Summary
تعد المواد العضوية المشتقة من المريض (PDOs) أداة قوية في أبحاث السرطان الانتقالية ، مما يعكس عدم التجانس الجيني والمظهري للمرض والاستجابة للعلاجات الشخصية المضادة للسرطان. هنا ، يتم تفصيل بروتوكول موحد لتوليد PDOs لسرطان المثانة الأولية البشرية استعدادا لتقييم تحليلات النمط الظاهري والاستجابات الدوائية.
Abstract
تفتقر منصات الاختبار العلاجي الحالية في المختبر إلى الصلة بالفيزيولوجيا المرضية للورم ، وعادة ما تستخدم خطوط الخلايا السرطانية التي تم إنشاؤها كثقافات ثنائية الأبعاد (2D) على بلاستيك زراعة الأنسجة. هناك حاجة ماسة إلى نماذج أكثر تمثيلا لتعقيد الورم يمكنها التنبؤ بدقة بالاستجابة العلاجية والحساسية. يهدف تطوير ثقافة ثلاثية الأبعاد (3D) خارج الجسم الحي من المواد العضوية المشتقة من المريض (PDOs) ، المستمدة من أنسجة الورم الطازجة ، إلى معالجة أوجه القصور هذه. يمكن استخدام الثقافات العضوية كبدائل للورم بالتوازي مع الإدارة السريرية الروتينية لإبلاغ القرارات العلاجية من خلال تحديد التدخلات الفعالة المحتملة والإشارة إلى العلاجات التي قد تكون غير مجدية. هنا ، يهدف هذا الإجراء إلى وصف الاستراتيجيات وبروتوكول مفصل خطوة بخطوة لإنشاء PDOs لسرطان المثانة من الأنسجة السريرية الجديدة والقابلة للحياة. بروتوكولاتنا الراسخة والمحسنة عملية لإعداد ثقافات 3D للتجارب باستخدام مواد أولية محدودة ومتنوعة مباشرة من المرضى أو مواد الورم xenograft (PDX) المشتقة من المريض. يمكن أيضا استخدام هذا الإجراء من قبل معظم المختبرات المجهزة بمعدات زراعة الأنسجة القياسية. يمكن استخدام المواد العضوية التي تم إنشاؤها باستخدام هذا البروتوكول كبدائل خارج الجسم الحي لفهم كل من الآليات الجزيئية التي تقوم عليها أمراض سرطان المسالك البولية وتقييم العلاجات لإبلاغ الإدارة السريرية.
Introduction
سرطان المثانة هو سرطان المسالك البولية الأكثر انتشارا وعاشر أكثر الأورام الخبيثة البشرية شيوعا في جميع أنحاء العالم1. وهو يشمل طيفا متنوعا وراثيا ومعقدا ظاهريا من المرض2. تعد الأشكال غير الغازية للعضلات غير الغازية لسرطان المثانة (NMIBC) هي أكثر تشخيصات سرطان المثانة شيوعا (70٪ -80٪) ، وتظهر هذه السرطانات عدم تجانس بيولوجي كبير ونتائج سريرية متغيرة2،3،4. عادة ما يعاني المرضى الذين يعانون من NMIBC من خطر كبير لتكرار المرض (50-70٪) ، وسوف يتطور ثلث السرطانات ويتطور إلى سرطان المثانة الغازي للعضلات (MIBC) الأكثر عدوانية2. على الرغم من أن معدلات البقاء على قيد الحياة لمدة 5 سنوات ل NMIBC مرتفعة (>90٪) ، يجب على هؤلاء المرضى الخضوع لإدارة سريرية طويلة الأجل5. من ناحية أخرى ، يعتبر MIBC المتقدم محليا (غير القابل للاستئصال) أو النقيلي غير قابل للشفاءبشكل عام 6. وبالتالي ، فإن سرطان المثانة لديه واحدة من أعلى تكاليف العلاج مدى الحياة داخل رعاية السرطان وهو عبء كبير على كل من الفرد ونظام الرعاية الصحية 3,7. الانحرافات الجينية الكامنة في الأمراض المتقدمة تجعل الإدارة العلاجية لسرطان المثانة تحديا سريريا ، ولم تتحسن الخيارات العلاجية للأورام البولية الغازية إلا مؤخرا منذ الموافقة على العلاجات المناعية لكل من NMIBC 8,9 المتقدم وعالي الخطورة. في الوقت الحالي ، تسترشد عملية صنع القرار السريري بالسمات السريرية والنسيجية المرضية التقليدية ، على الرغم من أن أورام سرطان المثانة الفردية تظهر اختلافات كبيرة في عدوانية المرض والاستجابة للعلاج10. هناك حاجة ملحة لتسريع البحث في نماذج مفيدة سريريا لتحسين التنبؤ بتشخيص المريض الفردي وتحديد العلاجات الفعالة.
تظهر المواد العضوية ثلاثية الأبعاد (3D) إمكانات كبيرة كنماذج للورم بسبب قدرتها على التنظيم الذاتي وتلخيص الورم الأصلي الجوهري في بنية الجسم الحي والملف الدوائي الجيني ، وقدرتها على عكس الوظيفة الخلوية الأصلية للنسيج الأصلي الذي اشتقت منه 11،12،13 . على الرغم من أن خطوط خلايا سرطان المثانة الراسخة متاحة بسهولة ، وفعالة نسبيا من حيث التكلفة ، وقابلة للتطوير ، وسهلة التلاعب ، إلا أن خطوط الخلايا في المختبر تفشل إلى حد كبير في محاكاة طيف التغيرات الجينية والجينية المتنوعة التي لوحظت في سرطانات المثانة السريرية 12,14 وتم إنشاؤها جميعا وصيانتها في ظل ظروف ثقافة 2D ، الالتصاق. بالإضافة إلى ذلك، فإن خطوط الخلايا المشتقة من أورام المثانة الأولية والنقيلية تؤوي اختلافا وراثيا كبيرا عن مادة الورم الأصلية. 8,15.
وهناك نهج بديل يتمثل في استخدام نماذج الفئران المهندسة وراثيا والمسرطنة. ومع ذلك ، في حين أن هذه النماذج تلخص بعض الشلالات الطبيعية الورمية المشاركة في الأورام البشرية (تمت مراجعتها في المراجع16،17،18) ، فإنها تفتقر إلى عدم تجانس الورم ، وهي مكلفة ، وتمثل سرطان المثانة الغازي والنقيلي بشكل سيئ ، وغير قابلة للتطبيق لاختبار المخدرات السريع على المدى الطويل لأن الأورام يمكن أن تستغرق عدة أشهر لتطوير14،19 . توفر النماذج المشتقة من المريض من السرطان (بما في ذلك المواد العضوية ، وزراعة الخلايا الأولية المعاد برمجتها بشكل مشروط ، و xenografts) فرصا لا تقدر بثمن لفهم آثار العلاج الدوائي قبل العلاج السريري20. على الرغم من ذلك ، فإن عددا قليلا من المجموعات تستخدم بشكل روتيني هذه النماذج القريبة من المريض بسبب محدودية الوصول إلى أنسجة المريض الأولية الطازجة والتحسين الشامل المطلوب لتوليد ظروف زراعة العضوية المشتقة من المريض (PDO) بشكل متكرر. في بيئة الجسم الحي ، يمكن للخلايا السرطانية أن تتفاعل وتتواصل مع تركيبات مختلفة من المكونات المحيطة ، بما في ذلك الخلايا اللحمية ، والأنسجة التي تتسلل إلى الخلايا المناعية ، والمصفوفة12. وبالمثل ، بالنسبة لشركة تنمية نفط عمان المزروعة بتنسيق 3D ، يمكن تخصيص تعقيد الخلايا / المصفوفة لتشمل المكونات الأخرى ذات الصلة. يمكن إنشاء PDOs بسرعة وغالبا ما تكون قادرة على المرور على نطاق واسع أو حفظها بالتجميد لاستخدامها لاحقا ، على الرغم من أن عمرها محدود21،22،23. يمكن تقييم الديناميكا الدوائية (أي الاستجابة للدواء) باستخدام قراءات متعددة ، بما في ذلك الجدوى العضوية والمورفولوجيا ، وتوصيف أهداف الكيمياء النسيجية المناعية أو تغييرات النسخ.
هنا ، يتم وصف إجراءات إنشاء المواد العضوية لسرطان المثانة من مواد المريض التي تم جمعها من استئصال ورم المثانة عبر الإحليل (TURBT) أو الاستئصال الجراحي للمثانة (استئصال المثانة الجذري). يتم توضيح طريقة توليد PDOs ، باستخدام المواد والأدوات المختبرية الرطبة المتاحة بسهولة. تتضمن نقاط النهاية تغيرات في الخصائص المورفولوجية للخلية وقابليتها للحياة. تم قياس هذه باستخدام الفحص المجهري الفلوري ، واختبارات الجدوى في المختبر (سلامة الأيض وغشاء الخلية) ، والتحليل النسيجي المرضي. يوضح الشكل 1 سير العمل لإنشاء PDOs لسرطان المثانة البشرية من المواد السريرية التي تم الحصول عليها أثناء الجراحة الاختيارية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
وافق المرضى على هذه الدراسة بعد قبولهم تحت إشراف فريق المسالك البولية في مستشفى الأميرة ألكسندرا ، بريسبان ، أستراليا. أجريت هذه الدراسة وفقا لمبادئ إعلان هلسنكي وضمن المبادئ التوجيهية الأخلاقية والمؤسسية (رقم الأخلاقيات HREC/05/QPAH/95، QUT 1000001165).
ملاحظة: كمعايير للأهلية ، كان عمر المرضى ≥ 18 عاما مصابا بالسرطان ، وقادرين على فهم وتقديم الموافقة. واستبعد أولئك الذين لم يتمكنوا من إعطاء الموافقة المستنيرة. واستبعد أولئك الذين لديهم لغة أساسية غير الانكليزية لأن توفير مترجمين شفويين لم يكن ممكنا بسبب اعتبارات لوجستية وتتعلق بالميزانية. كما تم استبعاد المرضى الذين لم تكن أورامهم متاحة للخزعة أو من غير المرجح أن تكون متاحة بكمية كافية بعد علم الأمراض الروتيني.
1. إعداد العضوية المتوسطة
ملاحظة: يتطلب الوسط العضوي لسرطان المثانة البشرية عوامل نمو تساعد في البقاء على قيد الحياة والنمو والتوسع المستمر للمواد العضوية المشتقة من المواد السريرية المنفصلة (الجدول 1). للحصول على تفاصيل كاملة عن كل ملحق مستخدم في هذا الإجراء، يرجى الرجوع إلى جدول المواد.
- تذوب المكونات المجمدة على الجليد أو في الثلاجة عند 2-8 درجة مئوية. تجنب دورات التجميد / الذوبان المتكررة والعمل من الأليكوتات المجمدة (المخزنة في -20 درجة مئوية).
- الوسط القاعدي: تحضير الوسط القاعدي عن طريق استكمال متوسط النسر المعدل المتقدم من دولبيكو / F-12 من لحم الخنزير (adDMEM / F12) مع HEPES (10 mM) والجلوتامين (2 mM). يستخدم هذا أيضا كوسيلة نقل ، وخلال خطوات الغسيل العضوي.
ملاحظة: يستخدم DMEM/F-12 المتقدم كوسيط قاعدي للمساعدة في توسيع المواد العضوية في وجود مصل محدود؛ ومع ذلك ، فإنه يتطلب مكملات مع HEPES و L-الجلوتامين. - لفترة وجيزة عامل نمو الخلايا الليفية بالطرد المركزي 10 (FGF-10) ، عامل نمو الخلايا الليفية 2 (FGF-2) ، عامل النمو الظهاري (EGF) ، SB202190 ، البروستاجلاندين E2 (PGE2) ، و A 83-01 قبل الفتح لضمان وجود المكونات في أسفل القارورة.
- وسط عضوي كامل: يكمل الوسط القاعدي بوسائط مشروطة بوسائط مشروطة ب noggin و R-spondin البشري بتركيز نهائي قدره 5٪ v / v ، EGF البشري (50 نانوغرام / مل) ، FGF-2 البشري (5 نانوغرام / مل) ، FGF-10 البشري (20 نانوغرام / مل) ، A 83-01 (500 نانومتر) ، SB202190 (10 ميكرومتر) ، B27 (1x) ، نيكوتيناميد (10 ملليمتر) ، N-acetylcysteine (1.25 mM) ، Y-27632 (10 μM) ، PGE2 (1 μM) وتكوين مضاد حيوي واسع الطيف بالتركيز الذي أشارت إليه الشركة المصنعة.
- تخزين الوسائط العضوية في 4 درجة مئوية في الظلام واستخدامها في غضون 2 أسابيع (1 شهر على الأكثر). لا تجمد. تجنب التعرض الطويل لمصادر الضوء.
ملاحظة: يتم تحضير الوسط العضوي الخالي من المصل. ومع ذلك ، يمكن استكمال المصل والبنسلين / الستربتومايسين على أساس المستخدم إلى المستخدم حسب الاقتضاء.
2. قبل يوم من الإجراء الموضح في 3
- عامل نمو ذوبان الغشاء السفلي المنخفض (BME؛ انظر جدول المواد) بين عشية وضحاها لمدة 12 ساعة على الأقل قبل الاستخدام في ثلاجة 4 درجات مئوية أو غرفة باردة. إذا لزم الأمر، قم بتوزيع BME في 1 مل من الأليكوتات في أنبوب 1.5 مل من البولي بروبيلين أحادي الاستخدام لتجنب دورات التجميد والذوبان.
- ضع أطراف الماصة المصفاة في ثلاجة 4 درجات مئوية أو غرفة باردة.
ملاحظة: يشير هذا القسم إلى أطراف الماصة التي سيتم استخدامها عند التعامل مع BME لمنع البلمرة المبكرة وتقليل طلاء BME على سطح الأطراف. - تعقيم جميع المعدات الجراحية اللازمة لهذا الإجراء.
3. توليد ورم المثانة العضوي
ملاحظة: هذه خطوة أولية لإنشاء شركة تنمية نفط عمان من أورام المرضى الأساسيين. يتم تكييف هذا الإجراء لأنسجة سرطان المثانة من الطرق التي وضعها Gao et al.24.
- استخدم غطاء محرك السيارة من الفئة الثانية للمخاطر البيولوجية لإعداد العينة. استرجع الثلج الجاف والرطب واطبع ورقة معالجة عينات المريض (ملف تكميلي).
- اتصل بموظفي الأبحاث إلى غرفة العمليات عندما يكون الاستئصال الجراحي على وشك الانتهاء.
ملاحظة: تأكد من أن المريض يستوفي معايير الأهلية ووقع على نموذج موافقة المشارك. يتم توفير الأنسجة للبحث فقط إذا كانت فائضة عن متطلبات التقييم النسيجي المرضي السريري. - جمع عينة جديدة من الورم قابلة للحياة بالمنظار العياني من الجراحة. تأكد من غمر العينة في وسط النقل (إما 1x adDMEM/F12 أو 1x Dulbecco الملحي المخزن بالفوسفات (DPBS)) في أنبوب مخروطي معقم سعة 50 مل أو جرة عينة بول أثناء النقل.
ملاحظة: في بعض المراكز السريرية، قد تحتاج الأنسجة إلى نقلها إلى مختبر علم الأمراض ليتم تخصيصها للبحث. في ظل هذه الظروف ، يوصى بإضافة المضادات الحيوية ومضادات الفطريات إلى وسيط النقل. يمكن تخزين الأنسجة عند 4 درجات مئوية في الوسط القاعدي لمدة تصل إلى 24 ساعة بعد الجراحة ولا تزال تولد ثقافات عضوية قابلة للحياة. - سجل تفاصيل العينة، بما في ذلك وزن الأنسجة (جم أو ملغ)، ووصف العينة، والتفاصيل المتعلقة بأي عينات دم وبول على ورقة معالجة عينات المريض (الملف التكميلي).
- قم بإزالة وسيط النقل بعناية واستبدله ب 10 مل من الوسائط القاعدية. اسمح لأنسجة الورم بالاستقرار عن طريق الجاذبية.
ملاحظة: تعتبر وسيلة النقل نفايات سريرية ويجب جمعها في حاوية نفايات تحمل علامة مناسبة في كمية مناسبة من محلول إزالة التلوث. بمجرد تطهير السائل كيميائيا ، يمكن التخلص منه وفقا للمبادئ التوجيهية المؤسسية للنفايات الخطرة. - قم بإزالة أنسجة الورم باستخدام الملقط وضعه في طبق بتري معقم 90 مم (الشكل 2A). سجل وزن الأنسجة بالمغ أو الغرام على ورقة معالجة العينات السريرية وشبكة التشريح (الشكل 2B).
- قم بإزالة الأنسجة غير السرطانية (بما في ذلك الأنسجة الدهنية) والمناطق الميتة المرئية عيانا باستخدام ملقط معقم وشفرة مشرط يمكن التخلص منها مثبتة على مقبض المشرط (الشكل 2C). اغسل قطع الورم 1-2 مرات مع DPBS الباردة 1x. جمع قطع الورم ونقلها إلى طبق بتري جديد معقم 90 ملم.
ملاحظة: نظرا لأن شفرات المشرط حادة، توخ الحذر عند التقطيع يدويا. يمكن تحديد الأنسجة الدهنية المجاورة للورم من خلال المناطق الناعمة والجيلاتينية والشاحبة المجاورة مباشرة لمحيط الورم البصري. تتطلب الأنسجة الدهنية العيانية ، والمناطق المظلمة التي تمثل مناطق النخر حكما شخصيا عند تشريح خزعة ورم المثانة الاستئصالية. - التقط صورة فوتوغرافية وارسم رسما تخطيطيا للأنسجة وخطط لتشريح الأنسجة على شبكة معالجة سريرية (الشكل 2B والشكل 2C).
ملاحظة: من المهم الاحتفاظ بسجل مرئي ورسم تقريبي لخصائص الورم العياني الفردية وتشريحها لكل حالة محددة. - تشريح قطع أنسجة الورم وتخصيصها للأمراض النسيجية (الشكل 2D) والتحليلات الجزيئية (الشكل 2E).
- للتحليلات النسيجية: ضع ما يقرب من 50 ملغ من أنسجة الورم في كاسيت الأنسجة البلاستيكية التي يمكن التخلص منها (الشكل 2D). قم بغمر كاسيت الأنسجة في حاوية بحجم 5x إلى 10x من الفورمالين المخزن مؤقتا المحايد بنسبة 10٪ (NBF). احتضان بين عشية وضحاها في RT.
- إزالة 10٪ NBF واستبدالها ب 70٪ (ث / ث) الإيثانول في اليوم التالي للتخزين في 4 درجات مئوية حتى يمكن معالجة الأنسجة باستخدام بروتوكول معالجة الأنسجة الروتيني
- للتحليلات الجزيئية: قم بتجميد قطعة ورم واحدة على الأقل 1-3 مم3 في قطعة مبردة خالية من RNase / DNase 1.5 مل باستخدام النيتروجين السائل وتخزينها عند -80 درجة مئوية (الشكل 2E).
- وزع 5 مل من الوسط العضوي (الجدول 1) في طبق بتري 90 مم الذي يحتوي على قطعة (قطع) الورم المتبقية.
- قم بفرم الأنسجة ميكانيكيا بأكبر قدر ممكن من الدقة (0.5-1 مم3 قطع أو أصغر) باستخدام شفرة مشرط معقمة # 10.
ملاحظة: ستستغرق الشظايا الأكبر أو أجزاء كاملة من الأنسجة (>3 مم3) وقتا أطول بكثير للهضم وستقلل من صلاحية العينة. احذف الخطوة المذكورة أعلاه إذا كانت الأنسجة مصنفة وكانت الشظايا صغيرة بما يكفي للماصة بطرف ماصة مصلية 5 مل. - انقل الأنسجة المفرومة ناعما إلى أنبوب مخروطي سعة 50 مل وأضف 4 مل من الوسط العضوي ، و 1 مل من 10x كولاجيناز / هيالورونيداز ، و 0.1 مجم / مل ديوكسي ريبونوكلياز 1 (DNase 1) لتجنب تكتل الخلايا.
ملاحظة: يجب تحضير محلول الإنزيم طازجا في كل مرة. زيادة حجم الوسط ليكون حوالي 10 أضعاف الكمية المرئية من شظايا الورم للعينات الكبيرة. - احتضن نسيج الورم المفروم ومحلول الإنزيم لمدة 1-2 ساعة على شاكر مداري أو دوار (150 دورة في الدقيقة) في حاضنة (37 درجة مئوية ، 5٪ CO2) لفصل الشظايا إلى تعليق خلوي وتحطيم الكولاجين. يمكن التحقق من ذلك من خلال التحليل النسيجي (الشكل 3A).
ملاحظة: إذا كانت كمية الأنسجة كبيرة أو لم يلاحظ أي تفكك واضح بعد 1-1.5 ساعة ، فقم بزيادة وقت الحضانة للتحقق من مستوى التفكك كل 30 دقيقة. يعتمد توقيت هذه الخطوة على العينة ويجب تحديده تجريبيا في كل مرة. يشير الحل الأكثر وضوحا بشكل ملحوظ مع شظايا الأنسجة التي لا يمكن تمييزها للعين (أو عدد قليل جدا من الشظايا) إلى الهضم الناجح. - إنهاء عملية الهضم بإضافة حجم 2x (20 مل) من الوسط القاعدي إلى العينة.
- قم بطرد العينة مركزيا بسرعة 261 × g لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة (RT) ، وقم بالشفط ، وتخلص من supernatant.
- لتحليل خلايا الدم الحمراء الملوثة (RBCs) ، أعد تعليق الكريات التي تم الحصول عليها من الخطوة المذكورة أعلاه في 5 مل من المخزن المؤقت للأمونيوم وكلوريد والبوتاسيوم (ACK). احتضن الأنبوب في RT لمدة 3 دقائق أو حتى يتم رؤية التحلل الكامل ل RBCs (يصبح التعليق واضحا).
ملاحظة: إذا لم يتم ملاحظة كرات الدم الحمراء ككتلة حمراء صغيرة في الكرية، فقد يتم حذف هذه الخطوة. - أضف 20 مل من الوسط القاعدي في الأنبوب. جهاز الطرد المركزي للأنبوب عند 261 × g لمدة 5 دقائق في RT وشفط السوبرناتان.
- في هذه الخطوة ، ضع أليكوت 10 مل من وسط عضوي 2x و 1x في حمام مائي 37 درجة مئوية للتدفئة.
- قم بتصفية العينة من خلال مصفاة 100 ميكرومتر قابلة للعكس قبل الرطب في أنبوب جديد سعة 50 مل لإزالة المواد الكبيرة غير القابلة للذوبان.
ملاحظة: قد تحتوي المواد الكبيرة غير المهضومة (>100 ميكرومتر) التي يجمعها المرشح على خلايا ذات أهمية ويمكن استزراعها في طبق بتري 90 مم أو صفيحة زراعة خلايا 6 آبار في وسط عضوي لاشتقاق مزارع ثنائية الأبعاد (الشكل 1 (الخطوة 5) والشكل 3B). - قم بتصفية المحلول من خلال مصفاة 37 ميكرومتر قابلة للعكس قبل الرطب لجمع الخلايا المفردة والمجموعات الصغيرة لعزل الخلايا الأحادية والخلايا المناعية (أنبوب 37-1; الشكل 1 (الخطوة 6) والشكل 3 باء).
ملاحظة: يمكن زيادة إنتاجية الخلايا السرطانية خلال هذه الخطوة عن طريق تمرير تعليق الخلايا المفلترة عبر المصفاة مرة أخرى. - عكس مصفاة 37 ميكرومتر واستخدام 10 مل من الوسائط القاعدية لجمع مجموعات صغيرة ومتوسطة الحجم (37-100 ميكرومتر) (أنبوب 70-1 ؛ الشكل 3 باء).
- قم بتعبئة كل من الأنابيب الجديدة سعة 50 مل (الأنابيب 70-1 و 37-1) باستخدام DPBS إلى 40 مل. قم بطرد مركزي للتعليق عند 261 × g لمدة 5 دقائق في RT. قم بشفط والتخلص من supernatant.
- أضف 10 مل من الوسائط القاعدية إلى الأنبوب 37-1 واحسب الخلايا باستخدام صبغة استبعاد التربان الزرقاء وعداد الخلايا الآلي (وفقا لمواصفات الشركة المصنعة). تحديد عدد الخلايا وصلاحية الخلايا.
- الطرد المركزي لبقية العينة عند 261 × g لمدة 5 دقائق في RT. استنشاق الوسط واستبدله بمحلول تجميد الخلايا أو الوسائط القاعدية التي تحتوي على 10٪ مصل بقري جنيني (FBS) ، و 1٪ بنسلين / ستربتومايسين ، و 10٪ ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO).
- ضع العينات في 1.5 مل من الكريوفيات وخزنها في حاوية لتجميد الخلايا. انقل الحاوية على الفور إلى ثلاجة -80 درجة مئوية للحصول على معدل تبريد مثالي. بعد تخزين الفريزر بين عشية وضحاها عند -80 درجة مئوية، انقل الكريوفيالات إلى سائل مبرد أو تخزين في مرحلة الهواء (-196 درجة مئوية) للتخزين على المدى الطويل.
- إعادة تعليق الخلايا من أنبوب 70-1 مع 500 ميكرولتر من وسط عضوي 2x مسخن مسبقا.
ملاحظة: يجب أن تكون كثافة البذر عالية لنجاح الانتشار العضوي. يجب تغيير حجم الوسط العضوي ، وبالتالي BME ، تجريبيا على عدد الخلايا المعزولة من خطوة الترشيح. توفر هذه الخطوة نقطة انطلاق ذات صلة بناء على الدراسات التي أجريت في مختبرنا. - أضف BME إلى الخلايا (بنسبة 1: 1 مع وسط عضوي 2x) مع أطراف ماصة مرشح معقمة P1000 باردة وتخلط بلطف لتعليق الخلايا. قم بسرعة وبعناية بماصة 100 ميكرولتر من الخلايا المعاد تشكيلها / خليط BME إلى آبار ذات لوحة مسطحة القاع ذات قاع مسطح منخفض للغاية من 96 بئرا. ضع الصفيحة المكونة من 96 بئرا في حاضنة (37 درجة مئوية ، 5٪ CO2) لمدة 20-30 دقيقة للتصلب.
- أضف نسبة 1: 2 من 1x وسط عضوي فوق تعليق خلية BME اعتمادا على الحجم الذي تم تقييمه تجريبيا. في نقطة البداية ذات الصلة ، أضف 50 ميكرولتر من 1x وسائط متوسطة عضوية فوق 100 ميكرولتر من الخلايا المعاد تشكيلها / خليط BME.
- ضع الصفيحة المكونة من 96 بئرا في حاضنة (37 درجة مئوية ، 5٪ CO2) لمدة 20 دقيقة لتحقيق التوازن.
- أخرج لوحة زراعة الخلايا من الحاضنة وقم بتجميعها على حامل عينة على مسرح المجهر. قم بتقييم المواد العضوية بصريا تحت تباين الطور أو إعدادات brightfield.
ملاحظة: من الأفضل الحصول على الصور بواسطة مجهر تباين الطور المقلوب المجهز ببصريات التداخل التفاضلي (DIC) والكاميرا الرقمية والبرامج المرتبطة بها لمراقبة تكوين PDOs كروية استعدادا لتحليل نقطة النهاية.- إذا كانت المجموعات المتميزة مرئية، ضع لوحة زراعة الخلايا في غرفة مجهر مسخنة إلكترونيا على خشبة المسرح (37 درجة مئوية، 5٪ CO2) لتصوير الخلايا الحية على مدار أول 24-72 ساعة.
- تأكد من توصيل طوق التسخين المرن بالعدسة لتقليل الانجراف الحراري وملء جهاز الترطيب ب dH2O.
- قم بإجراء التصوير الأولي باستخدام عدسة موضوعية 4x أو 10x (N.A. 0.30 ، W.D. 15.2 mm). الفاصل الزمني كل 5-10 دقائق على إعداد تباين الطور.
- تحقق من العزل الناجح كما يتميز بظهور >10 عضويات ذاتية التنظيم لكل بئر بعد فترة 24-72 ساعة.
- اسمح للمزارع بالاستمرار لمدة تصل إلى أسبوعين إذا كانت الأعداد العضوية منخفضة (الشكل 3C).
- قم بتعبئة الوسط كل 2-3 أيام باستخدام 50 ميكرولتر من الوسط العضوي المسخن مسبقا لتجديد عوامل النمو المستنفدة والحجم الكلي.
- احصل على صور (كما هو موضح في الخطوة 3.30) في الأيام 1 و2 و3 (سلسلة الفاصل الزمني)، وفي الأيام 5 و7 و10 قبل المرور (إن وجد).
ملاحظة: عادة ما يتم تمرير المواد العضوية (التي يتم ملاحظتها كهياكل مستديرة بشكل عام حيث لا يمكنك رؤية حواف الخلايا الفردية) بعد 7-10 أيام من الإعداد ، اعتمادا على نجاح العزلة. قبل أو بعد المرور ، يمكن علاج المواد العضوية بالسموم الخلوية أو العوامل العلاجية لمدة تصل إلى 6 أيام وقياس الاستجابة الدوائية باستخدام اختبارات صلاحية الخلايا والسمية الخلوية. بدلا من ذلك ، يمكن استرداد المواد العضوية من BME (باستخدام 1 mg / mL dispase) والمحفوظة بالتجميد (المصارف الحيوية) ، أو إعدادها للاختبار الجزيئي ، أو تضمينها وتقييمها نسيجيا (الشكل 4).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
تم تأسيس 3D العضوية بنجاح من مريض سرطان المثانة البشري TURBT وأنسجة استئصال المثانة. باختصار ، تسلط هذه التقنية الضوء على التكوين السريع للهياكل متعددة الخلايا 3D التي هي قابلة للحياة ومناسبة لتحليلات نقطة النهاية الأخرى مثل التقييم النسيجي ، والتوصيف الجزيئي (عن طريق الكيمياء النسيجية المناعية أو PCR الكمي في الوقت الفعلي) ، وفحص الأدوية. أثناء الإجراء (الشكل 1) ، يمكن الاستفادة من التوضيحات المختلفة خلال مراحل الترشيح لدينا (الشكل 1 ، الخطوات 1-6) للحفاظ على الخلايا المفردة بالتبريد لعزل الخلايا المناعية المتسللة إلى الورم (TILs) وتوليد بنك حيوي أحادي الخلية. يسمح هذا الإجراء ببنوك بيولوجية لجوانب متعددة من الورم الأولي غير المتجانس بشكل مناسب وبطريقة يمكن تتبعها عبر المرضى (الشكل 2A و B) ، بما في ذلك الأنسجة (الشكل 2C ، D) والعينات المجمدة الطازجة (الشكل 2E).
يسمح الهضم لمدة 2 ساعة باستخدام الكولاجيناز / الهيالورونيداز و DNase 1 المتاح تجاريا بهضم كاف من 0.5-1 مم3 قطع من أنسجة خزعة استئصال المثانة الأكثر تعقيدا ، بما في ذلك الخلايا الورمية داخل الصفيحة البروبريا والطبقات العضلية للمثانة (الشكل 3A). أثبتت شظايا ما بعد الهضم الأكبر حجما (>100 ميكرون) أنها مناسبة للزراعة في ألواح زراعة الأنسجة القياسية من أي حجم لعزل الثقافات ثنائية الأبعاد الجديدة (الشكل 3B). ومع ذلك ، هناك حاجة إلى توصيف جزيئي واسع النطاق للتحقق من صحة الأصل السرطاني لخطوط الخلايا هذه. تخضع المواد العضوية التي يتم إنشاؤها بنجاح باستخدام هذا البروتوكول لعمليات التجميع الذاتي الديناميكي ، بما في ذلك مراحل التجميع والضغط والتكوين النهائي ، حيث تتشكل في هياكل خلوية ضيقة (الشكل 3C) يمكن تقييمها للاستجابة للعلاجات القياسية للرعاية. يسلط الشكل 3C الضوء على خصائص التجميع الذاتي الفعالة للعضويات. من الناحية النسيجية ، تلخص هذه الهياكل ورم المريض الأصلي (الشكل 4). المواد العضوية المتولدة في هذا الإجراء مناسبة للعديد من الأغراض ، بما في ذلك مزيد من التوصيف ، والبنوك الحيوية ، واختبار فعالية الدواء (الشكل 5).
الشكل 1: التمثيل التخطيطي لزراعة الأنسجة العضوية من جمع عينات الورم من الجراحة إلى تحليلات نقطة النهاية. URN ، رقم سجل الوحدة ؛ TIL، الخلايا الليمفاوية المتسللة للورم. (1) يتم فرم الأنسجة ميكانيكيا في طبق بتري 90 مم بأكبر قدر ممكن من الدقة باستخدام شفرة مشرط معقمة (0.5-1 مم3 قطع). (2) يتم إعادة تعليق قطع الورم في وسط تفكك إنزيمي يتكون من الوسط العضوي ، الكولاجيناز / الهيالورونيداز ، و DNase 1. (3) يتم تحضين أنسجة الورم المفروم ومحلول الإنزيم لمدة 1-2 ساعة على حاضنة دوارة (150 دورة في الدقيقة ، 37 درجة مئوية ، 5٪ CO2) ثم يتم تكويرها (4) لفصل الشظايا إلى تعليق خلية أدق. تخضع العينة للترشيح من خلال مصافي قابلة للعكس قبل الرطب (5) 100 ميكرومتر و (6) 37 ميكرومتر في أنابيب جديدة سعة 50 مل لإزالة المواد الكبيرة غير القابلة للذوبان وعزل مجموعات 37-100 ميكرومتر. بعد (7) الطرد المركزي للجزء المعزول من الجزء الخلفي من مصفاة 37 ميكرومتر ، يتم تعليق مجموعات الخلايا في (8) BME والوسائط العضوية قبل (9) تصوير الخلايا الحية. تم إنشاؤها باستخدام BioRender.com. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: مناولة أنسجة الورم المعقمة من أجل إنشاء الأعضاء العضوية . (أ) عند الاستئصال والنقل إلى المختبر ، يتم وضع العينة في طبق بتري معقم ، ووزنها ، ثم تشريحها لاحقا. (ب) تستخدم شبكة تشريح العينة لوضع علامة على العينة لعمليات مختلفة. يظهر مثال على التشريح في (C) حيث يتم أخذ عينات من محيط الورم قدر الإمكان لتجنب مناطق النخر المركزي وشرحها (داخلي) قبل (D) جمع الأنسجة قبل تثبيت الأنسجة. شريط الميزان: 6 مم. شريط الميزان الداخلي: 4 مم (E) تؤخذ شظايا طازجة صغيرة للتجميد اللاحق والبنوك الحيوية. شريط الميزان: 5 مم. تم إنشاء عناصر هذه الصورة باستخدام BioRender.com. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: الاشتقاق الأنزيمي والتجميع الديناميكي للعضويات في ورم المثانة. (أ) صور تمثيلية للهيماتوكسيلين والإيوسين (H & E) أنسجة سرطان المثانة الأبوية الملطخة (علم الأمراض الذي تمت مراجعته على أنه T3bN0) على التثبيت الفوري (يسار) و 2 ساعة بعد الهضم مع 1x كولاجيناز / هيالورونيداز (يمين). شريط المقياس: 500 ميكرومتر. شريط المقياس الداخلي: 50 ميكرومتر (B) صور تمثيلية لعزلات >100 ميكرومتر و37-1 و70-1 (اليوم 2). تتم الإشارة إلى أشرطة المقياس داخل الصورة. (ج) يتم عرض صور تمثيلية لعزل سرطان المثانة العضوي على مدار 48 ساعة ويوم 7 من تلطيخ H & E العضوي. شريط المقياس: 50 ميكرومتر. شريط القياس للصورة في الجزء الداخلي: 20 ميكرومتر. DIC: تباين التداخل التفاضلي. تم إنشاء عناصر من هذه الصورة مع BioRender.com يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 4: تحافظ الثقافات العضوية المشتقة من سرطان المثانة على البنية النسيجية للأورام الأبوية. صورة H&E التمثيلية لسرطان المثانة منخفض الدرجة (Ta) وصورة المجال الساطع المقابلة للعضوي في اليوم 7 من الثقافة. تظهر اللوحة اليمينية المتطرفة تلطيخ H & E المرتبط باليوم 7 العضوي. يشار إلى أشرطة المقياس في الشكل. LG: درجة منخفضة ، BC: سرطان المثانة ، H & E: الهيماتوكسيلين والإيوسين ، و DIC: تباين التداخل التفاضلي. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5: التطبيقات النهائية مع المواد العضوية المشتقة من مريض سرطان المثانة. تم إنشاؤها باستخدام BioRender.com. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
| المضافه | النهائي كونك. | الأسهم كونك. | المذيبات | |
| الإعلام القاعدي | جلوتاماكس | 2 مللي متر | 1 م | كلوريد الصوديوم |
| هيبس | 10 مللي متر | 1 م | كلوريد الصوديوم / NaHPO4 حل مخزن مؤقتا | |
| مكملات للوسائط الكاملة | R-spondin 1 الوسائط المشروطة | 5٪ ضد / v | الوسائط المشروطة | DMEM / F-12 المتقدم |
| نوجين وسائل الإعلام المشروطة | 5٪ ضد / v | الوسائط المشروطة | DMEM / F-12 المتقدم | |
| إي جي إف | 50 نانوغرام/مل | 0.5 ملغم/مل | PBS / 0.1٪ BSA | |
| FGF-10 | 20 نانوغرام/مل | 100 ميكروغرام/مل | PBS / 0.1٪ BSA | |
| FGF-2 | 5 نانوغرام/مل | 50 ميكروغرام/مل | PBS / 0.1٪ BSA | |
| نيكوتيناميد | 10 مللي متر | 1 م | 1 غرام في 8.2 مل DDH20 | |
| N-أسيتيل-L-السيستين | 1.25 ملليمتر | 500 مللي متر | 40 مل DDH20 | |
| أ 83-01 | 0.5 ميكرومتر | 50 مللي متر | DMSO | |
| SB202190 | 10 ميكرومتر | 50 مللي متر | DMSO | |
| Y27632 | 10 ميكرومتر | 100 مللي متر | د د ح20 | |
| B-27 المضافة | 1X | 50x | ||
| البروستاجلاندين E2 | 1 ميكرومتر | 10 مللي متر | DMSO | |
| بريموسين | 100 ميكروغرام/مل | 50 ملغ / مل | ||
الجدول 1: المكملات الغذائية المستخدمة في الوسائط العضوية القاعدية والكاملة
الملف التكميلي: يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الملف.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
في حين أن بروتوكولات 3D العضوية المشتقة من أنسجة سرطان المثانة لا تزال في مهدها ، فهي مجال للبحث النشط والتحقيق السريري. هنا ، يتم تفصيل بروتوكول محسن لإنشاء PDOs لسرطان المثانة بنجاح والتي هي مناسبة لكل من عينات NMIBC و MIBC. يتكامل سير العمل هذا بالتوازي مع التجارب السريرية القائمة على المستشفيات ويأخذ في الاعتبار تراكم عينات البنك الحيوي ، بما في ذلك معالجة العينات النسيجية وبنوك الأنسجة المجمدة الطازجة ، وهو اعتبار مهم لخطوط الأنابيب العضوية السريرية. يعتمد هذا البروتوكول على الأساليب الحالية ويوفر منهجية موحدة لبناء خط أنابيب الطب الدقيق العضوي.
معدل النجاح الحالي لهذا البروتوكول - مثل غيره - هو حوالي 70٪ 25. ومن المتوقع أن يتحسن هذا مع تطور تقنيات العزل وتوصيف البيئة الدقيقة لورم سرطان المثانة. كما هو متوقع ، تؤثر جودة العينة الأولية على معدل النجاح وهي خطوة محدودة مهمة. توفر العينات التي تم الحصول عليها من مرضى العلاج الكيميائي الساذجين أعلى معدل نجاح ، في حين أن العينات من المرضى الذين تلقوا العلاج الكيميائي المساعد الجديد قد يكون لديهم عدد أقل من الخلايا القابلة للحياة26,27. عادة ، توفر عينات سرطان المثانة (من كل من TURBT واستئصال المثانة) كمية وافرة من العينات ذات الخلايا السرطانية العالية. وهذا يسمح بتوليد قوي من المواد العضوية التي تتراوح بين 30-100 ميكرومتر خلال فترة نمو 24-72 ساعة (بالنظر إلى بعض <يتم الاحتفاظ بمجموعات 40 ميكرومتر في خطوات الترشيح). الأهم من ذلك ، أن عدم التجانس الذي لوحظ في العينات العضوية (أي التكوينات الكيسية والهياكل الأكثر كثافة) يشير إلى أن هذا البروتوكول يوفر ظروفا مناسبة لاشتقاق مجموعات الخلايا السرطانية غير المتجانسة.
يمكن تنفيذ بروتوكولنا الأمثل على مواد أولية محدودة (كما هو الحال في بعض العمليات الجراحية الاختيارية ، بما في ذلك إجراءات TURBT أو العينات التي تم الحصول عليها من المرضى في تجربة سريرية) ، مما يتيح دمج تحليلات متعددة لزيادة قيمة العينة. يتضمن هذا البروتوكول طرقا لوصف خطوات زراعة 2D من الخلايا السرطانية الدخيلة ذات الأهمية التي قد توجد في أنسجة كبيرة غير قابلة للذوبان تتم معالجتها أثناء خطوة الترشيح الأولية. مثل المجموعات البحثية الأخرى التي تقترح معالجة العينات في غضون 24 ساعة بعد الجراحة28,29 ، لوحظ أن نقص الأكسجة في الأنسجة الذي يحدث خلال هذا الإطار الزمني لا يمنع توليد عضويات قابلة للحياة. مطلوب التحسين لتحديد كثافة الخلايا (المجموعات الأصلية) البذر لكل بئر. في تجربتنا ، يمكن أن تؤدي الأعداد المفرطة من المجموعات إلى ضعف نمو الثقافات ، في حين أن الثقافات منخفضة الكثافة البصرية يمكن أن تؤدي إلى موت الخلايا. يمكن تحديد ذلك من قبل المستخدم تجريبيا في سياق أحجامه التي يمكن تخفيفها ضمن نطاق حسب الضرورة. بالإضافة إلى ذلك ، غالبا ما تحتوي عينات TURBT على حواف محترقة بسبب عملية الاستئصال ، والتي تظهر كمناطق نخرية بارزة. الخطوة الحاسمة هي العزل الدقيق لأنسجة الورم العياني والتشريح اللاحق. هذا أمر بالغ الأهمية لاشتقاق ثقافات قابلة للحياة ويجب التواصل مع الفريق الجراحي. في بعض الحالات ، قد يكون هذا قيدا أوليا على الإجراء.
هناك قيد إضافي على التقنية الحالية وهو عدم وجود البيئة الدقيقة للورم بالتوازي مع المواد العضوية. ومن التطورات الضرورية نظم الزراعة المشتركة في المستقبل لزيادة التعقيد الخلوي وتوفير مكونات أخرى للبيئة الدقيقة للورم (أي السدى والخلايا المناعية). نظرا لأن المواد العضوية تعرف بأنها هياكل ذاتية التنظيم مع القدرة على إدامة نموها ذاتيا ، فستكون هناك حاجة إلى مزيد من العمل لتوضيح الخلايا الجذعية السرطانية المنفصلة (مثل CD44 و CD49) والتي قد تسمح بتحسين خصائص النمو في المختبر 31،32،33. إن الإثبات على وجه اليقين أن PDOs تنشأ من أنسجة الورم أمر بالغ الأهمية ، حيث أن المساهمة من الخلايا البولية الطبيعية في التحليلات الوظيفية والجزيئية سوف تربك التحقيقات في مقاومة الأدوية. في بعض الأحيان يكون أصل الورم للخلايا البولية في PDOs واضحا بسبب استخدام الأنسجة النقيلية أو الأورام الحليمية (كما هو الحال هنا ؛ انظر الشكل 4) ، ولكن عندما يتم استئصال النسيج المصدر من الغشاء المخاطي للمثانة وبالتالي يحتوي على هوامش من الظهارة البولية الحميدة ، فمن الأهمية بمكان التأكد من أن PDOs الناتجة تتكون من خلايا سرطانية باستخدام التقنيات الجزيئية. وبالتالي ، هناك حاجة إلى مقارنات مناعية وكيميائية وجينومية بين المواد العضوية الثابتة والورم الأساسي الذي اشتقت منه30.
فيما يتعلق بتوزيعات عدد وحجم المواد العضوية لكل بئر ، من الصعب الحفاظ على كثافة طلاء موحدة للعضويات 3D لتحليل السمية الخلوية. يتم تخفيف هذا قليلا عن طريق عزل نطاقات محددة باستخدام المرشحات ، لكنه لا يزال قيدا إذا تم عزل المجموعات الصغيرة والمواد العضوية الأكبر في نفس البئر. قد تخفف أجهزة فرز الجسيمات الكبيرة من هذه المشكلة ولكنها غير متوفرة على نطاق واسع في مختبرات الأبحاث الطبية. ومع ذلك ، فقد تم استخدام التقنيات التي تقيس إشارات الجدوى قبل وبعد العلاج بنجاح في المواد العضوية لسرطان المثانة34. ومع تقدم هذه التكنولوجيا، سيمكن ذلك الباحثين من تطوير مكتبة من منظمات تنمية نفط فلسطين لسرطان المثانة مع ملامح جينومية مختلفة، واستجابات ديناميكية دوائية يمكن استكشافها للتحقيق في علاجات جديدة. بالإضافة إلى ذلك ، فإن إجراء جمع العينات وطريقة التفكك الموصوفة هنا تسمح بالاستعدادات المتزامنة للتنميط المكاني للورم ، وقياس التدفق الخلوي متعدد المعلمات ، وتسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية. وإذا ما أخذنا ذلك معا، فإن هذا يسمح بمجموعة متنوعة من نقاط النهاية القوية التي يمكن جمعها معا لاستكشاف عدم تجانس الورم لدى المريض وإمكانية تطبيق الأدوية مثل العلاجات المناعية.
باختصار ، نحن نصف بروتوكولا لإنشاء وتقييم ثقافات المواد العضوية لسرطان المثانة المشتقة من المريض 3D في ظهور نقاط نهاية الطب الدقيق. من المهم ملاحظة أن الخطوات والملاحظات الموضحة هنا هي أساليب روتينية تستخدم لعزل PDOs لسرطان المثانة في مختبرنا. تم وصف الوسط الثقافي المستخدم في إجراءنا في الأصل لخلايا سرطان البروستاتا وقد ثبت الآن أنه مناسب لثقافة سرطان المثانة. الأهم من ذلك ، أن هذا البروتوكول مركزي ومناسب للاستخدام الروتيني في المختبرات ، وقابل للتطبيق على نطاق واسع عبر أنواع سرطان المسالك البولية. بالاقتران مع التنميط الظاهري الجزيئي عالي الدقة ونقاط نهاية الاستجابة للأدوية ، ستوفر هذه التقنية أداة مفيدة لاستكشاف الإدارة العلاجية الدقيقة لمرضى سرطان المثانة بسرعة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح.
Acknowledgments
ونعرب عن تقديرنا للمساعدة التقنية التي يقدمها معهد البحوث الانتقالية لعلم الأنسجة الأساسي ومرفق الموارد البيولوجية. تم دعم هذا البحث بتمويل من جائزة مؤسسة الأميرة ألكسندرا للأبحاث (I.V., E.D.W.) ، وبرنامج ترجمة البحوث التطبيقية السريعة التابع لصندوق مستقبل البحوث الطبية (MRFF) (مركز التحليل الشخصي للسرطانات (CPAC; E.D.W., I.V.). ويتلقى معهد البحوث الانتقالية الدعم من الحكومة الأسترالية.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.2 mL cryogenic vial | Corning | 430487 | |
| 1.5 mL Eppendorf tubes | Sigma-Aldrich | T9661-500EA | polypropylene single-use tube |
| 100 µM reversible strainer | STEMCELL Technologies | #27270 | |
| 100 mm Petri dish | Corning | 430167 | |
| 10x Collagenase/ Hyaluronidase | STEMCELL Technologies | #07912 | |
| 37 µM reversible strainer | STEMCELL Technologies | #27250 | |
| 37°C incubator | |||
| 37°C water bath | |||
| 50 mL falcon tube | Corning | CLS430829-500EA | |
| 6-well plate | Corning | CLS3516 | |
| 70% (w/w) ethanol | |||
| -80°C freezer | |||
| 96 well ultra low attachment plate (Black) | Sigma-Aldrich | CLS3474-24EA | |
| A 83-01 | BioScientific | 2939 | Prevents the growth-inhibitory effects of TGF-β |
| ACK lysis buffer | STEMCELL Technologies | #07850 | |
| adDMEM/F-12 | Thermo Fisher Scientific | 12634028 | Base medium |
| Animal-free recombinant EGF | Sigma-Aldrich | 518179 | Growth factor |
| Automated cell counter (TC20) | Bio-rad | 1450102 | |
| B27 additive | Gibco | 17504044 | Increases sphere-forming efficiency |
| Cell Counting Slides | Bio-rad | 1450015 | |
| Centrifuge | Eppendorf | EP022628188 | |
| Computer system | |||
| CryoStor CS10 | STEMCELL Technologies | #07930 | Cell freezing solution |
| Dispase II, powder | Thermofisher | 17105041 | To enzymatically disrupt Matrigel |
| DNAse 1 | STEMCELL Technologies | #07900 | |
| DPBS | Thermofisher | 14190144 | |
| Dry and wet ice | |||
| Esky | |||
| Farmdyne (Iodine 16g/L) | Ecolab | ||
| Formalin solution, neutral buffered, 10% | Sigma | HT501128 | Histological tissue fixative |
| Glutamax (L-alanine-L-glutamine) | Invitrogen | 35050061 | Source of nitrogen for the synthesis of proteins, nucleic acids |
| HEPES | Gibco | 15630-080 | All-purpose buffer |
| Histology cassette | ProSciTech | RCH44-W | |
| Human FGF-10 | Peprotech | 100-26-25 | Growth factor |
| Human FGF-2 | Peprotech | 100-18B-50 | Growth factor |
| Liquid nitrogen | |||
| Matrigel (Growth Factor Reduced (GFR), phenol red-free, LDEV free) | In Vitro Technologies | 356231 | Basement membrane extract (BME) |
| Mr. Frosty freezing container | ThermoFisher | 5100-0001 | cell freezing container |
| N-acetyl-L-cysteine (NAC) | Sigma | A7250 | Anti-oxidant required to protect against ROS-induced cytotoxicity |
| Nicotinamide | Sigma | N0636-100G | SIRT-1 inhibitor |
| NikonTs2U inverted microscope | Nikon | MFA510BB | |
| NIS-Elements Advanced Research | Nikon | MQS31000 | |
| Noggin conditioned media | In-house | BMP inhibitor | |
| Pipetboy acu 2 | Integra | 155000 | |
| Pipettes (p20, p100, p1000) with tips | |||
| Primocin | Jomar Bioscience | ant-pm2 | Combination of antibacterial and antifungal compounds to protect cell cultures from contaminations |
| Prostaglandin E2 (PGE2) | Tocris | 2296 | support proliferation of cells |
| Rotary tube mixer | Ratek | RSM7DC | |
| R-spondin 1 conditioned media | In-house | WNT signalling regulator | |
| SB202190 | Jomar Bioscience | s1077-25mg | Selective p38 MAP kinase inhibitor |
| Scale | |||
| Scalpel handle | Livingstone | WBLDHDL03 | |
| Scalpels, #11 blade | Medical and Surgical Requisites | EU-211-1 | |
| Serological pipettes (5, 10, 25 mL) | |||
| Specimen Waste Bags | Medical Search | SU09125X16 | |
| Urine specimen jar | |||
| Y27632 | Jomar Bioscience | s1049-10mg | Selective ROCK inhibitor. Increases survival of dissociated epithelial cells |
References
- Saginala, K., et al.
- Lindskrog, S. V., et al. An integrated multi-omics analysis identifies prognostic molecular subtypes of non-muscle-invasive bladder cancer. Nature Communications. 12 (1), 2301 (2021).
- Isharwal, S., Konety, B. Non-muscle invasive bladder cancer risk stratification. Indian Journal of Urology. 31 (4), 289-296 (2015).
- Lozano, F., Raventos, C. X., Carrion, A., Trilla, E., Morote, J. Current status of genetic urinary biomarkers for surveillance of non-muscle invasive bladder cancer: a systematic review. BMC Urology. 20 (1), 99 (2020).
- Batista, R., et al. TERT promoter mutation as a potential predictive biomarker in bcg-treated bladder cancer patients. Internation Journal of Molecular Science. 21 (3), 947 (2020).
- Patel, V. G., Oh, W. K., Galsky, M. D. Treatment of muscle-invasive and advanced bladder cancer in 2020. Cancer Journal for Clinicians. 70 (5), 404-423 (2020).
- Williams, S. B., et al. Estimated costs and long-term outcomes of patients with high-risk non-muscle-invasive bladder cancer treated with bacillus calmette-guérin in the veterans affairs health system. JAMA Network Open. 4 (3), 213800 (2021).
- Zhu, S., et al. Preclinical models for bladder cancer research. Hematology/Oncology Clinics of North America. 35 (3), 613-632 (2021).
- lvarez-Maestro, M., Guerrero-Ramos, F., Rodríguez-Faba, O., Domínguez-Escrig, J. L., Fernández-Gómez, J. M. Current treatments for BCG failure in non-muscle invasive bladder cancer (NMIBC). Actas Urológicas Españolas (English Edition). 45 (2), 93-102 (2021).
- Berry, D. L., et al. Treatment decision making in patients with bladder cancer. Bladder Cancer. 1 (2), 151-158 (2015).
- Drost, J., et al. Organoid culture systems for prostate epithelial and cancer tissue. Nature Protocols. 11 (2), 347-358 (2016).
- Kato, M., Sasaki, T., Inoue, T. Current experimental human tissue-derived models for prostate cancer research. International Journal of Urology. 28 (2), 150-162 (2021).
- Liu, L., Yu, L., Li, Z., Li, W., Huang, W. Patient-derived organoid (PDO) platforms to facilitate clinical decision making. Journal of Translational Medicine. 19 (1), 40 (2021).
- Joshi, A., Roberts, M. J., Alinezhad, S., Williams, E. D., Vela, I. Challenges, applications and future directions of precision medicine in prostate cancer - the role of organoids and patient-derived xenografts. British Journal of Urology International. 126 (1), 65-72 (2020).
- Pan, C. X., et al. Development and characterization of bladder cancer patient-derived xenografts for molecularly guided targeted therapy. PLoS One. 10 (8), 0134346 (2015).
- Gopinathan, A., Tuveson, D. A. The use of GEM models for experimental cancer therapeutics. Disease models & mechanisms. 1 (2-3), 83-86 (2008).
- Kemp, C. J. Animal models of chemical carcinogenesis: driving breakthroughs in cancer research for 100 years. Cold Spring Harbor Protocols. 2015 (10), 865-874 (2015).
- Day, C. P., Merlino, G., Van Dyke, T. Preclinical mouse cancer models: a maze of opportunities and challenges. Cell. 163 (1), 39-53 (2015).
- Kobayashi, T., Owczarek, T. B., McKiernan, J. M., Abate-Shen, C. Modelling bladder cancer in mice: opportunities and challenges. Nature Reviews Cancer. 15 (1), 42-54 (2015).
- Liu, W., et al. Conditional reprogramming: Modeling urological cancer and translation to clinics. Clinical Translational Medicine. 10 (2), 95 (2020).
- Yoshida, G. J. Applications of patient-derived tumor xenograft models and tumor organoids. Journal of Hematological Oncology. 13 (1), 4 (2020).
- Kim, J., Koo, B. K., Knoblich, J. A. Human organoids: model systems for human biology and medicine. Nature Reviews Molecular Cellular Biology. 21 (10), 571-584 (2020).
- Marshall, L. J., Triunfol, M., Seidle, T. Patient-derived xenograft vs. organoids: a preliminary analysis of cancer research output, funding and human health impact in 2014-2019. Animals. 10 (10), 1923 (2020).
- Gao, D., et al. Organoid cultures derived from patients with advanced prostate cancer. Cell. 159 (1), 176-187 (2014).
- Lee, S. H., et al. Tumor evolution and drug response in patient-derived organoid models of bladder cancer. Cell. 173 (2), 515-528 (2018).
- Kim, I. H., Lee, H. J. Perioperative immunotherapy for muscle-invasive bladder cancer. Translational Andrology and Urology. 9 (6), 2976-2985 (2020).
- Raphael, M. J., Booth, C. M. Neoadjuvant chemotherapy for muscle-invasive bladder cancer: Underused across the 49(th) parallel. Canadian Urological Association Journal. 13 (2), 29-31 (2019).
- Tiriac, H., French, R., Lowy, A. M. Isolation and characterization of patient-derived pancreatic ductal adenocarcinoma organoid models. Journal of Visualized Experiments. (155), e60364 (2020).
- Pleguezuelos-Manzano, C., et al. Establishment and culture of human intestinal organoids derived from adult stem cells. Current Protocols in Immunology. 130 (1), 106 (2020).
- Fusco, P., et al. Patient-derived organoids (PDOs) as a novel in vitro model for neuroblastoma tumours. BMC Cancer. 19 (1), 970 (2019).
- Mullenders, J., et al. Mouse and human urothelial cancer organoids: A tool for bladder cancer research. Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (10), 4567-4574 (2019).
- Vasyutinv, I., Zerihun, L., Ivan, C., Atala, A. Bladder organoids and spheroids: potential tools for normal and diseased tissue modelling. Anticancer Research. 39 (3), 1105-1118 (2019).
- Santos, C. P., et al. Urothelial organoids originating from Cd49fhigh mouse stem cells display Notch-dependent differentiation capacity. Nature Communications. 10 (1), 4407 (2019).
- Whyard, T., Liu, J., Darras, F. S., Waltzer, W. C., Romanov, V. Organoid model of urothelial cancer: establishment and applications for bladder cancer research. Biotechniques. 69 (3), 193-199 (2020).
