Summary
환자 유래 오가노이드 (PDO)는 질병의 유전 적 및 표현형 이질성과 개인화 된 항암 요법에 대한 반응을 모두 반영하는 번역 암 연구의 강력한 도구입니다. 여기서, 표현형 분석 및 약물 반응의 평가를 위한 준비로 인간 원발성 방광암 PDOs를 생성하기 위한 통합 프로토콜이 상세히 설명된다.
Abstract
현재의 시험관내 치료 시험 플랫폼은 종양 병태생리학과의 관련성이 결여되어 있으며, 일반적으로 조직 배양 플라스틱 상에서 2차원(2D) 배양물로서 확립된 암 세포주를 채용하고 있다. 치료 반응과 민감도를 정확하게 예측할 수 있는 종양 복잡성에 대한 보다 대표적인 모델에 대한 절실한 필요성이 존재한다. 신선한 종양 조직으로부터 유래된 환자 유래 오가노이드(PDOs)의 3차원(3D) 생체외 배양의 개발은 이러한 단점을 해결하는 것을 목표로 한다. 오가노이드 배양은 일상적인 임상 관리와 병행하여 종양 대리자로 사용되어 잠재적 인 효과적인 개입을 확인하고 쓸모없는 치료법을 나타냄으로써 치료 결정을 알릴 수 있습니다. 여기에서이 절차는 신선하고 실행 가능한 임상 조직에서 방광암 PDO를 확립하기위한 전략과 상세한 단계별 프로토콜을 설명하는 것을 목표로합니다. 우리의 잘 정립되고 최적화된 프로토콜은 환자 또는 환자 유래 이종이식편(PDX) 종양 물질로부터 직접 제한적이고 다양한 출발 물질을 사용하여 실험을 위한 3D 배양물을 설정하는 데 실용적입니다. 이 절차는 표준 조직 배양 장비를 갖춘 대부분의 실험실에서도 사용할 수 있습니다. 이 프로토콜을 사용하여 생성 된 오가노이드는 비뇨기과 암 병리학을 뒷받침하는 분자 메커니즘을 이해하고 임상 관리를 알리기위한 치료법을 평가하기 위해 생체외 대리자로 사용할 수 있습니다.
Introduction
방광암은 가장 널리 퍼진 요로 암이며 전 세계적으로 10 번째로 흔한 인간 악성 종양입니다1. 그것은 유전적으로 다양하고 표현형적으로 복잡한 스펙트럼의 질병2를 포괄한다. Urothelial non-muscle-invasive form of bladder cancer (NMIBC)는 방광암 진단 (70 % -80 %)의 가장 흔한 방광암 진단이며, 이러한 암은 상당한 생물학적 이질성 및 가변 임상 결과 2,3,4를 나타냅니다. NMIBC 환자는 일반적으로 질병 재발 위험이 높으며 (50-70 %), 암의 삼분의 일은 진행되어 훨씬 더 공격적인 근육 침습성 방광암 (MIBC)2로 발전합니다. NMIBC에 대한 5년 생존율은 높지만(>90%), 이들 환자는 장기적인 임상 관리를 받아야 한다5. 한편, 국부적으로 진행된(unresectable) 또는 전이성 MIBC는 일반적으로 난치성6으로 간주된다. 결과적으로, 방광암은 암 치료 내에서 가장 높은 평생 치료 비용 중 하나를 가지며 개인 및 건강 관리 시스템 3,7 모두에게 상당한 부담입니다. 진행성 질환의 근본적인 유전 적 수차는 방광암의 치료 관리를 임상 적 도전으로 만들고, 침습성 비뇨 생식기 종양에 대한 치료 옵션은 진행성 및 고위험 NMIBC 8,9에 대한 면역 요법의 승인 이후 최근에야 개선되었습니다. 현재, 임상 의사 결정은 개별 방광암 종양이 질병 공격성 및 요법10에 대한 반응에서 큰 차이를 보임에도 불구하고 종래의 임상 및 조직병리학적 특징에 의해 유도되었다. 개별 환자의 예후 예측과 효과적인 치료법의 식별을 개선하기 위해 임상적으로 유용한 모델에 대한 연구를 가속화해야 할 긴급한 필요성이 있습니다.
3차원 (3D) 오가노이드는 원래 종양의 내재적 생체 내 구조 및 약물 게놈 프로파일을 스스로 조직하고 재구성하는 능력과 이들이 유래 된 원래 조직의 고유 한 세포 기능을 반영하는 능력으로 인해 종양 모델로서 큰 잠재력을 보여줍니다11,12,13 . 확립된 방광암 세포주는 쉽게 이용가능하고, 비교적 비용 효율적이고, 확장 가능하고, 조작하기 간단하지만, 시험관내 세포주는 임상 방광암(12,14)에서 관찰된 다양한 유전적 및 후성유전학적 변화의 스펙트럼을 모방하는 데 크게 실패하고, 모두 2D, 부착성 배양 조건 하에서 확립되고 유지되었다. 추가적으로, 원발성 및 전이성 방광 종양으로부터 유래된 세포주는 원래의 종양 물질로부터 유의한 유전적 발산을 보유한다. 8,15년.
대안적인 접근법은 유전자 조작 및 발암물질 유발 마우스 모델을 사용하는 것이다. 그러나 이러한 모델은 인간 신생물에 관여하는 자연 종양성 캐스케이드 중 일부를 재검토하지만 (refs 16,17,18에서 검토), 종양 이질성이 부족하고 비용이 많이 들며 침습성 및 전이성 방광암을 제대로 나타내지 않으며 종양이 발병하는 데 수개월이 걸릴 수 있으므로 신속한 약물 검사에는 불가능합니다14,19 . 환자 유래 암 모델(오가노이드, 조건부로 재프로그램된 일차 세포 배양물, 및 이종이식편 포함)은 임상 치료20 전에 약물 치료의 효과를 이해할 수 있는 귀중한 기회를 제공한다. 그럼에도 불구하고, 신선한 일차 환자 조직에 대한 제한된 접근과 환자 유래 오가노이드 (PDO) 배양 조건을 재현 가능하게 생성하는 데 필요한 광범위한 최적화로 인해 이러한 환자 근위 모델을 일상적으로 사용하는 그룹은 거의 없습니다. 생체내 환경에서, 발암성 세포는 기질 세포, 조직 침윤 면역 세포, 및 매트릭스(12)를 포함하는 주변 구성성분의 다양한 조성물과 상호작용하고 통신할 수 있다. 마찬가지로, 3D 포맷으로 성장한 PDO의 경우, 셀룰러/매트릭스 복잡성은 다른 관련 컴포넌트를 포함하도록 커스터마이즈될 수 있다. PDO는 신속하게 생성될 수 있고, 종종 유한한 수명(21,22,23)을 가짐에도 불구하고, 광범위하게 계대되거나 나중에 사용하기 위해 동결보존될 수 있다. 약력학(즉, 약물에 대한 반응)은 오가노이드 생존력 및 형태학, 면역조직화학 표적의 특성화 또는 전사 변화를 포함하는 다중 판독을 사용하여 평가될 수 있다.
여기에서, 방광 종양의 경요도 절제술 (TURBT) 또는 방광의 외과적 제거 (라디칼 방광 절제술)로부터 수집 된 환자 물질로부터 방광암 오가노이드를 확립하는 절차가 기술되어 있다. PDO를 생성하는 방법은 쉽게 구할 수있는 습식 실험실 재료 및 도구를 사용하여 설명됩니다. 종점은 세포 형태학적 특성 및 생존력의 변화를 포함한다. 이들은 형광 현미경, 시험관내 생존력 (대사 및 세포막 완전성) 분석, 및 조직병리학적 분석을 사용하여 측정되었다. 도 1은 선택 수술 동안 수득된 임상 물질로부터 인간 방광암 PDO를 확립하기 위한 워크플로우를 보여준다.
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Protocol
환자들은 호주 브리즈번에있는 프린세스 알렉산드라 병원 (Princess Alexandra Hospital)의 비뇨기과 팀에 입원 한 후이 연구에 동의했습니다. 이 연구는 헬싱키 선언의 원칙과 윤리적 및 제도적 지침 (윤리 번호 HREC / 05 / QPAH / 95, QUT 1000001165)에 따라 수행되었습니다.
참고 : 자격 기준으로, 환자는 암에 걸린 18 세 이≥었으며 동의를 이해하고 제공 할 수있었습니다. 정보에 입각 한 동의를 할 수없는 사람들은 제외되었습니다. 영어 이외의 기본 언어를 사용하는 사람들은 물류 및 예산 고려 사항으로 인해 통역사 제공이 불가능했기 때문에 제외되었습니다. 또한 종양이 생검에 접근 할 수 없거나 일상적인 병리학 후에 적절한 양으로 이용 가능하지 않은 환자는 제외되었습니다.
1. 오가노이드 배지 준비
참고: 인간 방광암 오가노이드 배지는 해리된 임상 물질로부터 유래된 오가노이드의 생존, 성장 및 지속적인 확장을 돕는 성장 인자를 필요로 한다(표 1). 이 절차에 사용 된 각 보충 교재에 대한 자세한 내용은 자료 표를 참조하십시오.
- 냉동 재료를 얼음이나 2-8°C의 냉장고에 녹여 버립니다. 반복되는 동결 / 해동 사이클을 피하고 냉동 분취량 (-20 °C에서 저장)에서 작업하십시오.
- 기초 배지: 고급 둘베코의 변형 이글 배지/햄의 F-12(adDMEM/F12)를 HEPES(10mM) 및 글루타민(2mM)으로 보충하여 기본 배지를 준비합니다. 이것은 또한 수송 매질로서 그리고 오가노이드 세척 단계 동안 사용된다.
참고: 고급 DMEM/F-12는 제한된 혈청이 존재할 때 오가노이드의 확장을 돕기 위해 기본 배지로 사용됩니다. 그러나 HEPES와 L- 글루타민을 보충해야합니다. - 섬유아세포 성장인자 10(FGF-10), 섬유아세포 성장인자 2(FGF-2), 상피성장인자(EGF), SB202190, 프로스타글란딘 E2(PGE2), 및 A83-01 성분이 바이알의 바닥에 있는지 확인하기 위해 간단히 원심분리한다.
- 완전한 오가노이드 배지: 최종 농도 5% v/v, 인간 EGF(50 ng/mL), 인간 FGF-2(5 ng/mL), 인간 FGF-10(20 ng/mL), A 83-01(500 nM), SB202190(10 μM), B27(1x), 니코틴아미드(10 mM), N-아세틸시스테인(1.25 mM), Y-27632(10 μM), PGE2(1 μM) 및 제조업체가 지시한 농도에서 광범위한 스펙트럼 항생제 형성을 갖는 기본 배지를 보충한다.
- 어둠 속에서 4 °C에서 오가노이드 배지를 저장하고 2 주 (최대 1 개월) 이내에 사용하십시오. 얼지 마십시오. 광원에 장시간 노출되지 않도록 하십시오.
주: 오가노이드 배지는 무혈청으로 제조된다; 그러나 혈청과 페니실린 / 스트렙토 마이신은 필요에 따라 사용자 대 사용자 단위로 보충 될 수 있습니다.
2. 3에 설명 된 절차 하루 전
- 성장 인자 감소된 기저막(BME; 표 참조) 을 4°C 냉장고 또는 냉장실에서 사용하기 전에 적어도 12시간 동안 밤새 해동시켰다. 필요한 경우, BME를 1.5 mL 폴리프로필렌 일회용 튜브에 1 mL 분취량으로 분배하여 동결-해동 사이클을 피하십시오.
- 여과 된 피펫 팁을 4 °C 냉장고 또는 냉장실에 넣으십시오.
참고: 이 섹션에서는 BME를 처리할 때 조기 중합을 방지하고 팁 표면의 BME의 코팅을 줄이기 위해 사용되는 피펫 팁을 참조합니다. - 절차에 필요한 모든 수술 장비를 멸균하십시오.
3. 방광 종양 오가노이드의 생성
참고: 이것은 원발성 환자 종양으로부터 PDO 확립을 위한 초기 단계이다. 이 절차는 Gao et al.24에 의해 확립 된 방법에서 방광암 조직에 적합합니다.
- 클래스 II 생물 위험 후드를 사용하여 표본을 준비하십시오. 건조하고 젖은 얼음을 검색하고 환자 표본 처리 시트 (보충 파일)를 인쇄하십시오.
- 외과 적 절제술이 거의 완료되면 연구 요원을 수술실로 전화하십시오.
참고: 환자가 자격 기준을 충족하고 참가자 동의서에 서명했는지 확인하십시오. 조직은 임상 조직병리학적 평가를 위한 요건에 잉여가 있는 경우에만 연구를 위해 제공된다. - 수술에서 신선한 거시경 실행 가능한 종양 표본을 수집하십시오. 시료가 운반 중에 멸균된 50mL 원뿔형 튜브 또는 소변 시편 항아리의 운반 배지(1x adDMEM/F12 또는 1x Dulbecco의 인산염 완충 식염수(DPBS))에 잠겨 있는지 확인하십시오.
참고 : 일부 임상 센터에서는 연구를 위해 조직을 병리학 실험실로 옮겨야 할 수도 있습니다. 이러한 상황에서는 항생제와 항균제를 수송 매체에 첨가하는 것이 좋습니다. 조직은 수술 후 최대 24시간 동안 기본 배지에 4°C에서 저장될 수 있고 여전히 실행 가능한 오가노이드 배양물을 생성할 수 있다. - 조직 무게(g 또는 mg), 샘플 설명, 혈액 및 소변 샘플에 관한 세부 정보를 포함한 표본 세부 정보를 환자 표본 처리 시트 (보충 파일)에 기록합니다.
- 조심스럽게 운반 매체를 제거하고 10mL의 기본 배지로 교체하십시오. 종양 조직이 중력에 의해 침전되도록 허용하십시오.
참고: 운송 배지는 임상 폐기물로 간주되며 적절한 양의 오염 제거 용액으로 적절하게 라벨이 붙은 폐기물 용기에 수거해야 합니다. 액체가 화학적으로 오염 제거되면 유해 폐기물에 대한 제도적 지침에 따라 폐기 할 수 있습니다. - 포셉으로 종양 조직을 제거하고 멸균된 90mm 페트리 접시에 넣습니다(그림 2A). 조직의 중량을 mg 또는 g로 임상 표본 처리 시트 및 해부 격자 상에 기록한다(도 2B).
- 메스 손잡이에 장착된 멸균 포셉과 일회용 메스 블레이드를 사용하여 비암성 조직(지방 조직 포함) 및 거시적으로 보이는 괴사 부위를 제거합니다(그림 2C). 차가운 1x DPBS로 종양 조각을 1-2 번 씻으십시오. 종양 조각을 모아 새로운 멸균 90mm 페트리 접시로 옮깁니다.
참고: 메스 블레이드는 날카롭기 때문에 수동으로 슬라이스할 때는 주의해야 합니다. 종양-인접 지방 조직은 시각 종양 둘레에 바로 인접한 뚜렷하게 부드럽고, 젤라틴성이고, 창백한 영역에 의해 확인될 수 있다. 괴사의 영역을 나타내는 거시적 지방 조직 및 대포적으로 어두운 영역은 절제 방광 종양 생검으로부터 해부할 때 개인적인 판단을 필요로 할 것이다. - 사진을 찍고, 조직 다이어그램을 그리고, 임상 처리 그리드에서 조직 해부를 계획합니다(그림 2B 및 그림 2C).
참고 : 각 특정 사례에 대한 개별 거시적 종양 특성 및 해부에 대한 시각적 기록과 대략적인 스케치를 유지하는 것이 중요합니다. - 종양 조직 조각을 해부하고 조직병리학적(도 2D) 및 분자 분석(도 2E)을 위해 할당한다.
- 조직학적 분석의 경우: 약 50mg의 종양 조직을 표지된 일회용 플라스틱 조직학 카세트에 넣습니다(그림 2D). 조직학 카세트를 10% 중성 완충 포르말린(NBF)의 5x 내지 10x 부피의 용기에 담그십시오. RT에서 하룻밤 동안 배양하십시오.
- 10% NBF를 제거하고 다음날 70%(w/w) 에탄올로 교체하여 일상적인 조직 처리 프로토콜을 사용하여 조직을 처리할 수 있을 때까지 4°C에서 보관합니다.
- 분자 분석의 경우: 액체 질소를 사용하여 RNase/DNase가 없는 1.5mL 냉동 상태에서 적어도 하나의1-3mm3 종양 조각을 스냅 동결하고 -80°C에서 보관합니다(그림 2E).
- 5 mL의 오가노이드 배지 (표 1)를 나머지 종양 조각(들)을 함유하는 90 mm 페트리 접시에 분배한다.
- 멸균 된 # 10 메스 블레이드로 가능한 한 미세하게 (0.5-1 mm3 조각 이하) 기계적으로 조직을 다듬습니다.
참고 : 더 큰 파편 또는 조직의 전체 덩어리 (>3mm3)는 소화하는 데 상당히 오래 걸리고 표본의 생존력을 감소시킵니다. 조직이 분해되고 단편이 5mL 혈청 학적 피펫 팁으로 피펫에 충분히 작은 경우 위의 단계를 생략하십시오. - 잘게 다진 조직을 50mL 원뿔형 튜브로 옮기고 세포 응집을 피하기 위해 오가노이드 배지 4mL, 10x 콜라게나제/히알루로니다제 1mL, 데옥시리보뉴클레아제 1(DNase 1) 0.1mg/mL를 첨가합니다.
참고 : 효소 용액은 매번 신선하게 준비해야합니다. 배지의 부피를 큰 샘플에 대한 종양 단편의 가시량이 대략 10배가 되도록 증가시킨다. - 다진 종양 조직 및 효소 용액을 인큐베이터 (37°C, 5% CO2)의 오비탈 진탕기 또는 회전기 (150 rpm) 상에서1-2 시간 동안 인큐베이션하여 단편을 세포 현탁액으로 해리시키고 콜라겐을 분해한다. 이것은 조직학적 분석을 통해 확인할 수 있다(도 3A).
참고 : 조직의 양이 많거나 1-1.5 시간 후에 명백한 해리가 관찰되지 않으면 30 분마다 해리 수준을 확인하는 배양 시간을 늘리십시오. 이 단계의 타이밍은 샘플에 따라 다르며 매번 경험적으로 결정되어야합니다. 눈에 식별 할 수없는 조직 단편 (또는 극소수의 단편)이있는 눈에 띄게 명확한 용액은 성공적인 소화를 나타냅니다. - 2x 부피(20 mL)의 기초 배지를 샘플에 첨가하여 소화를 종료한다.
- 샘플을 실온 (RT)에서 5분 동안 261 x g 에서 원심분리하고, 흡인하고, 상청액을 버린다.
- 오염된 적혈구(RBCs)를 용해시키기 위해, 상기 단계로부터 수득된 펠렛을 5 mL의 염화암모늄-칼륨(ACK) 완충액에 재현탁시킨다. 튜브를 RT에서 3 분 동안 또는 RBC의 완전한 용해가 보일 때까지 인큐베이션하십시오 (현탁액이 분명 해집니다).
참고: RBC가 펠릿에서 작은 적색 덩어리로 관찰되지 않는 경우, 이 단계는 생략될 수 있습니다. - 튜브에 기본 배지 20 mL를 넣으십시오. 튜브를 RT에서 5분 동안 261 x g 에서 원심분리하고 상청액을 흡인한다.
- 이 단계에서, 2x 및 1x 오가노이드 배지의 10 mL 분취량을 37°C 수조에 넣고 가온한다.
- 샘플을 미리 습윤된 가역적 100 μm 스트레이너를 통해 새로운 50 mL 튜브로 여과하여 큰 불용성 물질을 제거한다.
참고: 필터에 의해 수집된 큰 소화되지 않은 물질(>100 μm)은 관심있는 세포를 함유할 수 있으며, 2D 배양을 유도하기 위해 오가노이드 배지의 90mm 페트리 접시 또는 6-웰 세포 배양 플레이트에서 배양될 수 있다(도 1(단계 5) 및 도 3B). - 용출액을 미리 습윤된 가역적 37 μm 스트레이너를 통해 여과하여 단일 세포 및 면역 세포 분리를 위한 단일 세포 및 작은 클러스터를 수집한다(튜브 37-1; 그림 1(단계 6) 및 그림 3B).
참고: 이 단계 동안 종양 세포의 수율은 여과된 세포 현탁액을 스트레이너를 통해 다시 통과시킴으로써 증가될 수 있다. - 37 μm 스트레이너를 역전시키고 10 mL의 기초 배지를 사용하여 작고 중간 크기의 클러스터 (37-100 μm)를 수집합니다 (튜브 70-1; 도 3B).
- 새로운 50mL 튜브(튜브 70-1 및 37-1)를 각각 DPBS로 40mL까지 충전합니다. 현탁액을 RT. 흡인물에서 5분 동안 261 x g 에서 원심분리하고 상청액을 버린다.
- 튜브 37-1 에 기본 배지 10mL를 넣고 트리판 블루 배제 염료와 자동화된 셀 카운터(제조업체 사양에 따라)를 사용하여 세포를 계산합니다. 세포의 세포 수와 생존력을 결정하십시오.
- 나머지 샘플을 RT. 배지에서 5분 동안 261 x g 에서 원심분리하고 10% 소 태아 혈청(FBS), 1% 페니실린/스트렙토마이신 및 10% 디메틸설폭사이드(DMSO)를 포함하는 세포 동결 용액 또는 기본 배지로 교체합니다.
- 샘플을 1.5 mL 냉동 용기에 넣고 세포 냉동 용기에 보관하십시오. 최적의 냉각 속도를 위해 용기를 즉시 -80°C 냉동고로 옮깁니다. -80°C에서 밤새 냉동고 보관한 후, 냉동 화물을 극저온 액체 또는 공기 상 저장소(-196°C)로 옮겨 장기간 보관한다.
- 튜브 70-1로부터 세포를 500 μL의 미리 가온된 2x 오가노이드 배지로 재현탁시킨다.
참고: 성공적인 오가노이드 번식을 위해서는 시드 밀도가 높아야 합니다. 오가노이드 배지 및 후속적으로, BME의 부피는 여과 단계로부터 단리된 세포의 수에 대해 경험적으로 변경되어야 한다. 이 단계는 우리 실험실에서의 연구를 기반으로 관련 출발점을 제공합니다. - 얼음처럼 차가운 P1000 멸균 필터 피펫 팁으로 세포에 BME를 (2x 오가노이드 배지와 1:1 비율로) 추가하고 부드럽게 혼합하여 세포를 현탁시킵니다. 신속하고 조심스럽게 재구성된 세포/BME 혼합물 100 μL를 초저 부착 플랫 바닥 96-웰 플레이트의 웰에 피펫한다. 96-웰 플레이트를 20-30분 동안 인큐베이터(37°C, 5% CO2)에 놓고 응고시킨다.
- 경험적으로 평가된 부피에 따라 BME 세포 현탁액의 상부에 1x 오가노이드 배지의 1:2 비율을 첨가한다. 관련 시작점에서, 재구성된 세포/BME 혼합물의 100 μL의 상부에 50 μL의 1x 오가노이드 배지 배지를 첨가한다.
- 96-웰 플레이트를 20분 동안 인큐베이터(37°C, 5%CO2)에 놓고 평형화시킨다.
- 세포 배양 플레이트를 인큐베이터에서 꺼내어 현미경 무대의 표본 홀더에 조립하십시오. 위상 대비 또는 밝은 필드 설정에서 오가노이드를 시각적으로 평가합니다.
참고: 이미지는 종점 분석에 대비하여 구형 PDO의 형성을 관찰하기 위해 차동 간섭(DIC) 광학, 디지털 카메라 및 관련 소프트웨어가 장착된 반전 위상차 현미경으로 가장 잘 수집됩니다.- 별개의 클러스터가 보이면, 세포 배양 플레이트를 무대 위의 전자적으로 가열된 현미경 챔버(37°C, 5% CO2)에 넣고 처음24-72시간에 걸쳐 라이브 세포 이미징을 한다.
- 열 드리프트를 줄이기 위해 유연한 가열 칼라가 렌즈에 부착되어 있고 가습기가dH2O로 채워져 있는지 확인하십시오.
- 4x 또는 10x 대물 렌즈(N.A. 0.30, W.D. 15.2 mm)를 사용하여 초기 이미징을 수행합니다. 위상차 설정에서 5-10분마다 타임랩스.
- 24-72 h 기간 후에 웰 당 >10 개의 자체 조직 오가노이드가 나타나는 것을 특징으로하는 성공적인 격리를 확인하십시오.
- 유기체 수가 낮은 경우 배양을 최대 2주 동안 계속하도록 허용합니다(그림 3C).
- 2-3일마다 50μL의 미리 예열된 오가노이드 배지를 사용하여 배지를 보충하여 고갈된 성장 인자와 전체 부피를 보충합니다.
- 1일, 2일, 3일(타임랩스 시리즈)에, 그리고 5일, 7일, 10일 전(해당하는 경우) 이미지를 획득합니다(해당하는 경우).
참고 : 오가노이드 (일반적으로 개별 세포의 가장자리를 볼 수없는 둥근 구조로 관찰됨)는 일반적으로 격리의 성공에 따라 설정 후 7-10 일 동안 통과됩니다. 통과 전 또는 통과 후, 오가노이드는 최대 6 일 동안 세포 독성 또는 치료제로 치료할 수 있으며 세포 생존율 및 세포 독성 분석을 사용하여 약물 반응을 측정 할 수 있습니다. 대안적으로, 오가노이드는 BME(1mg/mL 디스파제 사용) 및 동결보존(바이오뱅크 사용)으로부터 회수되거나, 분자 테스트를 위해 준비되거나, 조직학적으로 임베디드되고 평가될 수 있다(그림 4).
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Representative Results
3D 오가노이드는 인간 방광암 환자 TURBT 및 방광절제술 조직으로부터 성공적으로 확립되었다. 간단히 말해서,이 기술은 조직 학적 평가, 분자 특성화 (면역 조직 화학 또는 정량적 실시간 PCR에 의한) 및 약물 스크리닝과 같은 다른 종점 분석에 실행 가능하고 적합한 3D 다세포 구조의 신속한 형성을 강조합니다. 절차 (그림 1) 동안, 여과 단계 (그림 1, 단계 1-6) 동안 다양한 용출액은 종양 침윤 면역 세포 (TILs)의 분리 및 단일 세포 바이오 뱅크의 생성을 위해 단일 세포를 동결보존하는 데 활용 될 수 있습니다. 이 절차를 통해 이종 원발성 종양의 여러 측면을 적절하게 바이오뱅크화하고 조직학(그림 2C,D) 및 신선한 냉동 샘플(그림 2E)을 포함하여 환자 전반에서 추적할 수 있는 방식으로 바이오뱅크화할 수 있습니다.
시판되는 콜라게나제/히알루로니다아제 및 DNase 1을 사용한 2시간 소화는 라미나 프로프리아제 내의 신생물성 세포와 방광의 근육층을 포함하여 보다 복잡한 방광절제술 생검 조직의 0.5-1mm3 조각을 충분히 소화할 수 있게 해줍니다(그림 3A). 더 큰 소화 후 단편 (>100 미크론)은 새로운 2D 배양물의 단리를 위해 모든 크기의 표준 조직 배양 플레이트에서 배양에 적합한 것으로 입증되었습니다 (그림 3B). 그러나, 이러한 세포주의 암 기원을 검증하기 위해서는 광범위한 분자 특성화가 요구된다. 이 프로토콜로 성공적으로 생성되는 오가노이드는 응집, 압축 및 최종 형성 단계를 포함하여 동적 자기 조립 과정을 거치며, 이에 따라 표준 치료 요법에 대한 반응을 평가할 수있는 단단한 세포 구조 (그림 3C)로 형성됩니다. 도 3C는 오가노이드의 효율적인 자기조립 특성을 강조한다. 조직학적으로, 이들 구조는 원래의 환자 종양을 재생산한다(도 4). 이 절차에서 생성된 오가노이드는 추가 특성화, 바이오뱅킹 및 약물 효능 테스트를 포함한 다양한 목적에 적합합니다(그림 5).
그림 1: 수술에서 종점 분석까지 종양 샘플 수집에서 유기조직 배양의 개략적인 표현. URN, 단위 레코드 번호; TIL, 종양-침윤성 림프구. (1) 조직은 멸균 메스 블레이드 (0.5-1 mm3 개)로 가능한 한 미세하게 90mm 페트리 접시에 기계적으로 다진 것입니다. (2) 종양 조각은 오가노이드 배지, 콜라게나제/히알루로니다아제 및 DNase 1로 구성된 효소적 해리 배지에 재현탁된다. (3) 다진 종양 조직 및 효소 용액을 회전근 인큐베이터 (150 rpm, 37°C, 5%CO2) 상에서 1-2 시간 동안 인큐베이션하고, 이어서 펠릿화 (4)하여 단편을 더 미세한 세포 현탁액으로 해리시킨다. 샘플은 사전 습윤 가역적 (5) 100μm 및 (6) 37μm 스트레이너를 통해 새로운 50mL 튜브로 여과하여 큰 불용성 물질을 제거하고 37-100μm 클러스터를 분리합니다. (7) 37 μm 스트레이너의 역방향 분획으로부터 단리된 분획의 원심분리 후, 세포 클러스터는 (8) BME 및 오가노이드 배지에 현탁된 후 (9) 살아있는 세포 영상화. BioRender.com 로 만들었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 오가노이드 확립을 위한 멸균 종양 조직 취급 . (A) 절제 및 실험실로 이송되면, 표본을 멸균된 페트리 접시에 넣고, 칭량하고, 이어서 해부한다. (B) 시편 해부 격자는 다양한 공정에 대해 시편을 표시하는 데 사용됩니다. 해부의 예는 (C)에 도시되어 있는데, 여기서 샘플은 중추 괴사의 영역을 피하기 위해 가능한 한 종양 주변부로부터 채취되고 (D) 조직 고정 전에 조직을 총체화하기 전에 주석이 달린 (inset)이다. 스케일 바 : 6mm. 인셋 스케일 바 : 4mm. (E) 후속 냉동 및 바이오 뱅킹을 위해 작은 신선한 조각을 가져옵니다. 스케일 바 : 5mm. 이 이미지의 요소는 BioRender.com 로 만들어졌습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 방광 종양 오가노이드의 효소적 유도 및 동적 조립. (A) 헤마톡실린 및 에오신(H&E)이 즉시 고정된 부모 방광암 조직(T3bN0으로 검토된 병리학 검토)의 대표적인 사진(왼쪽) 및 1x 콜라게나제/히알루로니다아제로 소화 후 2시간 후(오른쪽). 스케일 바: 500 μm. 인셋 스케일 바: 50 μm. (B) >100 μm, 37-1 및 70-1(제2일) 단리의 대표적인 이미지. 배율 막대는 이미지 내에 표시됩니다. (c) 방광암 오가노이드 분리에 대한 대표적인 이미지는 48 h 및 7일째 오가노이드 H&E 염색에 대해 보여진다. 스케일 바: 50 μm. 인셋 내의 이미지에 대한 스케일 바: 20 μm. DIC: 차동 간섭 콘트라스트. 이 이미지의 요소는 BioRender.com 로 작성되었습니다 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 방광암 유래 오가노이드 배양은 부모 종양의 조직학적 구조를 유지한다. 저등급 방광암 (Ta)의 대표적인 H&E 이미지와 배양 7일째에 오가노이드의 밝은 필드 이미지. 극우 패널은 7일째 오가노이드의 관련 H&E 염색을 보여준다. 눈금 막대는 그림에 표시되어 있습니다. LG : 저급, BC : 방광암, H & E : 해마톡실린과 에오신, DIC : 차등 간섭 대비. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: 방광암 환자 유래 오가노이드를 사용한 다운스트림 적용. BioRender.com 로 만들었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 첨가물 | 최종 콘크. | 주식 콩. | 용매 | |
| 기초 미디어 | 글루타맥스 | 2 밀리지미터 | 1 엠 | 나클 |
| 헤페스 | 10 밀리지미터 | 1 엠 | NaCl/NaHPO4 완충 용액 | |
| 완전한 미디어를위한 보충 교재 | R-스폰딘 1 컨디셔닝 미디어 | 5% v/v | 컨디셔닝된 미디어 | 고급 DMEM/F-12 |
| 노긴컨디셔닝 미디어 | 5% v/v | 컨디셔닝된 미디어 | 고급 DMEM/F-12 | |
| EGF | 50 ng/mL | 0.5 밀리그램/mL | PBS / 0.1 % BSA | |
| FGF-10 | 20 ng/mL | 100 μg/mL | PBS / 0.1 % BSA | |
| FGF-2 | 5 ng/mL | 50 μg/mL | PBS / 0.1 % BSA | |
| 니코틴아미드 | 10 밀리지미터 | 1 엠 | 8.2 mL ddH2 0에1 g | |
| N-아세틸-L-시스테인 | 1.25 밀리지미터 | 500 밀리가바이트 | 40 mL ddH20 | |
| A 83-01 | 0.5 μM | 50 밀리지미터 | 증권 시세 표시기 | |
| SB202190 | 10 μM | 50 밀리지미터 | 증권 시세 표시기 | |
| Y27632 | 10 μM | 100 밀리미터 | ddH20 | |
| B-27 첨가제 | 1배 | 50배 | ||
| 프로스타글란딘 E2 | 1 μM | 10 밀리지미터 | 증권 시세 표시기 | |
| 프리모신 | 100 μg/mL | 50mg/mL | ||
표 1 : 기초 및 완전한 오가노이드 배지에 사용되는 보충제
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Discussion
방광암 조직에서 파생 된 3D 오가노이드 프로토콜은 아직 초기 단계에 있지만 활발한 연구 및 임상 조사 영역입니다. 여기서, NMIBC 및 MIBC 표본 모두에 적합한 방광암 PDO를 성공적으로 확립하기 위한 최적화된 프로토콜이 상세히 설명된다. 이 워크플로우는 병원 기반 임상 시험에 병행하여 통합되며 조직학적 샘플 처리 및 임상 오가노이드 파이프라인의 중요한 고려 사항인 신선한 냉동 조직 뱅킹을 포함한 바이오뱅크 샘플 발생을 고려합니다. 이 프로토콜은 기존 방법을 기반으로하며 오가노이드 정밀 의학 파이프 라인을 구축하기위한 통합 방법론을 제공합니다.
이 프로토콜의 현재 성공률은 다른 프로토콜과 마찬가지로 약 70 % 25입니다. 이것은 방광암 종양 미세 환경의 분리 기술 및 특성화가 진화함에 따라 개선 될 것으로 예상됩니다. 예상대로 초기 표본의 품질은 성공률에 영향을 미치며 중요한 제한 단계입니다. 화학 요법 순진한 환자로부터 얻은 표본은 가장 높은 성공률을 제공하는 반면, 신 보조 화학 요법을받은 환자의 표본은26,27 개의 생존 가능한 세포 수가 감소 할 수 있습니다. 전형적으로, 방광암 표본 (TURBT 및 방광절제술 둘 다로부터)은 높은 종양 세포성을 갖는 충분한 양의 샘플을 제공한다. 이것은 24-72 h 성장 기간 내에 30-100 μm 사이의 오가노이드의 강력한 생성을 허용한다 (일부 <40 μm 클러스터가 여과 단계에서 유지된다는 점을 감안할 때). 중요하게도, 오가노이드 샘플에서 관찰된 이질성(즉, 낭성 형성 및 보다 치밀한 구조)은 이 프로토콜이 이종 종양 세포 집단을 유도하기에 적합한 조건을 제공한다는 것을 나타낸다.
우리의 최적화 된 프로토콜은 제한된 출발 물질 (TURBT 절차 또는 임상 시험에서 환자로부터 획득 한 표본을 포함한 일부 선택 수술의 경우와 마찬가지로)에서 수행 할 수 있으므로 여러 분석을 통합하여 표본 가치를 극대화 할 수 있습니다. 이 프로토콜은 초기 여과 단계 동안 처리된 큰 불용성 조직에 상주할 수 있는 관심있는 외래 종양 세포로부터 2D 배양물을 성장시키는 단계를 기술하는 방법을 포함한다. 수술 후28,29 시간 내에 표본을 처리 할 것을 제안하는 다른 연구 그룹과 마찬가지로,이 기간 내에 발생하는 조직 저산소증이 생존 가능한 오가노이드 생성을 배제하지 않는다는 것이 관찰됩니다. 최적화는 웰 당 시딩되는 세포 (네이티브 클러스터)의 밀도를 결정하기 위해 필요합니다. 우리의 경험에 비추어 볼 때, 과도한 수의 클러스터는 배양물의 성장을 저조하게 만들 수 있으며, 낮은 시각적 밀도 배양은 세포 사멸로 이어질 수 있습니다. 이것은 필요에 따라 범위 내에서 희석 될 수있는 볼륨의 맥락에서 경험적으로 사용자에 의해 결정될 수 있습니다. 또한, TURBT 표본은 종종 절제 과정으로 인해 탄 가장자리를 포함하고 있으며, 이는 두드러진 괴사 부위로 명백합니다. 중요한 단계는 거시적 종양 조직과 후속 해부의 신중한 분리입니다. 이것은 실행 가능한 문화를 도출하는 데 가장 중요하며 외과 팀과 의사 소통을해야합니다. 일부 예에서, 이것은 절차의 초기 제한일 수 있다.
현재 기술에 대한 추가적인 한계는 오가노이드와 평행한 종양 미세환경의 부재이다. 필요한 개발은 세포 복잡성을 증가시키고 종양 미세 환경 (즉, 스트로마 및 면역 세포)의 다른 구성 요소를 제공하기 위해 미래의 공동 배양 시스템이 될 것입니다. 오가노이드가 그들의 성장을 자가-영속시킬 수 있는 능력을 갖는 자가-조직화 구조로서 정의됨에 따라, 시험관내 성장 특성(31,32,33)의 개선을 허용할 수 있는 분리된 암 줄기 세포(예를 들어 CD44 및 CD49)를 밝히기 위한 추가의 연구가 요구될 것이다. PDO가 종양 조직에서 유래한다는 것을 확실하게 확립하는 것은 기능적 및 분자 분석에서 정상적인 비뇨 생식기 세포의 기여가 약물 내성에 대한 조사를 혼란스럽게 할 것이기 때문에 중요합니다. 때때로 PDOs에서 비뇨생식기 세포의 종양 기원은 전이성 조직 또는 유두 종양의 사용으로 인해 명확하지만(여기서의 경우와 같이; 도 4 참조), 공급원 조직이 방광 점막으로부터 적출되어 양성 비뇨생식기의 여백을 포함하는 경우, 생성된 PDO가 분자 기술을 사용하여 종양 세포로 구성되어 있는지 확인하는 것이 중요하다. 따라서, 면역조직화학 및 게놈 비교는 확립된 오가노이드와 이들이 유래된 원발성 종양(30) 사이에서 요구된다.
웰 당 오가노이드의 수 및 크기 분포에 관해서는, 세포독성 분석을 위해 3D 오가노이드의 균일한 도금 밀도를 유지하는 것이 어렵다. 이는 필터를 사용하여 정의된 범위를 분리함으로써 약간 완화되지만, 작은 클러스터와 더 큰 오가노이드가 동일한 웰에서 격리되는 경우 여전히 제한적입니다. 대형 입자 분류기는이 문제를 완화 할 수 있지만 의학 연구 실험실에서는 널리 사용할 수 없습니다. 그럼에도 불구하고, 치료 전후에 생존력 신호를 측정하는 기술은 방광암 오가노이드(34)에서 성공적으로 사용되어 왔다. 이 기술이 발전함에 따라 연구자들은 다양한 게놈 프로파일을 가진 방광암 PDO 라이브러리와 새로운 치료법을 조사하기 위해 탐구 할 수있는 약력학 반응을 개발할 수있게 될 것입니다. 추가적으로, 본원에 기재된 표본 수집 절차 및 해리 방법은 종양 공간 프로파일링, 다발수 유동 세포측정, 및 단일 세포 RNA 시퀀싱을 위한 동시 준비를 허용한다. 종합하면, 이것은 환자의 종양 이질성 및 면역 요법과 같은 약물의 적용 가능성을 탐구하기 위해 함께 가져올 수있는 다양한 범위의 강력한 종점을 허용합니다.
요약하면, 우리는 정밀 의학 종점의 출현에서 3D 환자 유래 방광암 오가노이드의 배양을 수립하고 평가하는 프로토콜을 설명합니다. 여기에 설명 된 단계와 메모는 우리 실험실에서 방광암 PDO를 분리하는 데 사용되는 일상적인 접근법이라는 점에 유의해야합니다. 우리의 절차에 사용 된 배양 배지는 원래 전립선 암 세포에 대해 기술되었으며 현재 방광암 배양에 적합한 것으로 입증되었습니다. 중요한 것은,이 프로토콜은 중앙 집중화되어 실험실에서 일상적인 사용에 적합하며 비뇨기과 암 유형에 광범위하게 적용 할 수 있다는 것입니다. 높은 충실도 분자 표현형 및 약물 반응 종점과 함께이 기술은 방광암 환자의 정확한 치료 관리를 신속하게 탐구하는 데 유용한 도구를 제공 할 것입니다.
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Disclosures
저자는 이해 상충이 없습니다.
Acknowledgments
우리는 Translational Research Institute Histology 핵심 및 Biological Resource Facility의 기술 지원을 인정합니다. 이 연구는 알렉산드라 공주 연구 재단 상 (I.V., E.D.W.)과 의학 연구 미래 기금 (MRFF) 신속한 응용 연구 번역 프로그램 (암 맞춤형 분석 센터 (CPAC; E.D.W., I.V.). Translational Research Institute는 호주 정부의 지원을 받습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.2 mL cryogenic vial | Corning | 430487 | |
| 1.5 mL Eppendorf tubes | Sigma-Aldrich | T9661-500EA | polypropylene single-use tube |
| 100 µM reversible strainer | STEMCELL Technologies | #27270 | |
| 100 mm Petri dish | Corning | 430167 | |
| 10x Collagenase/ Hyaluronidase | STEMCELL Technologies | #07912 | |
| 37 µM reversible strainer | STEMCELL Technologies | #27250 | |
| 37°C incubator | |||
| 37°C water bath | |||
| 50 mL falcon tube | Corning | CLS430829-500EA | |
| 6-well plate | Corning | CLS3516 | |
| 70% (w/w) ethanol | |||
| -80°C freezer | |||
| 96 well ultra low attachment plate (Black) | Sigma-Aldrich | CLS3474-24EA | |
| A 83-01 | BioScientific | 2939 | Prevents the growth-inhibitory effects of TGF-β |
| ACK lysis buffer | STEMCELL Technologies | #07850 | |
| adDMEM/F-12 | Thermo Fisher Scientific | 12634028 | Base medium |
| Animal-free recombinant EGF | Sigma-Aldrich | 518179 | Growth factor |
| Automated cell counter (TC20) | Bio-rad | 1450102 | |
| B27 additive | Gibco | 17504044 | Increases sphere-forming efficiency |
| Cell Counting Slides | Bio-rad | 1450015 | |
| Centrifuge | Eppendorf | EP022628188 | |
| Computer system | |||
| CryoStor CS10 | STEMCELL Technologies | #07930 | Cell freezing solution |
| Dispase II, powder | Thermofisher | 17105041 | To enzymatically disrupt Matrigel |
| DNAse 1 | STEMCELL Technologies | #07900 | |
| DPBS | Thermofisher | 14190144 | |
| Dry and wet ice | |||
| Esky | |||
| Farmdyne (Iodine 16g/L) | Ecolab | ||
| Formalin solution, neutral buffered, 10% | Sigma | HT501128 | Histological tissue fixative |
| Glutamax (L-alanine-L-glutamine) | Invitrogen | 35050061 | Source of nitrogen for the synthesis of proteins, nucleic acids |
| HEPES | Gibco | 15630-080 | All-purpose buffer |
| Histology cassette | ProSciTech | RCH44-W | |
| Human FGF-10 | Peprotech | 100-26-25 | Growth factor |
| Human FGF-2 | Peprotech | 100-18B-50 | Growth factor |
| Liquid nitrogen | |||
| Matrigel (Growth Factor Reduced (GFR), phenol red-free, LDEV free) | In Vitro Technologies | 356231 | Basement membrane extract (BME) |
| Mr. Frosty freezing container | ThermoFisher | 5100-0001 | cell freezing container |
| N-acetyl-L-cysteine (NAC) | Sigma | A7250 | Anti-oxidant required to protect against ROS-induced cytotoxicity |
| Nicotinamide | Sigma | N0636-100G | SIRT-1 inhibitor |
| NikonTs2U inverted microscope | Nikon | MFA510BB | |
| NIS-Elements Advanced Research | Nikon | MQS31000 | |
| Noggin conditioned media | In-house | BMP inhibitor | |
| Pipetboy acu 2 | Integra | 155000 | |
| Pipettes (p20, p100, p1000) with tips | |||
| Primocin | Jomar Bioscience | ant-pm2 | Combination of antibacterial and antifungal compounds to protect cell cultures from contaminations |
| Prostaglandin E2 (PGE2) | Tocris | 2296 | support proliferation of cells |
| Rotary tube mixer | Ratek | RSM7DC | |
| R-spondin 1 conditioned media | In-house | WNT signalling regulator | |
| SB202190 | Jomar Bioscience | s1077-25mg | Selective p38 MAP kinase inhibitor |
| Scale | |||
| Scalpel handle | Livingstone | WBLDHDL03 | |
| Scalpels, #11 blade | Medical and Surgical Requisites | EU-211-1 | |
| Serological pipettes (5, 10, 25 mL) | |||
| Specimen Waste Bags | Medical Search | SU09125X16 | |
| Urine specimen jar | |||
| Y27632 | Jomar Bioscience | s1049-10mg | Selective ROCK inhibitor. Increases survival of dissociated epithelial cells |
References
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