpose buffer |
| Histology cassette | ProSciTech | RCH44-W | |
| Human FGF-10 | Peprotech | 100-26-25 | Growth factor |
| Human FGF-2 | Peprotech | 100-18B-50 | Growth factor |
| Liquid nitrogen | |||
| Matrigel (Growth Factor Reduced (GFR), phenol red-free, LDEV free) | In Vitro Technologies | 356231 | Basement membrane extract (BME) |
| Mr. Frosty freezing container | ThermoFisher | 5100-0001 | cell freezing container |
| N-acetyl-L-cysteine (NAC) | Sigma | A7250 | Anti-oxidant required to protect against ROS-induced cytotoxicity |
| Nicotinamide | Sigma | N0636-100G | SIRT-1 inhibitor |
| NikonTs2U inverted microscope | Nikon | MFA510BB | |
| NIS-Elements Advanced Research | Nikon | MQS31000 | |
| Noggin conditioned media | In-house | BMP inhibitor | |
| Pipetboy acu 2 | Integra | 155000 | |
| Pipettes (p20, p100, p1000) with tips | |||
| Primocin | Jomar Bioscience | ant-pm2 | Combination of antibacterial and antifungal compounds to protect cell cultures from contaminations |
| Prostaglandin E2 (PGE2) | Tocris | 2296 | support proliferation of cells |
| Rotary tube mixer | Ratek | RSM7DC | |
| R-spondin 1 conditioned media | In-house | WNT signalling regulator | |
| SB202190 | Jomar Bioscience | s1077-25mg | Selective p38 MAP kinase inhibitor |
| Scale | |||
| Scalpel handle | Livingstone | WBLDHDL03 | |
| Scalpels, #11 blade | Medical and Surgical Requisites | EU-211-1 | |
| Serological pipettes (5, 10, 25 mL) | |||
| Specimen Waste Bags | Medical Search | SU09125X16 | |
| Urine specimen jar | |||
| Y27632 | Jomar Bioscience | s1049-10mg | Selective ROCK inhibitor. Increases survival of dissociated epithelial cells |
References
- Saginala, K., et al.
- Lindskrog, S. V., et al. An integrated multi-omics analysis identifies prognostic molecular subtypes of non-muscle-invasive bladder cancer. Nature Communications. 12 (1), 2301 (2021).
- Isharwal, S., Konety, B. Non-muscle invasive bladder cancer risk stratification. Indian Journal of Urology. 31 (4), 289-296 (2015).
- Lozano, F., Raventos, C. X., Carrion, A., Trilla, E., Morote, J. Current status of genetic urinary biomarkers for surveillance of non-muscle invasive bladder cancer: a systematic review. BMC Urology. 20 (1), 99 (2020).
- Batista, R., et al. TERT promoter mutation as a potential predictive biomarker in bcg-treated bladder cancer patients. Internation Journal of Molecular Science. 21 (3), 947 (2020).
- Patel, V. G., Oh, W. K., Galsky, M. D. Treatment of muscle-invasive and advanced bladder cancer in 2020. Cancer Journal for Clinicians. 70 (5), 404-423 (2020).
- Williams, S. B., et al. Estimated costs and long-term outcomes of patients with high-risk non-muscle-invasive bladder cancer treated with bacillus calmette-guérin in the veterans affairs health system. JAMA Network Open. 4 (3), 213800 (2021).
- Zhu, S., et al. Preclinical models for bladder cancer research. Hematology/Oncology Clinics of North America. 35 (3), 613-632 (2021).
- lvarez-Maestro, M., Guerrero-Ramos, F., Rodríguez-Faba, O., Domínguez-Escrig, J. L., Fernández-Gómez, J. M. Current treatments for BCG failure in non-muscle invasive bladder cancer (NMIBC). Actas Urológicas Españolas (English Edition). 45 (2), 93-102 (2021).
- Berry, D. L., et al. Treatment decision making in patients with bladder cancer. Bladder Cancer. 1 (2), 151-158 (2015).
- Drost, J., et al. Organoid culture systems for prostate epithelial and cancer tissue. Nature Protocols. 11 (2), 347-358 (2016).
- Kato, M., Sasaki, T., Inoue, T. Current experimental human tissue-derived models for prostate cancer research. International Journal of Urology. 28 (2), 150-162 (2021).
- Liu, L., Yu, L., Li, Z., Li, W., Huang, W. Patient-derived organoid (PDO) platforms to facilitate clinical decision making. Journal of Translational Medicine. 19 (1), 40 (2021).
- Joshi, A., Roberts, M. J., Alinezhad, S., Williams, E. D., Vela, I. Challenges, applications and future directions of precision medicine in prostate cancer - the role of organoids and patient-derived xenografts. British Journal of Urology International. 126 (1), 65-72 (2020).
- Pan, C. X., et al. Development and characterization of bladder cancer patient-derived xenografts for molecularly guided targeted therapy. PLoS One. 10 (8), 0134346 (2015).
- Gopinathan, A., Tuveson, D. A. The use of GEM models for experimental cancer therapeutics. Disease models & mechanisms. 1 (2-3), 83-86 (2008).
- Kemp, C. J. Animal models of chemical carcinogenesis: driving breakthroughs in cancer research for 100 years. Cold Spring Harbor Protocols. 2015 (10), 865-874 (2015).
- Day, C. P., Merlino, G., Van Dyke, T. Preclinical mouse cancer models: a maze of opportunities and challenges. Cell. 163 (1), 39-53 (2015).
- Kobayashi, T., Owczarek, T. B., McKiernan, J. M., Abate-Shen, C. Modelling bladder cancer in mice: opportunities and challenges. Nature Reviews Cancer. 15 (1), 42-54 (2015).
- Liu, W., et al. Conditional reprogramming: Modeling urological cancer and translation to clinics. Clinical Translational Medicine. 10 (2), 95 (2020).
- Yoshida, G. J. Applications of patient-derived tumor xenograft models and tumor organoids. Journal of Hematological Oncology. 13 (1), 4 (2020).
- Kim, J., Koo, B. K., Knoblich, J. A. Human organoids: model systems for human biology and medicine. Nature Reviews Molecular Cellular Biology. 21 (10), 571-584 (2020).
- Marshall, L. J., Triunfol, M., Seidle, T. Patient-derived xenograft vs. organoids: a preliminary analysis of cancer research output, funding and human health impact in 2014-2019. Animals. 10 (10), 1923 (2020).
- Gao, D., et al. Organoid cultures derived from patients with advanced prostate cancer. Cell. 159 (1), 176-187 (2014).
- Lee, S. H., et al. Tumor evolution and drug response in patient-derived organoid models of bladder cancer. Cell. 173 (2), 515-528 (2018).
- Kim, I. H., Lee, H. J. Perioperative immunotherapy for muscle-invasive bladder cancer. Translational Andrology and Urology. 9 (6), 2976-2985 (2020).
- Raphael, M. J., Booth, C. M. Neoadjuvant chemotherapy for muscle-invasive bladder cancer: Underused across the 49(th) parallel. Canadian Urological Association Journal. 13 (2), 29-31 (2019).
- Tiriac, H., French, R., Lowy, A. M. Isolation and characterization of patient-derived pancreatic ductal adenocarcinoma organoid models. Journal of Visualized Experiments. (155), e60364 (2020).
- Pleguezuelos-Manzano, C., et al. Establishment and culture of human intestinal organoids derived from adult stem cells. Current Protocols in Immunology. 130 (1), 106 (2020).
- Fusco, P., et al. Patient-derived organoids (PDOs) as a novel in vitro model for neuroblastoma tumours. BMC Cancer. 19 (1), 970 (2019).
- Mullenders, J., et al. Mouse and human urothelial cancer organoids: A tool for bladder cancer research. Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (10), 4567-4574 (2019).
- Vasyutinv, I., Zerihun, L., Ivan, C., Atala, A. Bladder organoids and spheroids: potential tools for normal and diseased tissue modelling. Anticancer Research. 39 (3), 1105-1118 (2019).
- Santos, C. P., et al. Urothelial organoids originating from Cd49fhigh mouse stem cells display Notch-dependent differentiation capacity. Nature Communications. 10 (1), 4407 (2019).
- Whyard, T., Liu, J., Darras, F. S., Waltzer, W. C., Romanov, V. Organoid model of urothelial cancer: establishment and applications for bladder cancer research. Biotechniques. 69 (3), 193-199 (2020).
