Summary
Pasientavledede organoider (PUD) er et kraftig verktøy i translasjonell kreftforskning, som reflekterer både den genetiske og fenotypiske heterogeniteten til sykdommen og responsen på personlige kreftbehandlinger. Her er en konsolidert protokoll for å generere pdoer for human primærblærekreft som forberedelse til evaluering av fenotypiske analyser og legemiddelresponser detaljert.
Abstract
Nåværende in vitro terapeutiske testplattformer mangler relevans for tumorpatofysiologi, vanligvis ved hjelp av kreftcellelinjer etablert som todimensjonale (2D) kulturer på vevskulturplast. Det er et kritisk behov for mer representative modeller av tumorkompleksitet som nøyaktig kan forutsi terapeutisk respons og følsomhet. Utviklingen av tredimensjonal (3D) ex vivo kultur av pasient-avledede organoider (PUD), avledet fra fersk tumor vev, tar sikte på å adressere disse manglene. Organoidkulturer kan brukes som tumorsurrogater parallelt med rutinemessig klinisk styring for å informere terapeutiske beslutninger ved å identifisere potensielle effektive intervensjoner og indikere terapier som kan være nytteløse. Her tar denne prosedyren sikte på å beskrive strategier og en detaljert trinnvis protokoll for å etablere blærekreft-PUD-er fra friskt, levedyktig klinisk vev. Våre veletablerte, optimaliserte protokoller er praktiske for å sette opp 3D-kulturer for eksperimenter ved hjelp av begrenset og mangfoldig startmateriale direkte fra pasienter eller pasientavledede xenograft (PDX) tumormateriale. Denne prosedyren kan også brukes av de fleste laboratorier utstyrt med standard vevskulturutstyr. Organoidene som genereres ved hjelp av denne protokollen kan brukes som ex vivo surrogater for å forstå både molekylære mekanismer som underbygger urologisk kreftpatologi og for å evaluere behandlinger for å informere klinisk styring.
Introduction
Blærekreft er den mest utbredte urinveiskreft og den tiende vanligste menneskelige maligniteten over hele verden1. Det omfatter et genetisk mangfoldig og fenotypisk komplekst spekter av sykdom2. Urotheliale ikke-muskel-invasive former for blærekreft (NMIBC) er de vanligste blærekreftdiagnosene (70% -80%), og disse kreftformene viser betydelig biologisk heterogenitet og variable kliniske utfall 2,3,4. Pasienter med NMIBC opplever vanligvis høy risiko for tilbakefall av sykdommer (50-70%) og en tredjedel av kreft vil utvikle seg og utvikle seg til betydelig mer aggressiv muskelinvasiv blærekreft (MIBC)2. Selv om 5-års overlevelsesraten for NMIBC er høy (>90%), må disse pasientene gjennomgå langsiktig klinisk behandling5. På den annen side anses lokalt avansert (unresectable) eller metastatisk MIBC generelt som uhelbredelig6. Blærekreft har derfor en av de høyeste livstidsbehandlingskostnadene innen kreftomsorg og er en betydelig belastning for både individet og helsevesenet 3,7. De underliggende genetiske avvikene ved avansert sykdom gjør terapeutisk behandling av blærekreft til en klinisk utfordring, og terapeutiske alternativer for invasive urotelale svulster har bare nylig forbedret seg siden godkjenningen av immunterapi for både avanserte og høyrisiko NMIBC 8,9. For tiden har klinisk beslutningstaking blitt styrt av konvensjonelle kliniske og histopatologiske egenskaper, til tross for individuelle blærekreftsvulster som viser store forskjeller i sykdoms aggressivitet og respons på terapi10. Det er et presserende behov for å akselerere forskning på klinisk nyttige modeller for å forbedre prediksjonen av individuell pasientprognose og identifisering av effektive behandlinger.
Tredimensjonale (3D) organoider viser stort potensial som tumormodeller på grunn av deres evne til selvorganisering og rekapitulering av den opprinnelige svulstens iboende in vivo-arkitektur og farmakogenomiske profil, og deres evne til å speile den opprinnelige cellulære funksjonaliteten til det opprinnelige vevet som de ble avledet 11,12,13 fra . Selv om etablerte blærekreftcellelinjer er lett tilgjengelige, relativt kostnadseffektive, skalerbare og enkle å manipulere, klarer in vitro-cellelinjene i stor grad ikke å etterligne spekteret av forskjellige genetiske og epigenetiske endringer observert i kliniske blærekreft12,14 og ble alle etablert og vedlikeholdt under 2D, tilhørende kulturforhold. I tillegg har cellelinjer avledet fra primære og metastatiske blæretumorer betydelig genetisk divergens fra det opprinnelige tumormaterialet. 815.
En alternativ tilnærming er å bruke genmodifiserte og kreftfremkallende musemodeller. Men mens disse modellene rekapitulerer noen av de naturlige onkogene kaskadene som er involvert i human neoplasi (gjennomgått i refs 16,17,18), mangler de tumor heterogenitet, er dyre, dårlig representerer invasiv og metastatisk blærekreft, og er ikke levedyktige for rask legemiddeltesting, da svulster kan ta mange måneder å utvikle 14,19 . Pasientavledede kreftmodeller (inkludert organoider, betinget omprogrammert primærcellekultur og xenografter) gir uvurderlige muligheter til å forstå effekten av legemiddelbehandling før klinisk behandling20. Til tross for dette bruker få grupper rutinemessig disse pasientproksimale modellene på grunn av begrenset tilgang til ferskt primær pasientvev og den omfattende optimaliseringen som kreves for å reprodusere pasientavledede organoide (PUD) kulturforhold. I en in vivo-setting kan onkogene celler samhandle og kommunisere med ulike sammensetninger av de omkringliggende bestanddelene, inkludert stromale celler, vev som infiltrerer immunceller og matrise12. På samme måte, for PUD-er som vokser i et 3D-format, kan cellulær / matrisekompleksitet tilpasses for å inkludere andre relevante komponenter. PUD-er kan genereres raskt og kan ofte overføres mye eller kryopreserveres til senere bruk, til tross for at de har en begrenset levetidpå 21,22,23. Farmakodynamikk (dvs. respons på et legemiddel) kan evalueres ved hjelp av flere avlesninger, inkludert organoid levedyktighet og morfologi, og karakterisering av immunhiistokjemiske mål eller transkripsjonelle endringer.
Her beskrives prosedyrene for etablering av blærekreftorganoider fra pasientmateriale samlet inn fra transuretral reseksjon av blæresvulst (TURBT) eller kirurgisk fjerning av blæren (radikal cystektomi). Metoden for å generere PUD-er er illustrert ved hjelp av lett tilgjengelige våte laboratoriematerialer og verktøy. Endepunkter inkluderer endringer i cellemorfologiske egenskaper og levedyktighet. Disse ble målt ved hjelp av fluorescensmikroskopi, in vitro levedyktighet (metabolsk og cellemembranintegritet) analyser, og histopatologiske analyser. Figur 1 viser arbeidsflyten for etablering av PDOer for human blærekreft fra klinisk materiale oppnådd under elektiv kirurgi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Pasienter har samtykket til denne studien etter at de ble innlagt under urologiteamet ved Princess Alexandra Hospital, Brisbane, Australia. Denne studien ble utført i samsvar med prinsippene i Helsinkideklarasjonen og innenfor etiske og institusjonelle retningslinjer (etikknummer HREC/05/QPAH/95, QUT 1000001165).
MERK: Som kvalifikasjonskriterier ble pasienter i alderen ≥ 18 år med kreft, og i stand til å forstå og gi samtykke. De som ikke var i stand til å gi informert samtykke ble utelukket. De som hadde et annet primærspråk enn engelsk ble utelukket da levering av tolker ikke var mulig på grunn av logistiske og budsjettmessige hensyn. Også utelukket var pasienter hvis svulster ikke var tilgjengelige for biopsi eller usannsynlig å være tilgjengelige i tilstrekkelig mengde etter rutinemessig patologi.
1. Organoid medium forberedelse
MERK: Organoid medium for human blærekreft krever vekstfaktorer som bidrar til overlevelse, vekst og kontinuerlig utvidelse av organoider avledet fra dissosiert klinisk materiale (tabell 1). Hvis du vil ha mer informasjon om hvert tillegg som brukes i denne prosedyren, kan du se materialfortegnelsen.
- Tine frosne ingredienser på is eller i kjøleskap ved 2-8 °C. Unngå gjentatte fryse-/tinesykluser og arbeid fra frosne aliquots (lagret ved -20 °C).
- Basal medium: Forbered basal medium ved å supplere avansert Dulbeccos Modified Eagle Medium/Hams F-12 (adDMEM/F12) med HEPES (10 mM) og glutamin (2 mM). Dette brukes også som transportmedium, og under organoid vasketrinn.
MERK: Avansert DMEM/F-12 brukes som basalmedium for å hjelpe til med utvidelse av organoider i nærvær av begrenset serum; Det krever imidlertid tilskudd med HEPES og L-glutamin. - Kort sentrifugering fibroblast vekstfaktor 10 (FGF-10), fibroblast vekstfaktor 2 (FGF-2), epitel vekstfaktor (EGF), SB202190, prostaglandin E2 (PGE2) og A 83-01 før åpning for å sikre at komponentene er på bunnen av hetteglasset.
- Komplett organoid medium: Supplere basal medium med humant noggin- og R-spondin 1-betinget medium ved en endelig konsentrasjon på 5% v / v, menneskelig EGF (50 ng / ml), menneskelig FGF-2 (5 ng / ml), menneskelig FGF-10 (20 ng / ml), A 83-01 (500 nM), SB202190 (10 μM), B27 (1x), nikotinamid (10 mM), N-acetylcysteine (1,25 mM), Y-27632 (10 μM), PGE2 (1 μM) og en bredspektret antibiotikadannelse ved konsentrasjonen indikert av produsenten.
- Oppbevar organoide medier ved 4 °C i mørket og bruk det innen 2 uker (maksimalt 1 måned). Skal ikke fryses. Unngå utvidet eksponering for lyskilder.
MERK: Det organoide mediet er tilberedt serumfritt; Serum og penicillin/streptomycin kan imidlertid suppleres på bruker-til-bruker-basis etter behov.
2. En dag før prosedyren skissert i 3
- Tine vekstfaktor redusert kjellermembran (BME; se Materialbord) over natten i minst 12 timer før bruk i kjøleskap eller kjølerom ved 4 °C. Om nødvendig, dispenser BME i 1 ml aliquots i et 1,5 ml polypropylen engangsrør for å unngå fryse-tine sykluser.
- Plasser filtrerte pipettespisser i kjøleskap eller kjølerom på 4 °C.
MERK: Denne delen refererer til pipettespisser som vil bli brukt ved håndtering av BME for å forhindre for tidlig polymerisering og redusere belegget av BME på overflaten av spissene. - Steriliser alt kirurgisk utstyr som kreves for prosedyren.
3. Generering av blæretumororganoider
MERK: Dette er et første skritt for PUD-etablering fra primære pasientsvulster. Denne prosedyren er tilpasset blærekreftvev fra metoder etablert av Gao et al.24.
- Bruk en klasse II biofare hette for å forberede prøven. Hent tørr og våt is og skriv ut pasientprøvebehandlingsarket (tilleggsfil).
- Ring forskningspersonell til operasjonsrommet når kirurgisk reseksjon er nær fullført.
MERK: Bekreft at pasienten oppfyller kvalifikasjonskriteriene og har signert samtykkeskjemaet til deltakeren. Vev er kun gitt til forskning hvis overskudd til krav til klinisk histopatologisk vurdering. - Samle en frisk makroskopisk levedyktig tumorprøve fra kirurgi. Sørg for at prøven er nedsenket i transportmedium (enten 1x adDMEM/F12 eller 1x Dulbeccos fosfatbufrede saltvann (DPBS)) i et sterilt 50 ml konisk rør eller urinkanneprøve under transport.
MERK: På noen kliniske sentre kan vev måtte transporteres til et patologilaboratorium for å bli tildelt forskning. Under disse omstendighetene anbefales det at antibiotika og antimykotika legges til transportmediet. Vev kan lagres ved 4 °C i basalmedium i opptil 24 timer etter operasjonen og genererer fortsatt levedyktige organoidkulturer. - Registrer prøvedetaljer, inkludert vevsvekt (g eller mg), prøvebeskrivelse og detaljer om eventuelle blod- og urinprøver på pasientprøvebehandlingsarket (tilleggsfil).
- Fjern transportmediet forsiktig og erstatt det med 10 ml basale medier. La tumorvevet slå seg ned med tyngdekraften.
MERK: Transportmediet regnes som klinisk avfall og må samles i en riktig merket avfallsbeholder i en passende mengde dekontamineringsløsning. Når væsken er kjemisk dekontaminert, kan den avhendes i henhold til institusjonelle retningslinjer for farlig avfall. - Fjern tumorvevet med tang og legg det i en steril 90 mm Petri-tallerken (figur 2A). Registrer vevets vekt i mg eller g på det kliniske prøvebehandlingsarket og disseksjonsgitteret (figur 2B).
- Fjern ikke-kreftvev (inkludert fettvev) og makroskopisk synlige nekrotiske områder ved hjelp av sterile tang og engangs skalpellblad montert på skalpellhåndtak (figur 2C). Vask tumorstykker 1-2 ganger med kaldt 1x DPBS. Samle svulststykkene og overfør dem til en ny steril 90 mm Petri Dish.
MERK: Siden skalpellbladene er skarpe, må du være forsiktig når du skjærer manuelt. Tumor-tilstøtende fettvev kan identifiseres ved tydelig myke, gelatinøse, bleke områder rett ved siden av den visuelle svulsten. Makroskopisk fettvev, og brennvide mørke områder som representerer områder av nekrose, vil kreve personlig vurdering når de dissekerer fra en eksisjonell blæresvulstbiopsi. - Ta et bilde, tegn et diagram over vev og planlegg vevsdisse på et klinisk behandlingsgitter (figur 2B og figur 2C).
MERK: Det er viktig å holde en visuell oversikt og grov skisse av de enkelte makroskopiske tumoregenskapene og disseksjonen for hvert enkelt tilfelle. - Disseker tumorvevstykker og alloker for histopatologiske (figur 2D) og molekylære analyser (figur 2E).
- For histologiske analyser: Plasser ca. 50 mg tumorvev i en merket engangspastett for plast histologi (figur 2D). Senk histologikassetten ned i en beholder med 5x til 10x volum 10% nøytral bufret formalin (NBF). Inkuber over natten på RT.
- Fjern 10% NBF og erstatt med 70% (w / w) etanol neste dag for lagring ved 4 °C til vev kan behandles ved hjelp av rutinemessig vevsbehandlingsprotokoll
- For molekylære analyser: Trykk på minst ett 1-3 mm3 tumorstykke i en RNase/DNasefri 1,5 ml kryonal ved hjelp av flytende nitrogen og oppbevar ved -80 °C (figur 2E).
- Dispenser 5 ml organoidmedium (tabell 1) i 90 mm Petri-retten som inneholder de resterende svulststykkene.
- Mekanisk hakkevev så fint som mulig (0,5-1 mm3 stykker eller mindre) med et sterilt #10 skalpellblad.
MERK: Større fragmenter eller hele biter av vev (>3 mm3) vil ta betydelig lengre tid å fordøye og vil redusere levedyktigheten til prøven. Utelat trinnet ovenfor hvis vevet er oppløst og fragmenter er små nok til å pipette med en 5 ml serologisk pipettespiss. - Overfør fint hakket vev til et 50 ml konisk rør og tilsett 4 ml organoid medium, 1 ml 10x kollagenase/hyaluronidase og 0,1 mg/ml deoksyribonuklease 1 (DNase 1) for å unngå cellekumping.
MERK: Enzymoppløsningen skal tilberedes på nytt hver gang. Øk volumet på mediet til å være ca. 10 ganger den synlige mengden av tumorfragmentene for store prøver. - Inkuber hakket tumorvev og enzymoppløsning i 1-2 timer på en orbital shaker eller rotator (150 rpm) i en inkubator (37 °C, 5 % CO2) for å fjerne fragmenter i en celleoppheng og bryte ned kollagener. Dette kan kontrolleres med histologisk analyse (figur 3A).
MERK: Hvis mengden vev er stor eller ingen åpenbar dissosiasjon observeres etter 1-1,5 timer, øk inkubasjonstiden ved å sjekke dissosiasjonsnivået hvert 30. Tidsberegningen for dette trinnet avhenger av prøven og må bestemmes empirisk hver gang. En merkbart klarere løsning med vevsfragmenter uutslettelig for øyet (eller svært få fragmenter) indikerer vellykket fordøyelse. - Avslutt fordøyelsen med tilsetning av 2x volum (20 ml) basalmedium til prøven.
- Sentrifuger prøven ved 261 x g i 5 minutter ved romtemperatur (RT), aspirer og kast supernatanten.
- For å lyse forurensende røde blodlegemer (RBCer), resuspend pellet oppnådd fra ovennevnte trinn i 5 ml ammonium-klorid-kalium (ACK) buffer. Inkuber røret på RT i 3 minutter eller til rbcenes fullstendige lysis er sett (suspensjonen blir klar).
MERK: Hvis RBCer ikke observeres som en liten rød klump i pelletsen, kan dette trinnet utelates. - Tilsett 20 ml av basalmediet i røret. Sentrifuger røret på 261 x g i 5 min ved RT og aspirer supernatanten.
- På dette trinnet, plasser en 10 ml aliquot av 2x og 1x organoid medium i et 37 °C vannbad for å varme.
- Filtrer prøven gjennom en for-våt reversibel 100 μm sil i et nytt 50 ml rør for å fjerne stort uoppløselig materiale.
MERK: Stort ufordøyd materiale (>100 μm) samlet inn av filteret kan inneholde celler av interesse og kan dyrkes i 90 mm Petri-tallerken eller 6-brønns cellekulturplate i organoid medium for å utlede 2D-kulturer (figur 1 (trinn 5) og figur 3B). - Filtrer eluate gjennom en pre-våt reversibel 37 μm sil for å samle enkeltceller og små klynger for encellet og immuncelleisolasjon (Rør 37-1; Figur 1 (trinn 6) og figur 3B).
MERK: Utbyttet av tumorceller i løpet av dette trinnet kan økes ved å sende den filtrerte cellefjæringen gjennom silen igjen. - Snu 37 μm silen og bruk 10 ml basale medier for å samle små og moderate klynger (37-100 μm) (rør 70-1; Figur 3B).
- Fyll opp hvert av de nye 50 ml rørene (rør 70-1 og 37-1) med DPBS til 40 ml. Sentrifuger suspensjonen ved 261 x g i 5 minutter ved RT. Aspirer og kast supernatanten.
- Tilsett 10 ml basale medier i rør 37-1 og tell cellene ved hjelp av trypan blå eksklusjonsfargestoff og en automatisert celleteller (i henhold til produsentens spesifikasjoner). Bestem cellenummeret og levedyktigheten til celler.
- Sentrifuger resten av prøven ved 261 x g i 5 min ved RT. Aspirer mediet og erstatt det med cellefrysingsløsning eller basale medier som inneholder 10% foster bovint serum (FBS), 1% penicillin / streptomycin og 10% dimetylsulfoksid (DMSO).
- Plasser prøver i 1,5 ml kryolegemer og oppbevar dem i en cellefrysingsbeholder. Overfør beholderen umiddelbart til en -80 °C fryser for optimal kjølehastighet. Etter lagring av fryser over natten ved -80 °C, overfør kryovariene til kryogen væske- eller luftfaselagring (-196 °C) for langtidslagring.
- Resuspend celler fra rør 70-1 med 500 μL forvarmet 2x organoid medium.
MERK: Såingstettheten må være høy for vellykket organoid forplantning. Volumet av det organoide mediet og deretter BME bør endres empirisk på antall celler isolert fra filtreringstrinnet. Dette trinnet gir et relevant utgangspunkt basert på studier i vårt laboratorium. - Tilsett BME i celler (med et 1:1-forhold med 2x organoid medium) med iskalde P1000 sterile filterpipettespisser og bland forsiktig for å suspendere celler. Rør raskt og forsiktig 100 μL rekonstituerte celler/ BME-blanding til brønner av en ultra-lav feste flatbunns 96-brønnsplate. Plasser 96-brønnsplaten i en inkubator (37 °C, 5 % CO2) i 20–30 minutter for å størkne.
- Tilsett 1:2-forholdet mellom 1x organoid medium på toppen av BME-cellefjæring avhengig av det empirisk vurderte volumet. I det aktuelle utgangspunktet, tilsett 50 μL 1x organoid medium media på toppen av 100 μL rekonstituerte celler / BME-blanding.
- Plasser 96-brønnsplaten i en inkubator (37 °C, 5 % CO2) i 20 minutter for å likevekte.
- Ta cellekulturplaten ut av inkubatoren og monter den på en prøveholder på scenen til et mikroskop. Vurder organoider visuelt under fasekontrast eller brightfield-innstillinger.
MERK: Bilder er best anskaffet av et invertert fasekontrastmikroskop utstyrt med differensialinterferens (DIC) optikk, digitalt kamera og tilhørende programvare for å observere dannelsen av sfæriske PUD-er som forberedelse til endepunktanalyse.- Hvis distinkte klynger er synlige, plasserer du cellekulturplaten i et elektronisk oppvarmet mikroskopkammer på scenen (37 °C, 5 % CO2) for levende celleavbildning i løpet av de første 24–72 t.
- Sørg for at den fleksible oppvarmede kragen er festet til linsen for å redusere termisk drift og luftfukteren er fylt med dH2O.
- Utfør det første bildet med et objektiv på 4x eller 10x (N.A. 0,30, W.D. 15,2 mm). Tidsforløp hvert 5-10 min på fasekontrastinnstillingen.
- Se etter vellykket isolasjon som preget av utseendet på >10 selvorganiserende organoider per brønn etter en 24-72 timers periode.
- La kulturer fortsette i opptil to uker hvis organoidtallene er lave (figur 3C).
- Fyll opp mediet hver 2-3 dager ved hjelp av 50 μL forvarmet organoidmedium for å fylle opp utarmede vekstfaktorer og totalt volum.
- Hent bilder (som beskrevet i trinn 3.30) på dagene 1, 2 og 3 (intervallserier), og på dag 5, 7 og 10 før passiving (hvis aktuelt).
MERK: Organoider (observeres som generelt runde strukturer der du ikke kan se kantene på individuelle celler) passerer vanligvis 7-10 dager etter oppsett, avhengig av isolasjonens suksess. Før eller etter passivitet kan organoider behandles med cytotoksika eller terapeutiske midler i opptil 6 dager og legemiddelrespons målt ved hjelp av celle levedyktighet og cytotoksisitetsanalyser. Alternativt kan organoider hentes fra BME (ved hjelp av 1 mg/ml dispase) og kryopreservert (biobanket), klargjort for molekylær testing, eller innebygd og vurdert histologisk (figur 4).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
3D organoider ble vellykket etablert fra human blære kreft pasient TURBT og cystectomy vev. Kort sagt fremhever denne teknikken en rask dannelse av 3D multicellulære strukturer som både er levedyktige og egnet for andre endepunktanalyser som histologisk evaluering, molekylær karakterisering (ved immunhiistokjemi eller kvantitativ sanntids PCR) og narkotikascreening. Under prosedyren (figur 1) kan de ulike eluates under filtreringsfasene våre (figur 1, trinn 1-6) utnyttes til å kryopreservere enkeltceller for isolering av tumorinfiltrerende immunceller (TILer) og generering av en enkeltcellet biobank. Prosedyren gjør det mulig å spore flere aspekter av en heterogen primærsvulst på riktig måte og på en måte som kan spores på tvers av pasienter (figur 2A, B), inkludert histologi (figur 2C, D) og ferske frosne prøver (figur 2E).
En 2 h fordøyelse med kommersielt tilgjengelig kollagenase / hyaluronidase og DNase 1 gir tilstrekkelig fordøyelse på 0,5-1 mm3 stykker av det mer komplekse cystectomy biopsivevet, inkludert neoplastiske celler i lamina propria og muskulære lag i blæren (figur 3A). Større fragmenter etter fordøyelsen (>100 mikron) har vist seg egnet for kultur i standard vevskulturplater av alle størrelser for isolering av nye 2D-kulturer (figur 3B). Imidlertid er det nødvendig med omfattende molekylær karakterisering for å validere kreftopprinnelsen til slike cellelinjer. Organoider som er vellykket generert med denne protokollen gjennomgår prosesser for dynamisk selvmontering, inkludert faser av aggregering, komprimering og sluttdannelse, hvorved de dannes i tette cellulære strukturer (figur 3C) som kan vurderes for respons på standardbehandlinger. Figur 3C fremhever organoidenes effektive selvmonteringsegenskaper. Histologisk rekapitulerer disse strukturene den opprinnelige pasientsvulsten (figur 4). Organoider generert i denne prosedyren er egnet for en rekke formål, inkludert videre karakterisering, biobanking og testing av legemiddeleffekt (figur 5).
Figur 1: Skjematisk representasjon av organoid vevskultur fra innsamling av tumorprøver fra kirurgi til endepunktanalyser. URN, enhetspostnummer; TIL, tumorinfiltrerende lymfocytt. (1) Vev er mekanisk hakket i en 90 mm petriskål så fint som mulig med et sterilt skalpellblad (0,5-1 mm3 stykker). (2) Tumorstykker resuspenderes i et enzymatisk dissosiasjonsmedium som består av det organoide mediet, kollagenase/hyaluronidase og DNase 1. (3) Hakket tumorvev og enzymoppløsning inkuberes i 1-2 timer på en rotatorinkubator (150 rpm, 37 °C, 5 % CO2) og deretter pelletert (4) for å dissosiere fragmenter i en finere cellefjæring. Prøven gjennomgår filtrering gjennom pre-våte reversible (5) 100 μm og (6) 37 μm siler i nye 50 ml rør for å fjerne stort uoppløselig materiale og isolere 37-100 μm klynger. Etter (7) sentrifugering av fraksjonen isolert fra baksiden av 37 μm silen, er celleklyngene suspendert i (8) BME og organoide medier før (9) levende celleavbildning. Opprettet med BioRender.com. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Steril tumorvevshåndtering for organoid etablering. (A) Ved eksisjon og transport til laboratoriet plasseres prøven i en steril petriskål, veies og deretter dissekeres. (B) Et prøve disseksjonsgitter brukes til å markere prøven for ulike prosesser. Et eksempel på disseksjon er vist i (C) hvor prøver tas fra tumorperiphery så mye som mulig for å unngå områder med sentral nekrose og kommentert (innfelt) før (D) som grover vevet før vevsfiksering. Skalastang: 6 mm. Innfelt skalastang: 4 mm. (E) Små ferske fragmenter tas for etterfølgende frysing og biobanking. Skalastang: 5 mm. Elementer i dette bildet ble opprettet med BioRender.com. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Enzymatisk avledning og dynamisk montering av blæretumororganoider. (A) Representative bilder av hematoksylin og eosin (H&E) farget foreldreblærekreftvev (patologi gjennomgått som T3bN0) på umiddelbar fiksering (venstre) og 2 t post-fordøyelse med 1x kollagenase / hyaluronidase (høyre). Skala bar: 500 μm. Innfelt skalalinje: 50 μm. (B) Representative bilder av >100 μm, 37-1 og 70-1 (dag 2) isolasjoner. Skalalinjer angis i bildet. (C) Representative bilder vises for blærekreft organoid isolasjon over 48 timer og dag 7 organoid H&E farging. Skala bar: 50 μm. Skalalinje for bildet i innfelt: 20 μm. DIC: differensialinterferenskontrast. Elementer i dette bildet ble opprettet med BioRender.com Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Blærekreftavledede organoidkulturer opprettholder den histologiske arkitekturen til foreldresvulster. Representativt H&E-bilde av lavgradig blærekreft (Ta) og tilsvarende lysfeltbilde av organoid på dag 7 av kulturen. Panelet lengst til høyre viser assosiert H&E-farging av dag 7 organoid. Skalastenger er angitt i figuren. LG: lav klasse, BC: blærekreft, H&E: hematoksylin og eosin, og DIC: differensialinterferenskontrast. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: Nedstrømsapplikasjoner med blærekreftpasientavledede organoider. Opprettet med BioRender.com. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
| Tilsetningsstoff | Siste konklam. | Børs, kons. | Løsemiddel | |
| Basale medier | Glutamax | 2 mM | 1 M | NaCl |
| HEPES | 10 mM | 1 M | NaCl/NaHPO4 bufret løsning | |
| Tillegg for komplette medier | R-spondin 1-betinget medium | 5% v/ v | Betingede medier | Avansert DMEM/F-12 |
| Noggin-betingede medier | 5% v/ v | Betingede medier | Avansert DMEM/F-12 | |
| EGF | 50 ng/ml | 0,5 mg/ml | PBS/0,1 % BSA | |
| FGF-10 | 20 ng/ml | 100 μg/ml | PBS/0,1 % BSA | |
| FGF-2 | 5 ng/ml | 50 μg/ml | PBS/0,1 % BSA | |
| Nikotinamid | 10 mM | 1 M | 1 g i 8,2 ml ddH20 | |
| N-acetyl-L-cystein | 1,25 mM | 500 mM | 40 ml ddH20 | |
| En 83-01 | 0,5 μM | 50 mM | DMSO | |
| SB202190 | 10 μM | 50 mM | DMSO | |
| Y27632 | 10 μM | 100 mM | ddH20 | |
| B-27 additiv | 1X | 50x | ||
| Prostaglandin E2 | 1 μM | 10 mM | DMSO | |
| Primocin | 100 μg/ml | 50mg/ml | ||
Tabell 1: Kosttilskudd brukt til basale og komplette organoidmedier
Tilleggsfil: Klikk her for å laste ned denne filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Mens 3D organoid protokoller avledet fra blærekreft vev er fortsatt i sin barndom, de er et område av aktiv forskning og klinisk undersøkelse. Her er en optimalisert protokoll for å lykkes med å etablere blærekreft-PUD-er som passer for både NMIBC- og MIBC-prøver detaljert. Denne arbeidsflyten integreres parallelt i sykehusbaserte kliniske studier og vurderer biobankprøveopptjening, inkludert histologisk prøvebehandling og fersk frossen vevsbank, noe som er et viktig hensyn for kliniske organoidrørledninger. Denne protokollen bygger på eksisterende metoder og gir en konsolidert metodikk for å bygge en organoid presisjonsmedisinsk rørledning.
Den gjeldende suksessraten for denne protokollen - som andre - er omtrent 70%25. Det forventes at dette vil forbedre seg etter hvert som isolasjonsteknikker og karakterisering av blærekreftsvulstmikromiljøet utvikler seg. Som forventet påvirker kvaliteten på den første prøven suksessraten og er et viktig begrensende skritt. Prøver hentet fra kjemoterapi naive pasienter gir den høyeste suksessraten, mens de fra pasienter som har fått neoadjuvant kjemoterapi kan ha et redusert antall levedyktige celler26,27. Vanligvis gir blærekreftprøver (fra både TURBT og cystectomies) en god mengde prøver med høy tumor cellulæritet. Dette tillater robust generering av organoider som spenner mellom 30-100 μm innen en vekstperiode på 24-72 timer (gitt at noen <40 μm klynger beholdes i filtreringstrinnene). Det er viktig at heterogeniteten som observeres i organoidprøver (dvs. cystiske formasjoner og tettere strukturer) indikerer at denne protokollen gir forhold som er egnet til å utlede heterogene tumorcellepopulasjoner.
Vår optimaliserte protokoll kan utføres på begrenset startmateriale (som det er tilfellet fra noen valgfrie operasjoner, inkludert TURBT-prosedyrer eller prøver anskaffet fra pasienter på en klinisk studie), slik at inkorporering av flere analyser for å maksimere prøveverdien. Denne protokollen inkluderer metoder for å beskrive trinn for å vokse 2D-kultur fra fremmede tumorceller av interesse som kan ligge i store uoppløselige vev behandlet under det første filtreringstrinnet. Som andre forskningsgrupper som foreslår behandling av prøver innen 24 timer etter operasjonen28,29, observeres det at vevshypoksi som oppstår innen denne tidsrammen ikke utelukker å generere levedyktige organoider. Optimalisering er nødvendig for å bestemme tettheten av celle (innfødte klynger) såing per brønn. Vår erfaring er at for mange klynger kan føre til dårlig vekst i kulturene, mens lav synstetthetskultur kan føre til celledød. Dette kan bestemmes av brukeren empirisk i sammenheng med volumene som kan fortynnes innenfor et område etter behov. I tillegg inneholder TURBT-prøver ofte brente kanter på grunn av reseksjonsprosessen, som er tydelig som fremtredende nekrotiske regioner. Et kritisk skritt er forsiktig isolasjon av makroskopisk tumorvev og påfølgende disseksjon. Dette er avgjørende for å utlede levedyktige kulturer og må kommuniseres med operasjonsteamet. I noen tilfeller kan dette være en innledende begrensning i prosedyren.
En ekstra begrensning i den nåværende teknikken er fraværet av tumormikromiljøet parallelt med organoidene. En nødvendig utvikling vil være fremtidige samkultursystemer for å øke cellulær kompleksitet og gi andre komponenter i tumormikromiljøet (dvs. stroma og immunceller). Siden organoider er definert som selvorganiserende strukturer med evnen til selvopplevd vekst, vil det bli nødvendig med ytterligere arbeid for å belyse de diskrete kreftstamcellene (som CD44 og CD49) som kan tillate forbedrede in vitro vekstegenskaper 31,32,33. Å fastslå med sikkerhet at PUD-ene stammer fra tumorvev er kritisk, da bidraget fra normale urotelceller i funksjonelle og molekylære analyser vil forvirre undersøkelser av narkotikaresistens. Noen ganger er tumoropprinnelsen til de uroteliale cellene i PUD-ene klar på grunn av bruk av metastatisk vev eller papillære svulster (som det er tilfelle her; se figur 4), men når kildevevet utskilles fra blæreslimhinnen og dermed inneholder marginer av godartet urothelium, er det viktig å bekrefte at de resulterende PUD-ene består av tumorceller ved hjelp av molekylære teknikker. Dermed er det nødvendig med immunhiistokjemiske og genomiske sammenligninger mellom de etablerte organoidene og den primære svulsten som de ble avledet30 fra.
Når det gjelder antall og størrelsesfordelinger av organoidene per brønn, er det vanskelig å opprettholde jevn platingtetthet av 3D-organoider for cytotoksisitetsanalyse. Dette reduseres litt ved å isolere definerte områder ved hjelp av filtrene, men det er fortsatt en begrensning hvis små klynger og større organoider er isolert i samme brønn. Store partikkelsorteringsmidler kan redusere dette problemet, men er ikke allment tilgjengelig i medisinske forskningslaboratorier. Likevel har teknikker som måler levedyktighetssignaler før og etter behandling blitt brukt med hell i blærekreftorganoider34. Etter hvert som denne teknologien utvikler seg, vil dette gjøre det mulig for forskere å utvikle et bibliotek med blærekreft-PUD-er med varierende genomiske profiler, og farmakodynamiske responser som kan utforskes for å undersøke nye terapier. I tillegg tillater prøveinnsamlingsprosedyren og dissosiasjonsmetoden som er beskrevet her, samtidige preparater for tumor romlig profilering, multiparametrisk strømningscytometri og encellet RNA-sekvensering. Samlet sett gir dette mulighet for et mangfoldig utvalg av kraftige endepunkter som kan bringes sammen for å utforske pasientens tumor heterogenitet og anvendbarhet av legemidler som immunterapi.
Oppsummert beskriver vi en protokoll for å etablere og evaluere kulturer av 3D pasientavledede blærekreftorganoider i fremkomsten av presisjonsmedisinske endepunkter. Det er viktig å merke seg at trinnene og notatene som er beskrevet her, er rutinemessige tilnærminger som brukes til å isolere blærekreft-PUD-er i laboratoriet vårt. Kulturmediet som ble brukt i vår prosedyre ble opprinnelig beskrevet for prostatakreftceller og har nå vist seg å være egnet for blærekreftkulturen. Det er viktig at denne protokollen er sentralisert, egnet for rutinemessig bruk i laboratorier, og som i stor grad gjelder på tvers av urologiske krefttyper. I kombinasjon med høy kvalitet molekylær fenotyping og narkotika respons endepunkter, denne teknikken vil gi et nyttig verktøy for å raskt utforske presis terapeutisk styring av blærekreft pasienter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter.
Acknowledgments
Vi anerkjenner den tekniske hjelpen til Translasjonsforskningsinstituttets histologikjerne og biologiske ressursanlegg. Denne forskningen ble støttet av finansiering fra en Princess Alexandra Research Foundation award (I.V., E.D.W.), og Medical Research Future Fund (MRFF) Rapid Applied Research Translation Program (Centre for Personalised Analysis of Cancers (CPAC; E.D.W., I.V.). Translational Research Institute får støtte fra den australske regjeringen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.2 mL cryogenic vial | Corning | 430487 | |
| 1.5 mL Eppendorf tubes | Sigma-Aldrich | T9661-500EA | polypropylene single-use tube |
| 100 µM reversible strainer | STEMCELL Technologies | #27270 | |
| 100 mm Petri dish | Corning | 430167 | |
| 10x Collagenase/ Hyaluronidase | STEMCELL Technologies | #07912 | |
| 37 µM reversible strainer | STEMCELL Technologies | #27250 | |
| 37°C incubator | |||
| 37°C water bath | |||
| 50 mL falcon tube | Corning | CLS430829-500EA | |
| 6-well plate | Corning | CLS3516 | |
| 70% (w/w) ethanol | |||
| -80°C freezer | |||
| 96 well ultra low attachment plate (Black) | Sigma-Aldrich | CLS3474-24EA | |
| A 83-01 | BioScientific | 2939 | Prevents the growth-inhibitory effects of TGF-β |
| ACK lysis buffer | STEMCELL Technologies | #07850 | |
| adDMEM/F-12 | Thermo Fisher Scientific | 12634028 | Base medium |
| Animal-free recombinant EGF | Sigma-Aldrich | 518179 | Growth factor |
| Automated cell counter (TC20) | Bio-rad | 1450102 | |
| B27 additive | Gibco | 17504044 | Increases sphere-forming efficiency |
| Cell Counting Slides | Bio-rad | 1450015 | |
| Centrifuge | Eppendorf | EP022628188 | |
| Computer system | |||
| CryoStor CS10 | STEMCELL Technologies | #07930 | Cell freezing solution |
| Dispase II, powder | Thermofisher | 17105041 | To enzymatically disrupt Matrigel |
| DNAse 1 | STEMCELL Technologies | #07900 | |
| DPBS | Thermofisher | 14190144 | |
| Dry and wet ice | |||
| Esky | |||
| Farmdyne (Iodine 16g/L) | Ecolab | ||
| Formalin solution, neutral buffered, 10% | Sigma | HT501128 | Histological tissue fixative |
| Glutamax (L-alanine-L-glutamine) | Invitrogen | 35050061 | Source of nitrogen for the synthesis of proteins, nucleic acids |
| HEPES | Gibco | 15630-080 | All-purpose buffer |
| Histology cassette | ProSciTech | RCH44-W | |
| Human FGF-10 | Peprotech | 100-26-25 | Growth factor |
| Human FGF-2 | Peprotech | 100-18B-50 | Growth factor |
| Liquid nitrogen | |||
| Matrigel (Growth Factor Reduced (GFR), phenol red-free, LDEV free) | In Vitro Technologies | 356231 | Basement membrane extract (BME) |
| Mr. Frosty freezing container | ThermoFisher | 5100-0001 | cell freezing container |
| N-acetyl-L-cysteine (NAC) | Sigma | A7250 | Anti-oxidant required to protect against ROS-induced cytotoxicity |
| Nicotinamide | Sigma | N0636-100G | SIRT-1 inhibitor |
| NikonTs2U inverted microscope | Nikon | MFA510BB | |
| NIS-Elements Advanced Research | Nikon | MQS31000 | |
| Noggin conditioned media | In-house | BMP inhibitor | |
| Pipetboy acu 2 | Integra | 155000 | |
| Pipettes (p20, p100, p1000) with tips | |||
| Primocin | Jomar Bioscience | ant-pm2 | Combination of antibacterial and antifungal compounds to protect cell cultures from contaminations |
| Prostaglandin E2 (PGE2) | Tocris | 2296 | support proliferation of cells |
| Rotary tube mixer | Ratek | RSM7DC | |
| R-spondin 1 conditioned media | In-house | WNT signalling regulator | |
| SB202190 | Jomar Bioscience | s1077-25mg | Selective p38 MAP kinase inhibitor |
| Scale | |||
| Scalpel handle | Livingstone | WBLDHDL03 | |
| Scalpels, #11 blade | Medical and Surgical Requisites | EU-211-1 | |
| Serological pipettes (5, 10, 25 mL) | |||
| Specimen Waste Bags | Medical Search | SU09125X16 | |
| Urine specimen jar | |||
| Y27632 | Jomar Bioscience | s1049-10mg | Selective ROCK inhibitor. Increases survival of dissociated epithelial cells |
References
- Saginala, K., et al.
- Lindskrog, S. V., et al. An integrated multi-omics analysis identifies prognostic molecular subtypes of non-muscle-invasive bladder cancer. Nature Communications. 12 (1), 2301 (2021).
- Isharwal, S., Konety, B. Non-muscle invasive bladder cancer risk stratification. Indian Journal of Urology. 31 (4), 289-296 (2015).
- Lozano, F., Raventos, C. X., Carrion, A., Trilla, E., Morote, J. Current status of genetic urinary biomarkers for surveillance of non-muscle invasive bladder cancer: a systematic review. BMC Urology. 20 (1), 99 (2020).
- Batista, R., et al. TERT promoter mutation as a potential predictive biomarker in bcg-treated bladder cancer patients. Internation Journal of Molecular Science. 21 (3), 947 (2020).
- Patel, V. G., Oh, W. K., Galsky, M. D. Treatment of muscle-invasive and advanced bladder cancer in 2020. Cancer Journal for Clinicians. 70 (5), 404-423 (2020).
- Williams, S. B., et al. Estimated costs and long-term outcomes of patients with high-risk non-muscle-invasive bladder cancer treated with bacillus calmette-guérin in the veterans affairs health system. JAMA Network Open. 4 (3), 213800 (2021).
- Zhu, S., et al. Preclinical models for bladder cancer research. Hematology/Oncology Clinics of North America. 35 (3), 613-632 (2021).
- lvarez-Maestro, M., Guerrero-Ramos, F., Rodríguez-Faba, O., Domínguez-Escrig, J. L., Fernández-Gómez, J. M. Current treatments for BCG failure in non-muscle invasive bladder cancer (NMIBC). Actas Urológicas Españolas (English Edition). 45 (2), 93-102 (2021).
- Berry, D. L., et al. Treatment decision making in patients with bladder cancer. Bladder Cancer. 1 (2), 151-158 (2015).
- Drost, J., et al. Organoid culture systems for prostate epithelial and cancer tissue. Nature Protocols. 11 (2), 347-358 (2016).
- Kato, M., Sasaki, T., Inoue, T. Current experimental human tissue-derived models for prostate cancer research. International Journal of Urology. 28 (2), 150-162 (2021).
- Liu, L., Yu, L., Li, Z., Li, W., Huang, W. Patient-derived organoid (PDO) platforms to facilitate clinical decision making. Journal of Translational Medicine. 19 (1), 40 (2021).
- Joshi, A., Roberts, M. J., Alinezhad, S., Williams, E. D., Vela, I. Challenges, applications and future directions of precision medicine in prostate cancer - the role of organoids and patient-derived xenografts. British Journal of Urology International. 126 (1), 65-72 (2020).
- Pan, C. X., et al. Development and characterization of bladder cancer patient-derived xenografts for molecularly guided targeted therapy. PLoS One. 10 (8), 0134346 (2015).
- Gopinathan, A., Tuveson, D. A. The use of GEM models for experimental cancer therapeutics. Disease models & mechanisms. 1 (2-3), 83-86 (2008).
- Kemp, C. J. Animal models of chemical carcinogenesis: driving breakthroughs in cancer research for 100 years. Cold Spring Harbor Protocols. 2015 (10), 865-874 (2015).
- Day, C. P., Merlino, G., Van Dyke, T. Preclinical mouse cancer models: a maze of opportunities and challenges. Cell. 163 (1), 39-53 (2015).
- Kobayashi, T., Owczarek, T. B., McKiernan, J. M., Abate-Shen, C. Modelling bladder cancer in mice: opportunities and challenges. Nature Reviews Cancer. 15 (1), 42-54 (2015).
- Liu, W., et al. Conditional reprogramming: Modeling urological cancer and translation to clinics. Clinical Translational Medicine. 10 (2), 95 (2020).
- Yoshida, G. J. Applications of patient-derived tumor xenograft models and tumor organoids. Journal of Hematological Oncology. 13 (1), 4 (2020).
- Kim, J., Koo, B. K., Knoblich, J. A. Human organoids: model systems for human biology and medicine. Nature Reviews Molecular Cellular Biology. 21 (10), 571-584 (2020).
- Marshall, L. J., Triunfol, M., Seidle, T. Patient-derived xenograft vs. organoids: a preliminary analysis of cancer research output, funding and human health impact in 2014-2019. Animals. 10 (10), 1923 (2020).
- Gao, D., et al. Organoid cultures derived from patients with advanced prostate cancer. Cell. 159 (1), 176-187 (2014).
- Lee, S. H., et al. Tumor evolution and drug response in patient-derived organoid models of bladder cancer. Cell. 173 (2), 515-528 (2018).
- Kim, I. H., Lee, H. J. Perioperative immunotherapy for muscle-invasive bladder cancer. Translational Andrology and Urology. 9 (6), 2976-2985 (2020).
- Raphael, M. J., Booth, C. M. Neoadjuvant chemotherapy for muscle-invasive bladder cancer: Underused across the 49(th) parallel. Canadian Urological Association Journal. 13 (2), 29-31 (2019).
- Tiriac, H., French, R., Lowy, A. M. Isolation and characterization of patient-derived pancreatic ductal adenocarcinoma organoid models. Journal of Visualized Experiments. (155), e60364 (2020).
- Pleguezuelos-Manzano, C., et al. Establishment and culture of human intestinal organoids derived from adult stem cells. Current Protocols in Immunology. 130 (1), 106 (2020).
- Fusco, P., et al. Patient-derived organoids (PDOs) as a novel in vitro model for neuroblastoma tumours. BMC Cancer. 19 (1), 970 (2019).
- Mullenders, J., et al. Mouse and human urothelial cancer organoids: A tool for bladder cancer research. Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (10), 4567-4574 (2019).
- Vasyutinv, I., Zerihun, L., Ivan, C., Atala, A. Bladder organoids and spheroids: potential tools for normal and diseased tissue modelling. Anticancer Research. 39 (3), 1105-1118 (2019).
- Santos, C. P., et al. Urothelial organoids originating from Cd49fhigh mouse stem cells display Notch-dependent differentiation capacity. Nature Communications. 10 (1), 4407 (2019).
- Whyard, T., Liu, J., Darras, F. S., Waltzer, W. C., Romanov, V. Organoid model of urothelial cancer: establishment and applications for bladder cancer research. Biotechniques. 69 (3), 193-199 (2020).
