Summary
Hasta kaynaklı organoidler (PDO'lar), translasyonel kanser araştırmalarında, hastalığın hem genetik hem de fenotipik heterojenliğini ve kişiselleştirilmiş anti-kanser tedavilerine yanıtı yansıtan güçlü bir araçtır. Burada, fenotipik analizlerin ve ilaç yanıtlarının değerlendirilmesine hazırlık olarak insan primer mesane kanseri PDO'ları üretmek için konsolide bir protokol detaylandırılmıştır.
Abstract
Mevcut in vitro terapötik test platformları, tipik olarak doku kültürü plastiği üzerinde iki boyutlu (2D) kültürler olarak kurulan kanser hücre hatlarını kullanan tümör patofizyolojisi ile ilgisizdir. Terapötik yanıtı ve duyarlılığı doğru bir şekilde tahmin edebilen daha temsili tümör karmaşıklığı modellerine kritik bir ihtiyaç vardır. Taze tümör dokularından türetilen hasta kaynaklı organoidlerin (PDO'lar) üç boyutlu (3D) ex vivo kültürünün geliştirilmesi, bu eksiklikleri gidermeyi amaçlamaktadır. Organoid kültürler, potansiyel etkili müdahaleleri tanımlayarak ve yararsız olabilecek tedavileri belirterek terapötik kararları bilgilendirmek için rutin klinik yönetime paralel olarak tümör vekilleri olarak kullanılabilir. Burada, bu prosedür, taze, canlı klinik dokudan mesane kanseri PDO'larını oluşturmak için stratejileri ve ayrıntılı bir adım adım protokolü tanımlamayı amaçlamaktadır. İyi kurulmuş, optimize edilmiş protokollerimiz, doğrudan hastalardan veya hasta kaynaklı ksenogreft (PDX) tümör materyalinden sınırlı ve çeşitli başlangıç materyali kullanarak deneyler için 3D kültürler oluşturmak için pratiktir. Bu prosedür, standart doku kültürü ekipmanı ile donatılmış çoğu laboratuvar tarafından da kullanılabilir. Bu protokol kullanılarak üretilen organoidler, hem ürolojik kanser patolojisini destekleyen moleküler mekanizmaları anlamak hem de klinik yönetimi bilgilendirmek için tedavileri değerlendirmek için ex vivo vekiller olarak kullanılabilir.
Introduction
Mesane kanseri tüm dünyada en sık görülen üriner sistem kanseri ve onuncu en sık görülen insan malignitesidir1. Genetik olarak çeşitli ve fenotipik olarak karmaşık bir hastalık spektrumunu kapsar2. Mesane kanserinin ürotelyal non-kas invaziv formları (NMIBC) en sık görülen mesane kanseri tanılarıdır (%70-%80) ve bu kanserler önemli biyolojik heterojenite ve değişken klinik sonuçlar gösterir 2,3,4. NMIBC'li hastalar tipik olarak yüksek hastalık nüks riski (% 50-70) yaşarlar ve kanserlerin üçte biri önemli ölçüde daha agresif kas invaziv mesane kanserine (MIBC) ilerler ve gelişir2. NMIBC için 5 yıllık sağkalım oranları yüksek olmasına rağmen (%>90), bu hastalar uzun süreli klinik yönetime tabi tutulmalıdır5. Öte yandan, lokal olarak ilerlemiş (rezeke edilemez) veya metastatik MIBC genellikle tedavi edilemez olarak kabul edilir6. Sonuç olarak, mesane kanseri, kanser bakımı içinde en yüksek yaşam boyu tedavi maliyetlerinden birine sahiptir ve hem birey hem de sağlık sistemi için önemli bir yüktür 3,7. İleri evre hastalıkta altta yatan genetik anormallikler, mesane kanserinin terapötik yönetimini klinik bir zorluk haline getirmektedir ve invaziv ürotelyal tümörler için terapötik seçenekler, hem ileri hem de yüksek riskli NMIBC 8,9 için immünoterapilerin onaylanmasından bu yana yakın zamanda gelişmiştir. Günümüzde klinik karar verme, bireysel mesane kanseri tümörlerinin hastalık agresifliği ve tedaviye yanıtta büyük farklılıklar göstermesine rağmen, konvansiyonel klinik ve histopatolojik özelliklerle yönlendirilmektedir10. Bireysel hasta prognozunun tahminini ve etkili tedavilerin tanımlanmasını iyileştirmek için klinik olarak yararlı modellere yönelik araştırmaların hızlandırılmasına acil bir ihtiyaç vardır.
Üç boyutlu (3D) organoidler, orijinal tümörün içsel in vivo mimarisini ve farmakogenomik profilini kendi kendine organize etme ve özetleme yetenekleri ve türetildikleri orijinal dokunun doğal hücresel işlevselliğini yansıtma yetenekleri nedeniyle tümör modelleri olarak büyük potansiyel göstermektedir11,12,13 . Yerleşik mesane kanseri hücre hatları kolayca bulunabilse de, nispeten uygun maliyetli, ölçeklenebilir ve manipüle edilmesi basit olmasına rağmen, in vitro hücre hatları klinik mesane kanserlerinde gözlenen çeşitli genetik ve epigenetik değişikliklerin spektrumunu taklit etmekte büyük ölçüde başarısız olmuştur12,14 ve hepsi 2D, bağlı kültür koşulları altında kurulmuş ve sürdürülmüştür. Ek olarak, primer ve metastatik mesane tümörlerinden türetilen hücre hatları, orijinal tümör materyalinden önemli genetik ayrışma barındırmaktadır. 8,15.
Alternatif bir yaklaşım, genetiği değiştirilmiş ve kanserojen kaynaklı fare modellerini kullanmaktır. Bununla birlikte, bu modeller insan neoplazisinde yer alan bazı doğal onkojenik kaskadları özetlerken (refs 16,17,18'de gözden geçirilmiştir), tümör heterojenliğinden yoksundurlar, pahalıdırlar, invaziv ve metastatik mesane kanserini zayıf bir şekilde temsil ederler ve tümörlerin gelişmesi aylar sürebileceğinden hızlı süreli ilaç testi için uygun değildirler14,19 . Hasta kaynaklı kanser modelleri (organoidler, şartlı olarak yeniden programlanmış birincil hücre kültürü ve ksenogreftler dahil), klinik tedaviden önce ilaç tedavisinin etkilerini anlamak için paha biçilmez fırsatlar sunar20. Buna rağmen, az sayıda grup, taze primer hasta dokusuna sınırlı erişim ve hasta kaynaklı organoid (PDO) kültür koşullarını çoğaltılabilir bir şekilde üretmek için gereken kapsamlı optimizasyon nedeniyle bu hasta-proksimal modelleri rutin olarak kullanmaktadır. In vivo bir ortamda, onkojenik hücreler, stromal hücreler, bağışıklık hücrelerine sızan doku ve matris12 dahil olmak üzere çevredeki bileşenlerin çeşitli bileşimleriyle etkileşime girebilir ve iletişim kurabilir. Benzer şekilde, 3B formatında yetiştirilen PDO'lar için, hücresel/matris karmaşıklığı diğer ilgili bileşenleri içerecek şekilde özelleştirilebilir. PDO'lar hızlı bir şekilde üretilebilir ve21,22,23 sonlu bir ömre sahip olmasına rağmen, genellikle yaygın olarak geçirilebilir veya daha sonra kullanılmak üzere kriyokorunabilir. Farmakodinamik (yani, bir ilaca yanıt), organoid canlılık ve morfoloji ve immünohistokimya hedeflerinin veya transkripsiyonel değişikliklerin karakterizasyonu dahil olmak üzere çoklu okumalar kullanılarak değerlendirilebilir.
Burada, mesane tümörünün transüretral rezeksiyonundan (TURBT) toplanan hasta materyalinden mesane kanseri organoidlerinin kurulması veya mesanenin cerrahi olarak çıkarılması (radikal sistektomi) prosedürleri açıklanmaktadır. PDO'ları üretme yöntemi, hazır bulunan ıslak laboratuvar malzemeleri ve araçları kullanılarak gösterilmiştir. Son noktalar, hücre morfolojik özelliklerindeki ve canlılığındaki değişiklikleri içerir. Bunlar floresan mikroskopi, in vitro canlılık (metabolik ve hücre zarı bütünlüğü) testleri ve histopatolojik analiz kullanılarak ölçüldü. Şekil 1 , elektif cerrahi sırasında elde edilen klinik materyalden insan mesane kanseri PDO'larının kurulması için iş akışını göstermektedir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Hastalar, Avustralya'nın Brisbane kentindeki Princess Alexandra Hastanesi'ndeki Üroloji ekibi altında kabul edildikten sonra bu çalışmaya onay verdiler. Bu çalışma, Helsinki Deklarasyonu'nun ilkelerine uygun olarak, etik ve kurumsal kılavuzlar çerçevesinde gerçekleştirilmiştir (etik numarası HREC/05/QPAH/95, QUT 1000001165).
NOT: Uygunluk kriteri olarak, hastalar 18 yaşın ≥ kanserliydi ve anlayabiliyor ve onay verebiliyorlardı. Bilgilendirilmiş onam veremeyenler hariç tutuldu. İngilizce dışında bir ana dile sahip olanlar, lojistik ve bütçe hususları nedeniyle tercüman temini mümkün olmadığından hariç tutuldu. Ayrıca, tümörleri biyopsi için erişilebilir olmayan veya rutin patolojiden sonra yeterli miktarda bulunma olasılığı düşük olan hastalar da hariç tutuldu.
1. Organoid Orta Hazırlık
NOT: İnsan mesane kanseri organoid ortamı, ayrışmış klinik materyalden türetilen organoidlerin hayatta kalmasına, büyümesine ve sürekli genişlemesine yardımcı olan büyüme faktörleri gerektirir (Tablo 1). Bu prosedürde kullanılan her bir ekin tüm ayrıntıları için lütfen Malzeme Tablosuna bakın.
- Dondurulmuş malzemeleri buz üzerinde veya buzdolabında 2-8 ° C'de çözün. Tekrarlanan donma/çözülme döngülerinden kaçının ve dondurulmuş alikotlardan (-20 °C'de saklanır) çalışın.
- Bazal ortam: Gelişmiş Dulbecco'nun Modifiye Kartal Ortamı / Ham'ın F-12'sini (adDMEM / F12) HEPES (10 mM) ve glutamin (2 mM) ile destekleyerek bazal ortam hazırlayın. Bu aynı zamanda bir taşıma ortamı olarak ve organoid yıkama adımları sırasında da kullanılır.
NOT: Gelişmiş DMEM / F-12, sınırlı serum varlığında organoidlerin genişlemesine yardımcı olmak için bazal ortam olarak kullanılır; Bununla birlikte, HEPES ve L-glutamin ile takviye gerektirir. - Bileşenlerin şişenin dibinde olduğundan emin olmak için açılmadan önce fibroblast büyüme faktörü 10 (FGF-10), fibroblast büyüme faktörü 2 (FGF-2), epitel büyüme faktörü (EGF), SB202190, prostaglandin E2 (PGE2) ve A 83-01'i kısaca santrifüj edin.
- Tam organoid ortam: % 5 v / v, insan EGF (50 ng / mL), insan FGF-2 (5 ng / mL), insan FGF-10 (20 ng / mL), A 83-01 (500 nM), SB202190 (10 μM), B27 (1x), nikotinamid (10 mM), N-asetilsistein (1.25 mM), Y-27632 (10 μM), PGE2 (1 μM) ve üretici tarafından belirtilen konsantrasyonda geniş spektrumlu bir antibiyotik oluşumu ile insan noggin ve R-spondin 1 şartlandırılmış ortam ile ek bazal ortam.
- Organoid medyayı karanlıkta 4 °C'de saklayın ve 2 hafta içinde (en fazla 1 ay) kullanın. Donmayın. Işık kaynaklarına uzun süre maruz kalmaktan kaçının.
NOT: Organoid ortam serumsuz olarak hazırlanır; Bununla birlikte, serum ve penisilin / streptomisin gerektiğinde kullanıcıdan kullanıcıya bazda takviye edilebilir.
2. 3'te özetlenen prosedürden bir gün önce
- Çözülme büyüme faktörü, 4 °C'lik bir buzdolabında veya soğuk odada kullanılmadan önce en az 12 saat boyunca gece boyunca bazal membranı (BME; Malzeme Tablosuna bakınız) azalttı. Gerekirse, donma-çözülme döngülerini önlemek için BME'yi 1,5 mL'lik polipropilen tek kullanımlık bir tüpte 1 mL alikotlara dağıtın.
- Filtrelenmiş pipet uçlarını 4 °C'lik bir buzdolabına veya soğuk odaya yerleştirin.
NOT: Bu bölümde, erken polimerizasyonu önlemek ve uçların yüzeyindeki BME kaplamasını azaltmak için BME kullanılırken kullanılacak pipet uçları ele alınmaktadır. - İşlem için gerekli tüm cerrahi ekipmanı sterilize edin.
3. Mesane tümörü organoidlerinin oluşumu
NOT: Bu, primer hasta tümörlerinden PDO oluşumu için ilk adımdır. Bu prosedür, Gao ve ark.24 tarafından belirlenen yöntemlerden mesane kanseri dokuları için uyarlanmıştır.
- Numuneyi hazırlamak için sınıf II biyolojik tehlike başlığı kullanın. Kuru ve ıslak buzu alın ve Hasta Numune İşleme Sayfasını (Ek Dosya) yazdırın.
- Cerrahi rezeksiyon tamamlanmak üzereyken araştırma personelini ameliyathaneye çağırın.
NOT: Hastanın uygunluk kriterlerini karşıladığını ve katılımcı onay formunu imzaladığını onaylayın. Doku, yalnızca klinik histopatolojik değerlendirme için gerekliliklere fazlalık olması durumunda araştırma için sağlanır. - Ameliyattan taze makroskopik olarak uygulanabilir bir tümör örneği toplayın. Numunenin, taşıma sırasında steril 50 mL konik tüp veya idrar numunesi kavanozunda taşıma ortamına (1x adDMEM/F12 veya 1x Dulbecco'nun fosfat tamponlu salini (DPBS)) batırıldığından emin olun.
NOT: Bazı klinik merkezlerde, dokunun araştırma için tahsis edilmek üzere bir patoloji laboratuvarına taşınması gerekebilir. Bu koşullar altında, taşıma ortamına antibiyotik ve antimikotiklerin eklenmesi önerilir. Doku, ameliyat sonrası 24 saate kadar bazal ortamda 4 ° C'de saklanabilir ve yine de canlı organoid kültürler üretir. - Doku ağırlığı (g veya mg), numune açıklaması ve Hasta Numune İşleme Sayfası'ndaki (Ek Dosya) herhangi bir kan ve idrar örneğiyle ilgili ayrıntılar dahil olmak üzere numune ayrıntılarını kaydedin.
- Taşıma ortamını dikkatlice çıkarın ve 10 mL bazal medya ile değiştirin. Tümör dokusunun yerçekimi ile yerleşmesine izin verin.
NOT: Taşıma ortamı klinik atık olarak kabul edilir ve uygun miktarda dekontaminasyon çözeltisi içinde uygun şekilde etiketlenmiş bir atık kabında toplanmalıdır. Sıvı kimyasal olarak dekontamine edildikten sonra, tehlikeli atıklar için kurumsal kılavuzlara göre bertaraf edilebilir. - Tümör dokusunu forseps ile çıkarın ve steril 90 mm Petri kabına yerleştirin (Şekil 2A). Dokunun ağırlığını mg veya g cinsinden klinik numune işleme sayfasına ve diseksiyon ızgarasına kaydedin (Şekil 2B).
- Kanserli olmayan dokuları (yağ dokusu dahil) ve makroskopik olarak görülebilen nekrotik bölgeleri, neşter sapına monte edilmiş steril forseps ve tek kullanımlık neşter bıçağı kullanarak çıkarın (Şekil 2C). Tümör parçalarını soğuk 1x DPBS ile 1-2 kez yıkayın. Tümör parçalarını toplayın ve yeni bir steril 90 mm Petri Kabına aktarın.
NOT: Neşter bıçakları keskin olduğundan, manuel olarak dilimlerken dikkatli olun. Tümöre bitişik yağ dokusu, görsel tümör çevresine hemen bitişik belirgin yumuşak, jelatinimsi, soluk alanlarla tanımlanabilir. Makroskopik yağ dokusu ve nekroz alanlarını temsil eden fokal karanlık bölgeler, eksizyonel mesane tümörü biyopsisinden diseksiyon yaparken kişisel yargı gerektirecektir. - Bir fotoğraf çekin, bir doku diyagramı çizin ve klinik işlem ızgarasında doku diseksiyonunu planlayın (Şekil 2B ve Şekil 2C).
NOT: Her bir spesifik vaka için bireysel makroskopik tümör özelliklerinin ve diseksiyonunun görsel bir kaydını ve kaba bir taslağını tutmak önemlidir. - Tümör doku parçalarını diseke eder ve histopatolojik (Şekil 2D) ve moleküler analizler (Şekil 2E) için tahsis eder.
- Histolojik analizler için: Etiketli tek kullanımlık plastik histoloji kasetine yaklaşık 50 mg tümör dokusu yerleştirin (Şekil 2D). Histoloji kasetini 5x ila 10x hacimli% 10 nötr tamponlu formalin (NBF) içeren bir kaba batırın. RT'de bir gecede kuluçkaya yatırın.
- % 10 NBF'yi çıkarın ve ertesi gün% 70 (w / w) etanol ile değiştirin, doku rutin doku işleme protokolü kullanılarak işlenene kadar 4 ° C'de depolamak için
- Moleküler analizler için: Sıvı azot kullanarak RNaz / DNaz içermeyen 1.5 mL kriyovyalde en az bir adet1-3 mm3 tümör parçasını anında dondurun ve -80 ° C'de saklayın (Şekil 2E).
- Kalan tümör parçalarını içeren 90 mm'lik Petri kabına 5 mL organoid ortam (Tablo 1) dağıtın.
- Steril #10 neşter bıçağı ile dokuyu mümkün olduğunca ince (0,5-1 mm3 parça veya daha küçük) mekanik olarak kesin.
NOT: Daha büyük parçaların veya bütün doku parçalarının (>3mm3) sindirimi oldukça uzun sürecek ve numunenin canlılığını azaltacaktır. Doku ayrıştırılmışsa ve parçalar 5 mL serolojik pipet ucu ile pipet oluşturacak kadar küçükse yukarıdaki adımı atlayın. - İnce kıyılmış dokuyu 50 mL'lik bir konik tüpe aktarın ve hücre kümelenmesini önlemek için 4 mL organoid ortam, 1 mL 10x kollajenaz / hyaluronidaz ve 0.1 mg / mL deoksiribonükleaz 1 (DNaz 1) ekleyin.
NOT: Enzim çözeltisi her seferinde taze olarak hazırlanmalıdır. Ortamın hacmini, büyük örnekler için tümör fragmanlarının görünür miktarının yaklaşık 10 katı olacak şekilde artırın. - Kıyılmış tümör dokusunu ve enzim çözeltisini, fragmanları bir hücre süspansiyonuna ayırmak ve kollajenleri parçalamak için bir inkübatörde (37 ° C,% 5 CO 2) bir orbital çalkalayıcı veya rotatör (150 rpm) üzerinde1-2 saat boyunca inkübe edin. Bu histolojik analiz ile kontrol edilebilir (Şekil 3A).
NOT: Doku miktarı büyükse veya 1-1.5 saat sonra belirgin bir ayrışma gözlenmezse, her 30 dakikada bir ayrışma seviyesini kontrol ederek kuluçka süresini artırın. Bu adımın zamanlaması örneğe bağlıdır ve her seferinde ampirik olarak belirlenmelidir. Gözle fark edilemeyen doku parçaları (veya çok az parça) ile gözle görülür şekilde daha net bir çözelti, başarılı sindirimi gösterir. - Numuneye 2x hacim (20 mL) bazal ortam ekleyerek sindirimi sonlandırın.
- Numuneyi oda sıcaklığında (RT) 5 dakika boyunca 261 x g'de santrifüj yapın, aspire edin ve süpernatanı atın.
- Kirletici kırmızı kan hücrelerini (RBC'ler) lize etmek için, yukarıdaki adımdan elde edilen peleti 5 mL amonyum-klorür-potasyum (ACK) tamponunda yeniden askıya alın. Tüpü RT'de 3 dakika boyunca veya RBC'lerin tamamen lizisi görülene kadar inkübe edin (süspansiyon netleşir).
NOT: RBC'ler pelette küçük kırmızı bir küme olarak gözlenmezse, bu adım atlanabilir. - Tüpe 20 mL bazal ortam ekleyin. Tüpü RT'de 5 dakika boyunca 261 x g'de santrifüj yapın ve süpernatanı aspire edin.
- Bu adımda, ısınmak için 37 ° C'lik bir su banyosuna 10 mL'lik 2x ve 1x organoid ortamdan oluşan bir aliquot yerleştirin.
- Büyük çözünmez malzemeyi çıkarmak için numuneyi önceden ıslanmış tersinir 100 μm'lik bir süzgeçten yeni bir 50 mL tüpe filtreleyin.
NOT: Filtre tarafından toplanan büyük sindirilmemiş materyal (>100 μm) ilgilenilen hücreleri içerebilir ve 2B kültürleri türetmek için organoid ortamda 90 mm Petri kabında veya 6 delikli hücre kültürü plakasında kültürlenebilir (Şekil 1 (adım 5) ve Şekil 3B). - Tek hücreli ve immün hücre izolasyonu için tek hücreleri ve küçük kümeleri toplamak için ıslaklık öncesi tersinir 37 μm'lik bir süzgeçten elüatı filtreleyin (Tüp 37-1; Şekil 1 (adım 6) ve Şekil 3B).
NOT: Bu adımda tümör hücrelerinin verimi, filtrelenmiş hücre süspansiyonunun süzgeçten tekrar geçirilmesiyle arttırılabilir. - 37 μm süzgeci ters çevirin ve küçük ve orta büyüklükteki kümeleri (37-100 μm) toplamak için 10 mL bazal ortam kullanın (tüp 70-1; Şekil 3B).
- Yeni 50 mL tüplerin ( 70-1 ve 37-1 tüpleri) her birini DPBS ile 40 mL'ye kadar doldurun. RT'de 5 dakika boyunca süspansiyonu 261 x g'de santrifüj yapın.
- 37-1 numaralı tüpe 10 mL bazal ortam ekleyin ve tripan mavisi dışlama boyası ve otomatik bir hücre sayacı (üreticinin spesifikasyonlarına göre) kullanarak hücreleri sayın. Hücre sayısını ve hücrelerin yaşayabilirliğini belirleyin.
- Numunenin geri kalanını RT'de 5 dakika boyunca 261 x g'de santrifüj yapın. Ortamı aspire edin ve% 10 fetal sığır serumu (FBS),% 1 penisilin / streptomisin ve% 10 dimetil sülfoksit (DMSO) içeren hücre dondurma çözeltisi veya bazal medya ile değiştirin.
- Örnekleri 1,5 mL kriyovyallere yerleştirin ve hücre dondurucu bir kapta saklayın. Optimum soğutma hızı için kabı hemen -80 °C'lik bir dondurucuya aktarın. -80 °C'de gece boyunca dondurucu depolamanın ardından, kriyovalleri uzun süreli depolama için kriyojenik sıvı veya hava fazı depolamasına (-196 °C) aktarın.
- Hücreleri tüp 70-1'den 500 μL önceden ısıtılmış 2x organoid ortam ile yeniden askıya alın.
NOT: Başarılı organoid yayılımı için tohumlama yoğunluğu yüksek olmalıdır. Organoid ortamın hacmi ve daha sonra BME, filtrasyon adımından izole edilen hücre sayısına göre ampirik olarak değiştirilmelidir. Bu adım, laboratuvarımızdaki çalışmalara dayanan ilgili bir başlangıç noktası sağlar. - Buz gibi soğuk P1000 steril filtre pipet uçlarıyla hücrelere BME ekleyin (2x organoid ortam ile 1:1 oranında) ve hücreleri askıya almak için hafifçe karıştırın. 100 μL yeniden yapılandırılmış hücre/BME karışımını ultra düşük ataşmanlı düz tabanlı 96 delikli plakanın kuyularına hızlı ve dikkatli bir şekilde pipetleyin. Katılaşması için 96 delikli plakayı 20-30 dakika boyunca bir inkübatöre (37 °C, %5 CO2) yerleştirin.
- Ampirik olarak değerlendirilen hacme bağlı olarak BME hücre süspansiyonunun üzerine 1: 2 oranında 1x organoid ortam ekleyin. İlgili başlangıç noktasında, 100 μL yeniden yapılandırılmış hücre / BME karışımının üzerine 50 μL 1x organoid orta ortam ekleyin.
- Dengelemek için 96 delikli plakayı 20 dakika boyunca bir inkübatöre (37 °C, % 5 CO2) yerleştirin.
- Hücre kültürü plakasını inkübatörden çıkarın ve mikroskop sahnesindeki bir numune tutucuya monte edin. Organoidleri faz kontrastı veya parlak alan ayarları altında görsel olarak değerlendirin.
NOT: Görüntüler en iyi şekilde, uç nokta analizine hazırlık olarak küresel PDO'ların oluşumunu gözlemlemek için diferansiyel girişim (DIC) optikleri, dijital kamera ve ilgili yazılımlarla donatılmış ters çevrilmiş bir faz kontrastı mikroskobu ile elde edilir.- Farklı kümeler görülebiliyorsa, hücre kültürü plakasını ilk 24-72 saat boyunca canlı hücre görüntülemesi için sahnede elektronik olarak ısıtılan bir mikroskop odasına (37 ° C, % 5 CO 2) yerleştirin.
- Termal sapmayı azaltmak için esnek ısıtmalı tasmanın lense takılı olduğundan ve nemlendiricinin dH2O ile doldurulduğundan emin olun.
- İlk görüntülemeyi 4x veya 10x objektif lens (N.A. 0,30, W.D. 15,2 mm) kullanarak gerçekleştirin. Faz kontrastı ayarında her 5-10 dakikada bir hızlandırılmış çekim.
- 24-72 saatlik bir süreden sonra kuyu başına >10 kendi kendini organize eden organoidlerin ortaya çıkmasıyla karakterize edilen başarılı izolasyonu kontrol edin.
- Organoid sayıları düşükse kültürlerin iki haftaya kadar devam etmesine izin verin (Şekil 3C).
- Tükenmiş büyüme faktörlerini ve genel hacmi yenilemek için 50 μL önceden ısıtılmış organoid ortam kullanarak ortamı her 2-3 günde bir doldurun.
- 1, 2 ve 3. günlerde (hızlandırılmış seri) ve geçişten önceki 5, 7 ve 10. günlerde (varsa) görüntüleri (adım 3.30'da açıklandığı gibi) alın.
NOT: Organoidler (genellikle tek tek hücrelerin kenarlarını göremediğiniz yuvarlak yapılar olarak gözlenir), izolasyonun başarısına bağlı olarak, tipik olarak kurulumdan 7-10 gün sonra geçirilir. Pasajdan önce veya sonra, organoidler 6 güne kadar sitotoksik veya terapötik ajanlarla tedavi edilebilir ve hücre canlılığı ve sitotoksisite testleri kullanılarak ölçülen ilaç yanıtı. Alternatif olarak, organoidler BME'den (1 mg / mL dispase kullanılarak) alınabilir ve kriyokorunmuş (biyo bankalı), moleküler test için hazırlanabilir veya histolojik olarak gömülebilir ve değerlendirilebilir (Şekil 4).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
İnsan mesane kanseri hastası TURBT ve sistektomi dokularından 3D organoidler başarıyla kuruldu. Kısaca, bu teknik, histolojik değerlendirme, moleküler karakterizasyon (immünohistokimya veya kantitatif gerçek zamanlı PCR ile) ve ilaç taraması gibi diğer son nokta analizleri için hem uygulanabilir hem de uygun olan 3D çok hücreli yapıların hızlı oluşumunu vurgulamaktadır. İşlem sırasında (Şekil 1), filtrasyon aşamalarımız sırasında çeşitli elüatlar (Şekil 1, adım 1-6), tümöre sızan bağışıklık hücrelerinin (TIL'ler) izolasyonu ve tek hücreli bir biyobankanın oluşturulması için tek hücreleri kriyoproteksiyondan yararlanabilir. Prosedür, heterojen bir primer tümörün birçok yönünün uygun şekilde biyobanklanmasına ve histoloji (Şekil 2C, D) ve taze dondurulmuş örnekler (Şekil 2E) dahil olmak üzere hastalar arasında izlenebilecek şekilde (Şekil 2A, B) izin verir.
Ticari olarak temin edilebilen kollajenaz / hyaluronidaz ve DNaz 1 ile 2 saatlik bir sindirim, lamina propria içindeki neoplastik hücreler ve mesanenin kas tabakaları da dahil olmak üzere daha karmaşık sistektomi biyopsi dokusunun 0.5-1mm3 parçalarının yeterli sindirimine izin verir (Şekil 3A). Daha büyük sindirim sonrası fragmanların (>100 mikron), yeni 2D kültürlerin izolasyonu için herhangi bir boyuttaki standart doku kültürü plakalarındaki kültür için uygun olduğu kanıtlanmıştır (Şekil 3B). Bununla birlikte, bu tür hücre hatlarının kanser kökenini doğrulamak için kapsamlı moleküler karakterizasyon gereklidir. Bu protokolle başarılı bir şekilde üretilen organoidler, toplama, sıkıştırma ve son oluşum aşamaları da dahil olmak üzere dinamik kendi kendine montaj süreçlerinden geçerler ve bu sayede standart bakım tedavilerine yanıt için değerlendirilebilen sıkı hücresel yapılara (Şekil 3C) dönüşürler. Şekil 3C, organoidlerin verimli kendi kendine montaj özelliklerini vurgulamaktadır. Histolojik olarak bu yapılar orijinal hasta tümörünü özetler (Şekil 4). Bu prosedürde üretilen organoidler, daha fazla karakterizasyon, biyobankacılık ve ilaç etkinliği testi de dahil olmak üzere çok sayıda amaç için uygundur (Şekil 5).
Şekil 1: Cerrahiden tümör örneklerinin toplanmasından son nokta analizlerine kadar organoid doku kültürünün şematik gösterimi. URN, birim kayıt numarası; TIL, tümör infiltrasyonu yapan lenfosit. (1) Doku, steril bir neşter bıçağı (0,5-1 mm3 adet) ile 90 mm'lik bir petri kabında mekanik olarak mümkün olduğunca ince kıyılır. (2) Tümör parçaları organoid ortam, kollajenaz/hyaluronidaz ve DNaz 1'den oluşan enzimatik ayrışma ortamında yeniden askıya alınır. (3) Kıyılmış tümör dokusu ve enzim çözeltisi, bir rotator inkübatörde (150 rpm, 37 °C,% 5 CO 2)1-2 saat boyunca inkübe edilir ve daha sonra parçaları daha ince bir hücre süspansiyonuna ayırmak için peletlenir (4). Numune, büyük çözünmeyen malzemeyi çıkarmak ve 37-100 μm kümeleri izole etmek için ıslak öncesi geri dönüşümlü (5) 100 μm ve (6) 37 μm süzgeçlerden yeni 50 mL tüplere filtrelenir. (7) 37 μm süzgecin tersinden izole edilen fraksiyonun santrifüjlenmesini takiben, hücre kümeleri (9) canlı hücre görüntülemeden önce (8) BME ve organoid ortamlarda askıya alınır. BioRender.com ile oluşturuldu. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Organoid oluşumu için steril tümör dokusunun taşınması. (A) Eksizyon ve laboratuvara taşındıktan sonra, örnek steril bir petri kabına yerleştirilir, tartılır ve daha sonra diseke edilir. (B) Numuneyi çeşitli prosesler için işaretlemek üzere bir numune diseksiyon ızgarası kullanılır. Diseksiyonun bir örneği, merkezi nekroz alanlarından kaçınmak için tümör çevresinden mümkün olduğunca örneklerin alındığı ve (D) doku fiksasyonundan önce dokuyu brüt hale getirmeden önce açıklamalı (giriş) eklendiği (C) 'de gösterilmiştir. Ölçek çubuğu: 6 mm. İç ölçek çubuğu: 4 mm. (E) Daha sonra dondurma ve biyobankacılık için küçük taze parçalar alınır. Ölçek çubuğu: 5 mm. Bu görüntünün unsurları BioRender.com oluşturuldu. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Mesane tümörü organoidlerinin enzimatik türevi ve dinamik montajı . (A) Hematoksilin ve eozin (H&E) boyalı ebeveyn mesane kanseri dokusunun (patoloji T3bN0 olarak gözden geçirildi) acil fiksasyonda (solda) ve 1x kollajenaz / hyaluronidaz (sağda) ile 2 saat sonrasının temsili resimleri. Ölçek çubuğu: 500 μm. İç ölçek çubuğu: 50 μm. (B) >100 μm, 37-1 ve 70-1 (2 . gün) izolasyonlarının temsili görüntüleri. Ölçek çubukları görüntü içinde gösterilir. (C) Mesane kanseri organoid izolasyonu için 48 saat ve 7. gün organoid H&E boyama için temsili görüntüler gösterilmiştir. Ölçek çubuğu: 50 μm. Girişteki görüntü için ölçek çubuğu: 20 μm. DIC: diferansiyel girişim kontrastı. Bu resmin öğeleri BioRender.com ile oluşturulmuştur Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Mesane kanseri kaynaklı organoid kültürler ebeveyn tümörlerinin histolojik mimarisini korumaktadır. Düşük dereceli mesane kanserinin (Ta) temsili H&E görüntüsü ve kültürün 7. gününde organoidin karşılık gelen parlak alan görüntüsü. Aşırı sağ panel, 7. gün organoidinin ilişkili H&E boyamasını gösterir. Ölçek çubukları şekilde belirtilmiştir. LG: düşük dereceli, BC: mesane kanseri, H & E: hematoksilin ve eozin ve DIC: diferansiyel girişim kontrastı. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5: Mesane kanseri hastası kaynaklı organoidlerle aşağı akış uygulamaları. BioRender.com ile oluşturuldu. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
| Katkı | Son Conc. | Stok Conc. | Çözücü | |
| Bazal Medya | Glutamax | 2 mM | 1 milyon | Arjantin |
| HEPES | 10 mM | 1 milyon | NaCl/NaHPO4 tamponlu çözelti | |
| Tam medya için takviyeler | R-spondin 1 şartlandırılmış ortam | %5 d/v | Şartlandırılmış Medya | Gelişmiş DMEM/F-12 |
| Noggin şartlandırılmış medya | %5 d/v | Şartlandırılmış Medya | Gelişmiş DMEM/F-12 | |
| cesaret | 50 ng/mL | 0.5 mg/mL | PBS/%0,1 BSA | |
| FGF-10 Serisi | 20 ng/mL | 100 μg/mL | PBS/%0,1 BSA | |
| FGF-2 | 5 ng/mL | 50 μg/mL | PBS/%0,1 BSA | |
| Nikotinamid | 10 mM | 1 milyon | 1 g in 8.2 mL ddH20 | |
| N-asetil-L-sistein | 1,25 mM | 500 mM | 40 mL ddH20 | |
| A 83-01 | 0,5 μM | 50 mM | cesaret | |
| SB202190 | 10 μM | 50 mM | cesaret | |
| Y27632 · | 10 μM | 100 mM | ddH20 | |
| B-27 katkı maddesi | 1X | 50x | ||
| Prostaglandin E2 | 1 μM | 10 mM | cesaret | |
| Primosin | 100 μg/mL | 50mg/mL | ||
Tablo 1: Bazal ve tam organoid ortam için kullanılan takviyeler
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Mesane kanseri dokusundan türetilen 3D organoid protokoller henüz bebeklik döneminde olmakla birlikte, aktif bir araştırma ve klinik araştırma alanıdır. Burada, hem NMIBC hem de MIBC örnekleri için uygun olan mesane kanseri PDO'larını başarılı bir şekilde oluşturmak için optimize edilmiş bir protokol detaylandırılmıştır. Bu iş akışı, hastane tabanlı klinik çalışmalara paralel olarak entegre olur ve klinik organoid boru hatları için önemli bir husus olan histolojik numune işleme ve taze dondurulmuş doku bankacılığı dahil olmak üzere biyobanka numune tahakkukunu dikkate alır. Bu protokol mevcut yöntemlere dayanır ve organoid hassas tıp boru hattı oluşturmak için birleştirilmiş bir metodoloji sağlar.
Bu protokolün mevcut başarı oranı - diğerleri gibi - yaklaşık% 70 25'tir. İzolasyon teknikleri ve mesane kanseri tümör mikroçevresinin karakterizasyonu geliştikçe bunun iyileşeceği tahmin edilmektedir. Beklendiği gibi, ilk numunenin kalitesi başarı oranını etkiler ve önemli bir sınırlayıcı adımdır. Kemoterapi naif hastalardan elde edilen örnekler en yüksek başarı oranını sağlarken, neoadjuvan kemoterapi alan hastalardan elde edilen örnekler daha az sayıda canlı hücreye sahip olabilir26,27. Tipik olarak, mesane kanseri örnekleri (hem TURBT hem de sistektomilerden), yüksek tümör hücreselliğine sahip bol miktarda örnek sağlar. Bu, 24-72 saatlik bir büyüme periyodu içinde 30-100 μm arasında değişen sağlam organoid üretimine izin verir (filtrasyon adımlarında yaklaşık <40 μm kümelerin tutulması göz önüne alındığında). Önemli olarak, organoid örneklerde (yani kistik oluşumlar ve daha yoğun yapılar) gözlenen heterojenlik, bu protokolün heterojen tümör hücresi popülasyonlarını türetmek için uygun koşulları sağladığını göstermektedir.
Optimize edilmiş protokolümüz, sınırlı başlangıç materyali üzerinde gerçekleştirilebilir (TURBT prosedürleri veya klinik bir çalışmadaki hastalardan alınan örnekler de dahil olmak üzere bazı elektif ameliyatlarda olduğu gibi), numune değerini en üst düzeye çıkarmak için birden fazla analizin dahil edilmesini sağlar. Bu protokol, ilk filtrasyon adımı sırasında işlenen büyük çözünmez dokularda bulunabilecek yabancı tümör hücrelerinden 2D kültürü büyütme adımlarını tanımlamak için yöntemler içerir. Ameliyat sonrası 24 saat içinde örneklerin işlenmesini öneren diğer araştırma grupları gibi28,29, bu zaman diliminde ortaya çıkan doku hipoksisinin de canlı organoidlerin üretilmesini engellemediği gözlenmiştir. Kuyu başına hücre (yerel kümeler) tohumlama yoğunluğunu belirlemek için optimizasyon gereklidir. Deneyimlerimize göre, aşırı sayıda küme kültürlerin zayıf büyümesine neden olabilirken, düşük görsel yoğunluklu kültürler hücre ölümüne yol açabilir. Bu, kullanıcı tarafından, gerektiğinde bir aralıkta seyreltilebilen hacimleri bağlamında ampirik olarak belirlenebilir. Ek olarak, TURBT örnekleri genellikle rezeksiyon işlemi nedeniyle belirgin nekrotik bölgeler olarak belirgin olan yanmış kenarlar içerir. Kritik bir adım, makroskopik tümör dokusunun dikkatli bir şekilde izole edilmesi ve ardından diseksiyondur. Bu, uygulanabilir kültürlerin türetilmesi için çok önemlidir ve cerrahi ekiple iletişim kurulması gerekir. Bazı durumlarda, bu prosedür için ilk sınırlama olabilir.
Mevcut tekniğe ek bir sınırlama, organoidlere paralel tümör mikro ortamının olmamasıdır. Gerekli bir gelişme, hücresel karmaşıklığı arttırmak ve tümör mikro ortamının diğer bileşenlerini (yani stroma ve bağışıklık hücreleri) sağlamak için gelecekteki ortak kültür sistemleri olacaktır. Organoidler, büyümelerini kendi kendine sürdürme yeteneğine sahip kendi kendini organize eden yapılar olarak tanımlandığından, in vitro büyüme özelliklerinin 31,32,33 iyileşmesine izin verebilecek ayrık kanser kök hücrelerini (CD44 ve CD49 gibi) aydınlatmak için daha fazla çalışmaya ihtiyaç duyulacaktır. PDO'ların tümör dokusundan kaynaklandığını kesin olarak belirlemek kritik öneme sahiptir, çünkü fonksiyonel ve moleküler analizlerde normal ürotelyal hücrelerin katkısı, ilaç direncine yönelik araştırmaları karıştıracaktır. Bazen PDO'lardaki ürotelyal hücrelerin tümör kökeni, metastatik doku veya papiller tümörlerin kullanımı nedeniyle açıktır (burada olduğu gibi; bkz. Şekil 4), ancak kaynak doku mesane mukozasından eksize edildiğinde ve böylece benign ürotelyumun kenar boşluklarını içerdiğinde, ortaya çıkan PDO'ların moleküler teknikler kullanılarak tümör hücrelerinden oluştuğunu doğrulamak çok önemlidir. Bu nedenle, yerleşik organoidler ile türetildikleri primer tümör arasında immünohistokimyasal ve genomik karşılaştırmalar gereklidir30.
Organoidlerin kuyu başına sayı ve boyut dağılımları ile ilgili olarak, sitotoksisite analizi için 3D organoidlerin homojen kaplama yoğunluğunu korumak zordur. Bu, filtreler kullanılarak tanımlanmış aralıkların izole edilmesiyle biraz hafifletilir, ancak küçük kümelerin ve daha büyük organoidlerin aynı kuyuda izole edilmesi durumunda hala bir sınırlamadır. Büyük parçacık ayıklayıcıları bu sorunu hafifletebilir, ancak tıbbi araştırma laboratuvarlarında yaygın olarak bulunmaz. Bununla birlikte, tedaviden önce ve sonra canlılık sinyallerini ölçen teknikler mesane kanseri organoidlerinde başarıyla kullanılmıştır34. Bu teknoloji ilerledikçe, araştırmacıların değişen genomik profillere ve yeni tedavileri araştırmak için araştırılabilecek farmakodinamik yanıtlara sahip bir mesane kanseri PDO'ları kütüphanesi geliştirmelerini sağlayacaktır. Ek olarak, burada açıklanan numune toplama prosedürü ve ayrışma yöntemi, tümör uzamsal profilleme, multiparametrik akış sitometrisi ve tek hücreli RNA dizilimi için eşzamanlı preparatlara izin verir. Birlikte ele alındığında, bu, bir hastanın tümör heterojenliğini ve immünoterapiler gibi ilaçların uygulanabilirliğini keşfetmek için bir araya getirilebilecek çeşitli güçlü son noktalara izin verir.
Özetle, hassas tıp sonlanım noktalarının ortaya çıkışında 3D hasta kaynaklı mesane kanseri organoidlerinin kültürlerini oluşturmak ve değerlendirmek için bir protokol açıklıyoruz. Burada açıklanan basamak ve notların laboratuvarımızda mesane kanseri PDO'larını izole etmek için kullanılan rutin yaklaşımlar olduğunu belirtmek önemlidir. Prosedürümüzde kullanılan kültür ortamı başlangıçta prostat kanseri hücreleri için tanımlanmıştır ve şimdi mesane kanseri kültürü için uygun olduğu kanıtlanmıştır. Önemli olarak, bu protokol merkezileştirilmiştir, laboratuvarlarda rutin kullanım için uygundur ve ürolojik kanser türleri arasında geniş çapta uygulanabilir. Yüksek doğrulukta moleküler fenotipleme ve ilaç yanıtı sonlanım noktaları ile kombinasyon halinde, bu teknik mesane kanseri hastalarının kesin terapötik yönetimini hızlı bir şekilde araştırmak için yararlı bir araç sağlayacaktır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların çıkar çatışması yoktur.
Acknowledgments
Translasyonel Araştırma Enstitüsü Histoloji çekirdek ve Biyolojik Kaynak Tesisi'nin teknik yardımını kabul ediyoruz. Bu araştırma, Prenses Alexandra Araştırma Vakfı ödülü (I.V., E.D.W.) ve Tıbbi Araştırma Gelecek Fonu (MRFF) Hızlı Uygulamalı Araştırma Çeviri Programı (Kanserlerin Kişiselleştirilmiş Analizi Merkezi (CPAC; E.D.W., I.V.). Translasyonel Araştırma Enstitüsü, Avustralya Hükümeti'nden destek almaktadır.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.2 mL cryogenic vial | Corning | 430487 | |
| 1.5 mL Eppendorf tubes | Sigma-Aldrich | T9661-500EA | polypropylene single-use tube |
| 100 µM reversible strainer | STEMCELL Technologies | #27270 | |
| 100 mm Petri dish | Corning | 430167 | |
| 10x Collagenase/ Hyaluronidase | STEMCELL Technologies | #07912 | |
| 37 µM reversible strainer | STEMCELL Technologies | #27250 | |
| 37°C incubator | |||
| 37°C water bath | |||
| 50 mL falcon tube | Corning | CLS430829-500EA | |
| 6-well plate | Corning | CLS3516 | |
| 70% (w/w) ethanol | |||
| -80°C freezer | |||
| 96 well ultra low attachment plate (Black) | Sigma-Aldrich | CLS3474-24EA | |
| A 83-01 | BioScientific | 2939 | Prevents the growth-inhibitory effects of TGF-β |
| ACK lysis buffer | STEMCELL Technologies | #07850 | |
| adDMEM/F-12 | Thermo Fisher Scientific | 12634028 | Base medium |
| Animal-free recombinant EGF | Sigma-Aldrich | 518179 | Growth factor |
| Automated cell counter (TC20) | Bio-rad | 1450102 | |
| B27 additive | Gibco | 17504044 | Increases sphere-forming efficiency |
| Cell Counting Slides | Bio-rad | 1450015 | |
| Centrifuge | Eppendorf | EP022628188 | |
| Computer system | |||
| CryoStor CS10 | STEMCELL Technologies | #07930 | Cell freezing solution |
| Dispase II, powder | Thermofisher | 17105041 | To enzymatically disrupt Matrigel |
| DNAse 1 | STEMCELL Technologies | #07900 | |
| DPBS | Thermofisher | 14190144 | |
| Dry and wet ice | |||
| Esky | |||
| Farmdyne (Iodine 16g/L) | Ecolab | ||
| Formalin solution, neutral buffered, 10% | Sigma | HT501128 | Histological tissue fixative |
| Glutamax (L-alanine-L-glutamine) | Invitrogen | 35050061 | Source of nitrogen for the synthesis of proteins, nucleic acids |
| HEPES | Gibco | 15630-080 | All-purpose buffer |
| Histology cassette | ProSciTech | RCH44-W | |
| Human FGF-10 | Peprotech | 100-26-25 | Growth factor |
| Human FGF-2 | Peprotech | 100-18B-50 | Growth factor |
| Liquid nitrogen | |||
| Matrigel (Growth Factor Reduced (GFR), phenol red-free, LDEV free) | In Vitro Technologies | 356231 | Basement membrane extract (BME) |
| Mr. Frosty freezing container | ThermoFisher | 5100-0001 | cell freezing container |
| N-acetyl-L-cysteine (NAC) | Sigma | A7250 | Anti-oxidant required to protect against ROS-induced cytotoxicity |
| Nicotinamide | Sigma | N0636-100G | SIRT-1 inhibitor |
| NikonTs2U inverted microscope | Nikon | MFA510BB | |
| NIS-Elements Advanced Research | Nikon | MQS31000 | |
| Noggin conditioned media | In-house | BMP inhibitor | |
| Pipetboy acu 2 | Integra | 155000 | |
| Pipettes (p20, p100, p1000) with tips | |||
| Primocin | Jomar Bioscience | ant-pm2 | Combination of antibacterial and antifungal compounds to protect cell cultures from contaminations |
| Prostaglandin E2 (PGE2) | Tocris | 2296 | support proliferation of cells |
| Rotary tube mixer | Ratek | RSM7DC | |
| R-spondin 1 conditioned media | In-house | WNT signalling regulator | |
| SB202190 | Jomar Bioscience | s1077-25mg | Selective p38 MAP kinase inhibitor |
| Scale | |||
| Scalpel handle | Livingstone | WBLDHDL03 | |
| Scalpels, #11 blade | Medical and Surgical Requisites | EU-211-1 | |
| Serological pipettes (5, 10, 25 mL) | |||
| Specimen Waste Bags | Medical Search | SU09125X16 | |
| Urine specimen jar | |||
| Y27632 | Jomar Bioscience | s1049-10mg | Selective ROCK inhibitor. Increases survival of dissociated epithelial cells |
References
- Saginala, K., et al.
- Lindskrog, S. V., et al. An integrated multi-omics analysis identifies prognostic molecular subtypes of non-muscle-invasive bladder cancer. Nature Communications. 12 (1), 2301 (2021).
- Isharwal, S., Konety, B. Non-muscle invasive bladder cancer risk stratification. Indian Journal of Urology. 31 (4), 289-296 (2015).
- Lozano, F., Raventos, C. X., Carrion, A., Trilla, E., Morote, J. Current status of genetic urinary biomarkers for surveillance of non-muscle invasive bladder cancer: a systematic review. BMC Urology. 20 (1), 99 (2020).
- Batista, R., et al. TERT promoter mutation as a potential predictive biomarker in bcg-treated bladder cancer patients. Internation Journal of Molecular Science. 21 (3), 947 (2020).
- Patel, V. G., Oh, W. K., Galsky, M. D. Treatment of muscle-invasive and advanced bladder cancer in 2020. Cancer Journal for Clinicians. 70 (5), 404-423 (2020).
- Williams, S. B., et al. Estimated costs and long-term outcomes of patients with high-risk non-muscle-invasive bladder cancer treated with bacillus calmette-guérin in the veterans affairs health system. JAMA Network Open. 4 (3), 213800 (2021).
- Zhu, S., et al. Preclinical models for bladder cancer research. Hematology/Oncology Clinics of North America. 35 (3), 613-632 (2021).
- lvarez-Maestro, M., Guerrero-Ramos, F., Rodríguez-Faba, O., Domínguez-Escrig, J. L., Fernández-Gómez, J. M. Current treatments for BCG failure in non-muscle invasive bladder cancer (NMIBC). Actas Urológicas Españolas (English Edition). 45 (2), 93-102 (2021).
- Berry, D. L., et al. Treatment decision making in patients with bladder cancer. Bladder Cancer. 1 (2), 151-158 (2015).
- Drost, J., et al. Organoid culture systems for prostate epithelial and cancer tissue. Nature Protocols. 11 (2), 347-358 (2016).
- Kato, M., Sasaki, T., Inoue, T. Current experimental human tissue-derived models for prostate cancer research. International Journal of Urology. 28 (2), 150-162 (2021).
- Liu, L., Yu, L., Li, Z., Li, W., Huang, W. Patient-derived organoid (PDO) platforms to facilitate clinical decision making. Journal of Translational Medicine. 19 (1), 40 (2021).
- Joshi, A., Roberts, M. J., Alinezhad, S., Williams, E. D., Vela, I. Challenges, applications and future directions of precision medicine in prostate cancer - the role of organoids and patient-derived xenografts. British Journal of Urology International. 126 (1), 65-72 (2020).
- Pan, C. X., et al. Development and characterization of bladder cancer patient-derived xenografts for molecularly guided targeted therapy. PLoS One. 10 (8), 0134346 (2015).
- Gopinathan, A., Tuveson, D. A. The use of GEM models for experimental cancer therapeutics. Disease models & mechanisms. 1 (2-3), 83-86 (2008).
- Kemp, C. J. Animal models of chemical carcinogenesis: driving breakthroughs in cancer research for 100 years. Cold Spring Harbor Protocols. 2015 (10), 865-874 (2015).
- Day, C. P., Merlino, G., Van Dyke, T. Preclinical mouse cancer models: a maze of opportunities and challenges. Cell. 163 (1), 39-53 (2015).
- Kobayashi, T., Owczarek, T. B., McKiernan, J. M., Abate-Shen, C. Modelling bladder cancer in mice: opportunities and challenges. Nature Reviews Cancer. 15 (1), 42-54 (2015).
- Liu, W., et al. Conditional reprogramming: Modeling urological cancer and translation to clinics. Clinical Translational Medicine. 10 (2), 95 (2020).
- Yoshida, G. J. Applications of patient-derived tumor xenograft models and tumor organoids. Journal of Hematological Oncology. 13 (1), 4 (2020).
- Kim, J., Koo, B. K., Knoblich, J. A. Human organoids: model systems for human biology and medicine. Nature Reviews Molecular Cellular Biology. 21 (10), 571-584 (2020).
- Marshall, L. J., Triunfol, M., Seidle, T. Patient-derived xenograft vs. organoids: a preliminary analysis of cancer research output, funding and human health impact in 2014-2019. Animals. 10 (10), 1923 (2020).
- Gao, D., et al. Organoid cultures derived from patients with advanced prostate cancer. Cell. 159 (1), 176-187 (2014).
- Lee, S. H., et al. Tumor evolution and drug response in patient-derived organoid models of bladder cancer. Cell. 173 (2), 515-528 (2018).
- Kim, I. H., Lee, H. J. Perioperative immunotherapy for muscle-invasive bladder cancer. Translational Andrology and Urology. 9 (6), 2976-2985 (2020).
- Raphael, M. J., Booth, C. M. Neoadjuvant chemotherapy for muscle-invasive bladder cancer: Underused across the 49(th) parallel. Canadian Urological Association Journal. 13 (2), 29-31 (2019).
- Tiriac, H., French, R., Lowy, A. M. Isolation and characterization of patient-derived pancreatic ductal adenocarcinoma organoid models. Journal of Visualized Experiments. (155), e60364 (2020).
- Pleguezuelos-Manzano, C., et al. Establishment and culture of human intestinal organoids derived from adult stem cells. Current Protocols in Immunology. 130 (1), 106 (2020).
- Fusco, P., et al. Patient-derived organoids (PDOs) as a novel in vitro model for neuroblastoma tumours. BMC Cancer. 19 (1), 970 (2019).
- Mullenders, J., et al. Mouse and human urothelial cancer organoids: A tool for bladder cancer research. Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (10), 4567-4574 (2019).
- Vasyutinv, I., Zerihun, L., Ivan, C., Atala, A. Bladder organoids and spheroids: potential tools for normal and diseased tissue modelling. Anticancer Research. 39 (3), 1105-1118 (2019).
- Santos, C. P., et al. Urothelial organoids originating from Cd49fhigh mouse stem cells display Notch-dependent differentiation capacity. Nature Communications. 10 (1), 4407 (2019).
- Whyard, T., Liu, J., Darras, F. S., Waltzer, W. C., Romanov, V. Organoid model of urothelial cancer: establishment and applications for bladder cancer research. Biotechniques. 69 (3), 193-199 (2020).
